專利名稱：人胸腺素β4二串體蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組人胸腺素β 4 二串體目的蛋白的制備工藝。
背景技術(shù)：
胸腺素β4是由43個氨基酸殘基組成的多肽，在哺乳動物中高度保守。與胸腺素原或類胸腺素不同，胸腺素β 4是胞漿蛋白而非核蛋白，并且它只含有較少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys結(jié)構(gòu)區(qū)域。其氨基酸序列如下AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQ EKNPLPSKETIEQEKQAGES。胸腺素β 4廣泛分布于各組織、器官和細(xì)胞中，與免疫功能、神經(jīng)發(fā)育和肌動蛋白功能密切，還可抗炎，促進(jìn)血管生成、創(chuàng)傷愈合、毛囊發(fā)育，修復(fù)受損的心肌。雖然胸腺素β 4有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其分子太小，難于直接在大腸桿菌中表達(dá)。目前用于實驗室及臨床試驗的胸腺素β 4多為化學(xué)合成品，價格昂貴；而從哺乳動物組織中提取T β 4，過程復(fù)雜而且產(chǎn)量較低，使其應(yīng)用受到限制，如何以更經(jīng)濟(jì)的方法獲取此多肽顯得非常重要。Tsuji Y等用大腸桿菌高效表達(dá)了胸腺素β 4與TNF構(gòu)成的嵌合體蛋白，在適當(dāng)?shù)乃嵝原h(huán)境中將二者之間的Asp-Pro橋切開，胸腺素β 4從嵌合體蛋白中釋放，經(jīng)過純化便可得到較多的胸腺素β 4蛋白。陳妍柯等將胸腺素β 4基因片段克隆入質(zhì)粒PLDH4的EcoR V和Hind III位點之間，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，誘導(dǎo)后的目的蛋白經(jīng)硫酸銨鹽析技術(shù)、Source RPC反相層析柱和Q Sepharose HP陰離子交換柱純化，得到的N端融合5個氨基酸(HK⑶I)，可提高E-玫瑰花環(huán)結(jié)花率并能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化。賈琪等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Ti34，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)帶6XHis標(biāo)簽的融合蛋白，并經(jīng)鎳柱一步親和層析即獲得純化，CAM試驗證明 Hi S6-T β 4蛋白有促進(jìn)毛細(xì)血管生成的活性。XK Li等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒ρΤΧΒ-Τ β 4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER 2566，IPTG誘導(dǎo)得到的融合蛋白經(jīng)一步親和純化、DTT自動水解后，得到的胸腺素04C端融合5個氨基酸 (LEGSQ，不僅可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化，而且可以促進(jìn)傷口愈合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人胸腺素β 4 二串體蛋白的制備方法，本發(fā)明的制備方法步驟簡單，快速可靠，成本低，僅僅使用了一個層析柱就完成了純化過程，且純度達(dá)到 98%以上。此方法制備的人胸腺素β4 二串體蛋白具有生物學(xué)活性，促進(jìn)HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的增殖、遷移，活性優(yōu)于化學(xué)合成的單體。在本發(fā)明的詳述之前，應(yīng)當(dāng)將一些常用術(shù)語進(jìn)行限定和解釋，如下所用的術(shù)語“人胸腺素β4以二串體蛋白”意指將無法在大腸桿菌中直接表達(dá)的人胸腺素β 4以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)，利用大腸桿菌偏愛密碼子，合成人胸腺素β4全長基因，結(jié)合PCR技術(shù)構(gòu)建了人胸腺素β4 二串體基因表達(dá)載體 pET-22b (+) -T β 4②，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到人胸腺素 β 4 二串體蛋白。其 DNA 序列為CATATG AGT GAT AAA CCG GAT ATG GCC GAG ATT GAG AM TTT GATMG TCA AM TTG MG AM ACG GAA ACT CAG GM MG MC CCG TTGCCT TCA AM GAG ACC ATC GAA CAG GAA AAG CAG GCG GGG GAA AGCGGATCC AGT GAT AAA CCG GAT ATG GCC GAG ATT GAG AAA TTT GATAAG TCA AAA TTG AAG AAA ACG GAA ACC CAG GAA AAG AAC CCG TTGCCT TCA AAA GAG ACC ATC GAA CAG GAA AAG CAG GCG GGG GAA AGCTAG GTCGAC。劃線部分分別為Nde I, BamH I和Sail酶切點。IjfffiW^ MW (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) 是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，我們把這些疏水性基團(tuán)稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據(jù)這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的。溶液中高離子強度可以增強蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。利用這個性質(zhì)，在高離子強度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質(zhì)上，然后線性或階段降低離子強度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當(dāng)離子強度降低時，疏水性強的物質(zhì)才隨后被洗脫下來(見圖1)。所用的術(shù)語“Phenyl Sepharose 6Fast Flow，，是疏水性層析介質(zhì)的一種，這種層析介質(zhì)是以交聯(lián)瓊脂糖為支持物，交聯(lián)瓊脂糖支持物與苯基共價結(jié)合。苯基作為疏水性配體，可以與疏水性物質(zhì)發(fā)生疏水作用，如圖2。特別的，Wienyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)禾口 Phenyl Sepharose 6Fast Flow (low sub)意f旨取代度大約為每ml 介質(zhì)含40 μ mol苯基和20 μ mol苯基。所用的術(shù)語“硫酸銨緩沖液”意指含硫酸銨的上樣緩沖液，由于高鹽的存在，使蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)暴露增多，高濃度鹽與水分子發(fā)生強烈作用，導(dǎo)致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配給之間發(fā)生結(jié)合。本發(fā)明的人胸腺素β 4 二串體蛋白的制備方法，包含以下步驟1)誘導(dǎo)培養(yǎng)含有重組人胸腺素β 4 二串體蛋白質(zhì)的菌，離心獲得菌體；幻加入裂菌緩沖液對菌體進(jìn)行裂菌， 破碎細(xì)胞，離心，收集上清液；幻將步驟幻得到的上清液溶解在硫酸銨緩沖液中，再離心； 4)上清液上樣于一個疏水層析柱，收集各峰液進(jìn)行鑒定，確定目的蛋白質(zhì)所在峰；最終獲得純度達(dá)98%以上的目的蛋白質(zhì)。步驟1)中，誘導(dǎo)所使用的誘導(dǎo)劑為0. OlmM的IPTG，具體使用的菌體為是本室構(gòu)建的重組人胸腺素β 4 二串體表達(dá)的菌體，所述菌為大腸桿菌BL21。步驟2)中，菌體和裂菌緩沖液的比例為Ig菌體加IOml裂菌緩沖液，所述裂菌緩沖液為STE裂菌緩沖液，該裂菌緩沖液由IOOmM NaClUmM EDTA、pH 8. 0的20mM Tris-HCl 組成。再利用超聲波細(xì)胞粉碎機破碎細(xì)胞，離心、收集上清。步驟3)中，所述硫酸銨緩沖液為含飽和度為50%硫酸銨的20mM Tris-HCl緩沖液。步驟4)中，所述層析柱為Wienyl Sepharose 6Fast Flow層析柱。即將上清上樣于Phenyl Sepharose 6Fast Flow (low sub)疏水柱，收集各峰液，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后確定二串體所在峰，其純度可達(dá)98%以上。經(jīng)HPLC純度鑒定獲得活性高于98%的人胸腺素β4 二串體蛋白。再將該蛋白質(zhì)經(jīng)過除菌處理用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移試驗。除菌的具體操作過程為將目的蛋白質(zhì)裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液透析M 36h，中間換液2 3次，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌既得。 通過增殖實驗和遷移實驗測定其活性，結(jié)果表明，人胸腺素β 4 二串體蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，其活性優(yōu)于化學(xué)合成單體。因此，本發(fā)明制備獲得的目的蛋白質(zhì)可應(yīng)用于促進(jìn)細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞遷移。細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移試驗的具體操作過程為a) MTT法測細(xì)胞增殖將HUVECs細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的人胸腺素β 4蛋白(Τ β 4)和人胸腺素β4 二串體蛋白(Τβ4②)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，然后加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO，490nm波長處讀數(shù)。b) Transwell 遷移實驗將含有HUVECs細(xì)胞的培養(yǎng)基加入到Transwel 1小室，下室加入含有不同濃度的人胸腺素β4蛋白(Τβ4)和人胸腺素β4 二串體蛋白(Τβ4②)的培養(yǎng)基中。孵箱培養(yǎng)一定時間后，取出上層小室，用棉簽試去小室內(nèi)的細(xì)胞，固定，染色，顯微鏡下觀察微孔濾膜外側(cè)細(xì)胞。


圖1所示為疏水作用層析的基本原理。圖 2 為 Phenyl Sepharose 6Fast Flow 結(jié)構(gòu)示意圖。圖3所示為不同的硫酸銨飽和度所獲得的目的蛋白質(zhì)的SPS-PAGE電泳圖，泳道1 : 蛋白marker ；泳道2 40%硫酸銨上清；泳道3 40%硫酸銨沉淀；泳道4 50%硫酸銨上清； 泳道5 50%硫酸銨沉淀；泳道6 60%硫酸銨上清；泳道7 60%硫酸銨沉淀。圖4為目的蛋白質(zhì)經(jīng)過疏水層析柱分離后的純化情況，A圖1 穿過峰；2 目的蛋白洗脫峰；3，4 雜蛋白洗脫峰；B圖泳道1 蛋白marker ；泳道2 上樣；泳道3 穿過峰；泳道4:目的蛋白；5，6:雜蛋白洗脫峰。圖5所示為目的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE(A)和flfestem blot (B)鑒定，A圖泳道1 蛋白marker ；泳道2 未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌；泳道3 經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌；B圖泳道1 未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌；泳道2 經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌。圖6為人胸腺素β 4 二串體蛋白HPLC純度鑒定圖。圖7所示為MTT增殖實驗結(jié)果。圖8所示為"Transwell遷移實驗結(jié)果，A圖1 空白對照；2:1 μ g/ml Τβ4 ；3 1 μ g/ml Τβ4②；4 :10μ g/ml T β 4 ;5 :10 μ g/ml T β 4 ②；B 圖為 iTranswell 遷移實驗結(jié)果柱狀分析圖。
具體實施例方式下面將通過具體實施例對本發(fā)明作詳細(xì)的描述。
本次發(fā)明依次包括下述步驟一、人胸腺素β 4 二串體蛋白的細(xì)菌細(xì)胞破壞誘導(dǎo)培養(yǎng)含有重組人胸腺素β 4 二串體蛋白質(zhì)的工程菌BL21/ pET-22b (+) -T β 4②，誘導(dǎo)劑為低濃度IPTG (0. OlmM)，離心獲得菌體。按Ig 菌體加 IOml STE 裂菌緩沖液 QOmM Tris-HCl ρΗ 8. 0, IOOmM NaCl, ImM EDTA)的比例將菌體重懸，約15g，在冰浴中超聲裂解菌體，功率300W，工作時間5s，間歇時間10s，全程時間30min，離心(12000rpmX 20min, 4°C )，收集上清。二、人胸腺素β 4 二串體蛋白的純化將步驟一得到的上清(約150ml)，常溫溶解在含飽和度分別為40%、50%、60% 硫酸銨的20mM Tris-HCl緩沖液中，盡量避免氣泡產(chǎn)生，之后再緩慢攪拌30min，離心 (12000rpmX20min，4°C )，目的是促進(jìn)蛋白對疏水配基的結(jié)合，收集離心后上清進(jìn)行電泳后，選擇飽和度為50 %的硫酸銨緩沖液(見圖幻。用0. 45 μ m濾膜過濾后，將其用A液 20mM Tris-HCl ρΗ 7. 5,50% (NH4) 2S04 充分平衡后的 Phenyl Sepharose 6Fast Flow (low sub) (Pharmacia公司)層析柱純化，用B液20mMTris-HCl ρΗ 7. 5，負(fù)鹽梯度洗脫10個柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰進(jìn)行分析，人胸腺素β 4 二串體蛋白在目的峰1中，純度達(dá)98%以上(見圖4)。依據(jù)本發(fā)明得到的人胸腺素β 4 二串體蛋白的主要指標(biāo)的鑒定方法如下1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(見圖5Α)取200μ1待鑒定樣品加入200yL2X載樣緩沖液混勻，沸水中煮5min，離心 (12000rpmX5min)，取10 μ 1上清進(jìn)行15% SDS-PAGE，上樣后電壓為80V約30min，樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至120V約1.證，用0. 5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2h，脫色直至背景清洗后進(jìn)行膠的保存。2、Western-Blot 檢測產(chǎn)物(見圖 5B)在SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、 硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM TrisU92mM Glycine,20% 甲醇)中IOOV恒壓電泳lh，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，洗滌液 TBST (20mM Tris-HCl, pH7.5、150mM NaCl.O. 05% Tween-20)清洗后浸入封閉液(含 2% BSA的TBST)中室溫封閉lh，TBST室溫洗3次，每次5min，加入小鼠抗人T β 4單克隆抗體 (1 500)，室溫孵育lh，TBST室溫洗3次，每次5min，再加入HRP-羊抗小鼠IgG(l 3000)， 室溫孵育 lh，TBST室溫洗 3 次，每次5min，最后用 TBST QOmM Tris-HCl，pH7. 5、150mM NaCl) 洗3次，NC膜浸入DAB顯色液中，室溫避光顯色lmin，蒸餾水沖洗終止反應(yīng).3、HPLC純度鑒定用流動相QOmM Tris-HCl ρΗ 7.5)平衡TSK-Gel PW3000色譜柱至基線平穩(wěn)，流速為0. 5ml/min，取20μ 1蛋白樣品上樣，用流動相洗脫，檢測波長為280nm，記錄并分析結(jié)果(見圖6)。4、人胸腺素β 4 二串體蛋白的生物活性測定a) MTT法測細(xì)胞增殖將HUVECs細(xì)胞以每孔3000接種于96孔板，5% C02, 37°C孵箱培養(yǎng)，待貼壁后加入不同濃度的T β 4和T β 4②繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后加入MTT 20 μ 1/孔(5mg/ml)后繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMS0150l·! l，10min后在波長490nm處讀數(shù)。由結(jié)果知，人胸腺素 β 4蛋白(Τβ4)和人胸腺素β 4 二串體蛋白(Τβ4②)均可促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖，且 T β 4②刺激后的細(xì)胞增殖率高于T β 4，說明T β 4②有與T β 4相同的活性且高于化學(xué)合成單體(見圖7)。b) Transwell 遷移實驗將HUVECs細(xì)胞常規(guī)消化，終止消化后離心收集細(xì)胞沉淀，用無血清的RPMI 1640 重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lX106/ml。取100 μ 1加入Transwell小室(8 μ m，24well)。下室加入600 μ 1含有不同濃度Τβ 4和Τβ 4②的無血清的RPMI 1640。在5 % CO2, 37 °C孵箱培養(yǎng)4h后，取出上層小室，用棉簽試去小室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察微孔濾膜外側(cè)細(xì)胞，每個樣本選取10個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值表示(*為P < 0. 5，**為P < 0. 01)。微孔濾膜外側(cè)細(xì)胞即為受刺激后遷移的細(xì)胞，由結(jié)果知，人胸腺素β4蛋白(Τβ4)和人胸腺素β4 二串體蛋白(Τβ4②)均可促進(jìn)HUVECs細(xì)胞遷移，且 T β 4②刺激后的遷移率高于T β 4，說明T β 4②有與T β 4相同的活性且高于化學(xué)合成單體 (見圖8)。5、本發(fā)明的效果如下a)工程菌BL21/pET-22b(+)_Ti34②經(jīng)低濃度IPTG (0. OlmM)誘導(dǎo)后便可高效表達(dá)目的蛋白的，誘導(dǎo)后菌體的超聲裂解上清經(jīng)疏水作用層析可得到純度大于98%的目的蛋白。b)本發(fā)明工藝簡單，快速，可靠且純度高，成本低，僅僅使用了一個層析柱就完成了純化過程。c)純化的人胸腺素β 4 二串體蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品人胸腺素β 4均可促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移且在低劑量便可優(yōu)于單體，如1-10μ g/ml。
權(quán)利要求
1.一種重組人胸腺素β4 二串體蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，該制備方法包含以下步驟1)誘導(dǎo)培養(yǎng)含有重組人胸腺素β4 二串體蛋白質(zhì)的菌，離心獲得菌體；2)加入裂菌緩沖液對菌體進(jìn)行裂菌，破碎細(xì)胞，離心，收集上清液；3)將步驟幻得到的上清液溶解在硫酸銨緩沖液中，再離心；4)上清液上樣于一個疏水層析柱，收集各峰液進(jìn)行鑒定，確定目的蛋白質(zhì)所在峰；最終獲得純度達(dá)98%以上的目的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中，誘導(dǎo)所使用的誘導(dǎo)劑為 0. OlmM 的 IPTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述菌為大腸桿菌BL21。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，菌體和裂菌緩沖液的比例為Ig菌體加IOml裂菌緩沖液，所述裂菌緩沖液為STE裂菌緩沖液，該裂菌緩沖液由IOOmM NaClUmM EDTA, pH 8. 0 的 20mM Tris-HCl 組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟幻中，所述硫酸銨緩沖液為含飽和度為50%硫酸銨的20mM Tris-HCl緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中，所述層析柱為Wienyl Sepharose 6 Fast Flow low sub 層析柱。
7.權(quán)利要求1-6任意一項制備方法所制備獲得的重組人胸腺素β4二串體蛋白質(zhì)在促進(jìn)細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-6任意一項制備方法所制備獲得的重組人胸腺素β4二串體蛋白質(zhì)在促進(jìn)細(xì)胞遷移中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人胸腺素β4二串體蛋白質(zhì)的制備方法。通過該制備方法可獲得純度達(dá)98％以上的目的蛋白質(zhì)，所獲得的人胸腺素β4二串體蛋白質(zhì)具有生物學(xué)活性；通過增殖實驗、遷移實驗測定該蛋白質(zhì)活性，結(jié)果表明，人胸腺素β4二串體蛋白質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，其活性優(yōu)于化學(xué)合成單體；且該方法僅使用一個層析柱就完成了目的蛋白的分離純化，步驟簡單、快速、成本低，為人胸腺素β4的進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C07K1/20GK102533911SQ20111037636
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者張偉, 張英起, 徐天嬌, 李萌, 王增祿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)