專利名稱：一種花生活性肽分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生活性肽分離、純化工藝，屬于食品蛋白加工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般地，功能活性肽(抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽)的獲得途徑主要有三種(1)從天然生物體提取，由于提取成本高，不能大規(guī)模生產(chǎn)。( 化學(xué)合成、酶法合成或生物反應(yīng)器法(重組DNA技術(shù))合成，化學(xué)合成法成本高、副反應(yīng)物及殘留化合物對人體有害，其發(fā)展受到制約；酶法合成反應(yīng)周期長，產(chǎn)率低不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求；生物反應(yīng)器合成法剛開始興起，很多技術(shù)還不夠完善，還不能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。(3)水解蛋白產(chǎn)生，酸法水解蛋白，氨基酸受損嚴(yán)重，水解難控制而較少應(yīng)用；蛋白酶酶解法反應(yīng)條件溫和，可大量生產(chǎn)含有功能活性肽的粗酶解物，越來越受到重視。但是，蛋白酶酶解后的產(chǎn)物成分較多，既包括所需的目的功能活性肽類，也包括為了維持酶解過程中的PH值而加入的鹽類物質(zhì)，以及原料蛋白的一些成分如未水解的大分子蛋白、游離氨基酸、碳水化合物類、脂肪、無機(jī)鹽類等。因此，為了獲得比較純的功能活性肽，就必須對粗酶解物進(jìn)行分離、純化操作。功能活性肽類是一類兩性的生物活性物質(zhì)，它的活性受溶液的酸堿度、正負(fù)電荷多少、離子強(qiáng)度、金屬離子等影響。因此，對功能活性肽類進(jìn)行分離、純化就不能用化學(xué)方法，而必須采用物理方法。目前，物理分離方法通常采用納濾、陰陽離子交換樹脂法、超濾等。納濾(NF，Nanofiltration)是一種介于反滲透和超濾之間的壓力驅(qū)動(dòng)膜分離過程，納濾膜的孔徑范圍在幾個(gè)納米左右，可以脫除以二價(jià)離子為主的鹽類和相對分子質(zhì)量300以上的大多數(shù)有機(jī)物。離子交換樹脂一般呈現(xiàn)多孔狀或顆粒狀，當(dāng)溶液流經(jīng)離子交換樹脂時(shí)， 溶液中的某些離子，如鹽類離子會(huì)被帶相反電荷的離子交換樹脂所吸附，而溶液中其他成分不被吸附而流出，從而達(dá)到脫鹽的目的。超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一，以大分子與小分子分離為目的。在超濾過程中，水溶液在壓力推動(dòng)下，流經(jīng)膜表面，小于膜孔的溶劑(水)及小分子溶質(zhì)透過膜，成為透過液，比膜孔大的溶質(zhì)及溶質(zhì)集團(tuán)被截留，隨水流排出，成為濃縮液。綠色環(huán)保是當(dāng)前生產(chǎn)企業(yè)追求的目標(biāo)，納濾、陰陽離子交換樹脂法、超濾等分離技術(shù)是純物理操作過程，不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)污染，且分離效率高、分離效果好，愈來愈廣泛的應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)。本發(fā)明采用納濾、陰陽離子交換樹脂法、超濾等技術(shù)對花生蛋白粗酶解物進(jìn)行分離、純化，可以得到純度高的花生活性肽產(chǎn)品，包括抗氧化肽、抗菌肽和ACE抑制肽，適合工業(yè)化生產(chǎn)需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)品純度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好的花生活性肽的分離、純化方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下步驟
花生蛋白粉蛋白酶酶解液，納濾預(yù)濃縮，陰陽離子樹脂脫鹽，超濾分離、濃縮，檢驗(yàn)活性，冷凍干燥得到一定分子量范圍的花生活性肽，包括抗氧化肽、抗菌肽、ACE抑制肽。具體來說，所述的方法如下(1)花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制備；(2)將酶解液納濾，濾液預(yù)濃縮，得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(3)將預(yù)濃縮酶解液上樹脂柱脫鹽，收集濃縮液得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(4)將脫鹽的酶解液超濾，分離、濃縮，收集濃縮液，冷凍干燥，即得。所述的花生活性肽為抗氧化活性肽、抑菌活性肽或ACE抑制活性肽。優(yōu)選地，步驟(1)所述的花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制備方法是取質(zhì)量百分含量為8% 15%的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的 Viscozyme L(復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取/合成儀中， 以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min，調(diào)節(jié)pH值至 6.5 9.0，加入4000 800(^/^底物(U為蛋白酶酶活單位)的蛋白酶，在微波萃取/合成儀中，以800 IOOOw微波功率和45 60°C條件，微波酶解4 lOmin，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；優(yōu)選地，所述的蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶PH8. 0。優(yōu)選地，步驟(2)所述的納濾預(yù)濃縮條件為操作壓力為0. 1 0. 6MPa，溫度為 20 50°C，截留分子量為100 IOOODa(道爾頓)的卷式、平板式、管式納濾膜，時(shí)間為1 5min。優(yōu)選地，步驟(3)所述的樹脂裝柱陰陽離子比例為陰離子陽離子為1 4 4 1，過柱速度為3 8倍柱體積/h。優(yōu)選地，步驟(4)所述的超濾分離、濃縮條件為操作壓力為0. 05 0. 3MPa，溫度為20 40°C，截留分子量為IkDa IOkDa (千道爾頓)的卷式、板式、中空纖維式和管式超濾膜，時(shí)間為3 lOmin，超濾分離、濃縮的次數(shù)為3次?；ㄉ钚噪漠a(chǎn)品純度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好，可作為天然的食品添加劑(如抗氧化劑、防腐劑)用于食品工業(yè)中，也可作為天然的功能保健食品原料用于高血壓的輔助治療中?；ㄉ钚噪姆蛛x、純化工藝簡單，易操作，純物理分離過程，環(huán)境友好，為增加花生蛋白質(zhì)資源附加值，提供了新途徑，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取質(zhì)量百分含量為10%的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取 /合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min， 調(diào)節(jié)PH值至8.0，加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶，加入量為5000U/g底物(U為蛋白酶酶活單位)在微波萃取/合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解6min，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0.38MI^和25°C下，經(jīng)過截留分子量為IOOODa(道爾頓)的卷式納濾膜，納濾預(yù)濃縮 3. 5min，收集濃縮液得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液在5倍柱體積/h條件下，通過陰離子陽離子為3 2的陰陽離子樹脂柱脫鹽，得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. IOMPa 和25°C下，經(jīng)過截留分子量為IOkDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮 %iin，得到透過液1和濃縮液1，將透過液1在操作壓力為0. ISMPa和25°C下，經(jīng)過截留分子量為5kDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮6min，得到透過液2和濃縮液2，將透過液2在操作壓力為0. 25MPa和25°C下，經(jīng)過截留分子量為2kDa (千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮8min，得到透過液3和濃縮液3，檢驗(yàn)濃縮液1、濃縮液 2、濃縮液3、透過液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次為透過液3 >濃縮液3 >濃縮液2 >濃縮液1，將透過液3和濃縮液3分別冷凍干燥得到5kDa >分子量> 2kDa和分子量< 2kDa的兩種抗氧化鈦。實(shí)施例2取質(zhì)量百分含量為12%的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取/ 合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶， 加入量為6500U/g底物(U為蛋白酶酶活單位)在微波萃取/合成儀中，以900w微波功率和55°C條件，微波酶解5min，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為 0. 45MPa和30°C下，經(jīng)過截留分子量為800Da(道爾頓)的卷式納濾膜，納濾預(yù)濃縮5min， 收集濃縮液得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6 倍柱體積/h條件下，通過陰離子陽離子為4 1的陰陽離子樹脂柱脫鹽，得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. 12MI^和25°C 下，經(jīng)過截留分子量為6kDa(千道爾頓)的卷式超濾膜，超濾分離、濃縮5min，得到透過液1 和濃縮液1，將透過液1在操作壓力為0. 20MI^和25°C下，經(jīng)過截留分子量為3kDa(千道爾頓)的卷式超濾膜，超濾分離、濃縮8min，得到透過液2和濃縮液2，將透過液2在操作壓力為0.26MI^和25°C下，經(jīng)過截留分子量為IkDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮lOmin，得到透過液3和濃縮液3，檢驗(yàn)濃縮液1、濃縮液2、濃縮液3、透過液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次為透過液3 >>濃縮液3 >濃縮液2 >濃縮液1，將透過液3冷凍干燥得到分子量< IkDa的花生抗氧化肽。實(shí)施例3取質(zhì)量百分含量為14%的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L(復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取 /合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min， 調(diào)節(jié)PH值至8.0，加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶，加入量為7500U/g底物(U為蛋白酶酶活單位)在微波萃取/合成儀中，以IOOOw微波功率和52°C條件，微波酶解6. 5min，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0.42MI^和35°C下，經(jīng)過截留分子量為IOOODa(道爾頓)的管式納濾膜，納濾預(yù)濃縮 2min，收集濃縮液得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液在8倍柱體積/h條件下，通過陰離子陽離子為1 1的陰陽離子樹脂柱脫鹽，得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. 13MPa和 30°C下，經(jīng)過截留分子量為5kDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮7. 5min, 得到透過液1和濃縮液1，將透過液1在操作壓力為0. 20MI^和30°C下，經(jīng)過截留分子量為 3kDa(千道爾頓)的管式超濾膜，超濾分離、濃縮8. 5min，得到透過液2和濃縮液2，將透過液2在操作壓力為0.30MI^和30°C下，經(jīng)過截留分子量為IkDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮IOmin，得到透過液3和濃縮液3，檢驗(yàn)濃縮液1、濃縮液2、濃縮液3、 透過液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次為透過液3 >濃縮液3 >濃縮液2 >濃縮液1，將透過液3和濃縮液3分別冷凍干燥得到3kDa >分子量> IkDa和分子量< IkDa 的兩種花生ACE抑制肽。實(shí)施例4取質(zhì)量百分含量為8 %的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5. 0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取/ 合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶 PH8.0，加入量為6000U/g底物(U為蛋白酶酶活單位)在微波萃取/合成儀中，以900w微波功率和58°C條件，微波酶解8min，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min 離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. IOMI^a和35°C下，經(jīng)過截留分子量為SOODa(道爾頓)的卷式納濾膜，納濾預(yù)濃縮:3min， 收集濃縮液得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6 倍柱體積/h條件下，通過陰離子陽離子為1 4的陰陽離子樹脂柱脫鹽，得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. 12MI^和32°C 下，經(jīng)過截留分子量為6kDa (千道爾頓)的管式超濾膜，超濾分離、濃縮7min，得到透過液 1和濃縮液1，將透過液1在操作壓力為0. 22MPa和32°C下，經(jīng)過截留分子量為3kDa(千道爾頓)的管式超濾膜，超濾分離、濃縮9min，得到透過液2和濃縮液2，將透過液2在操作壓力為OJSMI^和32°C下，經(jīng)過截留分子量為IkDa(千道爾頓)的管式超濾膜，超濾分離、濃縮lOmin，得到透過液3和濃縮液3，檢驗(yàn)濃縮液1、濃縮液2、濃縮液3、透過液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次為透過液3 >濃縮液3 >濃縮液2 >濃縮液1，將透過液3、濃縮液3、濃縮液2分別冷凍干燥得到6kDa >分子量> 3kDa、3kDa >分子量> IkDa和分子量 < IkDa的三種花生抗菌肽。實(shí)施例5取質(zhì)量百分含量為12. 5 %的花生蛋白粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH值至5. 0，加入10FBG/g 花生蛋白粉的Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶，F(xiàn)BG為Viscozyme L酶活單位)，在微波萃取/合成儀中，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min， 調(diào)節(jié)PH值至8.0，加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶，加入量為8000U/g底物(U為蛋白酶酶活單位)在微波萃取/合成儀中，以800w微波功率和56°C條件，微波酶解8. 2min，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/ min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0.6MI^和30°C下，經(jīng)過截留分子量為IOOODa(道爾頓)的卷式納濾膜，納濾預(yù)濃縮 4min,收集濃縮液得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6倍柱體積/h條件下，通過陰離子陽離子為4 3的陰陽離子樹脂柱脫鹽，得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作壓力為0. IOMPa和 40°C下，經(jīng)過截留分子量為SkDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮8min， 得到透過液1和濃縮液1，將透過液1在操作壓力為0. 22MI^和40°C下，經(jīng)過截留分子量為 4kDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮8min，得到透過液2和濃縮液2，將透過液2在操作壓力為OJSMI^和40°C下，經(jīng)過截留分子量為IkDa(千道爾頓)的中空纖維式超濾膜，超濾分離、濃縮8min，得到透過液3和濃縮液3，檢驗(yàn)濃縮液1、濃縮液2、濃縮液3、透過液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次為透過液3 >>濃縮液3 >濃縮液 2 >濃縮液1，將透過液3冷凍干燥得到分子量< IkDa的花生抗菌肽。
權(quán)利要求
1.一種花生活性肽分離、純化方法，包括以下步驟(1)花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制備；(2)將酶解液納濾，濾液預(yù)濃縮，得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(3)將預(yù)濃縮酶解液上樹脂柱脫鹽，收集濃縮液得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(4)將脫鹽的酶解液超濾，分離、濃縮，收集濃縮液，冷凍干燥，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，所述的花生活性肽為抗氧化活性肽、抑菌活性肽或ACE抑制活性肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，步驟(1)所述的花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制備方法是取質(zhì)量百分含量為8% 15%的花生蛋白粉懸浮液， 調(diào)節(jié)PH值至5. 0，每克花生蛋白粉加入10FBG的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L，以800w微波功率和45°C條件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中滅酶20min，調(diào)節(jié)pH值至6. 5 9. 0， 每克底物加入4000 8000U的蛋白酶，以800 IOOOw微波功率和45 60°C條件，微波酶解4 lOmin，然后，100°C水浴中滅酶20min，在20°C條件下，5000r/min離心15min，上清液為花生蛋白粉蛋白酶酶解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，所述的蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶以2 2 3比例混合的復(fù)合酶pH8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，步驟( 所述的納濾預(yù)濃縮條件為操作壓力為0. 1 0. 6MPa，溫度為20 50°C，截留分子量為100 IOOODa納濾膜，時(shí)間為1 5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，步驟C3)所述的樹脂裝柱陰陽離子比例為陰離子陽離子為1 4 4 1，過柱速度為3 8倍柱體積/h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生活性肽分離、純化方法，其特征在于，步驟(4)所述的超濾分離、濃縮條件為操作壓力為0. 05 0. 3MPa，溫度為20 40°C，截留分子量為IkDa IOkDa超濾膜，時(shí)間為3 lOmin，超濾分離、濃縮的次數(shù)為3次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花生活性肽分離、純化方法，包括以下步驟花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制備；將酶解液納濾，濾液預(yù)濃縮，得到預(yù)濃縮花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將預(yù)濃縮酶解液上樹脂柱脫鹽，收集濃縮液得到脫鹽的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；將脫鹽的酶解液超濾，分離、濃縮，收集濃縮液，冷凍干燥，即得。以本發(fā)明制得的花生活性肽產(chǎn)品純度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好，可作為天然的食品添加劑用于食品工業(yè)中，也可作為天然的功能保健食品原料用于高血壓的輔助治療中。工藝簡單，易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/34GK102250999SQ201110145258
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者于麗娜, 孫杰, 張會(huì)翠, 張初署, 朱鳳, 楊慶利, 畢潔 申請人:山東省花生研究所