一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型生物分離材料及其制備方法：將親水性凝膠微球作為基質(zhì)在均三嗪活化劑中制成活化基質(zhì)，然后以偶聯(lián)法對活化基質(zhì)鍵合4-(2-羥基乙基)-吡啶等兩個小分子配體，具有更好的特異性與親和選擇性。本發(fā)明的分離介質(zhì)配合親和層析色譜或擴展床吸附用于工業(yè)化大規(guī)?？贵w生產(chǎn)，極具成本優(yōu)勢，僅一步可從血液、血清、血漿、血漿組分、腹水、細胞培養(yǎng)液、細胞均化液、奶液、初乳等生物原料中直接提取生產(chǎn)高純度的抗體產(chǎn)品，省時省事。
【專利說明】一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法，屬于生物分離材料領(lǐng) 域。具體地說涉及一種用于以親和層析色譜或擴展床吸附法從血液、血清、血漿、血漿組分、 腹水、細胞培養(yǎng)液、細胞均化液、奶液、初乳等生物原料中分離純化抗體的新型生物分離材 料及其制備方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]生物分離介質(zhì)是專門用于提純和精制生物相關(guān)產(chǎn)品的一類材料。分離介質(zhì)廣泛用 于醫(yī)藥行業(yè)、發(fā)酵行業(yè)、生物制品、血液制品、疫苗和基因工程產(chǎn)品分離。在純化產(chǎn)品時，分 離介質(zhì)具有分離效果好、產(chǎn)品純度高、使用范圍廣，而且還具有可以進行大規(guī)模連續(xù)自動化 生產(chǎn)的特點，使之成為目前對高純度和高附加值產(chǎn)品進行分離的首選方法。依賴分離介質(zhì) 的產(chǎn)品涵蓋基因重組藥物、抗體、疫苗、診斷試劑、生化產(chǎn)品、血液凈化、基因芯片以及抗生 素等。
[0004]近年來，針對抗體的分離介質(zhì)倍受重視。但是,抗體產(chǎn)品純度往往要求較高，同時 還要盡可能地保持其生物活性，傳統(tǒng)分離介質(zhì)難以滿足要求。常規(guī)離子交換層析分離介質(zhì) 以及疏水作用層析分離介質(zhì)能夠結(jié)合抗體，但是特異性和選擇性較差，造成分離步驟多，降 低抗體的收率與活性；例如，人IgG抗體普遍使用Cohn-Oncley的四步分離法從血庫血衆(zhòng)中 提取，得到的IgG純度僅85%，且易形成多聚體或聚集體；又例如使用離子交換層析法從單 克隆抗體含3%牛血清的細胞培養(yǎng)液中直接提取IgG，抗體回收率僅為70%，且抗體僅占白 蛋白的二分之一，使用硫酸銨沉淀法，純度更低。
[0005]目前，使用昂貴的proteinA或基因重組蛋白質(zhì)大分子作為親和配體、專門用 于抗體藥物分離純化的親和分離介質(zhì)，其選擇性非常好，例如美國GE公司已商品化的 MabSelect以及IgSelect等專門針對抗體的親和分離介質(zhì)產(chǎn)品,但這些蛋白質(zhì)大分子配體 價格昂貴，容易受到從分離前段工序帶來的蛋白酶的降解，既降低分離介質(zhì)的重復(fù)使用次 數(shù)或壽命、穩(wěn)定性低，又可能產(chǎn)生肽鏈碎片污染抗體產(chǎn)品、影響其質(zhì)量與安全。以高效的小 分子親和配體取代這些昂貴的大分子配體，可解決傳統(tǒng)大分子配體分離介質(zhì)的生產(chǎn)成本、 保存穩(wěn)定性、掉肽鏈(leaking，大分子配體從微球介質(zhì)上斷鏈或形成碎片)等問題。美國專 利(USPatent 5，652、348、5，719，269、7，144，743)描述了利用雜環(huán)配體與抗體的疏水相互 作用進行吸附分離的新型分離介質(zhì)及其制備方法，中國專利CN101284224描述了一種以巰 基乙基吡啶和砜基為配基、以纖維素/無機增重劑復(fù)合微球為基質(zhì)的分離抗體的擴張床吸 附介質(zhì)及制備方法，但存在介質(zhì)生物相容性不夠，且需要在堿性條件下操作、砜基易產(chǎn)生非 特異性吸附等缺點。所有這些小分子配體存在一個更致命的問題:選擇性比protein A或 基因重組蛋白質(zhì)大分子親和配體低得多。因此，本發(fā)明除選擇生物相容性更好的親水凝膠 微球作為介質(zhì)的基質(zhì)，主要是設(shè)計、制備選擇性更好的小分子作為配體，更有效地實現(xiàn)抗體 的分離純化過程。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是，針對目前用于抗體藥物分離純化的親和分離介質(zhì)的諸多問題， 提出一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法。這一方法具有如下具體特征:
[0007]1、本發(fā)明所述的一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法，其特征在于將親水性凝膠微球作為基質(zhì)懸浮于均三嗪活化劑中制成活化基質(zhì)，然后以偶聯(lián)法對活化基質(zhì)鍵合兩個小分子配體；所述分離介質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)為:
【權(quán)利要求】
1.一種用于分離純化抗體的介質(zhì)及其制備方法，其特征在于將親水性凝膠微球作為基質(zhì)懸浮于均三嗪活化劑中制成活化基質(zhì)，然后以偶聯(lián)法對活化基質(zhì)鍵合兩個小分子配體； 所述分離介質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其特征在于，構(gòu)成所述介質(zhì)的基質(zhì)Matrix為親水性凝膠微球，包括親水性瓊脂糖凝膠微球、親水性葡聚糖凝膠微球、親水性聚丙烯酰胺凝膠微球；但優(yōu)選親水性瓊脂糖凝膠微球作為基質(zhì)材料；基質(zhì)的粒徑為50-160微米，交聯(lián)度為 4-10%范圍。
3.本發(fā)明所述的介質(zhì)，其特征在于，構(gòu)成所述介質(zhì)的基質(zhì)Matrix與均三嗪之間可以通過-0-(醚鍵)，-NH-, -S-(硫醚鍵)相連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其特征在于，構(gòu)成所述介質(zhì)的基質(zhì)Matrix與均三嗪之間還可以以包括但不限于下列一種加長的連接臂相連接:-0-CH2-CH2-CH2-X-，其中 X = 0，N，S-0-CH2-CH(0H)-CH2-X-，其中 X = 0，N，S-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-X，其中 X = 0，N，S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其特征在于，構(gòu)成所述介質(zhì)的小分子配體Rl、R2包括但不限于含羥基、伯胺基或巰基的吡啶類衍生化合物，具體包括但不限于2-(2-羥基乙基)-吡唆，3- (2-羥基乙基)-吡唆，4- (2-羥基乙基)-吡啶(又名吡啶乙醇)，2- (2-巰基乙基)-吡啶，3- (2-巰基乙基)-吡啶，4- (2-巰基乙基)-吡啶，2- (2-氨基乙基)-吡啶， 3_(2_氨基乙基)-批唆，4-(2-氨基乙基)-吡唳。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的介質(zhì)制備方法，其特征在于，所述制備介質(zhì)所使用的均三嗪活化劑可以是其本身；亦可是通過均三嗪與環(huán)氧氯丙烷、二乙烯砜、羰基二咪唑等反應(yīng)后串聯(lián)環(huán)氧基、砜乙烯基等其它基團的均三嗪衍生物，使得活化基質(zhì)具備更豐富的表面化學(xué)活性有機官能團。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述介質(zhì)用于以親和層析色譜和擴展床吸附法分離純化抗體。Malrix
【文檔編號】C07K1/22GK103506079SQ201210202165
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月19日
【發(fā)明者】汪志友 申請人:汪志友