專利名稱：一種抗除草劑莎稗磷的特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含莎稗磷原有結(jié)構(gòu)的化合物作為莎稗磷半抗原，并將半抗原制成抗原、進(jìn)而產(chǎn)生抗體；以及此類半抗原、抗原的合成與抗體制備方法。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
除草劑是近20年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái)的一種農(nóng)藥類型，隨著化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，除草劑的品種也逐漸增多。在我國(guó)研制和投產(chǎn)的除草劑也已達(dá)數(shù)十種。有些除草劑具有致畸作用，除草劑的安全性已經(jīng)引起人們的關(guān)注，應(yīng)注意除草劑對(duì)環(huán)境的污染和人畜毒性作用問(wèn)題。使用除草劑能在糧食等中殘留，通過(guò)食物鏈而使人畜發(fā)生慢性危害作用。日本肯定列表制度《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量食品卷/藥品卷》中莎稗磷在大米(糙米)中的檢測(cè)限為0.05mg/kg ;《食品中農(nóng)用化學(xué)品殘留檢測(cè)方法增補(bǔ)本I》中莎稗磷的氣質(zhì)測(cè)定低限為
0.025mg/kg ;《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(2008-09-04發(fā)布2009-03-16實(shí)施)中運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)大米、糙米、大麥、小麥和玉米5中食品中110種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定其中莎稗磷的測(cè)定低限為0.0lmg/kg。然而，莎稗磷由于其分子量為367.84,小于IOOOdolton (道爾頓)，一般傳統(tǒng)上米用氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)或氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用等物化方法對(duì)其殘留進(jìn)行檢測(cè)。雖然這些傳統(tǒng)的理化分析方法靈敏度較高，而且較為準(zhǔn)確，但由于它們普遍操作繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢，所以難于滿足實(shí)際分析的需要，因此迫切需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的分析技術(shù)。而免疫分析技術(shù)正是一種快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低的檢測(cè)技術(shù)。其基本原理認(rèn)為:抗原抗體的免疫反應(yīng)涉及分子間的立體結(jié)構(gòu)，電荷、氫鍵及范德華引力作用等諸多因素，具有極高特異性和靈敏性，遵循質(zhì)量作用定律，不僅可體內(nèi)進(jìn)行，也可體外進(jìn)行，這些特點(diǎn)使其能被利用建立免疫分析方法，可達(dá)到傳統(tǒng)理化分析技術(shù)無(wú)法達(dá)到的選擇性和靈敏度。所以，免疫分析為莎稗磷殘留研究提供了一條新的分析檢測(cè)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物制備對(duì)小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，從而定性定量的檢測(cè)樣本中超微量小分子目標(biāo)物，可用于樣本測(cè)定。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和全抗原及抗體的制備。本發(fā)明為達(dá)到以上目的所設(shè)計(jì)的技術(shù)方案是合成分子結(jié)構(gòu)式如下圖所示的莎稗磷半抗原，然后將半抗原與載體蛋白聯(lián)接合成人工抗原，免疫動(dòng)物，獲得抗體。
權(quán)利要求
1.除草劑莎稗磷的人工抗原和抗體其特征在于使用分子式為
2.權(quán)利要求1所述的除草劑莎稗磷人工抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得: (1)N-氯乙酰基-N-異丙基-4-氯苯胺(CCPA)的合成 稱取5.859g N-異丙基對(duì)氯苯胺、28ml無(wú)水甲苯、3.57g三乙胺置于圓底燒瓶中，在室溫?cái)嚢柘拢煤銐旱我郝┒废蚱渲兄鸬蔚渭?.92g氯乙酰氯，控制滴加的速度使溫度保持在65°C以下，滴加完畢后，保持溫度在110°C回流5-6h，冷卻，過(guò)濾，用苯洗滌生成的三乙胺鹽酸鹽，濾液水洗至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，得到一深色溶液，將深色溶液過(guò)硅膠柱純化，收集目標(biāo)組分并旋蒸掉其中的大部分有機(jī)溶劑，室溫冷卻，析出的白色結(jié)晶即為N-氯乙?；?N-異丙基-4-氯苯胺； (2)半抗原的合成 稱取2.25g氫氧化鈉溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg巰基乙酸,攪拌15min后，向其中投入354.24mg的CCPA,回流2h,冷卻,用濃鹽酸酸化至pH =1.過(guò)濾,水洗,得到半抗原的白色固體； (3)稱取4.568mg半抗原于一棕色小瓶中，加入350 μ I 二甲基亞砜(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解后再分別稱取8.711mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、6.242mg N，N_ 二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)24h，離心出去沉淀，得到活化酯液； (4)人工抗原的合成 將上述活化酯液逐滴緩慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH = 7.4的PBS緩沖液中所配置的溶液中，4°C反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)產(chǎn)物于4°C、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析三天，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測(cè)定濃度，分裝，_20°C保存；
3.權(quán)利要求1所述的莎稗磷酶標(biāo)抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得: 稱取1.02784mg半抗原于一棕色小瓶中，加入150 μ I 二甲基亞砜(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解，再分別稱取1.96mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1.4045mg N, N-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)24h，離心出去沉淀，得到活化酯液；然后準(zhǔn)確稱取5mg的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶解于2ml的NaHCO3溶液中，將上述的活化酯溶液于冰浴中緩慢加入到HRP溶液中，4°C條件下攪拌過(guò)夜。后用pH7.4磷酸鹽緩沖液透析3天，加入硫柳萊，4 C冰箱保存；
4.權(quán)利要求1所述的除草劑莎稗磷抗體的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得: 免疫動(dòng)物選用雄性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周,6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，具體做法是: 初次免疫:取Img按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 加強(qiáng)免疫:用0.5mg上述人工抗原溶于0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 抗體純化:定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)一定的包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采集血液，并離心獲 得抗血清，使用G-S^harose蛋白親和層析柱對(duì)抗血清進(jìn)行純化，獲得抗莎稗磷的特異性抗體。
全文摘要
除草劑莎稗磷的半抗原、人工抗原和抗體的制備涉及具有除草劑莎稗磷基本結(jié)構(gòu)的半抗原、人工抗原和抗體的制備。本發(fā)明以簡(jiǎn)便的方法制備了特異性良好的除草劑莎稗磷的抗體。該抗體是以N-氯乙?；?N-異丙基-4-氯苯胺與巰基乙酸合成半抗原，然后分別與牛血清白蛋白(BSA)和辣根過(guò)氧化酶(HRP)連接合成人工抗原和酶標(biāo)抗原。人工抗原再經(jīng)動(dòng)物免疫，取血，分出抗血清，純化制得抗體。該抗體穩(wěn)定，具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡(jiǎn)單，可用于環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品和食品中除草劑莎稗磷殘留的快速免疫檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K16/44GK103073634SQ20111032628
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者王俊平, 王碩, 生威 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)