專利名稱：一種大孔樹脂制備高純度冠菌酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用大孔樹脂從發(fā)酵液中提取冠菌酸的方法，該方法適合從大量發(fā)酵液中提取冠菌酸。
背景技術(shù)：
冠菌酸(coronafacic acid, CFA)是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)冠菌素(coronatine，C0R) 合成的一個(gè)前體聚酮化合物，是茉莉酸(Jasmonic Acid JA)的結(jié)構(gòu)類似物。冠菌酸在很多作物上能夠引起與JA和COR類似的效果，研究表明20nmol的COR能夠引起中等到重度的番茄葉片黃萎病，而冠菌酸和Me-JA沒有引起失綠病斑的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)擬南芥、番茄花青素積累和抑制根伸長的實(shí)驗(yàn)中表明，COR的效果更顯著于Me-JA，而冠菌酸的作用效果介于COR 與Me-JA之間。通過研究COR及其前體物質(zhì)冠菌酸和CMA的作用反應(yīng)基因來進(jìn)一步確定各種物質(zhì)的作用機(jī)理，Srinivasa等^00 利用cDNA芯片技術(shù)研究番茄葉片在各種化合物處理后各個(gè)時(shí)間段的基因表達(dá)情況進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Verm圖顯示C0R、冠菌酸與冠烷酸(coronamic acid, CMA)誘導(dǎo)了不同數(shù)量基因表達(dá)的上調(diào)與下降。從這些結(jié)果顯示出冠菌酸與COR有功能更大程度的重疊作用，但是COR較冠菌酸誘導(dǎo)更多基因的表達(dá)。同時(shí)研究表明冠菌酸在有些作用方面與COR有類似的效果，有些效果略低于COR的誘導(dǎo)效果，同時(shí)也有一些顯著低于COR誘導(dǎo)效果的作用。隨著研究的深入，特別是JA作用受體的發(fā)現(xiàn)，更多研究者開始重新關(guān)注冠菌酸的作用，包括冠菌酸的生理作用，以及它的作用形式和機(jī)理， 目前關(guān)于COR的作用研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，在研究其作用機(jī)理時(shí)又主要集中在冠菌酸與CMA的作用機(jī)理，到底COR的作用是由冠菌酸還是CMA起主導(dǎo)作用，研究的還不是很清楚，近來有研究報(bào)道冠菌酸起主導(dǎo)作用，但是冠菌酸具體的作用效果以及機(jī)理還缺乏研究， COR對35%的Me-JA誘導(dǎo)的基因有調(diào)控作用，而冠菌酸對39. 4%的COR調(diào)控基因有誘導(dǎo)效應(yīng)，表明冠菌酸與COR重疊的誘導(dǎo)效果更顯著(Srinivasa等2005)。因此人們推測冠菌酸是COR主要起作用的基團(tuán)，也有研究證明JA與冠菌酸有著相同的誘導(dǎo)效果，研究表明在誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成，馬鈴薯塊莖細(xì)胞伸長以及大豆愈傷組織的生長和誘導(dǎo)燕麥葉片的衰老等作用中，冠菌酸和JA有相同的誘導(dǎo)效果，即相同濃度的冠菌酸與JA誘導(dǎo)效果相似。綜上所述，故大量研究需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證冠菌酸的生理功能以及其作用形式， 其中涉及到冠菌酸在作物抵抗逆境脅迫中的大量生理作用，例如冠菌酸是否可以調(diào)控植物生長、抑制衰老、促進(jìn)細(xì)胞分化、提高葉綠素含量和植物抗逆性等生理功能，這就需要大量冠菌酸樣品的獲得。如果冠菌酸可以代替COR來應(yīng)用于植物逆境脅迫，則冠菌酸有望作為又一種新的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)被廣泛應(yīng)用。因?yàn)榘l(fā)酵法獲得冠菌酸要比COR的獲得更容易，且發(fā)酵周期也明顯縮短，丁香假單胞菌發(fā)酵前期就有冠菌酸的合成，且產(chǎn)量遠(yuǎn)大于C0R， 如果冠菌酸能夠代替COR應(yīng)用于作物抗逆調(diào)控，不僅能夠節(jié)約能源，將低成本，同時(shí)，工業(yè)化生產(chǎn)冠菌酸將更能成為可能，因?yàn)楣诰岬纳锖铣梢菴OR的合成更簡單，工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌的獲得更為容易。近年來，集中研究冠菌酸作用機(jī)理的研究越來越多，但苦于缺乏冠菌酸樣品的獲得，不僅發(fā)酵合成冠菌酸產(chǎn)量較低，同時(shí)冠菌酸的分離純化工藝也較復(fù)雜，很難得到冠菌酸純品。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，是 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的新型有機(jī)高聚物吸附劑，已在環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離純化冠菌酸的方法，該方法工藝簡單，收率高，可達(dá) 80%以上，純度90%以上，該方法生產(chǎn)成本低，對冠菌酸的結(jié)構(gòu)和活性沒有任何影響，而且耗能低，污染小，完全適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本發(fā)明所提供的提取冠菌酸的方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進(jìn)行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機(jī)溶劑。所述大孔吸附樹脂具體可為HPD300、HZ818或YPRII。所述有機(jī)溶劑選自下述7種物質(zhì)中的至少一種乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液和丙酮。其中，所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱吸附速度(就是吸附柱底部流出液的速度)為4升/小時(shí)-8升/小時(shí)。為了節(jié)省洗脫劑用量，所述洗脫的流速(吸附柱底部流出液的速度)可為3升/ 小時(shí)-5升/小時(shí)。所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱量為具體可為3_200ml/g大孔吸附樹脂(如100ml/g)。所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液可按照包括如下步驟的方法制備在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵冠菌酸產(chǎn)生菌3-4天，收集發(fā)酵液中的上清液。所述方法在將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱前，還包括將所述上清液的PH值調(diào)至2-5. 5的步驟。所述吸附層析中包括收集第3個(gè)以上柱體積(如第3個(gè)柱體積、第3-4個(gè)柱體積、 第3-6個(gè)柱體積)的洗脫液，從所述洗脫液中得到冠菌酸的步驟。所述冠菌酸產(chǎn)生菌可包括以下幾種丁香假單胞菌絳紅致病變種(P. s. pv. atropurpruea)、丁香假單胞菌大豆致病變種(P. s. pv. glycinea)、丁香假單胞菌番茄致病變種(P. s. pv. tomato)、丁香假單胞菌李死致病變種(P. s. pv. morsprunorum)、丁香假單胞菌斑生致病變種(P. s.pv.maculicola)、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(P. s. pv. actinidiae)、野油菜黃單胞菌棲新西蘭麻致病變種(X. c. pv. Phormiicola) (Palmer D A, Bender C L. Effects of environmental and nutritional factors on production of the polyketide phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv.glycinea. App1. Environ. Microbiol. 1993，59，1619—1626.)。其中的丁香假單胞菌大豆致病變種(P. s. pv. glycinea)具體可為保藏號為 CGMCC1412的丁香假單胞菌大豆致病變種，或?yàn)楸２靥枮镃GMCC1276的丁香假單胞菌大豆致病變種，或?yàn)楸２鼐幪枮镃GMCC No. 2533的丁香假單胞菌大豆致病變種(I^eudomonas syringae pv.glycinea)MW1230可用現(xiàn)有的培養(yǎng)丁香假單胞菌的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)上述冠菌酸產(chǎn)生菌，如蔗糖15g， 氯化銨 1. Og, ΚΗ2Ρ044· lg, K2HP043. 6g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, KNO3O. 3g，2mMFeCl310ml，用蒸餾水定容至 1000ml, pH 7. 0o所述發(fā)酵中采用的溫度為適宜丁香假單胞菌生長的溫度，如18°C -23°C。所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液，是將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液進(jìn)行離心，得到的去除沉淀的液體。所述離心中，所采用的離心力可為3000_8000g，離心時(shí)間可為3_20分鐘。所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液調(diào)節(jié)pH值為2-5. 5后進(jìn)行上柱。本發(fā)明經(jīng)過不斷優(yōu)化小量制備冠菌酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)，進(jìn)而逐級放大，得到一種最優(yōu)化的制備冠菌酸大量樣品的技術(shù)，從而為進(jìn)一步大量研究冠菌酸生理功能提供基礎(chǔ)。 本發(fā)明方法采用的大孔吸附樹脂對冠菌酸的選擇性良好、吸附快、解析也快、吸附容量較大、生產(chǎn)周期短；且大孔樹脂物理化學(xué)穩(wěn)定性高、機(jī)械強(qiáng)度好、再生容易；工藝簡單，操作十分簡便，一步即可達(dá)到分離目的，同時(shí)冠菌酸收率較高，純度較好，溶劑皆可回收利用，成本低廉，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為冠菌酸的HPLC法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為實(shí)施例1的HPLC測定冠菌酸標(biāo)樣(A)、冠菌酸粗提樣品(B)及純化后的冠菌酸樣品(C)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體是利用大孔樹脂吸附層析的方法從發(fā)酵液中分離提取冠菌酸的方法， 其特征是將成熟發(fā)酵液離心棄沉淀，用上清液作流動相，經(jīng)大孔樹脂柱分離，經(jīng)優(yōu)化的淋洗液洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，得到冠菌酸。具體工藝流程為⑴將發(fā)酵3-4天的含冠菌酸的成熟發(fā)酵液室溫條件下 3000-8000g,離心3-20分鐘，棄沉淀，收集上清液；(2)將上述所得上清液以4升/小時(shí)-8升/小時(shí)的速度流經(jīng)大孔吸附樹脂；(3)用大量水沖洗至流出液無色后，改用有機(jī)溶劑洗脫冠菌酸，所用的洗脫劑為 3-6倍柱體積，洗脫液流量為3升/小時(shí)-5升/小時(shí)，所用的洗脫劑是乙醇、乙醚、石油醚、 正己烷、乙酸乙酯、丙酮、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液，或者之中任意兩種或者三種的混合溶劑。(4)將洗脫液在真空度0. 07-0. 09MPA下減壓蒸發(fā)，收集冠菌酸，并回收溶劑。下述實(shí)施例中所用的非極性大孔吸附樹脂HPD300、HZ818或YPRII分別購自滄州寶恩吸附材料有限公司，上海華震科技有限公司，上海勁凱樹脂有限公司。實(shí)施例1、從微生物發(fā)酵液中提取冠菌酸1、發(fā)酵挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC MW1232533 (記載在中國專利200810119153. 2 中)于斜面培養(yǎng)基(配方為 2%蛋白胨，0. KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 · 7H20,1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養(yǎng)基的pH 7. 0)上培養(yǎng)48_60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有l(wèi)Oug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(配方為2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1 % MgSO4 ·7Η20 ；溶劑為水；該培養(yǎng)基的pH 7.0 ;121°C滅菌30min)中，28°C培養(yǎng)36-4 ,到對數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按5% (體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖15g，氯化銨1. Og, KH2P044. lg, K2HP043. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KNO3O. 3g, 2mM FeCl3IOml,用蒸餾水定容至1000ml。該培養(yǎng)基的pH 7.0)中，在溫度為18°C、轉(zhuǎn)速為260rpm的條件下發(fā)酵3天。2、純化取步驟1的發(fā)酵液5L在室溫條件下5000g離心5分鐘，收集上清液，調(diào)節(jié)pH值為 2。將50克HPD300大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分比)的鹽酸溶液以IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH = 7.0;用3-5% (體積質(zhì)量百分比)的NaOH溶液以IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至pH = 7. O ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液5L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)為4 升/小時(shí)；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用4倍柱體積的丙酮洗脫，洗脫速率為3升/小時(shí)(吸附柱底部流出液的速度)，收集第3-4個(gè)柱體積的洗脫液。 在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮該丙酮洗脫液得浸膏，在45°C干燥得冠菌酸產(chǎn)品。將該冠菌酸產(chǎn)品用色譜級甲醇進(jìn)行溶解。冠菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備和檢測按照如下文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行 Jones WT, Harvey D, Mitchell RE, Ryan GB, Bender CL, ReynoldsPHS(1997) Competitive ELISA employing monoclonal antibodies specific for coronafacoyl amino acid conjugates. Food Agric Immunol 9:67—76。根據(jù)標(biāo)樣濃度及峰面積建立冠菌酸檢測線性曲線。如圖1。冠菌酸的純度則由分析型高效液相色譜儀(流速每分鐘1毫升)給出。其中，分析型高效液相色譜儀的型號島津CBM-10A VP PULS，所采用的色譜柱的型號 Agela4. 6*250mm C18。色譜操作條件洗脫液是80%色譜甲醇溶液，時(shí)間10分鐘。根據(jù)純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計(jì)算冠菌酸收率。 其中，用于上樣檢測的純化前樣品中冠菌酸的上樣液按照如下方法制備取ImL步驟1的發(fā)酵液到離心管內(nèi)，5000rpm離心3min，取0. 5mL上清液到新的離心管內(nèi)，每支離心管內(nèi)加 30yL 3M HC1，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，收集有機(jī)相55°C水浴吹干所得物或自然風(fēng)干。 甲醇溶解高效液相色譜檢測冠菌酸含量。根據(jù)純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計(jì)算冠菌酸收率為82%，根據(jù)冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計(jì)算冠菌酸純度為90% (見圖 2)。圖2為標(biāo)準(zhǔn)品(A)、冠菌酸粗提樣品(B)和本實(shí)施例提取得到的冠菌酸純度為 90%產(chǎn)品的HPLC圖譜。冠菌酸在該色譜條件下的保留時(shí)間是7分鐘。圖2的橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(分鐘)。實(shí)施例2、從微生物發(fā)酵液中提取冠菌酸1、發(fā)酵
挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276(記載在中國專利 ZL200510011466. 2 中)于斜面培養(yǎng)基(配方為 2%蛋白胨，0. 1 % KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 · 7H20,1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養(yǎng)基的pH 7. 0)上培養(yǎng)48_60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有l(wèi)Oug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(配方是2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1 % MgSO4 · 7H20 ；溶劑為水。該培養(yǎng)基的PH 7.0 ;121°C滅菌30min)中，28°C培養(yǎng)36-4 ,到對數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按5% (體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖15g，氯化銨1. 0g,KH2P044. lg,K2HP043. 6g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g，KNO3O. 3g, 2mM FeCl3IOml,用蒸餾水定容至1000ml。該培養(yǎng)基的pH 7.0)中，在溫度為21°C、轉(zhuǎn)速為260rpm的條件下發(fā)酵4天。2、純化取步驟1的發(fā)酵液4. 8L在室溫條件下3000g離心20分鐘，收集上清液，調(diào)pH為 3 ；將50克HZ818大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分含量)的鹽酸溶液以IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH =7.0;用3-5% (質(zhì)量百分含量)的NaOH溶液以 IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至ph = 7.0 ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液(pH值3)4. 8L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)8升/小時(shí)；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用3倍柱體積的乙醇洗脫，洗脫速率(吸附柱底部流出液的速度)為5升/小時(shí)，收集第3個(gè)柱體積的洗脫液；在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮乙醇洗脫液得浸膏，在40°C干燥得冠菌酸產(chǎn)品。將該冠菌酸產(chǎn)品用色譜甲醇進(jìn)行溶解。用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線同實(shí)施例1。將冠菌酸標(biāo)準(zhǔn)品和該冠菌酸產(chǎn)品用實(shí)施例1的分析型高效液相色譜儀按照上述色譜條件進(jìn)行純度分析。根據(jù)純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計(jì)算冠菌酸收率為80%，根據(jù)冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計(jì)算冠菌酸純度為92%。實(shí)施例3、從微生物發(fā)酵液中提取冠菌酸1、發(fā)酵挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種O^seudomonas syringae pv. glycinea)MW123(已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2533，已在中國專利ZL 200810119153. 2得到授權(quán))于斜面培養(yǎng)基(配方為 2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 ·7Η20，1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養(yǎng)基的PH 7.0)上，28°C培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有IOug/ ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(配方是2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. MgSO4 · 7H20 ；溶劑為水。該培養(yǎng)基的pH7. O ;121°C滅菌30min)中，28°C培養(yǎng) 36-4 ,到對數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按5% (體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖15g，氯化銨 1. Og, KH2PO4 4. lg, K2HPO4 3. 6g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, KNO3 0. 3g,2mM FeCl3 10ml，用蒸溜水定容至1000ml。該培養(yǎng)基的pH 7.0)中，在溫度為23°C、轉(zhuǎn)速為^Orpm的條件下發(fā)酵3 天。2、純化
取步驟1的發(fā)酵液16L在室溫條件下SOOOg離心3分鐘，收集上清液，調(diào)pH為 5. 5 ；；將150克YPRII大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分含量)的鹽酸溶液以IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH = 7;用3-5% (質(zhì)量百分含量)的NaOH溶液以IOL/小時(shí)的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至pH = 7. 0 ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液(pH為5.5) 16L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)為5升/小時(shí)；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用6倍柱體積的95%乙醇水溶液洗脫，洗脫速率(吸附柱底部流出液的速度)為4升/小時(shí)，收集第3-6 個(gè)柱體積的洗脫液；在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮該洗脫液得浸膏，在40°C 干燥得冠菌酸產(chǎn)品。將該冠菌酸產(chǎn)品用色譜甲醇進(jìn)行溶解。用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線同實(shí)施例1。將冠菌酸標(biāo)準(zhǔn)品和該冠菌酸產(chǎn)品用實(shí)施例1的分析型高效液相色譜儀按照上述色譜條件進(jìn)行純度分析。根據(jù)純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計(jì)算冠菌酸收率為85%，根據(jù)冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計(jì)算冠菌酸純度為89%。
權(quán)利要求
1.一種提取冠菌酸的方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進(jìn)行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂；所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機(jī)溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂的型號為HPD300、 HZ818 或 YPRII。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自下述7種物質(zhì)中的至少一種乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液和丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱吸附速率為4升/小時(shí)-8升/小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱量為3-200ml/g大孔吸附樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液按照包括如下步驟的方法制備在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵冠菌酸產(chǎn)生菌3-4天，收集發(fā)酵液中的上清液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法在將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱前，包括將所述上清液的PH值調(diào)至2-5. 5的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液，是將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液進(jìn)行離心，得到的去除沉淀的液體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述離心中，所采用的離心力 3000-8000g，離心時(shí)間是3-20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大孔樹脂制備冠菌酸的方法。該方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發(fā)酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進(jìn)行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂；所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機(jī)溶劑。本發(fā)明的方法具有冠菌酸提取得率高、操作簡單、生產(chǎn)成本低和對環(huán)境污染低的特點(diǎn)，適合大量制備冠菌酸樣品。
文檔編號C07C51/47GK102304040SQ201110140219
公開日2012年1月4日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者吳慧玲, 周繁, 岳躍森, 張博, 李召虎, 李茂營, 段留生, 譚偉明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)