專利名稱：使用膨脹床色譜從植物中捕獲病毒樣顆粒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從混合物中對目的顆?！绮《緲宇w粒(例如,重組表達的自裝配VLP)的捕獲。本發(fā)明能夠對目的顆粒進行有效捕獲，并可擴大規(guī)模到商業(yè)規(guī)模用途的大體積。前言基因工程革命已擴展到開發(fā)可進行多種應用的重組蛋白質，包括人類及動物治療齊U。美國FDA批準了大約超過100種生物技術來源的治療劑及疫苗用于醫(yī)療用途，此外，有超過1000種其他藥物和疫苗正進行不同階段的臨床試驗。目前，細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)用于生產重組蛋白質有不同的成功程度。盡管技術上的此項發(fā)展掀起了一場藥物和治療產品的生產和傳遞上的革命，但在對可獲得的分子的純化方面還存在問題。例如，純化來自細菌的蛋白質要求裂解細胞，這可能需要數(shù)個步驟以及溶液澄清。這樣，純化過程中使用的色譜樹脂會容易結塊，于是細胞提取物可能需要通過其他過程進行進一步澄清一如通過離心或過濾。還可能需要多階段的純化過程，這會花費時間且還會導致樣品的丟失及降低產出。目的蛋白質的純化過程可能很昂貴，而且面臨技術挑戰(zhàn)。下游的加工可占據(jù)整個成本的高達80%。在蛋白質的純化中廣泛采用填充床吸附色譜。使用填充床需要移除整個細胞或膠質碎片。碎片的移除在實驗室規(guī)模過程的開發(fā)中常常受到忽視，但其卻是達到高效率的最挑戰(zhàn)的操作之一。膨脹床吸附是近期發(fā)展的方法，可用于純化可溶性蛋白質，對加工流的澄清過程要求不高。其使液體流穿起始的填充床結構以接觸高的流體空隙。病毒樣顆粒(VLP)是用于生產重組蛋白質，尤其是免疫原性重組蛋白質如免疫原性病毒重組蛋白質的一個手段。許多病毒具有的衣殼可由單獨表達的結構蛋白質組裝而成，組裝過程可以在體內在形成VL`P的過程中表達結構蛋白質和重組蛋白質的細胞內進行，也可在分離和純化后在細胞外部進行。然而，在含有高含量懸浮固體和不同大小的顆粒的混合物中要捕獲這些VLP在技術上非常具有挑戰(zhàn)性，這通常是在涉及植物來源材料的情況下。當將VLP注射入動物以誘導產生阻斷感染的抗病毒抗體時，VLP可能是免疫原性的。因此，例如以用來自H5N1禽流感菌株的蛋白質產生的病毒樣顆粒免疫的小鼠可在以致死性H5N1病毒攻擊時得到保護。在工業(yè)上仍然需要一種方法用于以提高的效率和產率捕獲目的顆粒。還需要一種可規(guī)?；糜谏虡I(yè)水平的方法用于以成本有效的形式捕獲顆粒。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分地基于此項發(fā)現(xiàn):膨脹床吸附(EBA)色譜對從混合物中捕獲目的顆粒尤其有效。特定實施方式中，此方法可有利地用于在一步結合及洗脫過程中捕獲目的顆粒，這可規(guī)模化到商業(yè)水平。在一個一般方面，提供了用于從混合物中捕獲目的顆粒的方法，其包括使用吸附劑膨脹床。在一個實施方式中，所述方法包括步驟:(a)提供吸附劑的膨脹床；(b)將混合物與吸附劑相接觸，使混合物的成分與吸附劑的膨脹床接觸并相互作用；(C)可選地，洗滌吸附劑；以及(d)可選地，從吸附劑中洗脫目的顆粒。在一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒是目的生物學顆粒。在一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒包含至少一種蛋白質。在一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒包含至少兩種蛋白質，其中至少一種是目的蛋白質。在一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒是病毒樣顆粒。在本發(fā)明的第一個方面，提供了用于從混合物中捕獲病毒樣顆粒的方法，其包括使用吸附劑膨脹床，合適地，其中所述方法包括步驟:(a)提供吸附劑的膨脹床；(b)將混合物與吸附劑相接觸，使混合物中的病毒樣顆粒與吸附劑結合；(C)可選地，洗滌吸附劑；以及(d)可選地，從吸附劑中洗脫目的顆粒。在所述第一方面的一個實施方式中，本發(fā)明進一步涉及根據(jù)前述實施方式或上述實施方式的組合的方法，其中所述病毒樣顆粒包含流感病毒的蛋白質，特別是血凝素；合適地，其為選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 的血凝素亞型或其中兩種或 更多種的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述更實施方式的組合中，吸附劑包含在柱子當中。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物為植物，或來源于植物。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述植物是天然發(fā)生的植物、突變體植物、非天然發(fā)生的植物或轉基因植物。在一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物為植物葉子，或來源于植物葉子。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，在與吸附劑接觸之前通過對植物材料均質化而產生所述混合物。因此，根據(jù)所述實施方式，混合物為均質化的植物材料。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述植物為植物細胞——如生長于培養(yǎng)物中或在植物之外生長的植物細胞，如體外生長的植物細胞或細胞團塊——如胡蘿卜細胞。在本發(fā)明第一個方面的一個實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)前述任何實施方式或前述實施方式組合的方法，其中混合物包含破裂的植物細胞；合適地，其中植物為浸潤了在植物中瞬時表達特定蛋白質的核酸分子的煙草植物，所述蛋白質存在于病毒樣顆粒中；更合適地，其中混合物為植物的地上部分，或來源于植物的地上部分。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，吸附劑包含多個的珠子。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，珠子為包含惰性內核材料的復合珠子。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，珠子包含選自塑料、甲基丙烯酸酯、陰離子交換劑、二乙氨基乙基、陽離子交換劑、多糖、硅石、聚(苯乙烯-二乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷及其衍生物的材料或其中兩種或更多種的組合，或由其構成，或基本上由其構成。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，珠子包含多糖；合適地為纖維素、瓊脂糖、右旋糖或其衍生物，或前述的兩種或更多種的組合，或由其構成，或基本上由其構成。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，惰性內核材料包含選自以下的材料，或由所述材料構成，或基本上由所述材料構成:石英，娃石，Nd-Fe-B合金，不銹鋼，鋯氧化物，氧化鋯，金屬硅酸鹽，金屬硼硅酸鹽，陶瓷包括二硼化鈦，碳化鈦，二硼化鋯，碳化鋯，碳化鎢，碳化硅，氮化鋁，氮化硅，氮化鈦，氧化釔，硅的金屬粉末，以及二娃化鑰；金屬氧化物和硫化物，包括鎂，招，鈦，銀，鉻，錯，鉿，猛，鐵，鈷，鎳，銅和銀的氧化物；非金屬氧化物；金屬鹽，包括硫酸鋇；金屬元素，包括鎢，鋯，鈦，鉿，釩，鉻，錳，鐵，鈷，鎳，銦，銅，銀，金，鈀，鉬，釕，鋨，銠和銥，以及金屬元素的合金，如所述金屬元素之間形成的合金及其衍生物的材料，或其中兩種或更多種的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，珠子的大小為大約5 μ m-500 μ m或更大。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，結合目的顆粒的珠子大小為大約25 μ m-100 μ m,合適地,為大約50 μ m。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，結合目的顆粒之外的材料例如植物材料的珠子大小為大約125 μ m-250 μ m,合適地，為大約150 μ m0在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述方法包括預捕獲階段(其包括使用另外的吸附劑的膨脹床)。合適地，該第一吸附劑膨脹床包含的珠子大小范圍為大約12 5 μ m-250 μ m ;更合適地，為大約150 μ m。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，吸附劑包含配體。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，配體包含選自以下的配體，或由所述配體構成，或基本上由所述配體構成:(i)芐胺或其衍生物；(ii)烷基胺或其衍生物；(iii)烯基胺或其衍生物；(iv)炔基胺或其衍生物，(V)烷氧基胺或其衍生物；以及(vi)單環(huán)或雙環(huán)芳族或雜芳族成分的胺類，或其衍生物，或者其中兩種或更多種的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，配體包含陰離子交換樹脂，由陰離子交換樹脂構成，或基本上由其構成。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，陰離子交換樹脂包含二乙氨基乙基纖維素基的離子交換樹脂，合適地為二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂，或由所述樹脂構成，或基本上由其構成，或為所述樹脂。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物在與吸附劑接觸前的電導率為大約lmS/cm-10mS/cm,合適地,為2mS/cm-3mS/cm。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物在與吸附劑接觸前的pH為大約pH6.0-pH8.0。
在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，將混合物以大約lcm/min-15cm/min的范圍內的線性流速加樣到柱上以結合目的顆粒。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，吸附劑的密度范圍為大約lg/ml-20g/ml.
在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，膨脹床的膨脹度程度的范圍為大約1-5。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述方法在使混合物接觸吸附劑前包括預捕獲步驟。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，預捕獲步驟選自過濾、微濾、離心、傾析和沉積，或其中兩種或更多種的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，預捕獲步驟包括(i)將材料與離子交換樹脂接觸；或(ii)對材料進行酸沉淀及過濾。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，以靜態(tài)結合或批式孵育的形式將這些材料與離子交換樹脂接觸。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，會對步驟(d)中獲得的洗脫液或其一個或多個積分進行進一步的處理步驟。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述其他處理步驟選自純化、過濾、微濾、離心、傾析和沉積，或其中兩種或更多種的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒包含目的蛋白質。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的蛋白質為抗原。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的蛋白質為血凝素。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述血凝素為選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 的血凝
素亞型，或其中兩種或更多種亞型的組合。在包括所述第一方面的實施方式的一個實施方式或上述實施方式的組合中，膨脹床在洗脫步驟中的膨脹率為大約0.5-5。在第二方面，提供了用于從混合物中捕獲目的顆粒的方法，其包括步驟:(i)提供吸附劑的膨脹床，其在柱內包含配體，靜止床高大于10cm，其中吸附劑的密度為大約Ig/ml-20g/ml，其中膨脹床的膨脹度為大約1_5，且其中平均吸附劑顆粒大小為大約5 μ m_大約500μπι;( )在大約ρΗ6.0-8.0范圍內的pH下平衡樹脂材料；(iii)提供包含目的顆粒的混合物，其中所述混合物具有的電導率為大約lmS/cm-10mS/cm; (iv)以大約lcm/min-15cm/min范圍內的流速(例如線性流速)將混合物加樣到柱上以結合目的顆粒；(V)使用pH為大約pH6.0-8.0范圍內的緩沖液洗滌加樣后的柱子；以及(vi)從柱子上將結合的目的顆粒洗脫于一個或多個部分。在所述第二 方面的一個實施方式中，目的顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或膜影樣顆粒。
在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物為植物，或來源于植物。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述植物為天然發(fā)生的植物、突變體植物、非天然發(fā)生的植物或轉基因植物。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，混合物為植物的葉子，或來源于植物葉子。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的顆粒包含目的蛋白質。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的蛋白質為抗原。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，目的蛋白質為血凝素。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，所述血凝素為選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 的血凝素亞型，或其
中兩種或更多種亞型的組合。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，結合目的顆粒的珠子大小為大約25 μ m-100 μ m ;合適地,為大約50 μ m。在所述第二方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，結合目的顆粒之外的材料例如植物材料的珠子大小為大約125 μ m-250 μ m ;合適地，為大約150 μ m。在所述第二方面的一個實施方式或在所述第二方面的上述實施方式的組合中，提供了從混合物中捕獲病毒樣顆粒的方法，其包括以下步驟:(i)提供吸附劑的膨脹床，其在柱子中包含二乙氨基乙基纖維素葡聚糖，其中吸附劑的密度為2.5g/ml-3.5g/ml，且其中吸附劑顆粒的平均大小為大約50;(ii)在大約pH6.0-8.0范圍內的pH下平衡樹脂材料；(iii)提供包含煙草植物材料的混合物，其中所述混合物具有的電導率為大約2mS/cm_3mS/cm;(iv)以大約2.5cm/min的流速將混合物加樣到柱上以結合病毒樣顆粒，其中膨脹床的柱子膨脹度為大約2;(V)使用pH為大約pH6.0-8.0范圍內的緩沖液洗滌加樣后的柱子；以及(vi)從柱子上將結合的目的顆粒洗脫于一個或多個級分。在一個實施方式中，所述第二方面的前述實施方式或上述實施方式的組合的方法包括步驟(iii)，其包括(a)提供瞬時表達蛋白質的完整的煙草植物，所述蛋白質存在于病毒樣顆粒中；(b)破壞煙草植物的葉子和莖以生產煙草植物材料；以及(c)用緩沖液或去離子水進行稀釋，以調整混合物的pH和電導率。在一個實施方式中，所述第二方面的前述實施方式或上述實施方式的組合的方法在步驟(iv)之前包括的步驟包括過濾步驟(iii)的混合物以及使經(jīng)過過濾的步驟(iii)的混合物與含有聚乙烯亞胺的吸附劑的第一膨脹床相接觸以從混合物中移除不期望的物質，其中珠子的大小為大約150 μ m。在第三個進一步的方面，提供 了吸附劑的膨脹床，其中吸附劑包含與其可逆結合的目的顆粒。
在所述第三方面的一個實施方式中，所述吸附劑包含多個珠子。在所述第三方面的一個實施方式或上述實施方式的組合中，結合目的顆粒的珠子大小為大約25 μ m-100 μ m ;合適地,為大約50 μ m。
在第四個進一步的方面，提供了吸附劑膨的脹床用于從混合物中捕獲目的顆粒，特別是捕獲目的病毒樣顆粒，所述混合物特別是來源于瞬時表達特定蛋白質的植物的混合物，所述蛋白質存在于病毒樣顆粒之中。在所述第四方面的一個實施方式中，顆粒為病毒樣顆粒(VLP)或膜影樣顆粒。第五方面涉及包含目的顆粒的吸附劑的膨脹床；合適地，所述顆粒為可逆地與其結合的目的病毒樣顆粒，特別是其中吸附劑為膨脹床色譜形式。第六方面涉及使用膨脹床色譜用于從混合物中捕獲目的顆粒；合適地，所述顆粒為病毒樣顆粒。上文描述的關于本發(fā)明的一般方面及第一方面的(多種)實施方式及實施方式的組合至少還可形成本發(fā)明的第二、第三、第四、第五和第六方面。定義在本申請范圍內使用的技術術語和表達一般被給予了植物和分子生物學相關技術中通常對其應用的意義。以下術語定義適用于本申請的全部內容。詞語“包含”不排除其他元素或步驟，不定冠詞“一”或“一個”不排除復數(shù)形式。單個步驟可以滿足權利要求中提出的數(shù)種特征的功能。術語“基本上”、“大約”、“近似”，諸如此類，在關系到屬性或值時具體而言分別精確限定了屬性或精確限定了值。術語“大約”在給定數(shù)量值或數(shù)量范圍的情況下指代所述給定值或范圍的20%之內、10%之內或5%之內的值或范圍。術語“百萬分率”或“ppm”在本文交換使用用于指代對所純化的目的分子或目的蛋白質的純度的度量。單位ppm指代每毫克/毫升的目的蛋白質中宿主蛋白質的ng/毫升的量，其中當?shù)鞍踪|在溶液中時，宿主蛋白質ppm=(宿主蛋白質ng/ml)/(目的蛋白質mg/ml)]。當?shù)鞍踪|為干燥形式時，如是凍干形式，ppm指代(宿主蛋白質ng)/(目的蛋白質mg)。術語“膨脹床”涉及這樣的實施方式，其中色譜過程是以大小范圍、密度范圍或這兩個范圍進行分類的(分層的)的吸附劑的床進行操作的，其由直接導向的液體流進行穩(wěn)定的流化；合適地，為向上的液體流，這樣吸附劑的軸向混合達到最小，并允許液體中的液體和固體組分都能與吸附劑相接觸，同時遷移穿過床。合適地，液體以近似塞狀流的條件下遷移穿過床?！拔絼敝复魏文軌蛲ㄟ^分子間作用力將目的顆粒吸附至其表面的物質。通常目的顆粒對吸附劑的結合是可逆的，這樣可在需要的時間將其從吸附劑上洗脫。如本文所使用的，術語“目的顆?！敝复枰獜幕旌衔镏胁东@的分子實體。在特定實施方式中，目的顆粒包含一種或多種或兩種蛋白質。在其他實施方式中，目的顆粒包含一種或多種或者兩種或更多種蛋白質(例如多個蛋白質)，其中至少一種為目的蛋白質。在一個實施方式中，要捕獲的顆粒是包含多個生物來源的大分子的顆粒，并因此是目的生物學顆粒。在另一個實施方式中，要捕獲的顆粒為病毒樣顆粒。在另一個實施方式中，要捕獲的顆粒為細菌膜影顆粒。如本文所使用的“所捕獲的目的顆粒”指代目的顆粒的制備物，其中制備物重量的至少大約 10%、20%、30%、40%、50%、55%60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%為所需的目的顆粒。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法捕獲了混合物中起始存在的目的顆?？偭康闹辽?0%，包括目的顆粒的至少60%、70%、80%or90%?？赡苓_到甚至更高的捕獲率——如至少92.5%、95%、96%、97%、98%或至少99%。術語“純化的目的顆?！敝复康念w粒的制備物，其中制備物重量的至少大約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%是所需要的目的顆粒，剩下的重量被污染性雜質或污染物所占據(jù)，特別是可以與純化的目的顆粒一同純化其他蛋白質、核酸、脂質或碳水化合物或其組合——如來源于宿主細胞的那些。在一個實施方式中，所捕獲或純化的目的顆?；旧喜缓廴拘源蠓肿?溶劑除外)。本文描述的顆?？赏ㄟ^本領域已知的多種方法進行鑒定——如電微分遷移率分析(ES-DMA)，非對稱流場流分級法用多角度光散射檢測(AFFFF-MALS)和透射電子顯微鏡(TEM)。在一個實施方式中，目的顆粒的直徑測量值低于大約 1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04
或 0.03 μ m-如直徑為 1.0-0.03,0.8-0.03,0.6-0.03,0.4-0.03,0.2-0.03,0.1-0.03、
0.08_0.03、0.06_0.03、0.05_0.03 或 0.04_0.03 u m。如本文所使用的，術語“病毒樣顆?！?VLP)、"多種病毒樣顆?！?(VLP)或目的VLP指代通過自裝配形成的 分子實體，其包含多個蛋白質，其中包括至少一種目的蛋白質，且其在至少一個屬性上與病毒是類似的。值得注意的是，不像病毒顆粒或病毒粒子，VLP缺少病毒的基因組核酸。VLP可具有多樣化的多類型的大小分布，其中大小的分布可受到生產過程變化的影響。例如,植物中產生的VLP的大小分布可能與不同宿主中產生的VLP的大小分布有不同。在一些實施方式中，VLP(例如從植物材料中捕獲的VLP)的平均直徑可為35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm或75nm。在一些實施方式中，使用本發(fā)明的方法(例如從植物材料中)捕獲的VLP的直徑范圍為35nm-75nm ;合適地，為35nm_70nm ;更合適地，為35nm_65nm ;甚至更合適地，為35nm-60nm ;特別合適地，為35nm_55nm ;甚至更特別合適地，為35nm_50nm ;進一步更合適地，為35nm_45nm ;最合適地，為35nm_40nm。如本文所使用的，“混合物”包含目的顆粒連同一種或多種不想要的材料，如雜質或污染物。術語“雜質”和“污染物”交換使用，意指目的蛋白質之外的任何材料，不論其是否來自宿主生物體，只要是需要將其從包含目的顆粒的組合物中移除的。所述混合物可直接從生產目的顆粒的宿主生物體或宿主細胞中獲得。不意欲產生限制，可根據(jù)本發(fā)明的方法處理的混合物的實例包括進料、破裂的宿主細胞材料、宿主組織均質物、宿主組織裂解物、宿主組織提取物、發(fā)酵液以及宿主細胞培養(yǎng)物上清。雜質可包括但不限于任何生物學大分子如目的蛋白質之外的蛋白質，目的顆粒之外的顆粒、核算(例如DNA和RNA)、脂質、多糖(例如，淀粉、纖維素)、木素，酚醛樹脂、碳水化合物和色素?！敖?jīng)調整的混合物”是為本發(fā)明的方法所使用的色譜步驟制備的混合物，是通過對混合物與進行緩沖液交換、稀釋、鹽類添加、PH滴定中的一種或多種過程，或前述過程的組合以分別設定pH、電導率范圍、緩沖液條件或其組合而制備的，以達到所需的色譜效果。“經(jīng)調整的混合物”可為進料，并可用于標準化色譜柱的加樣條件。術語“目的蛋白質”在本文與術語“靶標蛋白質”交換使用，其指代存在于目的顆粒中并可作為未裝配蛋白質、多聚形式的蛋白質或部分裝配顆粒與目的顆粒一同捕獲的一種或多種重組生產的蛋白質。術語“宿主蛋白質”指代來源于生產包含靶標蛋白質的(多種)目的顆粒宿主細胞的任何蛋白質，并包括從宿主基因組表達的任何蛋白質或重組表達的蛋白質，其不是目的顆粒的成分。在包含至少目的顆粒或目的蛋白質的混合物中存在的宿主蛋白質的量提供了對純化度的量度。通常，蛋白質混合物中宿主蛋白質的量以混合物中目的顆粒量或目的蛋白質的量的百萬分率表示。 術語“捕獲”及其語法變化體在本文交換使用，意指從混合物中對目的顆粒的保留或收集，產生比混合物中濃度更高的目的顆粒的濃度。從混合物中對目的顆粒的捕獲可能是不完全的。所捕獲的目的顆?？蔀榛旌衔镏锌偰康念w粒的一部分，例如但不限于，為其中的大約 2%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80% 或 90% 或更多。使用術語“純化”和“分離”及其語法變化體，意指完全或部分地從混合物中分開或移除至少一種雜質，由此提高組合物中目的顆粒純度水平。可對目的蛋白質進行純化以得到這樣的組合物，其含有低于IOOppm宿主蛋白質，合適地含有低于90ppm、低于80ppm、低于70ppm、低于60ppm、低于50ppm、低于40ppm、低于30ppm、低于20ppm、低于IOppm或低于5ppm宿主蛋白質，通常由ELISA確定?！芭潴w”可用于捕獲特異性與其結合的一種或多種目的顆?；蚰康牡鞍踪|。合適地，生物學特異性配體共價連接于吸附劑或形成色譜系統(tǒng)的固定相的固態(tài)支持物并接近流動相中存在的目的顆粒或目的蛋白質。目的顆?；蚰康牡鞍踪|在色譜步驟中都保持對所述配體的特異性結合親和力，而混合物中的其他溶質和蛋白質最好不會特異性結合于配體。目的顆粒或目的蛋白質對固定相中配體的結合使得流動相中的污染物或雜質能通過膨脹床，而目的顆粒或目的蛋白質保持與配體特異性結合。特異性結合的目的顆?；虻鞍踪|可從配體上洗脫。例如，這可使用低pH、高pH、低鹽、競爭配體等等，或甚至使用其中一種或多種的組合而達到，使用洗脫緩沖液通過膨脹床。術語“特異性結合”及“結合特異性”描述了目的顆?；蚰康牡鞍踪|與配體之間的普遍特異性及可逆的相互作用。配體可具有可化學修飾的基團，使其能夠連接于吸附劑或固態(tài)支持物而不破壞其結 合活性。配體在自由溶液中對目的顆?；虻鞍踪|的親和力范圍通常為 10E+4-10E+8M。術語“植物”指代處于其生命周期或發(fā)育過程的任何階段的任何植物及其子代。所述植物可以為天然發(fā)生的、突變的、非天然發(fā)生的或轉基因植物?？梢杂镁幋a蛋白質的核酸分子對植物進行浸潤，并在浸潤的植物中表達所述蛋白質。這種浸潤的植物并不是轉基因植物，因為不需要將核酸分子插入植物基因組并傳遞到子代。術語“植物細胞”指代植物的結構和生理學單位。植物細胞可為無細胞壁的原生質體、分離的單細胞、培養(yǎng)的細胞、兩個或多個細胞的團塊的形式，或為更高組織單位的一部分，所述更高組織單位為例如但不限于，植物組織、植物器官或完整的植物。術語“植物材料”指代獲自或可獲自植物的任何固體或液體組合物或其組合，包夜葉子、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、扦插物、分泌物、提取物、細胞或組織培養(yǎng)物或植物的任何其他部分或產物。在一個實施方式中，植物材料為葉子或來源于葉子一如綠色葉子。如果在本文中提供范圍，在該范圍低側和高側的最大數(shù)值表示包括在該范圍內。例如，如果提供了大約125 μ m-250 μ m的范圍，則該范圍表示分別包括最大數(shù)值125 μ m和250 μ m0發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于通過膨脹床吸附從混合物中捕獲目的顆粒的方法。目的顆粒包含一種或多種目的蛋白質，其中一種或多種可由宿主細胞重組生產。膨脹床吸附(EBA)是一種組合固體-液體分離和產物純化的單元操作。該過程是以不同大小、密度或二者都不同的吸附劑的床進行操作的，以向上的液體流使床膨脹。在多種實施方式中，柱子被設計成能避免湍流和過度的液體混合，尤其是沿著柱子軸向的返混，而單個的珠子保持在非固定的動態(tài)狀態(tài)，僅僅在柱子內的局部區(qū)域做狹窄的運動。膨脹床在柱子底部部分中可具有小的混合區(qū)域，其中進入的液體分布于柱子的整個橫截面上；合適地，膨脹床通常在塞狀流條件下進行操作。該過程使得進料中的液體和固體組分都能與吸附劑接觸并相互作用，這樣使得柱子中能進行多階段的色譜分離過程。床的膨脹使得進料中的固體顆粒差異性地流穿床，由此提供了澄清的功能。在傳統(tǒng)的填充床色譜方法中，樹脂被限制在柱子底部和流量調適器之間，當緊密堆積的樹脂周圍顆粒狀物質和細胞碎片不能流動時會發(fā)生結塊。相反，EBA中的液體流是從下進入的，調適器是維持在遠離堆積樹脂的層面的，這樣給吸附劑一定空間膨脹，并由此在其之間創(chuàng)造出空間。床的膨脹度受到混合物流速、混合物粘度以及吸附劑密度的影響。在將吸附劑堆積在柱子中時，其緊密地挨在一起，沒有留給大的聚集物和團塊太多活動空間。因為緩沖液是從下面注射的，當吸附劑的沉積速率與向上的液體流動速率相等時，吸附劑就就會流體化，并形成穩(wěn)定的濃度梯度。有多種可用規(guī)格的EBA，其中有些在柱子的基底包含過濾裝置，而有些則不含。在一個實施方式中，柱子在柱子基底不包含過濾裝置。床可存在于合適的容器中一如柱子中。在本文的上下文中，術語“柱子”涉及任何種類的容器，其配有至少一個用于混合物進入柱子的入口以及至少一個用于隨后從混合物中洗脫目的顆?；蚰康牡鞍踪|的出口。在一個實施方式中，容器是柱狀的。通常，膨脹床吸附柱是在塞狀流的條件下運行的，吸附劑床中的返混和湍流達到最小。根據(jù)本發(fā)明，混合物被弓I入包含吸附劑的膨脹床柱中，其中混合物的成分與柱中吸附劑接觸并相互作用。本領域技術人員能夠根據(jù)混合物的輸入體積設計具有特定直徑和高度的柱子。在將混合物引入柱子時，固體粒子和細胞碎片在吸附劑周圍自由移動，最終穿過柱子上部離開。與任何色譜步驟相同，通常會對吸附劑進行高強度的洗滌以限制非特異性相互作用。同時，目的顆粒和目的蛋白質會與吸附劑相互作用，結合于吸附劑，并滯留在柱子當中。然后，使柱子堆積，流 向逆轉，按傳統(tǒng)方法將目的顆粒從珠子上洗脫下來。一個進一步的方面涉及這樣的吸附劑膨脹床，其包含可逆結合于其上的目的顆粒。合適地，吸附劑具有一種或多種本文描述的吸附劑特性。一個其他的方面涉及用于從混合物中捕獲目的顆粒的膨脹床吸附劑用途或EBA色譜的用途。用于從混合物中捕獲目的顆粒的過程基于的是對可用于EBA中的任何形狀和規(guī)格的任何類型的固相材料的吸附。進一步地，所述的吸附的特征在于使用了所選擇的吸附劑的特征、配體化學或其組合，其能夠使得基本上僅有目的顆粒進行特異性結合及隨后的洗脫，或備選地，其能夠使得一些生物分子物質進行一組特異性結合，隨后從吸附劑上對目的顆粒進行選擇性、連續(xù)性的洗脫。在多種實施方式中，吸附劑是珠子的形式。這些珠子可以在大小、密度、重量或其組合上是一致的，或其可在大小、密度、重量或其組合上是多樣的。一個實施方式涉及大小一致但具有多樣的密度或重量，或密度重量二者的珠子。這種安排可使珠子進行分布。珠子大小通常在5 μ m-500 μ m的范圍內。珠子的合適大小可為直徑在大約5 μ m-500 μ m的范圍內，如大約 5 μ m-400 μ m、或大約 5 μ m-300 μ m、或大約 5 μ m-200 μ m、大約 5 μ m-100 μ m、大約 50 μ m-400 μ m、或大約 50 μ m-300 μ m、或大約 50 μ m-200 μ m、或大約 50 μ m-150 μ m 或
50 μ m-100 μ m-如大約20 μ m-80 μ m、大約150 μ m、大約100 μ m、或大約50 μ m。按珠子
體積計，至少大約70%、大約80%、大約90%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%或100%的單個珠子可具有所述體積。較大的珠子聚集于流化床的較低部分，而較小的珠子會聚集在較高的部分。如果珠子太小，會以近似于顆粒污染物逃逸的速率發(fā)生膨脹，這會降低捕獲效率。類似地，如果珠子太大，流化作用要求更高的流動速率，蛋白質結合會受到妨害，因為珠子之間會有不恰當?shù)臄U散情況。珠子的形式可以為任何形狀，例如但不限于基本上是球形、長形、圓柱狀、柱狀或不規(guī)則形式。在一個實施方式中，珠子是球形的。本領域技術人員可根據(jù)要使用的過程選擇合適的珠子大小、形狀和多孔性。在另一個實施方式中，捕獲目的顆粒的珠子的大小為大約25μπι-125μπι;合適地，為大約25 μ m-100 μ m ;更合適地，為大約25 μ m-95 μ m ;更合適地，為大約25 μ m-90 μ m ；更合適地，為大約30ν-90 μ m ;更合適地，為大約30 μ m_85 μ m ;更合適地，為大約35 μ m-85 μ m ;更合適地，為大約35 μ m-80 μ m ;更合適地，為大約40 μ m-80 μ m ;更合適地，為大約40 μ m-75 μ m ；更合適地，為大約45 μ m_75 μ m ;更合適地，為大約45 μ m_70 μ m ；更合適地，為大約40 μ m-70 μ m ;更合適地，為大約40 μ m_65 μ m ;更合適地，為大約45 μ m-65 μ m ;更合適地，為大約45 μ m-60 μ m ;更合適地，為大約45 μ m_55 μ m ;最合適地，為大約50 μ m。在另一個實施方式中，捕獲目的顆粒之外的材料(例如植物材料)的珠子大小為大約130 μ m-250 μ m ;合適地，為大約135 μ m_250 μ m ;更合適地，為大約135μπι-225μπι ;更合適地，為大約135 μ m-200 μ m ;更合適地，為大約135 μ m-175 μ m ;更合適地，為大約135 μ m-170 μ m ；更合適地，為大約140 μ m-170 μ m ；更合適地，為大約140 μ m-165 μ m ；更合適地，為大約140 μ m-160 μ m ;更合適地，為大約145 μ m-160 μ m ;更合適地，為大約145 μ m-145 μ m ;最合適地,為大約150 μ m。合適地,這些珠子可用于使用膨脹床吸附劑的捕獲前步驟中。

在另一個實施方式中，吸附劑顆粒的密度可在大約lg/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約2g/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約3g/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約4g/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約5g/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約6g/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約7g/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約8g/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約9g/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約IOg/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約llg/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約12g/ml-20g/ml的范圍內，更合適地在大約13g/ml_20g/ml的范圍內；更合適地在大約14g/ml-20g/ml的范圍內；更合適地在大約14g/ml_19g/ml的范圍內；更合適地在大約14g/ml-18g/ml的范圍內，更合適地在大約14g/ml_17g/ml的范圍內；更合適地在大約15g/ml-17g/ml的范圍內；最合適地為16g/ml。本發(fā)明使用的吸附劑，并不限于任何具體的材料，本領域一般技術人員會能夠選擇適當?shù)牟牧?。這些方法可使用不同珠子的新型組合或在相同珠子上使用各種功能基團或配體的新型組合。珠子可以為非常多孔的、大孔的、微孔的、無孔的、親水的、疏水的、高度帶電的、微電的、無電的、剛性的或可膨脹的，但不限于此。珠子可以為塑料、甲基丙烯酸酯，多糖(如瓊脂糖，纖維素)，氧化硅(例如，可控孔度玻璃)，聚(苯乙烯-二乙烯苯)、聚丙烯酰胺，陶瓷珠，以及其的任何衍生物，不限于此。進一步的例子包括，結合能力高、結合能力低的強陰離子交換劑(如Q)、弱陰離子交換珠(例如，二乙基氨基乙基(DEAE)，ANX)，強陽離子交換材料(例如，SP)，或弱陽離子交換材料(例如，CM)。為減少向上的流動中進料中吸附劑和粒子的速率之間的差異，可使用許多不同的吸附劑材料。為處理高粘性的進料或達到高的流速，需要的是增加珠子的大小、密度或增加二者。在本發(fā)明的多種實施方式中，密度的增加可通過使用高密度多孔材料或通過為高密度無孔材料包被有空材料而完成。僅僅由有機材料制造的珠子密度有限，出于常規(guī)色譜考慮，如考慮到高的沉積速率，其需要有非常大的直徑。這樣的大的珠子直徑產生長的擴散途徑長度，這引起了顯著的傳質阻力，對生產起到反作用。本發(fā)明包括復合珠子的應用，其包含比有機材料更致密的惰性內核材料。在本文的上下文中，術語“內核”涉及存在于珠子內部的無孔內核。內核不限于位于珠子中心。這些珠子的益處為具有高的密度和適合本發(fā)明方法的珠子大小。所述材料的密度范圍為大約1.2-大約4.0，例如，石英(1.2)，硅石(1.4 1.6)、Nd-Fe-B系合金(1.8-2.1)、不銹鋼、鎢碳化物(2.5-3.5)、鋯氧化物(3.2)或氧化鋯(3.85)。可用于包被內核的多孔材料包括但不限于，瓊脂糖、陶瓷羥基磷灰石、纖維素、氧化鋯凝膠、硅膠、和羥乙基甲基丙烯酸酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯共聚物。合適的無孔內核材料的其他實例為無機化合物、金屬、重金屬、非金屬元素、金屬氧化物、非金屬氧化物、金屬鹽和金屬合金。這種內核材料的實例為金屬硅酸鹽、金屬硼硅酸鹽；陶瓷包括二硼化鈦、碳化鈦、二硼化鋯、碳化鋯、碳化鎢、碳化硅、氮化鋁、氮化硅、氮化鈦、氧化釔、硅的金屬粉末、和二硅化鑰；金屬氧化物和硫化物、包括鎂、鋁、鈦、釩、鉻、鋯、鉿、錳、鐵、鈷、鎳、銅和銀的氧化物；非金屬氧化物；金屬鹽，包括硫酸鋇；金屬元素、包括鎢、鋯、鈦、鉿、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銦、銅、銀、金、鈀、鉬、釕、鋨、銠、銥和金屬元素的合金、如所述金屬元素之間形成的合金，例如不銹鋼；晶體和無定形形式的碳，包括石墨、炭黑和木炭。合適的無孔內核材料為碳化鎢、鎢、鋼和鈦珠-如不銹鋼珠。無孔內核通常至多構成了吸附劑顆粒總體積的70%、例如至多60%、合適地至多50%、合適地至多40%、合適地至多30%、合適地至多20%、合適地至多15%、合適地至多10%、合適地為至多5%。通常用作吸附劑的材料為瓊脂糖，這是一種已經(jīng)證明對工業(yè)規(guī)模的色譜能很好運作的材料。因此，在一個實施方`式中，吸附劑為瓊脂糖或瓊脂糖基的。(優(yōu)選地高度交聯(lián)的)瓊脂糖基質的大孔結構將對大分子如蛋白質的良好結合能力與高的化學和機械穩(wěn)定性相組合。在另一個實施方式中，吸附劑是葡聚糖或葡聚糖基的。高的機械穩(wěn)定性是是基質的一項重要特性，用于減少珠子自由移動時的摩擦效應。因為對膨脹床方法的設計有不同于柱色譜的考慮，所以瓊脂糖珠可比標準珠子更小或更大，或交聯(lián)的量有差異。床材料中的所有結構材料都包括這些變化或不包括任何變化。修飾的瓊脂糖基質可能脆性低于無機材料如一些玻璃或陶瓷材料。本發(fā)明包括珠子在柱內的多分散性。珠子的大小和密度梯度將珠子定位在珠子或床的特定位置。較小、較輕的珠子移動至一個位置，而較大、較重的珠子移動至不同位置。本發(fā)明還包括其他珠子特征的多分散性或分散性。大小、密度、結合能力、排阻孔大小、支持材料的差異是用于本發(fā)明的多種組分和因素的組合中的幾個。在本發(fā)明的特定實施方式中，吸附劑包含適合用于捕獲目的顆粒的配體。在本發(fā)明特定實施方式中，吸附劑包含適合用于純化目的顆?；蚰康牡鞍踪|的配體?？捎糜诒景l(fā)明的配體包括但不限于:包含以下物質，由以下物質構成或基本上由以下物質構成的配體:(i)芐基胺或其衍生物，( )烷基胺，包括具有如下烷基的烷基胺，所述烷基具有1-12個碳原子的直鏈或支鏈或環(huán)狀結構，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、i^一烷基、十二烷基、環(huán)戊基、環(huán)己基或十氫萘基，可選地，所述烷基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；(iii)烯基胺，包括烯基基團，其包括具有2-12個碳原子的單-，二-或多不飽和的烷基，所述烯基可以是直鏈，支鏈或環(huán)狀的，并且其中的雙鍵可能存在于鏈中或環(huán)上的任何位置，可選地，所述烯基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；(iv)炔基胺，其包括基本上對炔基胺定義的C2_12炔基基團，包括被酸性基團以外的至少一個基團所置換的炔基基團；(V)烷氧基胺，具有C2_12烷氧基基團，可選地，所述烷氧基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；以及(vi)單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基團的胺類，可選地，所述芳族基團或雜芳族基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換。

在一個進一步的實施方式中，能夠捕獲目的顆粒如VLP的配體選自這樣的配體，其包含以下物質，由以下構成，或基本上由其構成:(i)芐基胺或其衍生物，( )烷基胺，包括具有如下烷基的烷基胺，所述烷基具有1-12個碳原子的直鏈或支鏈或環(huán)狀結構，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戍基、己基、庚基、羊基、壬基、十二燒基、環(huán)戊基、環(huán)己基或十氫萘基，可選地，所述烷基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；
(iii)烯基胺，包括烯基基團，其包括具有2-12個碳原子的單-，二-或多不飽和的烷基，所述烯基可以是直鏈，支鏈或環(huán)狀的，并且其中的雙鍵可能存在于鏈中或環(huán)上的任何位置，可選地，所述烯基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；(iv)炔基胺，其包括基本上對炔基胺定義的(:2_12炔基基團，包括被酸性基團以外的至少一個基團所置換的炔基基團；(V)烷氧基胺，具有C2_12烷氧基基團，可選地，所述烷氧基基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換；以及(vi)單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基團的胺類，可選地，所述芳族基團或雜芳族基團被酸性基團以外的至少一個基團所置換，或其組合。在一個進一步的實施方式中，所述配體包含芳族酸類或雜芳族酸類，由芳族酸類或雜芳族酸類構成或基本上由其構成，其中芳族酸類或雜芳族酸類選自羧酸、磺酸、膦酸、硼酸等。合適地，配體選自2-巰基苯甲酸、2-巰基煙酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸和4-氨基苯甲酸、4-羥基苯基-巰基乙酸、4-羥基苯基-巰基丙酸、4-羥基苯基-巰基-丁酸、2，3-二羥基苯甲酸、2，4-二羥基苯甲酸、2，5 二羥基苯甲酸、2，6-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、3，5-二羥基苯甲酸、巰基苯并咪唑磺酸、鄰氨苯磺酸、間氨基苯磺酸、對氨基苯磺酸、4-甲基苯胺-2-磺酸、4-甲氧基苯胺-2-磺酸、苯胺-2，5-二磺酸、N-氨基甲苯磺酸、7-氨基-1-萘酚-3-磺酸、1-萘酚-4-磺酸、2-萘酚-6-磺酸和2-羥基-3-萘甲酸、以及2-巰基苯并咪唑磺酸。在一個進一步其他的實施方式中，所述配體包含芳族或雜芳族基團(根)，由芳族或雜芳族基團(根)構成或基本上由芳族或雜芳族基團(根)構成，所述芳族或雜芳族基團(根)選自i)配體、其包含以下類型的功能基團:苯甲酸，如2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-巰基苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、2-氨基-5-氯苯甲酸、2-氨基-4-氯苯甲酸、4-氨基水楊酸、5-氨基水楊酸、3，4- 二氨基苯甲酸、3，5- 二氨基苯甲酸、5-氨基間苯二甲酸、4-氨基鄰苯甲酸、肉桂酸、如羥基肉桂酸；煙堿酸、如2-巰基煙酸；萘甲酸，如2-羥基-1-萘甲酸；喹啉類，如2-巰基喹啉；四氮唑乙酸、如5-巰基-1-四氮唑乙酸、例如2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑；苯并咪唑如2-氨基苯并咪唑、2-巰基苯并咪唑和2-巰基-5-氮苯并咪唑；硝基苯并噻唑如2-氨基苯并噻唑、2-氨基-6-硝基苯并噻唑、2-巰基苯并噻唑和2-巰基-6-乙氧基苯并噻唑；苯唑酮、如2-巰基苯唑酮；苯硫酹、如苯硫酹和2-氨基苯硫酚；2- (4-氨基苯硫基)乙酸；芳族或雜芳族磺酸和膦酸、如1-氨基-2-萘酚-4-磺酸和酚類、如2-氨基-4-硝基苯酚、ii)配體，其包含2-羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸和4-羥基肉桂酸；iii)配體，其包含羧酸和作為取代基的氨基基團，如2-氨基煙酸、2-巰基煙酸、6-氨基煙酸和2-氨基-4-羥基嘧啶羧酸；iv)配體，其包含由苯環(huán)與雜芳環(huán)體系融合衍生的基團，例如，選自以下物質的配體:苯并咪唑、如2-巰基苯并咪唑以及2-巰基-5-硝基-苯并咪唑；苯并噻唑、如2-氨基-6-硝基苯并、2-巰基苯并噻唑以及2-巰基-6-乙氧基苯并噻唑；苯唑酮如2-巰基苯唑酮；以及V)選自苯硫酹的配體如苯硫酹和2-氨基苯硫酹。配體可具有對目的顆?；蚰康牡鞍踪|的親和力。因此，配體能夠發(fā)生高度特異的生物學相互作用，如抗原和抗體之間、酶和底物之間或受體和受體配體之間可能發(fā)生的那些相互作用。因此，配體可以為抗體、抗原、酶、酶底物、受體、受體配體或適配子，等等。在一個實施方式中，配體為抗體。生物學配體可單獨使用或與本文描述的一種或多種化學配體組合使用。所述生物學配體可包含一種或多種相同或不同的配體，可選地，可與本文描述的一種或多種化學配體相組合。通常將包含配體的吸附劑平衡到目的顆粒結合發(fā)生的最佳pH條件。平衡過程通常是通過使用PH值在大約3-10的范圍內的的緩沖液進行的，如pH范圍為大約5-7，合適地，為PH7。包含配體的珠子通常包含多個的配體。在一個特定實施方式中，珠子包含如上文描述的配體，并組合有第二種類型的配體，其中根據(jù)本發(fā)明的配體存在量為總配體量的至少大約30%,合適地,為至少大約50%,更合適地，為至少大約70%，最合適地，為至少大約90%。這樣的組合配體分離基 質可設計為用于特定情況，其中其他相互作用的元素提高了其分離特性。第二種配體種類可包含一個或多個帶電基團，如陽離子交換劑，其被用于通過電荷排斥洗脫化合物；疏水基團；能夠形成氫鍵的基團；親和基團等等。因此，還包括的是如本文所描述的能夠結合目的顆粒的不同配體的組合，這些配體可以相同比率或不同比率存在。在多種實施方式中，需要以如下流速運行所述方法，所述流速超過進料中粒子的收尾速率但不超過珠子的收尾速率。在一個實施方式中，膨脹床中線性流速為至少大約2cm/min、至少大約3cm/min、至少大約4cm/min、至少大約5cm/min、至少大約6cm/min、至少大約7cm/min、至少大約8cm/min、至少大約10cm/min、至少大約12cm/min、至少大約15cm/min、至少大約20cm/min、至少大約25cm/min、至少大約30cm/min、至少大約40cm/min或至少大約50cm/min。在另一個實施方式中，線性流速范圍為大約lcm/min-15cm/min,例如大約 2cm/min-10cm/min、或大約 2cm/min-9cm/min、或大約 2cm/min-8cm/min、或大約 3cm/min-8cm/min、或大約3.5cm/min-7.5cm/min。在一個實施方式中，流速為大約3.8cm/min。在另一個實施方式中，流速為大約7.5cm/min.可通過在出口處收集限定的時間段內的液體體積測量流速。在其他實施方式中，膨脹床中進料的輸入可以以至少大約150cm/小時的線性流速進行_如至少大約180cm/小時、至少大約200cm/小時、至少大約210cm/小時、至少大約220cm/小時、至少大約230cm/小時、至少大約240cm/小時、至少大約250cm/小時、至少大約300cm/小時、至少大約400cm/小時、至少大約425cm/小時、至少大約450cm/小時、至少大約475cm/小時、至少大約500cm/小時或至少大約600cm/小時或更多。在另一個實施方式中，膨脹床中進料的輸入可以以至少大約200-500cm/小時的流速進行——例如大約300-500cm/小時、或大約400cm/小時。在一個實施方式中，流速為大約228cm/小時。在另一個實施方式中，流速為大約450cm/小時。床的膨脹度的測量公式為:高度0/高度1，其中高度I是沒有液體流穿柱子時填充床形式中的床高度，高度O是有液體流穿柱子時膨脹床形式中的床高度。在一個實施方式中，膨脹度范圍為1-5，例如，為1-4或1-3或1-2——如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9。對一些實施方式，膨脹度最多為大約1.2。在另一個實施方式中，流速為大約5cm/min，膨脹度為 1-2，例如為 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8 或 1.9，合適地，為 1.2。在另一個實施方式中，流速為大約6cm/min，膨脹度為1_2，例如為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9，合適地，為1.2。在另一個實施方式中，流速為大約7cm/min，膨脹度為
1-2，例如為1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7、1.8或1.9，合適地，為1.2。在另一個實施方式中，流速為大約 8cm/min，膨脹度為 1-2，例如為 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7、1.8 或 1.9，合適地，為1.2。在另一個實施方式中，流速為大約9cm/min，膨脹度為1_2，例如為1.1、1.2、1.3,1.4,1.5,1.6,1.7、1.8或1.9，合適地，為1.2。在另一個實施方式中，流速為大約IOcm/min，膨脹度為 1-2，例 如為 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8 或 1.9，合適地，為 1.2。在另一個實施方式中，流速為大約4cm/min (例如為大約3.8cm/min),膨脹度為1-2,例如為1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8或1.9，合適地，為1.2。在另一個實施方式中，流速為大約 8cm/min (例如為大約 7.8cm/min)，膨脹度為 1-2，例如為 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7,1.8 或 1.9，合適地，為 1.2。偶聯(lián)有配體的膨脹床吸附劑用于從混合物中捕獲目的顆粒的用途可包括首先提供包含一種或多種目的顆粒的混合物的步驟。混合物可具有限定的PH值，或者可調整混合物的PH以獲得所需的pH值。將混合物與膨脹床吸附劑相接觸，可選地，用一種或多種緩沖液進行洗滌。一種或多種目的顆?？赡娴亟Y合于吸附劑，或者其保持未結合的狀態(tài)。然后可用緩沖液洗滌吸附劑，以獲得包含未結合材料的部分。然后，可用至少一種洗脫緩沖液洗滌吸附劑以獲得至少一種洗脫液，其包含一種或多種可逆地結合于吸附劑的目的顆粒。洗滌步驟、洗脫步驟或二者可以用PH值比起始接觸吸附劑的混合物pH高的緩沖液進行。所述(多種)緩沖液可包含一種或多種進一步的化合物——例如一種或多種去垢劑?？梢栽诿總€洗脫步驟之間用緩沖液洗滌吸附劑。洗脫步驟中所獲得的包含未結合材料或目的顆粒，或二者的部分可經(jīng)過本文討論的其他下游處理，包括但不限于，色譜、免疫純化、離心、傾析、沉積過程，等等，或兩種或更多種前述過程的組合。洗脫步驟中床的膨脹度在0.5-5的范圍內，例如，1-4或1-3或1-2，如1.1、1.2、
1.3,1.4,1.5,1.6,1.7、1.8或1.9。對一些實施方式，膨脹度至多為大約1.2。在一個實施方式中，可使用兩種或更多種不同的吸附劑從混合物中捕獲兩種或更多種目的顆粒，其中所述吸附劑中一種或多種，例如其中所有都是膨脹床模式。因此，本發(fā)明包括兩種或更多種、三種或多種、四種或多種或者五種或多種不同吸附劑用于捕獲目的顆粒的用途。在一個其他的方面，本發(fā)明涉及從混合物中捕獲目的顆粒的方法，所述方法包括在目的顆粒與吸附劑結合的條件下將混合物與膨脹床吸附劑相接觸，以及改變條件將目的顆粒從吸附劑上洗脫下來。在一些實施方式中，所述方法捕獲了起始存在于混合物中的目的顆?？偭康闹辽?0%，包括目的顆粒的至少大約60%、70%、80%或90%。甚至可達到更高的捕獲率-如至少92.5%、95%、96%、97%、98%或至少99%?，F(xiàn)在描述本發(fā)明的其他實施方式。在捕獲前，可對包含目的顆粒的宿主細胞進行裂解、均質化、研磨、粉碎、破碎、干燥(例如，冷凍干燥)、擠壓，或對其進行上述兩種或更多種的組合。還可使用其他已知的減少大體積材料的大小、破壞細胞或釋放細胞內容物的方法。如果宿主細胞為植物宿主細胞,則可使用本領域已知方法進行破壞或均質化——例如但不限于，螺旋壓榨機(例如，以大約15Kg/hr-20Kg/hr使用Vincent CP-4螺旋壓榨機,錐體上使用至少45psi的壓力)、銑刀、或煙草加工中常用的一種或多種機器(例如，擠出機)。收集所獲得的提取物，可選地，加以儲存。當綠葉占起始材料中主要成分時，還將其稱為綠汁或綠色提取物。這種提取物不僅包含細胞間空間的內容物(即質外體)，還包含細胞的細胞內內容物。在一個實施方式中，可添加一種或多種化學品或組合物等對提取物進行其他處理。因此，在一個實施方式中，可將偏亞硫酸氫鈉加入提取物中。此步驟是可選的，因為目的顆?？赡軓募毎蟹置诔鰜?。提取物的電導率可使用本領域已知方法測量-如通過使用Condutimeter
Multi350i/set。如果電導率不在所需范圍內，則可在使用前用去離子水稀釋提取物。例如，有觀察到煙草的莖和葉子的均質化產生的植物材料的電導率為大約20mS/cm。在來源于普通煙草(N.Tabacum)和本氏煙草(N.bentamiana)的均質化植物材料中一致觀察到該數(shù)值。根據(jù)一個實施方式，電導率應當在lmS/cm-10mS/cm的范圍內；合適地,為2mS/cm-8mS/cm ;合適地，為 3mS /cm-7mS/cm ;合適地，為 4mS/cm-6mS/cm,例如,為 5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、
5.6、5.7、5.8或5.9mS/cm。根據(jù)另一個實施方式，電導率可以為lmS/cm-5mS/cm的范圍；合適地，為 2mS/cm-3mS/cm，例如為 2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8 或 2.9mS/cm。在另一個實施方式中，提取物的PH為大約pH6.0-8.0，合適地，為大約pH7.0?？扇〉?，可以在捕獲前對進料進行預處理。在其中目的顆粒存在于植物提取物的情況下，有利的是移除一些能在捕獲過程中引起結塊和阻塞的植物來源的大分子。根據(jù)一個實施方式，使用離子交換劑——如聚乙烯亞胺(PEI)離子交換劑以結合不期望的植物來源大分子。此步驟可以以批式孵育的模式施行，合適地，在第一個柱子中進行孵育，可選地，將由其獲得的洗脫材料與第二個包含膨脹的床的柱子相接觸。合適地，用于此捕獲前步驟的離子交換劑具有的平均吸附顆粒尺寸為大約100 μ m-200 μ m ;合適地，為大約150 μ m, pH為大約7。通常，用合適的緩沖液平衡離子交換劑——如0.5M Tris/HCl緩沖液(pH7)，隨后使用IOmM Tris/HCl緩沖液(pH7.0)進行平衡。本發(fā)明包括的其他捕獲前步驟可包括過濾、微濾、離心(例如，低速離心)、傾析或沉積作用，或兩種或更多種這些方法的組合。根據(jù)另一個實施方式，捕獲前步驟包括吸附劑膨脹床的應用。合適地，用于捕獲前步驟的珠子大小為大約130 μ m-250 μ m ;合適地,為大約135 μ m-250 μ m ;更合適地,為大約135μπι-225μπι;更合適地，為大約135 μ m_200 μ m ;更合適地，為大約135μπι-175μπι ;更合適地，為大約135 μ m-170 μ m ;更合適地，為大約140 μ m-170 μ m ;更合適地，為大約140 μ m-165 μ m ;更合適地,為大約140 μ m-160 μ m ;更合適地,為大約145 μ m-160 μ m ;更合適地，為大約145 μ m-145 μ m ;最合適地，為大約150 μ m。合適地,可在使用膨脹床吸附劑的捕獲前步驟中使用這些珠子。因此，本發(fā)明的一個其他方面涉及用于從混合物中捕獲目的顆粒的方法，包括以下步驟:(a)提供第一吸附劑膨脹床；(b)在混合物中不期望的材料結合于第一吸附劑的條件下將混合物與第一吸附劑相接觸；(C)提供第二吸附劑膨脹床；(d)在目的顆粒結合于第二吸附劑的條件下將來自步驟(b)的目的顆粒與第二吸附劑接觸；(e)可選地，洗滌第二吸附劑；(f)可選地，從第二吸附劑中洗脫目的顆粒；以及(g)可選地，重復進行一或多次步驟(a)-(f)。在一個實施方式中，膨脹床模式中使用的吸附劑為陰離子交換樹脂——如二乙氨基乙基纖維素基的離子交換樹脂，合適地為二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹月旨。樹脂通常是用PH為大約pH6.0-8.0的緩沖液平衡的；合適地，所述緩沖液為pH7.0，例如使用0.5M Tris/HCl緩沖液(pH7)，隨后使用IOmM Tris/HCl (ρΗ7.0)。在一個實施方式中，吸附劑的平均吸附劑顆粒大小為大約25 μ m-200 μ m ;合適地，為大約25 μ m_75 μ m ;最合適地，為大約50 μ m。如果該方法是在膨脹床柱子中進行的，那么技術人員會清楚知道可使用多種大小的柱子。在一個實施方式中，柱子直徑為1cm，柱高為大約70cm，床高為大約15cm。本發(fā)明還包括更大的珠子的應用一如可用于工業(yè)規(guī)模的柱子。例如，柱子大小范圍是直徑大約Icm-直徑1500cm——例如多至直徑為大約10cm、多至直徑為大約100cm、多至直徑為大約250cm、多至直徑為大約500cm、多至直徑為大約750cm、多至直徑為大約1000cm、多至直徑為大約1250cm、多至直徑為大約1500cm、多至直徑為大約1750cm或至少多至直徑為大約2000cm。其他直徑包括2cm直徑、IOcm直徑、45cm直徑和150cm直徑。如本文所描述的，將上清液以所需的流速加樣上柱，在加樣上柱后，通常地，用PH為大約6.0-8.0的洗滌緩沖液洗滌珠子；合適地，使用pH7.0的洗脫緩沖液-如IOmM Tris/HClPH7.0。然后可使用合適的 洗脫緩沖液洗脫結合的材料，通常，洗脫緩沖液比洗滌緩沖液的pH更高或更低。在一個實施方式中，洗滌緩沖液包含50mM Tris/HCl和IM NaCl，pH9.0。合適地將洗脫液收集于一個部分中，洗脫過程中添加緩沖液一如IM Tris/HCl (pH6.5)調整其PH至pH7——例如在收集洗脫液之前將溶液加至管中。根據(jù)一種操作模式，植物提取物中存在的目的顆粒的結合和洗脫是使用DEAE離子交換劑，隨后用PEI離子交換劑進行預捕獲而完成的。在另一個實施方式中，提取物未經(jīng)過預處理，這樣目的顆粒可在一步結合盒洗脫過程中得到分離。這種操作模式對于使用膨脹床吸附的大規(guī)模捕獲目的顆粒是尤其合適的。因此，根據(jù)本方法可處理至少100升(例如，至少250升、至少500升、至少750升、至少1000升、至少1250升、至少1500升、至少1750升以及至少2000升)的提取物。在一個實施方式中，珠子組合物為瓊脂糖基的——如環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的瓊脂糖(例如，以4%w/v使用)。珠子可包含與珠子其他部分不同的組合物的內核一如碳化鎢的內核。合適的配體為DEAE離子交換劑，其通常具有的平均直徑為大約50 μ m。合適地，吸附劑顆粒的平均密度為大約16kg/L。合適的柱子直徑為大約45cm，其在沉積狀態(tài)下的空隙體積包含近似40%的堆積體積。在一個實施方式中，柱子是用0.5M Tris-Cl緩沖液(pH7)，隨后使用IOmM Tris-Cl緩沖液(pH7)平衡的。合適地，提取物的加樣是通過以如本文所描述的流速向上泵入提取物而完成的。膨脹系數(shù)通常在2.0-2.5的區(qū)域內，未結合的材料是用IOmM Tris/HCl (pH7)以相同的膨脹速率洗出的。在EBA色譜步驟后，可用50mM Tris-Cl和IM NaCl (pH9)以大約1.2的膨脹速率洗脫目的顆粒。可通過收集洗脫峰前向容器中添加lMTris/HCl (pH6.5)中和洗脫級分?？蓞R合含有或包含目的顆粒的級分用于其它捕獲和純化過程。珠子的平均密度可為大約lg/ml-20g/ml,線性流速可為至少大約150cm/小時,膨脹床的膨脹度可為大約1-5。在本發(fā)明的一個實施方式中，可選地，可分別用一種或多種洗滌緩沖液和平衡緩沖液對吸附劑進行洗滌或平衡，或進行洗滌和平衡。加至吸附劑的混合物可為經(jīng)調整的混合物。在其中吸附劑并非維持在柱子中的情況下，其可為偶聯(lián)有配體的固相，例如用于膜基的吸附，例如膜過濾器、纖維或片層。因此，一個其他的方面涉及用于從混合物中捕獲目的顆粒的方法，包括步驟:(i)提供吸附劑的膨脹床，其在柱子中包含配體，靜止床高超過10cm，其中吸附劑的密度為大約lg/ml-20g/ml，其中膨脹床的膨脹度為大約1_5，并且其中吸附劑顆粒的平均大小為大約25 μ m-大約200 μ m; (ii)以在大約pH6.0-8.0范圍內的pH下平衡樹脂材料；(iii)提供包含目的顆粒的混合物，其中所述混合物的電導率為大約lmS/cm-10mS/cm; (iv)以大約lcm/min-15cm/min范圍內的線性流速將混合物加樣到柱上以結合目的顆粒；(iv)使用具有的pH值在大約pH6.0-8.0范圍內的緩沖液洗滌加樣后的柱子；以及(V)從柱子上將結合的目的顆粒洗脫于一個或多個級分。如本文所指代的，“緩沖液”為通過其酸堿綴合物組分耐受加入酸或堿時的pH變化的溶液。根據(jù)所需 的緩沖液PH值以及捕獲過程中具體步驟，可采用多種緩沖液?？捎糜诳刂票景l(fā)明的方法所需要的pH范圍的緩沖液組分的非限制性實例包括乙酸、檸檬酸、組氨酸、磷酸、銨緩沖液如乙酸銨、肉桂酸銨、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO, HEPES, Tris等等，以及TRIS-蘋果酸-NaOH、馬來酸、氯乙酸、甲酸鹽、苯甲酸鹽、丙酸鹽、卩比啶、哌嗪、ADA、PIPES、ACES、BES, TES、甘氨酸、N- 二甘氨酸、TAPS、乙醇胺、CHES, CAPS、甲胺、哌啶、硼酸、碳酸、乳酸、丁二酸、二乙基丙二酸、雙甘氨肽、HEPPS、HEPPS0、咪唑類、苯酚、P0PS0、琥珀酸鹽、TAPS、芐胺、三甲基胺或二甲基胺或乙基胺或苯基胺、乙二胺、或嗎啉的組合。根據(jù)需要、其他組分(添加劑)可以存在于緩沖液中，例如，鹽類可用于調整緩沖液離子強度，如氯化鈉、硫酸鈉和氯化鉀；以及其他添加劑、如氨基酸(如甘氨酸、組氨酸)、離液劑(如尿素)、醇類(如乙醇、甘露糖醇、甘油、和芐醇)、清潔劑(見上文)、以及糖類(如蔗糖、甘露糖醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖和果糖)。所述緩沖液組分和添加劑以及所使用的濃度可根據(jù)本發(fā)明中實行的色譜類型而變動。術語“去垢劑”指代離子型、兩性離子型及非離子型表面活性劑，可用于防止蛋白質的聚集并防止污染物與目的蛋白質的非特異性相互作用或結合，其可存在于本發(fā)明所使用的多種緩沖液中，包括消毒、平衡、加樣、加樣后洗滌、洗脫或再生緩沖液。在具體實施方式
中，去垢劑是添加到洗滌緩沖液中的?？捎糜诒景l(fā)明的去垢劑的實例包括但不限于聚山梨醇酯(例如，聚山梨酸酯20或80);泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188) ；Triton ;十二烷基硫酸納(SDS);硫酸月桂納；糖昔羊基納；月桂基、肉 蓮基、亞油基或硬脂基硫代甜菜喊；月桂基、肉豆蘧基、亞油基或硬脂基酰肌氨酸；亞油基，肉豆蘧基，鯨蠟基甜菜堿；月桂酰胺丙基、椰油酰胺基丙基、亞油基酰胺丙基、肉豆蘧酰胺丙基、棕櫚酰胺丙基或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蘧酰胺丙基、棕櫚酰胺丙基或異硬脂酰胺丙基二甲胺；甲基椰油基鈉，或油?；谆；撬岫c；MONAQUAT 系列(Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.);Igepal CA-630、Pluronic、Triton、BRIJ、Atlas G2127>GenapoI>HECAMEG>LUBROLPX,MEGA,NP,THESIT,TOPPS,CHAPS,CHAPSO,DDMAU,EMPIGEN BB、AWITTERGENT 和 C12E8。去垢劑可加入任何工作緩沖液中，還可包括在含有目的分子的進料內。去垢劑可以以任何適合用于本文描述的方法的量存在，例如，為大約0.001%-大約20%，通常為大約0.01%-大約1%。在一個具體的實施方式中，對于CEXC在所使用的洗滌緩沖液中使用了聚山梨酸酯80。色譜運行可使用多種本領域熟知的方法進行監(jiān)測-如通過在280nm和600nm處
測量UV吸收值，通過測量電導率或通過pH，或通過這些測量的組合而進行監(jiān)測。對所需目的顆粒的捕獲可使用特異于目的蛋白質的恰當?shù)臏y定法進行監(jiān)測。可使用一些測定法——如熟知的Bradford測定法——確定各級分的總蛋白質含量。SDS-PAGE可用于確定其純度。Western印記可用于對目的蛋白質進行鑒別和定性。還可使用測量蛋白質活性的方法——例如本文所描述的血凝素測定法。根據(jù)另一個實施方式，在使用后對膨脹床和柱子進行清潔和再生。因此，例如在洗脫后，用0.5M NaOH洗滌，隨后使用蒸餾水進行洗滌，以對樹脂進行清潔和再生。使用IOmMTris-Cl緩沖液(pH7)可再次平衡。因此，本發(fā)明的一些方面涉及從植物中捕獲目的顆粒。因此，一個方面涉及用于從植物、植物細胞或植物提取物中捕獲目的顆粒的方法，包括使用膨脹床或EBA色譜。根據(jù)一個實施方式，所述方法包括以下步驟:(a)提供吸附劑膨脹床；合適地，其為DEAE基的吸附劑；(b)將植物材料與吸附劑相接觸；(c)可選地，對吸附劑進行沖洗；以及(d)可選地，從吸附劑上洗脫目的顆粒。合適地，植物提取物在與吸附劑接觸前的電導率為lmS/cm-lOmS/ cm,合適地為2mS/cm-3mS/cm。合適地,吸附劑包含多個珠子-如包含瓊脂糖以及適合與
目的顆粒相結合的配體的珠子。這些珠子的平均直徑為大約50 μ m。合適地，配體包含陰離子交換樹脂，或由陰離子交換樹脂構成，或基本上由其構成——如二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂，合適地是二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂。合適地，珠子的平均密度為大約lg/ml-20g/ml。合適地,線性流速為至少大約150cm/小時。合適地，膨脹床的膨脹度為大約1-5。通常，VLP與感染中產生的病毒子的抗原性類似，但缺少足以進行復制的基因信息，因此通常是非感染性的。VLP可與感染中產生的病毒子在形態(tài)學上類似，但并不總是如此。VLP-如病毒來源的VLP-可具有很廣的大小分布，并可與感染中產生的病毒子形狀相異一如，不是那么球形、有更長的軸或是扁平的外觀。因此，有時候可將VLP視為變形的病毒，這使得對其的捕獲具有挑戰(zhàn)性。VLP產生于多種病毒家族的組分，包括細小DNA病毒科(Parvoviridae，例如腺相關病毒)、逆轉錄病毒科(Retroviridae,例如HIV)以及黃病毒科(Flaviviridae,例如C型肝炎病毒)。VLP可產生于多種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，包括哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系、酵母和植物細胞。在特定實施方式中，存在于VLP中的一種或多種蛋白質種類可以是從天然發(fā)生的序列修飾而來。VLP可產生于合適的宿主細胞，包括哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞和昆蟲細胞。在一個實施方式中，VLP產生于植物的細胞中。VLP常常可通過異源表達而大量生產。VLP可以以完整的結構分離自宿主或宿主細胞?？赏ㄟ^例如免疫測定、功能測定(例如，凝集反應)、電子顯微鏡或尺寸排阻色譜就結構和大小對VLP進行評估。VLP可包含一種或多種不同的目的蛋白質。這些蛋白質可以為不同生物學來源，但其中至少一種是病毒來源。對于包含超過一種蛋白質種類的VLP來說，所述蛋白質種類可來自相同病毒種屬，或可包含來自不同病毒種、屬、亞科或家族的蛋白質。此外，VLP可另外包含非蛋白質的其他類型的分子，例如但不限于脂質和碳水化合物。在一個實施方式中，VLP是目的蛋白質單體單位的多聚組裝體。在多個實施方式中，目的蛋白質為病毒蛋白質，例如但不限于衣殼蛋白質。大多數(shù)病毒結構是基于其衣殼結構，并能以螺旋體、二十面體或等軸體或信封體形式存在。螺旋對稱體在病毒的圓周一圈有蛋白質亞基，形成盤狀。二十面體重對稱的衣殼形成了準球形結構；對于信封體病毒，蛋白質亞基則暴露于外部環(huán)境。在多種實施方式中，VLP包含衣殼，包括三個到大約200個衣殼。在一個實施方式中，VLP包括至少30、至少50、至少60、至少90或至少120個衣殼。在另一個實施方式中，每個VLP包括至少150個衣殼、至少160、至少170或至少180個衣殼。在其他實施方式中，目的蛋白質可為病毒基質蛋白質或病毒糖蛋白，等等。

在一個實施方式中，VLP是以二十面體結構表達的。在另一個實施方式，VLP是以與衣殼序列來源的原生病毒相同的幾何體形式表達的。在另一個實施方式中，VLP不具有與原生病毒一致的幾何體形式。在一個實施方式中，至少有一個衣殼包含至少一種目的蛋白質。在一個實施方式中，通過本發(fā)明捕獲的VLP可用于制造藥用組合物，包括但不限于疫苗——如流感或禽流感疫苗。這種疫苗可施用于人類或動物以防止病原體感染或治療這些病原體引起的感染，所述病原體為例如病毒、細菌、原蟲、線蟲、寄生蟲，但不限于此。目的顆?？梢詾榧毦び邦w粒。這種類型的顆粒為細菌如革蘭氏陰性細菌的空的細菌細胞外殼。通常，其是通過受控制的基因外源表達而制備的，所述基因影響細菌(特別是革蘭氏陰性細菌)的部分裂解。例如，裂解基因可以為噬菌體PhiX174基因E，其編碼一種多肽，所述多肽插入到革蘭氏陰性細菌細胞外殼復合物中并形成穿透內膜和外膜的跨膜通道結構。所述通道結構的內徑可在大約20nm-400nm的范圍內，特別是40nm_200nm或500nm-l, OOOnm的范圍內，這取決于所應用的裂解條件。細胞質組分通過所述通道結構釋放出來，其中獲得了具有完整形態(tài)學的空細胞外殼復合物，即所謂的細菌膜影。細菌ghost膜影的用途公開于W091/13555和W093/01791。細菌膜影顆?？蔀橹亟M膜影顆粒。所述細菌膜影顆?？蔀樵谄浔砻嬲故居幸环N或多種目的蛋白質——如疫苗抗原的重組膜影顆粒。該過程可產生至少0.lg/L的VLP形式的蛋白質。在另一個實施方式中，該過程產生0.lg/L-10g/L的VLP形式的蛋白質。在其他實施方式中，所述過程產生至少大約0.2、
0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1.0g/L的VLP形式的蛋白質。在一個實施方式中，產生的VLP總量為至少1.0g/L。所表達的病毒衣殼部分可操作地連接至目的蛋白質，其形成于細胞的不可溶聚集體內。在一個實施方式中，目的蛋白質時從如本文描述的不可溶聚集體內復性得到的。在一個實施方式中，可操作地連接于病毒衣殼序列的蛋白質包含至少2個氨基酸。在另一個實施方式中，所述蛋白質包含至少3個、至少4個、至少5個或至少6個氨基酸。在另一個實施方式中，所述蛋白質長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少十個或至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多的氨基酸。在一個實施方式中，蛋白質的分子量為至少25kDa、50kDa、IOOkDa 或 150kDa 或更多。目的蛋白質可以為并非來源于所述病毒的異源蛋白質，可選地，其并不來源于與宿主細胞相同的種屬。目的蛋白質可以為功能性蛋白質；結構蛋白質；抗原；免疫原；毒素；抗微生物蛋白質、治療性蛋白質或預防性蛋白質，用于治療或預防或者治療及預防人類或動物的疾病。本文描述的蛋白質的片段、融合蛋白質、前體或共聚體也包括在內。功能性蛋白質的非限制性實例包括但不限于，免疫活性蛋白質(例如，抗原蛋白質、過敏原性蛋白質、免疫調控子、免疫調節(jié)劑)；信號傳導及信號轉導蛋白質及抑制性蛋白質(例如，毒性的、殺生物的或生物穩(wěn)定型蛋白質，如蛋白質、毒素和抗微生物蛋白質)。結構性蛋白質包括但不限于，適配體；折疊蛋白質、促粘附蛋白質、界面蛋白質、微觀結構和納米結構的蛋白質和預激活蛋白。催化性蛋白質包括，例如，RNA編輯蛋白質；tRNA合成酶的催化蛋白質；核糖體失活蛋白質；以及病毒催化性蛋白質。目的蛋白質可以為相關蛋白質(例如抗原性病毒蛋白質；病毒相關蛋白質、抗體獨特結構域；細胞表面蛋白質；人類，動物，原生生物，植物，真菌，細菌或古生物的抗原性蛋白質；過敏原性蛋白和過敏原脫敏蛋白質)。蛋白質還可以為免疫調控子和免疫調節(jié)劑(例如，干擾素、白介素、免疫抑制劑和免疫增強劑)；抗體(例如，單鏈抗體；單鏈抗體片段和構建體，例如單鏈Fv分子；抗體輕鏈分子、抗體重鏈分子、結構域刪除的抗體輕鏈或重鏈分子；單鏈抗體結構域和分子，例如
011、011-3、013、011-4、014、￥!1(:!11、(^、0)1 1或？1 1-0)1 141 2結構域；旁原位肽(paratopicpeptide)、微抗體)；其他結合蛋白質(例如，適配體、細胞內和細胞表面受體蛋白質、受體片段)。所述蛋白質可以為酶底物或酶抑制劑或細胞表面受體配體、激動劑、以及拮抗劑、激素、細胞因子、趨化因子、病毒因子以及病毒受體激素釋放及釋放抑制蛋白質、經(jīng)遞質或通道阻滯劑，毒素，或毒素前體。蛋白質也可以是代謝和消化相關蛋白，細胞粘附調節(jié)或介導蛋白，細胞外基質蛋白，神經(jīng)保護劑或促髓鞘化蛋白質；或聚集抑制性蛋白質。目的蛋白質可以為分泌蛋白質。蛋白質的編碼序列可以為原生編碼序列，但更通常地，為經(jīng)過選擇、改進或優(yōu)化以在所選擇的宿主細胞中使用的編碼序列:例如，通過合成基因以反映出宿主種屬的密碼子使用偏好，或在其中包含信號肽。在一個實施方式中，目的蛋白質為可用于疫苗或疫苗組合物的抗原。合適地，疫苗還包含藥用可接受載體或佐劑，或二者。疫苗的預期用途是預防性或治療性的?！邦A防性”處理是這樣的處理，施用于未顯示疾病征兆或僅僅顯示出早期征兆的受試者，用于降低發(fā)展病理狀況風險的目的。疫苗可作為預防性治療以減少發(fā)展病理狀況的可能性，或者在已發(fā)展病理學狀況的情況下使病理學狀況的嚴重度最小化?！爸委熜浴碧幚硎沁@樣的處理:施用于顯示有病理狀況的征兆或癥狀的受試者，用于減小或消除這些征兆或癥狀的目的。所述征兆或癥狀可以為生物化學層面、細胞層面 、組織學層面、功能性、主觀性或客觀性的征兆或癥狀。
在一個實施方式中，抗原為血凝素(HA)或其衍生物。HA為包含近似560個氨基酸的病毒表面糖蛋白。其負責感染早期階段病毒的粘附及向宿主細胞的滲透。有至少16種已知的 HA 亞型，分類為 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或H16亞型。血凝素可見于流感病毒以及很多其他細菌和病毒的表面。目前，人類中流感感染的最顯著的原因歸結于A型流感病毒HlNl和H3N2。然而，引起流行性感染的流感病毒株為例如H5N1亞型，通常的流感疫苗對其起不到防護作用。H2、H7和H9亞型也具有流行感染的潛在可能。高度致病的禽流感病毒能夠引起鳥類的嚴重呼吸疾病以及死亡?，F(xiàn)在僅僅已知H5和H7亞型的HA有這項特征。因為一些禽類病毒能夠傳染到人類，所以這些病毒也成為人類健康的威脅。禽流感病毒的病原性具有多基因特性，而HA蛋白質已經(jīng)顯示出在感染中起主要作用。HA蛋白質可表達為單體、雙體和三體的形式。任何HA亞型和變體以及任何HA的單體、雙體或三體形式都可以為目的蛋白質并存在于本文描述的VLP中。
凝血素蛋白質可使用標準方法通過ELISA進行檢測，其中可能包含抗體的應用。用于測量凝血活性的方法在本領域內已知，包括將樣品與血紅細胞一同孵育，如W02004/098533中所描述的。用于生產目的顆粒的宿主通常為其中不允許病毒蛋白質進行復制或感染所述細胞的宿主。在一個實施方式中,病毒蛋白質來源于不感染宿主細胞所來源的細胞種屬的病毒。例如，在一個實施方式中，病毒種屬感染哺乳動物細胞，表達系統(tǒng)使用植物宿主細胞。宿主細胞可經(jīng)過修飾以提高目的顆粒的組裝。宿主細胞可以經(jīng)過修飾以包括蛋白質分子伴侶，其促進由表達的病毒蛋白質形成目的顆粒。在另一個實施方式中，宿主細胞經(jīng)過修飾，包括抑制子蛋白質，這樣可以更有效地調控衣殼的表達，以促進目的顆粒的調控性形成。宿主細胞包括細菌、酵母、藻類、昆蟲、哺乳動物和植物細胞。在本發(fā)明的一些實施方式中，宿主細胞為農癌桿菌屬的細菌宿主細胞，例如放射形農桿菌(A.Radiobacter)、發(fā)根農桿菌(A.Rhizogenes)以及懸鉤子農桿菌(A.Rubi)。在本發(fā)明的一些實施方式中，細菌宿主細胞是節(jié)桿菌屬，例如，金黃節(jié)桿菌(A.Aurescens)、朽1檬色節(jié)桿菌(A.Citreus)、球狀節(jié)桿菌(A.Globformis)、裂烴谷氨酸(A.Hydrocarboglutamicus)、邁索爾節(jié)桿菌(A.Mysorens)、煙草節(jié)桿菌(A.Nicotianae)、石臘節(jié)桿菌(A.Paraffineus)、A.Protophonniae> A.Roseoparqffinus、硫橫節(jié)桿菌(A.Sulfureus )以及產脲節(jié)桿菌(A.Ureafaciens)。在本發(fā)明的一些實施方式中，細菌宿主細胞為芽孢桿菌屬的，例如，蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、巨大芽抱桿菌(B.megaterium)、枯草芽抱桿菌(B.subtilis)、緩慢芽孢桿菌(B.Lentos)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、
B.Lautus、凝結芽抱桿菌(B.coagulans)、堅強芽抱桿菌(B.Firmus)、B.Alkaophius、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜熱脂肪芽桿菌(B.stearothermophiIus)>耐鹽嗜堿芽孢桿菌(B.Halodurans)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。在具體的實施方式中，宿主細胞是工業(yè)芽孢桿菌菌株，包括但不限于枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌。在一些實施方式，細菌宿主細胞為梭狀芽胞桿菌屬，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum),破傷風梭菌(C.tetani) E88、
C.lituseburense, C.Saccharobutylicum> 產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、拜季林斯基梭菌(C.Beijerinckii)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為棒桿菌屬，例如，谷氨酸棒桿菌(C.Glutamicum)和嗜乙酰乙酸棒桿菌(C.AcetoacidophiIum) 在一些實施方式中，細菌宿主細胞是埃希氏菌屬，如大腸桿菌(E.Coli)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為歐文氏菌屬，例如，嗷夏孢歐文氏菌(E.Uredovora)、軟腐病歐文氏菌(E.Carotovora)、菠蘿歐文氏菌(E.Ananas)、草生歐文氏菌(E.Herbicola)、斑點泛菌(E.Punctata)和草生歐文氏菌(E.Teireus)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為泛菌屬(Pantoea)，例如，檸檬假交替單胞菌(P.Citrea)和成團泛菌(P.Agglomerans)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為假單胞菌屬(Pseudomonas genus),例如，惡臭假單胞菌(P.Putida),銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)和還原酶假單胞菌(P.Mevalonii)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為鏈球菌屬(Streptococcus genus),例如，C型菌馬鏈球菌(S.EquisimiIes)，化膿鏈球菌(S.Pyogenes),和乳房鏈球菌(S.Uberis)0在一些實施方式中，細菌宿主細胞為鏈霉菌屬(Streptomyces genus),例如，生二素鏈霉菌(S.Ambofaciens)、不產色鏈霉菌(S.Achromogenes )、多拉菌素產生菌(S.Avermiti I is)、天藍色鏈霉菌(S.Coeli color)、金霉素鏈霉菌(S.Aureofaciens)、金黃色葡萄球菌(S.Aureus)、殺真菌鏈霉菌(S.Fungicidicus)、灰色鏈霉菌(S.Griseus)和變鉛青鏈霉菌(S.Lividans)。在一些實施方式中，細菌宿主細胞為發(fā)酵單胞菌屬，例如運動發(fā)酵單胞菌(Z.Mobilis)和解脂發(fā)酵單胞菌(Z.Lipolytica)。因為重組蛋白質的產出具有快速、高效、便宜及豐富的潛在特質，所以將細菌視為生產目的顆粒如VLP的表達系統(tǒng)的宿主細胞。研究者已經(jīng)表明，不含重組蛋白質插入片段的具體野生型病毒衣殼可在非熱帶腸桿菌中轉基因表達。研究者還顯示，這些衣殼可在體內和在體外進行組裝，以形成目的顆?！鏥LP。酵母宿主細胞可以為以下酵母屬的細胞，但不限于:假絲酵母(Candida)，漢遜酵母(Hansenula)、出芽酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、畢赤酵母(Pichia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)和耶氏酵母(Yarrowia)。在本發(fā)明的一些實施方式中，酵母細胞為漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡氏酵母(Saccaromyces carlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、出芽酵母(Saccharomyces norbensis)、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯得畢赤酵母(Pichia p astoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、白神畢赤酵母(Pichia kodamae)、膜購畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、有抱畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、子囊座畢赤酵母(Pichiaquercuum)、皮杰普畢赤酵母(Pichia pijperi)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、白假絲酵母(Candida albicans)、和固定化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。真菌宿主細胞可為以下屬的細胞，但不限于:綿霉菌(Achlya)、頂頭孢霉菌(Acremonium)、曲霉菌(Aspergillus)、范芽短梗霉菌(Aureobasidium)、煙管菌(Bjerkandera)、白腐菌(Ceriporiopsis)、頭抱霉菌(Cephalosporium)、金抱子菌(Chrysosporium)、旋抱霉菌(Cochliobolus)、棒囊菌(Corynascus)、栗疫病菌(Cryphonectria)、隱球菌(Cryptococcus)、雞腿燕菌(Coprinus)、色二抱菌(Coriolus)、殼囊孢菌(Diplodia)、鐮刀菌(Endothis)、赤霉菌(Fusarium)、粘帚霉菌(Gibberella)、腐質霉菌(GliocIadium)、肉座菌(Humicola)、毀絲霉菌(Hypocrea)、毛霉菌(Myceliophthora)、鏈抱霉菌(Mucor)、青霉菌(Neurospora)、柄抱殼菌(Penicillium)、金黃射脈菌(Podospora)、單鞭毛菌(Phlebia) , Piromyces)、稻痕菌(Pyricularia)、寄生根黏菌(Rhizomucor)、孢根霉菌(Rhizopus)、裂裙菌(SchizophyIIum)、頂孢微菌(Scytalidium)、申克孢子絲菌(Sporotrichum)、籃狀菌(Talaromyces)、嗜熱子囊菌(Thermoascus)、喜熱菌(Thielavia)、栓菌(Trametes)、彎頸霉菌(Tolypocladium)、木霉菌(Trichoderma)、輪枝菌(Verticillium)、小包腳燕菌(Volvariella),或有性型菌或無性型菌，以及其同義詞或分類學等價物。在本發(fā)明的一些實施方式中，宿主細胞為藻類細胞如衣藻(例如，萊茵衣藻(C.Reinhardtii))和席藻屬(P.sp.ATCC29409)。昆蟲宿主細胞的實例包括Lepidoptora細胞系，如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda) (Sf9 或 Sf21)或粉紋夜蛾(Trichoplusioani )細胞(High Five)。哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如CH0_K1;ATCC CCL-61),綠猴細胞系(COS)(例如 COSl (ATCC CRL-1650), C0S7 (ATCC CRL-1651));小鼠細胞(例如NS/0),幼倉鼠腎(BHK)細胞系(例如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，以及人類細胞(例如 HEK293(ATCC CRL-1573))。在一個實施方式中，宿主為植物，宿主細胞為植物細胞。植物細胞來源于植物，或可來源于植物，或其可為培養(yǎng)的植物細胞，其是在植物之外培養(yǎng)的。因此，在一個實施方式中，植物為植物細胞——如在培養(yǎng)物中生長或在植物之外生長的植物細胞，如體外生長植物細胞或細胞團塊。所述植物的非限制性實例包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物，觀賞植物，和非馴養(yǎng)或野生植物。其他實例包括具有商業(yè)或農業(yè)價值的植物，如作物(尤其是用于人類食品或動物飼料的作物)，生產木材或紙漿的樹木，蔬菜植物，水果植物以及觀賞植物。`所述植物的非限制性實例包括谷物作物(如小麥,燕麥,大麥,玉米,黑麥,小黑麥，大米，小米，高粱，藜，莧菜，和蕎麥)；牧草作物(如牧草和牧草雙子葉植物，包括野豌豆，苜蓿，紫花苜蓿，等)；油籽作物(如棉花，紅花，向日葵，大豆，油菜，油菜籽，亞麻，花生以及油棕)；樹堅果(如核桃，腰果，榛子，山核桃，杏仁，等等)；甘蔗、椰子，棗椰，橄欖，甜菜，茶葉以及咖啡；生產木材或木漿的樹木；蔬菜作物，如豆類(例如，大豆，豌豆，扁豆，苜蓿，花生)，萵苣，蘆筍，洋薊，芹菜，胡蘿卜，蘿卜，蕓苔屬蔬菜(例如，白菜，羽衣甘藍，芥菜，及其他葉類蕓苔屬蔬菜，椰菜，花椰菜，抱子甘藍，蕪菁甘藍，甘藍)，瓜類(如黃瓜，西瓜，西葫蘆，筍瓜)，蔥屬植物(例如，蔥，蒜，韭菜，大蔥，香蔥)，茄科成員(例如，西紅柿，茄子，土豆，辣椒，地莓)，以及藜科成員(例如，甜菜根，甜菜，菠菜，藜，莧菜)；水果作物，如蘋果，梨，柑橘類水果(如橙，酸橙，檸檬，柚子，以及其他)，核果(例如，杏，桃，李子，油桃)，香蕉，菠蘿，葡萄，獼猴桃，木瓜，鱷梨，以及漿果；以及觀賞植物，包括開花觀賞植物，觀賞樹木和灌木，觀賞性地被植物，觀賞草皮。雙子葉植物的其他實例包括但不限于，油菜，棉花，馬鈴薯，藜，莧菜，蕎麥，紅花，大豆，甜菜，以及向日葵，更合適地為大豆，油菜，和棉花。單子葉植物中的其他實例包括但不限于，小麥，燕麥，大麥，玉米，黑麥，黑小麥，水稻，觀賞草皮和牧草，高粱，小米，和甘蔗。作為重組蛋白質生產宿主的植物包含獨特的一組污染物，其可在目的顆粒的捕獲和純化中移除。進一步地，需要在提取后早期移除的植物固體物一般比傳統(tǒng)細菌和哺乳動物細胞培養(yǎng)物碎片濃度更高、大小范圍更廣，并且密度更大。典型的植物加工和純化流程由以下步驟構成:分離含有重組蛋白質的植物組織、組織級分，并同時減小顆粒大小、將靶標蛋白質萃取入水溶液介質、對粗提取物進行澄清，以及最后對產物進行純化。因此，從植物細胞中對目的顆粒的捕獲過程的改進對總體生產成本產生有助的影響。適合用于本發(fā)明的植物材料可以為單子葉植物或雙子葉植物或植物細胞系統(tǒng)，或來源于單子葉植物或雙子葉植物或植物細胞系統(tǒng)，包括來自以下家族之一的種屬:爵床科(Acanthaceae)、蔥科(Alliaceae)、百合水仙科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夾竹桃科，掠桐科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae),小梁科(Berberidaceae),廁脂樹科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae),鳳梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(CaryophylIaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、暮葡科(Dioscoreaceae)、麻黃科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)> 大戟科(Euphorbiaceae)、丑科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亞麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、錦葵科(Malvaceae)、黑藥花科(MeIanthiaceae)、色蓮科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、拱桐科(Nyssaceae)、罌■粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、車前草科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蓄薇科(Rosaceae )、菌草科(Rubiaceae )、楊柳科(Salicaceae )、無患子科(Sapindaceae )、爺科(Solanaceae)、紅 杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。合適的種屬可包括以下屬:金花、冷杉、槭樹、翦股穎、蔥、六出花、菠蘿、穿心蓮、須芒草、蒿、蘆竹、顛茄、小檗、Beta、紅木屬、蕓薹屬、山茶、喜樹、大麻、辣椒、紅花、長春花、三尖杉、菊花、金雞納、西瓜、咖啡、秋水仙、彩葉草、黃瓜、南瓜、狗牙根、曼陀羅、石竹、洋地黃、黃藥、山藥、油棕、麻黃、蔗茅屬、古柯屬、桉樹、羊茅、草莓、雪花蓮、大豆、棉花、向日葵、三葉橡膠、大麥、黑麥草、天仙子、萵苣、小桐子、亞麻、羽扇豆、番爺、石松、木薯、苜猜、薄荷、芒草、香蕉、煙草、水稻、黍、罌粟、銀膠菊、狼尾草、矮牽牛、法拉里斯、貓尾、五針松、早熟禾、一品紅、龍胡楊、蘿芙木、蓖麻、羅莎、甘蔗、沙柳、血根草、莨菪、黑麥、高粱、互花米草、菠菜屬、菊蒿、紅豆杉、可可、 小黑麥、小麥、北美穗草屬、藜蘆、長春花屬、葡萄、玉米。合適的種屬可包括黍屬、高粱屬、芒草屬、甘蔗屬、斑菌、楊樹菌、東方被大須芒草(大須芒草)、狗尾草(大象草)、草蘆(利甘草)、狗牙根(百慕大草)、高羊茅(牛尾草)、草原網(wǎng)茅(草原索草)、紫花苜蓿(苜蓿)、蘆竹(巨頭蘆葦)、黑麥(裸麥)、柳屬(楊柳)、桉樹屬(桉樹)、小黑麥(小麥-小麥、times.裸麥)、竹、向日葵(向日葵)、紅花(紅花)、小桐子(麻瘋樹)、蓖麻(蓖麻)、油棕(棕櫚)、亞麻(亞麻)、芥菜、甜菜屬(甜菜)、木薯(木薯)、番爺(西紅柿)、萵苣(生菜)、粉芭蕉(香蕉)、馬鈴薯(土豆)、甘藍(西蘭花、菜花、布魯塞爾豆芽)、茶樹(茶)、草莓(草莓)、可可(可可)、小粒咖啡(咖啡)、釀酒葡萄(葡萄)、菠蘿(鳳梨)、辣椒(辣椒和甜椒)、洋蔥(洋蔥)、甜瓜(哈密瓜)、黃瓜(黃瓜)、筍瓜(南瓜)、南瓜(南瓜)、菠菜(菠菜)、西瓜(西瓜)、黃秋葵(秋葵)、茄子(爺子)、薔薇屬(玫瑰)、香石竹(康乃馨)、矮牽牛屬(矮牽牛)、一品紅(一品紅)、白羽扇豆(羽扇豆)、海濱燕麥草(燕麥)、翦股穎(翦股穎屬)、顫楊(白楊)、松屬(松樹)、冷杉屬(冷杉)、槭屬(楓木)、大麥(青稞)、草地早熟禾(蘭草)、黑麥草屬(黑麥草)和貓尾草(提摩太)、柳枝稷(柳枝)、高粱(高粱、蘇丹草)、芒草竹材(芒草)、甘蔗屬(能源甘蔗)、胡楊(楊樹)、玉米(玉米)、大豆(大豆)、油菜(油菜籽)、小麥(小麥)、棉花(棉花)、水稻(大米)、向日葵(向日葵)、紫花苜蓿(苜蓿)、甜菜(甜菜)、或灰綠狼尾草(珍珠粟)。植物材料可為天然發(fā)生的、突變體的、非天然發(fā)生的或轉基因的煙草植物，或可來源于所述植物，包括以煙草屬、多種煙草種屬的植物，包括本氏煙草(N.benthamiana)和普通煙草(N.tabacum)(例如，LA B21, LN KY171, TI1406, Basmaj Galpaoj Periquej BeinhartlOOO-1，和Petico)。其他種屬包括無莖煙草(N.Acaulis)、漸尖葉煙草(N.acuminata)、多花種尖葉煙草(N.acuminata var.Multiflora)、非洲煙草(N.africana)、花煙草(N.alata)、抱莖煙草(N.amplexicaulis)、阿倫特氏煙草(N.arentsii)、漸狹葉煙草(N.attenuata)、貝納末特氏煙草(N.benavidesii)、黃花煙草(N.rustica)、海蓬子煙草(N.bigelovii)、博內里煙草(N.bonariensis)、洞生煙草(N.cavicola)、克利夫蘭煙草(N.c I eve landi i)、落葵煙草(N.cordifolia)、傘床煙草(N.corymbosa)、迪勃納氏煙草(N.debneyi)、高煙草(N.excelsior)、福氏煙草(N.forgetiana)、香煙草(N.fragrans)、粉藍煙草(N.glauca)、粘煙草(N.glutinosa)、古德斯比氏煙草(N.goodspeedii)、哥西氏煙草(N.gossei)、雜種花葉煙草(N.hybrid)、因古兒巴煙草(N.1ngulba)、格氏栲煙草(N.kawakamii)、奈特氏煙草(N.knightiana)、朗氏煙草(N.1angsdorffii)、狹葉煙草(N.linearis)、長花煙草(N.longiflora)、(N.maritima)、麥格隆熄豐煙草(N.megalosiphon)、摩西氏煙草(N.miersii)、圓錘煙草(N.noctiflora)、裸莖煙草(N.nudicaulis)、歐布特斯煙草(N.0btusifolia)、西方煙草(N.0ccidental is)、偏斜西方煙草(N.0ccidentalis subsp.hesperis)、耳狀煙草(N.0tophora)、圓維煙草(N.paniculata)、少花煙草(N.pauciflora)、碧冬煙(N.petunioides)、皺葉煙草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏煙草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏煙草(N.raimondii)、殘波煙草(N.repanda)、蓮座葉煙草(N.rosulata)、蓮座葉亞因古兒巴煙草(N.rosulatasubsp.1ngulba)、藍鈴草煙草(N.rotundifolia)、賽特氏煙草(N.setchellii)、擬似煙草(N.simulans)、煎葉煙草(N.solanifolia)、斯佩格茨煙草(N.spegazzinii)、斯托克通氏煙草(N.stocktonii)、 香花煙草(N.suaveolens)、林煙草(N.sylvestris)、紅花煙草(N.Tabacum)、唐印煙草(N.thyrsif lora)、域毛煙草(N.tomentosa)、域毛狀煙草(N.tomentosiformis)、狹煙草(N.trigonophylla)、藤葉煙草(N.umbratica)、波葉煙草(N.undulata)、天我鳥域煙草(N.velutina)、序葉煙草(N.wigandioides)、和桑德煙草(N.xsanderae)。來自或來源于栽培種或精英栽培種的植物材料的用途也包含在內。所述變種或栽培種的非限制性實例為:BD64、CC101、CC200、CC27、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、Cokerl76、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CD263、Denzizl1、DF911、Galpao 煙草、GL26H、GL350、GL600、GL737、GL939、GL973、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、KarabaglarΛ Little Crittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeaf Madole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NC BH129、NC2002、Neal Smith Madole、OXF OR D207、iPeriquei 煙草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RG H51、RGH4、RGH51、RS1410、Speightl68、Speightl72、Speightl79、Speight210、Speight220、Speight225>Speight227>Speight234>Speight G_28、Speight G_70、Speight H-6>SpeightH20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN86、TN86LC、TN90、TN97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole>Turkish Samson、VA309、VA359、DAC、Mata、Fina、P02、BY_64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944 (MN944)、Burley2UK149、Yaka JB125/3, Kasturi Mawar, NC297、Coker371Gold、P02、Wislica、Simmaba、Turkish Samsun、AA37_l、B13P、BU21x Hoja Parado 系 97 雜交的 F4、Samsun 或 POl。普通煙草栽培種的非限制性實例為 AA37-1、B13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、KTRD#3Hybridl07、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC#2Hybrid49、KTRDCMHybridllO、Burley21、BY-64、KTRDC#5KY160S1、KTRDC#7FCA、KTRDC#6TN86S1、Coker371Gold、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KY10、KY14、KY160、KY17、KY8959、KY9、KY907、MD609、McNair373、NC2000、PGO1、PG04、M066、PO1、P02、P03、RG11、RG17、RG8、Spe i ghtG-28、TN86、TN90、VA509、AS44>Banket AKBasma DramaB84/31>Basma I Zichna ZP4/B>Basma Xanthi BX2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker319、Coker347、Criollo Misionero、DAC Mata Fina、Delcrest、Djebel81、DVH405、Galp3() Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kasturi Mawar、Kutsage El、KY14xL8、KY171、LA BU21、McNair944、NC2326、NC71、NC297、NC3、PVH03、PVH09、PVH19、PVH2110、Red Russian、Samsun, Saplak、Simmaba、Talgar28、Turkish Samsun、Wislica、Yayaldag、NC4、TR Madole、Prilep HC-72、Prilep P23、PrilepPB156/l、Pril印 PI2-2/UYaka JK_48、Yaka JB125/3、T1-1068、KDH-960、T1-1070、TW136、Samsun NN、Izmir、Basma>TKF4028、L8、TKF2002、TN90、GR141、Basma xanth1、GR149、GRl53、Petit Havana 或 Xanthi NN0瞬時表達系統(tǒng)尤其適合于生成用于本發(fā)明方法的植物。合適地，所述瞬時表達系統(tǒng)可用于多種煙草種屬及普通煙草變種，其包括通過本領域已知物理方法(例如，施加真空，或大于大氣壓的壓力)將遺傳工 程改造的根瘤農癌桿菌的懸液浸潤到完整植物的葉子中，這依賴農癌桿菌將編碼目的蛋白質的核酸分子(一般為能在農癌桿菌中復制的表達構建體)轉移至植物細胞的能力。所述表達構建體在浸潤的植物細胞中的拷貝數(shù)高于用于生成轉基因植物所使用的拷貝數(shù)。用于生成本發(fā)明所使用的植物的瞬時表達方法的特征在于，不要求將表達構建體整合入植物基因組，雖然農癌桿菌的浸潤可能導致整合發(fā)生。因此，大多數(shù)浸潤的植物細胞不包含含有整合的表達構建體的基因組，而且瞬時表達也不要求表達構建體向子代植物中的轉移。通常，在浸潤后的2-15天，或合適地，在4-6天后，重組蛋白質在浸潤的植物細胞中累積并形成病毒樣顆粒。可在此時收獲生物質，特別是收集浸潤的葉子，并加工以分離顆粒。因此，植物材料可來源于瞬時表達存在于病毒樣顆粒中的蛋白質的植物(如本氏煙草和普通煙草的變種)，合適地，其來源于用包含編碼所述蛋白質并使得所述蛋白質能在浸潤的植物細胞中瞬時表達的表達構建體的農癌桿菌細胞浸潤的植物。植物材料用作進料提出了另外的挑戰(zhàn)，因為其固體含量很高，例如，含量超過5%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%w/w。進料可含有高濃度的比細胞培養(yǎng)物上清液中可見的那些材料大的材料，例如，目的顆粒大小范圍為10E-4到10E-2U0E-4到10E-1U0E-3到10E-1U0E-4到lmm, 10E-3到Imm或10E-2到1_。進料為化學復合物，其通常含有脂質、淀粉、木質素、酚類化合物及色素。植物中重組蛋白的產出相對細胞培養(yǎng)物較低,這要求加樣時使用更高體積的進料。如果混合物為植物或來源于植物，則其可為植物汁液提取物的形式。如本文所使用的，術語“植物汁液提取物”指的是來源于植物的包含有葉綠素的液體材料。植物汁液提取物可為經(jīng)調整的植物汁液提取物。技術人員會理解，目的蛋白質可包含在一種或多種目的顆粒之內，在一些實施方式中，需要從目的顆粒中分離或純化目的蛋白質。因此，本文描述的方法包括一個可選的進一步的步驟一從目的顆粒中純化蛋白質。因此，可通過本領域熟知的標準技術純化包含在目的顆粒之內的目的蛋白質至基本上純凈，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、鎳色譜、羥基磷灰石色譜，反相色譜，凝集素層析，制備性電泳，去垢劑溶解、用柱色譜相同的物質進行選擇性沉淀、免疫純化方法，等等。例如，已經(jīng)有確認的分子粘附特性的分子可以可逆地融合至配體。對于合適的配體，可將蛋白質選擇性地吸附至純化柱，然后使其以相對純凈的形式從柱上釋放。此外，可使用免疫親和柱子或N1-NTA柱子純化蛋白質。還要理解，本發(fā)明的方法可包括加工材料的其他步驟，可以在接觸膨脹床之前或之后進行。因此，本文描述的方法可包括其他的上游或下游加工步驟。因此，在一個實施方式中，該方法包括在與膨脹床接觸之前或之后處理材料的可選的進一步步驟。在另一個實施方式中，該方法包括在目的顆粒從吸附劑上洗脫后立即對其處理的可選的進一步步驟。因此，例如，可對材料材料進行硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、鎳色譜、羥基磷灰石色譜、反相色譜、凝集素色譜、制備性電泳、用 柱色譜相同的物質進行選擇性沉淀、免疫純化方法、過濾、微濾、離心、傾析或沉積，或前述過程的組合。“陽離子交換色譜”是帶負電的，具有可與經(jīng)過或穿過吸附劑或固相的水溶液中陽離子交換的游離陽離子?？墒褂萌魏螏ж撾姷倪m合形成陽離子交換樹脂的配體，例如，羧酸鹽、磺酸鹽及下文描述的其他配體。商業(yè)可得的陽離子交換樹脂包括但不限于，例如具有基于橫酸基團的配體(例如，MonoS, MiniS, Source 15S 和 30S, SP Sepharose Fast Flow ,SP Sepharose High Performance (來自 GE Healthcare), Toyopearl SP-650S 和 SP-650M(來自 Tosoh), Macro-Prep High S (來自 BioRad)，Ceramic HyperD S, Trisacryl M 和 LSSP以及Spherodex LS SP (來自Pall Technologies));具有基于磺乙基基團的配體(例如，F(xiàn)ractogel SE (來自 EMD)、Poros S-10 和 S-20 (來自 Applied Biosystems));具有基于磺丙基基團的配體(例如，TSK Gel SP5PW和SP-5PW-HR (來自Tosoh) ,Poros HS-20和HS50 (來自Applied Biosystems));具有基于磺異丁基基團的配體(例如，(FractogelEMD SO3"(來自EMD));具有基于磺乙基基團的配體(例如，SE52、SE53和Express-1on S(來自Whatman)),具有基于竣甲基基團的配體(例如，CM Sepharose Fast Flow (來自GEHealthcare),Hydrocell CM (來自 Biochrom Labs Inc.),Macro-Prep CM (來自 BioRad)、Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM (來自 Pall Technologies),Matrx Cellufme C500 和 C200 (來自 Millipore)，CM52，CM32，CM23 和 Express-1on C (來自 Whatman), Toyopearl CM-650S, CM-650M 和 CM-650C (來自 Tosoh));基于橫酸和竣酸的基團的配體(例如，BAKEPVBOND Carboxy-Sulfon (來自J.T.Baker));基于羧酸的基團的配體(例如，WP CBX (來自 J.TBaker)，DOffEX MAC-3 (來自 Dow Liquid Separations),Amberlite Weak Cation Exchangers, DOffEX Weak Cation Exchanger 和 Diaion WeakCation Exchangers (來自 Sigma-Aldrich)以及 Fractogel EMD COO-(來自 EMD));具有基于橫酸的基團的配體(例如，Hydrocell SP(來自 Biochrom Labs Inc.)>DOffEX Fine MeshStrong Acid Cation Resin(來自 Dow Liquid Separations),UNOsphere S, WP Sulfonic(來自 J.T.Baker), Sartobind S膜(來自 Sartorius), Amberlite Strong Cation Exchangers,DOffEX Strong Cation 和 Diaion Strong Cation Exchanger (來自 Sigma-Aldrich));以及基于正磷酸的基團的配體(例如，Pll (來自Whatman))?！瓣庪x子交換樹脂”是帶正電的，因此具有與其連接的一個或多個帶正電的配體?？墒褂萌魏芜B接于吸附劑或固相的適合形成陰離子交換樹脂的帶正電配體，如季銨基團。商業(yè)可得的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素，Poros PI20, PI50, HQ10, HQ20, HQ50, D50(來自 Applied Biosystems), Sartobind Q (來自 Sartorius), MonoQ, MiniQ, Sourcel5Q和 30Q，Q, DEAE 及 ANX Sepharose Fast Flow，高效 Q Sepharose, QAE SEPHADEX 和 FASTQ SEPHAROSE (GE Healthcare), WP PEI, WP DEAM，WP QUAT (來自 J.T.Baker)，HydrocellDEAE 和 Hydrocell QA (來自 Biochrom Labs Inc.), UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE 和Macro-Prep High Q (來自 Biorad), Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, TrisacrylM 和 LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M 和 Mustang Q(來自 Pall Technologies), DOffEX Fine Mesh Strong Base I 型和 II 型陰離子樹脂以及DOffEX MONOSPHER E77,弱喊性陰離子樹脂(來自 Dow Liquid Separations), Intercept Qmembrane> Matrex Cellufme A200, A500, Q500 及 Q800 (來自 Millipore), Fractogel EMDTMAE, Fractogel EMD DEAE 和 Fractogel EMD DMAE (來自 EMD)、Amberiite I 型和 II 型弱/強陰離子交換劑、DOWEX I型和II型弱/強陰離子交換劑，Diaion I型和II型弱/強陰離子交換劑，Duolite (來自 Sigma-Aldrich), TSK gel Q 和 DEAE5PW 及 5PW-HR、ToyopearlSuperQ-650S, 650M 和 650C，QAE-550C 和 650S，DEAE-650M 和 650C(來自 Tosoh)，QA52，DE23，DE32, DE51, DE52, DE53, Express-1on D 和 Express-1on Q (來自 Whatman)。親硫色譜的應用也包含在內，也稱為親硫吸附色譜。術語“親硫”指代蛋白質對緊挨硫醚基的磺基基團具有選擇性 。這是一種非親和的色譜類型，其中含有親硫區(qū)域和芳族氨基殘基的目的蛋白質結合于含有硫磺的配體，這樣蛋白質可以得到分離。親硫凝膠可通過用巰基乙醇還原二乙烯砜(偶聯(lián)于S印harose4B)而制備。親硫吸附色譜是基于電子的供體-受體特性，與基于疏水性的色譜不同。對于親硫吸附劑，并不發(fā)生疏水結合及離子相互作用，因為硫代乙基砜結構不具有顯著的疏水性或離子電荷。商業(yè)可得的親硫色譜的實例包括 Fractogel EMD TA (Merck; Rahway, NJ), Uniflow and Superflow 樹脂(Clontech)和 T-Gel (Pierce)。術語“親和色譜”指代一種分離技術，其中目的蛋白質可逆、特異地結合于生物學特異性配體，其中通常組合有空間互補作用和一種或多種類型的相互作用，例如:結合位點處的靜電力、氫鍵作用、疏水力以及范德華力。這些相互作用并非由于分子間的通用特性，如等電點、疏水性或大小，而是由于目的蛋白質和配體之間有特異相互作用，例如，免疫球蛋白結合于表位、蛋白質A結合于免疫球蛋白、生物反應調節(jié)子和其細胞表面受體之間的相互作用。在很多情況下，生物學特異配體還可以是能固定化于固相(如柱子)的蛋白質或多肽?！盎旌夏Ｊ诫x子交換樹脂”也包括在本文中，指代用陽離子、陰離子或疏水部分共價修飾的固相。混合模式離子交換樹脂包括BAKERBOND ABX (J.T.Baker;PhiIlipsburg, NJ)、I和II型陶瓷輕磷灰石以及含氟輕磷灰石(BioRad; Hercules, CA)以及 MEP 和 MBI HyperCel (Pall Corporation; East Hills, NY)。術語“疏水性電荷誘導色譜”(或“HCIC”)是一種混合模式色譜過程的類型，其中混合物中目的蛋白質在未添加鹽時(例如致溶鹽類)通過中等疏水相互作用結合于可離子化的配體?；旌夏Ｊ街复糜诮Y合的一種模式和用于洗脫的另一種模式，例如，用于HCIC的固相含有的配體具有親硫效應(即，利用了親硫色譜的特性)、疏水性和可離子化基團的組合特性，這些都有助于其的分離能力。因此，本發(fā)明的方法中使用的吸附劑含有可離子化的配體，所述配體在中性(生理條件)或輕微酸性的pH下(例如大約pH5-10，優(yōu)選地大約PH6-9.5)是中度疏水的。在這個pH范圍中，配體主要是不帶電的，并通過中度的非特異性疏水相互作用結合目的蛋白質。當PH下降時，配體獲得電荷，pH變化導致的對溶質的靜電荷排斥破壞疏水結合。用于HCIC的合適配體的實例包括任何可離子化的芳族或雜環(huán)結構(例如、具有吡啶環(huán)的結構、如2-氨基甲基吡啶、3-氨基甲基吡啶和4-氨基甲基吡啶、2-巰基吡啶、4-巰基吡啶或4-硫醇基-乙基吡啶)、巰基酸、巰基醇、巰基甲基咪唑、2-巰基苯并咪唑、氨甲基苯并咪唑、組胺、巰基苯并咪唑、二甲基丙二胺、氨丙基嗎啉、氨丙基咪唑、氨基己酸、羥基硝基苯甲酸、硝基酪氨酸/乙醇胺、二氯水楊酸、二溴酪胺、氯羥基苯乙酸、羥基苯乙酸、酪胺、苯硫酚、谷胱甘肽、硫酸氫鹽、以及染料、還包括其衍生物。在目的顆粒中表達的一種或多種蛋白質可具有其序列所來源的原生蛋白質的特異活性的至少20%、30%或40%，合適地具有所述活性的至少50%、60%或70%，最合適地為至少80%、90%或95%。進一步地，其底物特異性(keat/Km)可選地與原生蛋白質基本上類似。通常，kcat/Km為原生蛋白質的至少30%、40%和50% ;更合適地為至少60%、70%、80%或90%。對蛋白質和蛋白質活性以 及底物特異性(kMt/Km)的測定和定量的方法對本領域技術人員是熟知的。可將重組蛋白質的活性與先前確定的原生蛋白質的標準活性相比較。備選地，重組蛋白質的活性可以在與原生蛋白質同時或基本上同時的競爭性測定中得到確定。例如，體外測定可用于確定重組蛋白質和靶標之間的任何可檢測的相互作用，例如在表達的酶和底物之間、在表達的激素和激素受體之間、在表達的抗體和抗原之間，等等。這樣的檢測可包括對熱量變化、增殖變化、細胞死亡、細胞排斥、放射性變化、溶解性變化、分子量變化的測量，可通過凝膠電泳或凝膠排除方法、磷酸化能力、抗體特異性測定如ELISA測定等等進行測量。此外，體內測定包括但不限于這些測定法，其檢測所產生的蛋白質相比原生蛋白質的生理學效應，例如對免疫應答或炎癥的誘導情況。通常，任何體外或體內測定都可用于確定目的顆粒的活性特質。備選地，可測定本發(fā)明生產的蛋白質刺激或抑制蛋白質和正常與所述蛋白質相互作用的分子間的相互作用的能力，所述蛋白質為例如底物。所述測定法通?？砂▽⒌鞍踪|與底物分子在允許其相互作用的條件下組合，并檢測所述相互作用的生化結果的步驟。如果所表達的蛋白質是作為不可溶蛋白質表達的，則可經(jīng)過復性或重新折疊生成二級和四級蛋白質結構構象。如有必要，可使用蛋白質重折疊步驟以完成重組產物的構象。重折疊和復性可使用本領域已知試劑完成，以促進蛋白質的解離/結合。例如，可將蛋白質與二硫蘇糖醇一同孵育，隨后與氧化谷胱甘肽二鈉鹽孵育，其后與含有重折疊試劑如尿素的緩沖液一同孵育。重組蛋白質還可通過例如在磷酸緩沖液(PBS)或加有200mMNaCl的50mM乙酸鈉(PH6)緩沖液中透析得到復性。備選地，蛋白質在固定化于柱子(例如Ni NTA柱子)上的時候也可進行重折疊，其中使用線性梯度為6M-1M的尿素，溶于含有蛋白酶抑制劑的500mMNaCl、20%甘油、20mM Tris/HCl(pH7.4)的緩沖液中。復性過程可進行1.5小時或更久。復性后，可添加250mM的咪唑洗脫蛋白質?？赏ㄟ^對磷酸緩沖液(PBS)或加有200mM NaCl的50mM乙酸鈉(pH6)緩沖液進行最后的透析步驟以移除咪唑。純化的蛋白可儲存于4°C，或冷凍于_80°C?？赏ㄟ^與可選的藥物可接受載體、輔料或穩(wěn)定劑(見Remington’ sPharmaceuticalSciencesl6th edition, Osol, A.Ed.(1980))相混合,將根據(jù)本發(fā)明獲得或可根據(jù)本發(fā)明獲得的具有所需的純度的目的顆粒制備成凍干制劑或水溶液的制劑進行儲存?？山邮茌d體、輔料或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對接收者是無毒的，其包括緩沖液如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯基、丁基或芐基醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；以及m-甲酚)；低分子量多肽(少于大約10個殘基)；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；疏水多聚體如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，以及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖類，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬復合物(例如鋅-蛋白質復合物)；或非離子表面活性劑如TWEEN , PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明將在以下實施例中進行進一步描述，以下實施例不意欲限制權利要求中描述的本發(fā)明的范圍。
實施例 提供以下實施例進行闡述，但不限制于此。除非另有指出，本發(fā)明采用的都是生物化學、分子生物學和植物生物學的常規(guī)技術和方法。實施例1.流感病毒樣顆粒在本氏煙草中的瞬時表達如D，Aoust, M.-A., Lavoie, P.-0., Couture, Μ.M.-J., Trepaillcr, S.，Guay, J.-M.，Dargisj M.，Mongrandj S.，Landry, N.，Ward, B.J.，V ζ η ，L.-P 所描述的，在本氏煙草植物中生產流感病毒樣顆粒。由本氏煙草中瞬時表達生產的流感病毒樣顆粒誘導針對致死性病毒攻擊的保護性免疫應答。Plant Biotechnology Journal6 (2008) 930-940。實施例2.血凝素的檢測如W02004/098533中所描述的，將樣品與血紅細胞一同孵育，測量血細胞凝集情況。使用標準方法進行ELISA,檢測血凝素蛋白質。使用來自Immunetech的兔的抗-H5抗體(目錄號IT-003-005V)和來自Jackson的辣根過氧化物酶標記的二抗(目錄號
11-035-046)檢測血凝素H5蛋白質。實施例3.本氏煙草的提取
如實施例1中所描述的，通過D’ Aoust等人(2008，見上文)的方法浸潤本氏煙草植物，將浸潤后的植物在溫室中孵育6天并收獲。在收獲葉子時，將生物質在避光條件下于4°C過夜，使用螺旋壓榨機(Vincent CP-4)在15_20Kg/hr下進行均質化，錐體施加的壓力為至少45-psi。收集綠汁提取物，并將焦亞硫酸鈉加入綠汁，達到終濃度為10mM。測量電導率，必要時在用于捕獲實驗前用水對提取物進行稀釋。實施例4.用于結合來自植物汁液提取物中病毒樣顆粒的配體如實施例3中所描述的，使用螺旋壓榨機獲得含有血凝素H5病毒樣顆粒的本氏煙草綠汁提取物(D’Aoust等人，(2008)，見上文)。用去離子水將所述綠汁提取物稀釋5倍，最終pH為7，測量電導率。電導率為5.6mS/cm。測試四種不同配體的結合情況:二乙氨基乙基(DEAE)離子交換劑、葡聚糖基的DEAE離子交換劑、葡聚糖基的2-氯甲基苯并咪唑和葡聚糖基的1-(2-氯乙基)哌啶鹽酸鹽配體。所使用的多種吸附劑對樣品的比率為1:5。靜止模式中批式孵育后，收集上清液，并根據(jù)實施例2的步驟測量凝血活性。結果。與DEAE、葡聚糖基的DEAE、葡聚糖基的2-氯甲基苯并咪唑和葡聚糖基的
1-(2-氯乙基)哌啶鹽酸鹽的配體一同孵育，使用血凝測定法測量的上清中以及結合于配體的血凝素的量在表I中給出。在此實驗中，植物綠汁提取物中包含血凝素的病毒樣顆粒對DEAE基的離子交換吸附劑的結合最好。表1.多種吸附劑對含有血凝素病毒樣顆粒的綠汁提取物的比率，以及靜態(tài)模式下，上清液和已結合材料在提取物與多種吸附劑一同孵育時檢測的血凝活性(起始提取物％)。
權利要求
1.用于從混合物中捕獲目的病毒樣顆粒的方法，包括使用吸附劑膨脹床；合適地，其中所述方法包括步驟:(a)提供吸附劑膨脹床；(b)將混合物與吸附劑相接觸，使得混合物中的病毒樣顆粒結合于吸附劑；(C)可選地，洗滌吸附劑；以及(d)可選地，從吸附劑中洗脫病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中病毒樣顆粒包含流感病毒蛋白質。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2的方法，其中病毒樣顆粒包含血凝素；合適地，包含選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 的血凝素亞型，或其中兩種或更多種的組合。
4.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中混合物包含破裂的植物細胞；合適地，其中植物為用在植物中瞬時表達蛋白質的核酸分子浸潤的煙草植物，所述蛋白質存在于病毒樣顆粒中；更合適地，其中混合物為植物的地上部分，或來源于植物的地上部分。
5.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中珠子包含選自以下的材料，或由所述材料構成，或基本上由所述材料構成 :塑料、甲基丙烯酸酯、陰離子交換劑、二乙氨基乙基、陽離子交換劑、多糖、硅石、聚(苯乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷及其衍生物或者其中兩種或更多種的組合；合適地，其中珠子包含多糖，由多糖構成，或基本上由多糖構成，所述多糖選自:纖維素、瓊脂糖和葡聚糖及其衍生物或其中兩種或更多種的組合。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中珠子包含惰性內核，惰性內核材料包含選自以下物質的材料，或由這些構成，或基本上由這些構成，所述物質為:石英，娃石，Nd-Fe-B系合金,不銹鋼，鋯氧化物，氧化鋯，金屬硅酸鹽，金屬硼硅酸鹽，陶瓷包括二硼化鈦、碳化鈦、二硼化鋯，碳化鋯，碳化鎢，碳化硅，氮化鋁、氮化硅，氮化鈦，氧化釔，硅的金屬粉末，和二硅化鑰；金屬氧化物和硫化物，包括鎂，招，鈦，銀，鉻，錯，鉿，猛，鐵，鈷，鎳，銅和銀的氧化物；非金屬氧化物；金屬鹽，包括硫Ife鎖；金屬兀素，包括鶴，錯，欽，給，鑰；，絡，猛，鐵，鉆，鎮(zhèn)，鋼，銅，銀，金，鈀，鉬，釕，鋨，銠和銥，以及金屬元素的合金，如所述金屬元素之間形成的合金，及其衍生物，或者其中兩種或更多種的組合。
7.根據(jù)權利要求5-6中任何一項的方法，其中結合于目的顆粒的珠子大小為大約25 μ m-100 μ m ;合適地，為大約50 μ m。
8.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中所述方法包括預捕獲步驟，其包括使用第一吸附劑膨脹床；合適地，其中珠子大小為大約125 μ m-250 μ m ;更合適地，為大約150 μ m。
9.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中吸附劑包含配體，由配體構成，或基本上由配體構成；合適地，其中配體包含選自以下的配體，由所述配體構成，或基本上由所述配體構成，所述配體為:(i)芐胺或其衍生物；(ii)烷基胺或其衍生物；(iii)烯基胺或其衍生物；(iv)炔基胺或其衍生物；(V)烷氧基胺或其衍生物；以及(vi)單環(huán)或雙環(huán)芳族或雜芳族部分的胺類，或其衍生物，或者其中兩種或更多種的組合；或者其中配體包含陰離子交換樹月旨，由陰離子交換樹脂構成，或基本上由陰離子交換樹脂構成；合適地，其中陰離子交換樹脂包含二乙氨基乙基纖維素基的離子交換樹脂，由二乙氨基乙基纖維素基的離子交換樹脂構成，或基本上由二乙氨基乙基纖維素基的離子交換樹脂構成，或者包含二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂，由二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂構成，或基本上由二乙氨基乙基纖維素葡聚糖基的離子交換樹脂構成。
10.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中混合物在接觸吸附劑之前的電導率為大約lmS/cm-lOmS/cm;和/或混合物在接觸吸附劑之前的pH為大約pH6.0_pH8.0。
11.根據(jù)任何前述權利要求的方法，其中膨脹床的膨脹度范圍為大約1-5;并且混合物流穿膨脹床的線性流速范圍為大約lcm/min-15cm/min。
12.用于從混合物中捕獲目的病毒樣顆粒的方法，其包括步驟: (i)提供吸附劑膨脹床，其在柱子中包含二乙氨基乙基纖維素葡聚糖，其中吸附劑密度為大約2.5g/ml-3.5g/ml,并且其中平均吸附劑平均顆粒大小為大約50 μ m; ( )在大約PH6.0-8.0范圍內的pH下平衡樹脂材料； (iii)提供包含煙草植物材料的混合物，其中所述混合物導電率為大約2mS/cm-3mS/cm; (iv)以大約2.5cm/min的流速將混合物加樣到柱子上以結合病毒樣顆粒，并且其中柱中膨脹床的膨脹度為大約2; (V)使用具有的pH在pH6.0-8.0范圍內的緩沖液洗滌加樣的柱子；以及 (vi)從柱子上將結合的目的顆 粒洗脫于一個或多個級分中。
13.權利要求12的方法，其中步驟(iii)包括(a)提供瞬時表達存在于病毒樣顆粒中的蛋白質的完整煙草植物；(b)破壞煙草植物的葉子和莖的細胞以生產煙草植物材料；以及(c)用緩沖液或去離子水進行稀釋而調節(jié)混合物的pH和電導率。
14.權利要求12的方法,其進一步在步驟(iv)之前包括步驟,其包括過濾步驟(iii)的混合物以及將經(jīng)過濾的步驟(iii)的混合物與包含聚乙烯亞胺的第一吸附劑膨脹床相接觸以從混合物中移除不期望的物質，其中珠子的大小為大約150 μ m。
15.吸附劑膨脹床，其包含可逆地與其結合的病毒樣顆粒。
16.吸附劑膨脹床用于從混合物中捕獲目的病毒樣顆粒的用途，其中混合物來源于瞬時表達特定蛋白質的植物，所述蛋白質存在于病毒樣顆粒中。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從混合物中捕獲目的病毒樣顆粒的方法，包括使用吸附劑的膨脹床，合適地，其中所述方法包括步驟(a)提供吸附劑膨脹床；(b)將混合物與吸附劑相接觸，使得混合物中的成分結合于吸附劑；(c)可選地，洗滌吸附劑；以及(d)可選地，從吸附劑中洗脫病毒樣顆粒。
文檔編號C07K1/18GK103228327SQ201180057480
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權日2010年10月27日
發(fā)明者A·利姆, K·奧伊什, I·瓦斯特, R·卡布雷拉 申請人:菲利普莫里斯生產公司