專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分級(jí)分離低植酸的大豆7s球蛋白和11s球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由含大豆蛋白的溶液經(jīng)分解植酸處理，并使用沉淀劑分級(jí)分離， 得到低植酸的富含7S球蛋白的級(jí)分和富含IlS球蛋白的級(jí)分。
背景技術(shù)：
根據(jù)超離心分析時(shí)的沉降常數(shù)，大豆儲(chǔ)存蛋白可進(jìn)一步分為2S、7S、11S和15S球蛋白。7S球蛋白、IlS球蛋白具有特有的不同性質(zhì)，例如黏度、凝聚性、表面活性等。于是， 通過(guò)7S球蛋白和IlS球蛋白的分級(jí)分離，就有可能對(duì)蛋白組分各自不同的性質(zhì)加以利用， 并可期望擴(kuò)大蛋白在工業(yè)上的應(yīng)用。另一方面，植酸是一種有機(jī)磷酸鹽化學(xué)物(肌醇六磷酸鹽6個(gè)磷酸基團(tuán)連接到肌醇上)，它主要以鈣鹽、鎂鹽和鉀鹽的形式存在于植物的種子中。大豆含有約為的磷， 其中大部分以肌醇六磷酸鈣鎂的形式存在，由于植酸通過(guò)螯合鍵與營(yíng)養(yǎng)上重要的礦物組分 (鈣、鎂、鐵、鋅等)連接，形成微溶的化合物，這就表明，植酸降低了這些微量元素在活體內(nèi)的吸收，此外，植酸易與蛋白和多價(jià)金屬陽(yáng)離子形成絡(luò)合物，正常情況下，按蛋白重量計(jì)大豆蛋白含有1-3%重量的植酸。分解植酸的活性是指從植酸中釋放出磷酸的活性，植酸酶是具有這種活性的代表性酶。日本專(zhuān)利JP^_1M457A介紹了利用其等電點(diǎn)的不同的方法將pH調(diào)至約為IlS球蛋白的等電點(diǎn)，然后進(jìn)行提取，此時(shí)只提取出7S球蛋白；日本專(zhuān)利JP61-187755A公開(kāi)了利用冷沉淀現(xiàn)象和還原劑等的方法。Deak N A，Murphy P A, Johnson L A. Fractionating soybeanstorage proteins using Ca2+and NaHS03[J]Journal of food science.2006,71 C413-C423公開(kāi)了利用與鈣反應(yīng)性不同的方法；于提取液中加入少量的鈣鹽，以分離富含 7S和IlS球蛋白組分。這些分級(jí)分離方法利用因pH、離子強(qiáng)度、某些鹽類(lèi)的存在、溫度等而引起的7S球蛋白與IlS球蛋白之間的溶解都不同。但是，IlS球蛋白級(jí)分中的植酸含量因加入了 CaCl2而顯著增加。因此，單純使用鈣等金屬離子沉淀大豆蛋白無(wú)法同時(shí)獲得低植酸含量的 IlS 和 7S 級(jí)分。(Deak N A, Johnson L A. Fate of phytic acid in producing soy protein ingredients[J]. J Amer. Oil. Chem. 2007, Soc. 84 :369-376.)。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN00805910. 1公開(kāi)了大豆蛋白的提取液中7S球蛋白和IlS球蛋白的工業(yè)化的分級(jí)分離方法。該方法是在大豆蛋白的提取液中，加入植酸酶分解植酸，然后將 PH調(diào)節(jié)至特定值下，7S球蛋白和IlS球蛋白溶解性改變，大部分IlS球蛋白組分不溶，7S組分可溶，離心分離不溶和可溶組分，從而實(shí)現(xiàn)7S球蛋白和IlS球蛋白的簡(jiǎn)單可工業(yè)化的分級(jí)分離。該方法可以顯著降低植酸在兩級(jí)分之中的富集，在不使用沉淀劑的時(shí)候，經(jīng)過(guò)酶解降植酸的大豆蛋白組分的溶解性顯著改變，有利于IlS不溶級(jí)分的進(jìn)一步分離，然而，由于沉淀IlS組分是在高于通常的大豆蛋白的等電點(diǎn)時(shí)進(jìn)行的，所形成的沉淀蛋白凝塊不夠結(jié)實(shí)，不利于工業(yè)上采用低速離心進(jìn)行分離。此外，單純使用酶，需要精確地調(diào)節(jié)沉淀IlS組分所需要的PH值，嚴(yán)重影響了工業(yè)化生產(chǎn)的操作及所獲得組分的純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種有效地實(shí)現(xiàn)富含7S球蛋白的級(jí)分和富含lis球蛋白的級(jí)分，而且有效避免單獨(dú)使用金屬離子帶來(lái)的植酸富集于IlS組分的問(wèn)題的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白分級(jí)分離新方法，獲得一種植酸含量低的大豆蛋白原料。本發(fā)明通過(guò)在植酸酶分解植酸后的蛋白提取液中加入二價(jià)金屬陽(yáng)離子沉淀劑，使得大豆IlS球蛋白在比其等電點(diǎn)高的pH范圍內(nèi)形成結(jié)實(shí)的凝塊并離心分離，來(lái)解決上述問(wèn)題。本發(fā)明目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，包括如下步驟和工藝條件(1)將脫脂大豆粉溶于10-20倍重量的水，控制PH值為8. 0-9. 0，室溫下提取 30min-120min，分離除去豆渣后得到大豆蛋白提取液；(2)將大豆蛋白提取液pH值調(diào)節(jié)為3. 0 6. 8的弱酸性，加入植酸酶，在溫度為 20-70°C條件下酶處理5分鐘-3小時(shí)，得到酶解蛋白液；植酸酶加入量為600-1000 μ /g大
豆蛋白；(3)在酶解蛋白液中，加入鈣或鎂離子沉淀劑，控制鈣或鎂離子在酶解蛋白液中濃度為5-25mM，調(diào)節(jié)pH至5. 8-6. 8，將富含7S球蛋白的級(jí)分和富含1IS球蛋白的級(jí)分通過(guò)離心分離。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，所述的脫脂大豆粉由脫脂豆粕粉碎后過(guò)篩得到；脫脂豆粕的氮溶解度指數(shù)大于60%，蛋白重量含量為47 53%。所述的植酸酶加入量?jī)?yōu)選為800 μ /g大豆蛋白。所述的酶處理溫度優(yōu)選為35_50°C。所述酶處理的時(shí)間優(yōu)選為30min-3h。所述離心分離采用潷析器的連續(xù)離心分離；或者是所述離心分離采用間歇式離心機(jī)分離。本發(fā)明采用鈣鹽進(jìn)行7S球蛋白和IlS球蛋白的分級(jí)分離會(huì)使大量的植酸以植酸鈣鹽的形式與lis共沉淀，限制了 IlS球蛋白在食品尤其是高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值如嬰兒配方食品中的應(yīng)用；使用鎂代替鈣，通過(guò)調(diào)節(jié)PH及加入合適的量，可以顯著降低植酸與IlS組分的沉淀，因?yàn)橹菜徭V在特定PH下比植酸鈣的溶解性顯著地高，但7S的植酸含量卻無(wú)法降低。因此，單純使用金屬離子沉淀大豆蛋白無(wú)法同時(shí)獲得低植酸含量的IlS和7S兩種級(jí)分，植酸總是富集于其中某一組分。在加入金屬離子沉淀劑之前先使用植酸酶處理大豆蛋白提取液，可顯著地降低加入金屬離子所帶來(lái)的植酸共沉淀，植酸酶是在一定PH下具有分解植酸活性的酶，本發(fā)明進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，用具有分解植酸活性的酶或酶制劑處理含大豆蛋白的溶液，使其所含的植酸和肌醇六磷酸鹽分解，隨后加入合適量的沉淀劑，在合適的PH范圍內(nèi)分離該溶液，在室溫下，不必加入還原劑等，富含7S球蛋白的級(jí)分可簡(jiǎn)單容易地進(jìn)入可溶級(jí)分，而富含IlS球蛋白的級(jí)分則進(jìn)入不溶級(jí)分。用植酸酶處理后，可使與蛋白和多價(jià)金屬離子形成絡(luò)合物的植酸和肌醇六磷酸鹽分解，從而產(chǎn)生以下兩方面的主要影響，其一為大大降低植酸與鈣等金屬離子的共沉淀現(xiàn)象；其二為大豆球蛋白中的與金屬離子結(jié)合的位點(diǎn)將會(huì)由于作為有效結(jié)合位點(diǎn)的植酸的分解而下降。由此增大了其在特定PH沉淀劑的用量。然而，通過(guò)調(diào)整PH是能夠顯著改變金屬離子的用量的，因此，并不會(huì)存在金屬離子使用過(guò)多的問(wèn)題。雖然已經(jīng)存在利用植酸酶水解植酸改變大豆蛋白兩種主要組分IlS和7S溶解性來(lái)實(shí)現(xiàn)兩者分離的方法，但這類(lèi)方法主要是利用了和大豆蛋白結(jié)合的植酸降解后，大豆蛋白兩組分溶解性差別增大的性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，其分離過(guò)程需要精確控制蛋白提取液PH，無(wú)法獲得兩者高純度的分離。本發(fā)明利用植酸去除后大豆蛋白和氯化鈣反應(yīng)性與植酸去處前有明顯變化這一特點(diǎn)，通過(guò)氯化鈣與除植酸后大豆球蛋白的特定結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)兩者的精確分離。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)相對(duì)于單純使用鈣和鎂鹽作為沉淀劑的分級(jí)分離方法，在加入沉淀劑之前先使用植酸酶進(jìn)行植酸降解，可以顯著避免僅使用鈣和鎂帶來(lái)的植酸與蛋白共沉淀的問(wèn)題， 提高大豆蛋白產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。(2)相對(duì)于僅使用植酸酶進(jìn)行分級(jí)分離的方法，在酶解后加入沉淀劑，有利于提高分級(jí)效率，同時(shí)可以在更高PH范圍(pH>6. 5)進(jìn)行分離操作，且更有利于使用低速離心機(jī)進(jìn)行分離操作，這是因?yàn)槌恋韯┯欣诮Y(jié)實(shí)凝塊的形成，以及隨后的離心分離。(3)由于使用的鈣和鎂沉淀劑的濃度很低，避免了通常使用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)分離所需要的脫鹽步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。實(shí)施例1將脫脂豆粕(NSI = 91，蛋白重量含量49% )粉碎并過(guò)60目篩得到脫脂大豆粉，按照1 15的質(zhì)量比例與水混合，在室溫及pH為8.0條件下提取1小時(shí)，然后離心得到脫脂大豆蛋白提取液。得到脫脂大豆蛋白提取液用鹽酸將其PH調(diào)至5. 8并加熱至40°C。在溶液中(植酸含量為1.80%蛋白重量)加入植酸酶(“PHYTASE”，德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn))，加入量為每克蛋白加入植酸酶800 μ，進(jìn)行酶處理池。用211101/1鹽酸將？!1調(diào)節(jié)至6.8，并加入氯化鈣，氯化鈣在溶液中濃度為25mM。在室溫下攪拌IOmin后，用批量式離心機(jī)(3000g) 離心以分離出含7S球蛋白的可溶部分和含IlS球蛋白的不溶部分，離心過(guò)程中料液保持室溫。所得的產(chǎn)品利用如下方法進(jìn)行分析檢驗(yàn)，結(jié)果如表11 總蛋白微量凱氏定氮法(GB/T5009. 5_03)，測(cè)定氮含量并乘以系數(shù)6. 25轉(zhuǎn)換為
總蛋白含量。表中，IlS及7S球蛋白產(chǎn)率及純度大豆蛋白11S/7S組分通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度分析，基于Laemmli的方法(Nature，227，680 (1970)，使用濃度為4%的分離膠與12%的濃縮膠進(jìn)行分析，樣品的量為20μ g。凝膠取出后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色劑染色30-40min，之后置入甲醇冰乙酸水體積比為1 1 8的脫色劑中靜置Mh。 所得的凝膠圖譜經(jīng)拍攝后用Quantity One (美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司)軟件進(jìn)行光密度掃描分析。圖譜中相應(yīng)于大豆IlS及7S蛋白的各條帶根據(jù)0’ Keefe等人方法鑒定 (J. Agric. Food. Chem. 1991，39 :1022-1028])。其中，7S 球蛋白含量是指 α、α，禾口 β 亞基的總量，而IlS球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和堿性多肽(B)的總量。各組分的產(chǎn)率率由下式確定組分回收率=(組分純度X組分質(zhì)量X組分蛋白含量)/(原料質(zhì)量X原料蛋白含量X原料中該組分所占比例)。其中組分蛋白含量與原料蛋白含量由微量凱氏定氮法測(cè)定。各組分的純度由該組分對(duì)應(yīng)條帶算得的光密度總和除以全部條帶光密度的總和確定。IlS及7S球蛋白的植酸含量使用D. B. Thompson的方法(J. Food Sci. 47 513-517(1982))。具體步驟如下稱(chēng)取0. 5g樣品，溶于25mL鹽酸(1.2%,w/w)中，振蕩提取池。在17200g，4°C條件下離心，使蛋白質(zhì)充分沉淀后將上清液定容至25mL。取ImL上清液，加入1. 5mL濃硝酸及0. 5mL濃硫酸，在電爐上加熱使混合液保持微沸狀態(tài)30-40min， 當(dāng)消化液呈無(wú)色時(shí)停止加熱，加入IOmL去離子水并在沸水浴中加熱15min以解離消化過(guò)程中可能生成的多聚磷酸鹽，加熱完成后冷卻并定容至25mL，記為提取液1。從上述上清液的剩余部分中取10mL，加入IOmL 1. 2%鹽酸及12mL氯化鐵溶液(每升該溶液中含2. Og FeCl3 · 6H20及16. 3ml濃鹽酸)，在97°C下恒溫75分鐘后冷卻至室溫，在前述條件下離心使植酸沉淀，所得的上清液定容至25mL。取4mL上清液，加入2. 5mL濃硝酸及ImL濃硫酸， 消化后加入IOmL去離子水，按前述方法加熱15min后定容至25mL，記為提取液2。取2mL提取液1，加入2mL去離子水及4mL顯色劑(含有IOmL 10%抗壞血酸溶液， IOmL 2. 5%鉬酸銨溶液，IOmL 3M硫酸及20mL去離子水)，在37°C水浴中恒溫90分鐘后冷卻至室溫，在820nm下測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(由磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液及顯色劑按照相同顯色方法測(cè)定，R2 = 0.999)回歸算得總磷含量。取4mL提取液2，加入4mL顯色劑，按照同樣方法測(cè)得無(wú)機(jī)磷含量。兩者相減得到樣品中的有機(jī)磷(其中90%為植酸中的磷)， 按照1/0. 282的系數(shù)算得樣品的植酸含量。表 1. 權(quán)利要求
1.一種分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件(1)將脫脂大豆粉溶于10-20倍重量的水，控制PH值為8.0-9.0，室溫下提取 30min-120min，分離除去豆渣后得到大豆蛋白提取液；(2)將大豆蛋白提取液的pH值調(diào)節(jié)為3.0 6.8的弱酸性，加入植酸酶，在溫度為 20-70°C條件下酶處理5分鐘-3小時(shí)，得到酶解蛋白液；植酸酶加入量為600-1000 μ /g大豆蛋白；(3)在酶解蛋白液中，加入鈣或鎂離子沉淀劑，控制鈣或鎂離子在酶解蛋白液中濃度為 5-25mM，調(diào)節(jié)pH至5. 8-6. 8，將富含7S球蛋白的級(jí)分和富含IlS球蛋白的級(jí)分通過(guò)離心分1 O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于所述的脫脂大豆粉由脫脂豆粕粉碎后過(guò)篩得到；脫脂豆粕的氮溶解度指數(shù)大于 60%，蛋白質(zhì)含量為47 53%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于所述的植酸酶加入量為800 μ /g大豆蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于所述的酶處理溫度為35-50°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于所述酶處理的時(shí)間為30min-;3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和IlS球蛋白的方法，其特征在于所述離心分離采用潷析器的連續(xù)離心分離；或者是所述離心分離采用間歇式離心機(jī)分離。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分級(jí)分離低植酸的大豆7S球蛋白和11S球蛋白的方法，該方法將脫脂大豆粉溶于10-20倍重量的水，控制pH值，室溫下提取，分離除去豆渣后得到大豆蛋白提取液；然后將大豆蛋白提取液的pH值調(diào)節(jié)為3.0～6.8的弱酸性，加入植酸酶，在溫度為20-70℃條件下酶處理5分鐘-3小時(shí)，得到酶解蛋白液；在酶解蛋白液中，加入鈣或鎂離子沉淀劑，控制鈣或鎂離子在酶解蛋白液中濃度為5-25mM，調(diào)節(jié)pH至5.8-6.8，將富含7S球蛋白的級(jí)分和富含11S球蛋白的級(jí)分通過(guò)離心分離。本發(fā)明使不溶性的11S球蛋白與可溶性的7S球蛋白在較高的pH值條件下實(shí)現(xiàn)精確分離，獲得顯著降低肌醇六磷酸含量的兩種組分。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102229644SQ201110145658
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者劉翀, 楊曉泉, 騰紫, 齊軍茹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)