專利名稱：從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
雞蛋清來源廣泛，價(jià)格低廉，干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量超過80%，是最理想的蛋白質(zhì)資源之一。雞蛋清蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的功能特性，如凝膠性、起泡性和成膜性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)和其它制造業(yè)領(lǐng)域，取得了巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而雞蛋清蛋白質(zhì)所具有的生物活性具有更加廣闊的應(yīng)用前景。如溶菌酶的抗菌活性、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的特性、卵粘蛋白的抗病毒活性，以及卵黃素蛋白結(jié)合核黃素的活性，這些重要的生物活性已經(jīng)引起廣大科研工作者的強(qiáng)烈關(guān)注。在生命健康越來越受到關(guān)注的今天，雞蛋清蛋白質(zhì)的生物活性使其在保健食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)有國內(nèi)雞蛋清蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)主要為一種或兩種蛋白質(zhì)的分離純化，更多種類的蛋白質(zhì)聯(lián)合提取技術(shù)鮮見報(bào)道。國外有少量使用液相層析技術(shù)聯(lián)合提取多種雞蛋清蛋白質(zhì)的報(bào)道，但存在提取效率低、蛋白質(zhì)純度不高、需多種層析填料且填料價(jià)格高等問題，制備成本較高，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上還存在很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了填補(bǔ)國內(nèi)雞蛋清中多種蛋白質(zhì)聯(lián)合提取的技術(shù)空白，提供一種提取效果好，產(chǎn)品純度高，適于工業(yè)化生產(chǎn)的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法包括以下步驟(I)新鮮雞蛋清用等體積的20 IOOmM氯化鈉溶液稀釋后混勻，調(diào)節(jié)pH值至
5.O 8. 0，得到處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質(zhì)量百分比濃度為2 6%，優(yōu)選為2. 7 4. 5%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其質(zhì)量百分比濃度為8 12 %，優(yōu)選為8. 6 10. 0%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇 8000至其質(zhì)量百分比濃度為14 18%，優(yōu)選為14. 8 16. 3%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心，得到沉淀C和上清D ;該步驟中充分?jǐn)嚢钑r(shí)間均優(yōu)選為2 4小時(shí)；(3)將沉淀A懸浮于200 800mM氯化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢钁腋? 24小時(shí)后離心，所得新的沉淀懸浮于蒸餾水中，充分?jǐn)嚢韬箅x心，重復(fù)懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，即得卵粘蛋白；(4)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF陰離子交換層析進(jìn)行分離,然后用氯化鈉溶液分步洗脫，所得各洗脫峰分別收集，透析后冷凍干燥得到多個(gè)待鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品;
(5)多個(gè)待鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，合并相同蛋白質(zhì)產(chǎn)品，即得溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白。其中，所述步驟(4)中的用氯化鈉溶液分步洗脫優(yōu)選為依次使用含有O. 05
O.12M、0. 15 O. 25M和O. 28 O. 50M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進(jìn)行分步洗脫， 更優(yōu)選為依次使用含有O. 07 O. 09M、0. 16 O. 21M和O. 29 O. 40M氯化鈉的Tris-HCl 緩沖液以相同流速進(jìn)行分步洗脫。優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7. O 8. 5，濃度為10 IOOmM,所述含氯化鈉的Tris-HCl緩沖液的流速為2. O 3. OmL/min。本發(fā)明所述的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，可以一次性獲得卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白五種蛋白質(zhì)，和現(xiàn)有的從蛋清中分離一至兩種蛋白質(zhì)的方法相比提高了抽提效率和原料的利用率。本方法采用聚乙二醇分級(jí)沉淀預(yù)分離、離子交換層析純化的技術(shù)路線，聚乙二醇分級(jí)沉淀法與現(xiàn)有技術(shù)中常采用的硫酸銨鹽析沉淀法相比，具有以下優(yōu)勢(shì)其一、條件溫和，有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和生物活性；其二、沉淀所得蛋白質(zhì)產(chǎn)品經(jīng)溶解后即可直接進(jìn)行離子交換層析，不需要脫鹽處理，縮短了時(shí)間(約縮短24小時(shí))，降低了大量蒸餾水消耗；其四、聚乙二醇性質(zhì)穩(wěn)定，無環(huán)境危害，不會(huì)導(dǎo)致水質(zhì)富營養(yǎng)化等問題。在預(yù)分離過程中，通過優(yōu)化聚乙二醇8000分級(jí)沉淀的濃度范圍，使蛋清中幾種主要的蛋白質(zhì)成分有效分開，其中卵粘蛋白全部存在于沉淀A中，卵黃素蛋白主要存在于沉淀B中，溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白王要存在于沉淀B和C中，而大部分的卵清蛋白存在于上清D中，每種蛋白質(zhì)在其對(duì)應(yīng)的沉淀中已經(jīng)具有較好的純度，從而使后續(xù)的Q Sepharose FF陰離子交換層析僅需采用一種層析填料即可獲得高純度的蛋白，無需更換填料，簡化了操作步驟，進(jìn)一步縮短了提取蛋白質(zhì)的時(shí)間。本發(fā)明中的Q Sepharose FF陰離子交換層析可采用市售常用填料,價(jià)格低, 性能穩(wěn)定，且支持工業(yè)化應(yīng)用，在生產(chǎn)規(guī)模從實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大至中試和工業(yè)化的過程中，其相關(guān)技術(shù)參數(shù)不需再次優(yōu)化。本發(fā)明的有益效果通過從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法可以在一次提取過程中同時(shí)獲得五種蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度高，回收率較好，該方法僅需常用層析填料即可進(jìn)行，大幅度縮減了生產(chǎn)成本，為蛋清中蛋白質(zhì)提取的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了有利條件。


圖I為本發(fā)明的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法的流程示意圖；圖2為沉淀A、B、C和上清D的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖3為沉淀B的陰離子交換層析圖譜；圖4為沉淀C的陰離子交換層析圖譜；圖5為上清D的陰離子交換層析圖譜；圖6為沉淀B、C和上清D經(jīng)陰離子交換層析所得各峰的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖7為溶菌酶產(chǎn)品的HPLC圖譜；圖8為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；
圖9為卵清蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；圖10為卵黃素蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；其中，OVM為卵粘蛋白、LYZ為溶菌酶、OVT為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、OVA為卵清蛋白、OVF為卵黃素蛋白、EW為雞蛋清。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例一、樣品前處理將新鮮的雞蛋打蛋，使用蛋黃分離器分離蛋清和蛋黃，收集蛋清。二、蛋白質(zhì)提取(I)取I. OL蛋清，邊攪拌邊向蛋清中加入等體積的50mM氯化鈉溶液，攪拌2小時(shí)以混合均勻，然后用濃度為2Mol/L的鹽酸調(diào)pH值到6. O,即得處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質(zhì)量百分比濃度為2. 7 4. 5%，此時(shí)溶液中產(chǎn)生沉淀，利用磁力攪拌充分?jǐn)U散2小時(shí)，得到懸濁液， 然后在4°C、轉(zhuǎn)速為15000 Xg的條件下離心10分鐘，得到沉淀A和上清A ;(3)向上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質(zhì)量百分比濃度為8. 6 10. 0%，充分?jǐn)嚢?小時(shí)，然后在4°C、轉(zhuǎn)速為12000Xg條件下離心10分鐘，得到沉淀B和上清B ;(4)向上清B中進(jìn)一步添加聚乙二醇8000至其在上清B中質(zhì)量百分比濃度為 14. 8 16. 3%，充分?jǐn)嚢?小時(shí)，然后在4°C、轉(zhuǎn)速為12000X g條件下離心10分鐘，得到沉淀C和上清D。將沉淀A、B、C和上清D取樣，進(jìn)行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，可以初步鑒定其中所含的蛋白質(zhì)成分。三、蛋白質(zhì)分離與純化(I)將沉淀A懸浮于500mM氯化鈉溶液中，4°C下攪拌4小時(shí)，然后在4°C、15000Xg 下離心10分鐘，除去大部分的溶菌酶、卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，收集所得的沉淀Al，再將沉淀Al在蒸餾水中懸浮2小時(shí)，并于同樣條件下離心分離，再懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，真空冷凍干燥后得到3. 38g卵粘蛋白產(chǎn)品，其SDS-聚丙酰胺凝膠電泳顯示如圖2中的0VM，使用凝膠成像分析軟件計(jì)算其純度為82. 40%，將卵粘蛋白產(chǎn)品于零下20°C下貯存。(2)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF陰離子交換層析進(jìn)行分離將Q Sepharose FF陰離子交換填料裝填入層析柱(50X 5cm)中，用Tris-HCl緩沖液(pH8. 0， 20mM)，以2mL/min的流速平衡層析柱2小時(shí)。取沉淀B，溶解于Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,20mM)中，4°C下12000 Xg離心10分鐘以除去少量不溶物，然后注入到陰離子交換層析柱中。先用Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,20mM) 以2mL/min的流速?zèng)_洗層析柱，隨后分別用含有O. 07,0. 16和O. 40M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8.0，20mM)以相同流速進(jìn)行分步洗脫。分別收集洗脫過程中產(chǎn)生的各個(gè)峰，將各峰收集液用蒸餾水透析四次，然后冷凍干燥。沉淀C和上清D也使用相同的方法進(jìn)行分離，如圖3 5所示，得到和沉淀B、C和上清D中各個(gè)峰相對(duì)應(yīng)的多個(gè)待鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的凍干粉則、82、83、84、(1、02、03、01、02、03。
(3) SDS-聚丙酰胺凝膠電泳鑒定采用12%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。將上述待鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的凍干粉稱取約10毫克，溶解于5毫升的雙蒸水中， 充分溶解后取80微升溶液，加入20微升的蛋白上樣緩沖液(5倍濃度)，混勻后沸水浴加熱約5分鐘，冷卻后取5微升注入到點(diǎn)樣孔中，恒定電壓100V進(jìn)行電泳。電泳完成后，首先使用固定液(50%乙醇，10%乙酸)對(duì)凝膠進(jìn)行固定30分鐘，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液 (R-250含量O. 1%，同時(shí)含有25%乙醇、8%乙酸)在45°C下染色30分鐘，染色完成后轉(zhuǎn)移至脫色液(25%乙醇和8%乙酸)中脫色，至背景顏色褪去、條帶清晰為止。使用軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，計(jì)算相對(duì)分子量。所得的電泳圖如圖6所示，BI中所含的蛋白質(zhì)為溶菌酶，B2中所含的蛋白質(zhì)為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，B3中所含的蛋白質(zhì)為卵清蛋白，B4中所含的蛋白質(zhì)為卵黃素蛋白，Cl中所含的蛋白質(zhì)為溶菌酶，C2中所含的蛋白質(zhì)為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，C3中所含的蛋白質(zhì)為卵清蛋白，Dl和D2中未含目的蛋白質(zhì)，D3中所含的蛋白質(zhì)為卵清蛋白。將相同蛋白組分合并，B1、C1混合為1.57g溶菌酶產(chǎn)品，B2、C2混合為15. 51g卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品， B3、C3和D3混合為138. 46g卵清蛋白產(chǎn)品，B4為2. IOg卵黃素蛋白產(chǎn)品。四、純度測定及回收率計(jì)算(I)蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量測定卵粘蛋白產(chǎn)品采用凱氏定氮法測定蛋白含量。溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白產(chǎn)品采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒法測定蛋白含量。各蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的蛋白含量測定結(jié)果如下
χΖ 口廣口口卵粘蛋白溶菌酶卵轉(zhuǎn)鐵蛋白卵清蛋白卵黃素蛋白蛋白含量78.32%74.51%64.90%36.56%14.67%(2)蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度測定卵粘蛋白產(chǎn)品的純度已在沉淀A的分離純化步驟中用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。溶菌酶產(chǎn)品、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品、卵清蛋白產(chǎn)品和卵黃素蛋白產(chǎn)品的純度使用Grace Vydac C4 (214TP, 5 μ m, 250 X 4. 6mm)反相高效液相色譜柱進(jìn)行測定。用含O. 1%三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液以I. OmL/min的流速進(jìn)行線性梯度洗脫，首先用5%乙腈溶液平衡色譜柱5分鐘，然后在15分鐘內(nèi)乙腈濃度由5%升高至80%，再在I 分鐘內(nèi)降至5%，并維持4分鐘。柱溫度維持在35°C。用Waters e2695光電二極管檢測器在280nm下進(jìn)行檢測。由軟件對(duì)峰面積進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積比對(duì)各蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度進(jìn)行定量計(jì)算。各蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度測定結(jié)果如下(圖7 10):
χΖ 口廣口口卵粘蛋白溶菌酶卵轉(zhuǎn)鐵蛋白卵清蛋白卵黃素蛋白純度82.40%91.84%94.55%96.45%88.16% (3)回收率計(jì)算
根據(jù)從250g雞蛋清中純化所得各種蛋白質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量、蛋白含量和純度，使用以下公式計(jì)算所得的各個(gè)蛋白質(zhì)的回收率，
蛋白樣品干重X樣品蛋白含量X蛋白純度N/ nn o/ _蛋清質(zhì)量X蛋清中蛋白質(zhì)含量X該蛋白占蛋清總蛋白質(zhì)的比例
需要說明的是，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，新鮮蛋清中蛋白質(zhì)含量以10. 2%計(jì)算，卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白占蛋清總蛋白質(zhì)的比例分別以3. 4%、3. 5%、12%、54%和O. 5%計(jì)算，將其作為理論數(shù)值與本實(shí)施例所得的各蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見下表
權(quán)利要求
1.一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)新鮮雞蛋清用等體積20 IOOmM氯化鈉溶液稀釋后混勻，調(diào)節(jié)pH值至5.O 8. 0， 得到處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質(zhì)量百分比濃度為2 6%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質(zhì)量百分比濃度為8 12%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清B中質(zhì)量百分比濃度為14 18%，充分?jǐn)嚢? 12小時(shí)后離心，得到沉淀C和上清D ；(3)將沉淀A懸浮于200 800mM氯化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢钁腋? 24小時(shí)后離心，所得沉淀Al懸浮于蒸餾水中，充分?jǐn)嚢韬箅x心，再懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，即得卵粘蛋白；(4)沉淀B、C和上清D分別使用QSepharose FF陰離子交換層析進(jìn)行分離，然后分別用氯化鈉溶液分步洗脫，所得各洗脫峰分別收集，透析后冷凍干燥得到多個(gè)待鑒定的蛋白質(zhì)廣品；(5)對(duì)多個(gè)待鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行取樣，并經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，合并相同蛋白質(zhì)產(chǎn)品，即得溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述步驟⑷中的用氯化鈉溶液分步洗脫為用含有O. 05 O. 12M、0. 15 O. 25M和O. 28 O. 50M 氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進(jìn)行分步洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述 Tris-HCl緩沖液的pH為7. O 8. 5，濃度為10 IOOmM,所述含氯化鈉的Tris-HCl緩沖液的流速為2. O 3. OmL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，其特征在于 所述步驟(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質(zhì)量百分比濃度為2. 7 4. 5%，充分?jǐn)嚢? 4小時(shí)后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質(zhì)量百分比濃度為8. 6 10. 0%，充分?jǐn)嚢? 4 小時(shí)后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清B中質(zhì)量百分比濃度為14. 8 16. 3%，充分?jǐn)嚢? 4小時(shí)后離心，得到沉淀C和上清D。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述步驟(4)中的用氯化鈉溶液分步洗脫為用含有O. 07 O. 09M、O. 16 O. 2IM和O. 29 O. 40M 氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進(jìn)行分步洗脫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質(zhì)的方法，通過聚乙二醇8000分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)，然后采用Q Sepharose FF陰離子交換層析進(jìn)行分離，可以一次性獲得卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白，且蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度高，回收率較好，該方法僅需常用層析填料即可進(jìn)行，大幅度縮減了生產(chǎn)成本，為蛋清中蛋白質(zhì)提取的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了有利條件。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102604915SQ20121008336
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者張曉維, 耿放, 馬美湖, 黃群 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)