專利名稱：一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙及抗體和細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙及抗體和細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
瘧疾是廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣地區(qū)的一種重要蟲媒傳染病。在所有蟲媒傳染性疾病中，瘧疾是發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。目前世界上仍有90多個(gè)國家、M億人生活在瘧疾流行區(qū)。每年有5億人發(fā)病，250多萬人死亡。發(fā)病和死亡的病例中，90%是在非洲和亞洲的貧窮國家。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前中國全國估計(jì)每年有25 — 30萬人發(fā)病。另外，瘧疾還是造成進(jìn)入瘧區(qū)部隊(duì)非戰(zhàn)斗減員的主要疾病之一。面對瘧疾對人類造成的嚴(yán)重威脅，世界衛(wèi)生組織(WHO)提出進(jìn)一步研究與開發(fā)更有效的瘧疾防治藥物和診斷技術(shù)，以達(dá)到2010年全球瘧疾死亡人數(shù)減少50%，2015年再減少50%的目標(biāo)。由于受各種因素的影響，瘧疾疫苗的研制進(jìn)展緩慢，因此實(shí)現(xiàn)瘧疾的快速有效的診斷和治療就顯得尤為重要。八十年代以來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因診斷技術(shù)的出現(xiàn)，瘧疾診斷方法也在不斷改進(jìn)，顯示了較高的敏感性和特異性，且實(shí)現(xiàn)了瘧疾的早期快速診斷。然而，這些方法都需要使用復(fù)雜的儀器設(shè)備和技術(shù)條件，所以難以在基層推廣應(yīng)用。以檢測瘧原蟲特異性抗原為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法具有快速、簡便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，在瘧疾診斷上日益受到重視。免疫學(xué)檢測主要是利用單克隆抗體檢測瘧原蟲的特異性抗原(即所謂抗原捕獲法)。根據(jù)瘧疾流行區(qū)偏僻、落后的特點(diǎn)，迄今已開發(fā)了多種適合瘧疾流行區(qū)現(xiàn)場使用的免疫層析檢測方法和相應(yīng)的試劑條。其原理為利用硝酸纖維素膜制備免疫層析測試條，在硝酸纖維素膜上包被抗被檢抗原的一株單克隆抗體作為捕獲帶，同時(shí)，將另一株單克隆抗體偶聯(lián)在膠體金或乳膠上作為檢測試劑。當(dāng)樣品溶液和檢測試劑通過捕獲帶時(shí)， 二者形成的復(fù)合物即被包被在膜上的抗體捕捉，如果樣品中含有被檢抗原，則捕獲帶可發(fā)生顏色反應(yīng)，并且顏色反應(yīng)的強(qiáng)弱與樣本中的抗原濃度成正比。目前報(bào)道的瘧原蟲診斷靶抗原主要有富組氨酸蛋白II (HRP II)和乳酸脫氫酶(LDH)。HRP-II是惡性瘧原蟲感染、特別是急性感染病人血清中存在的一種特異性標(biāo)志，幾乎在整個(gè)紅內(nèi)期均有分泌，在感染機(jī)體的血清中含量很高，有種特異性，且為暴露的抗原成分，被認(rèn)為是理想的惡性瘧原蟲診斷抗原。檢測惡性瘧原蟲的商品檢測條 ParaSight-F(dipstick)和 ICT Malaria P. f (ICTl)都是基于 HRP II建立的。但基于靶抗原HRPII的診斷方法存在某些缺點(diǎn)，包括=HRPII只存在于無性期和早期配子體中，故不能檢測僅含有成熟配子體的血液樣品；臨床癥狀已消失、血液中蟲體已被清除之后，HRPII仍會存在很長一段時(shí)間；由于抗HRPII單克隆抗體可能與類風(fēng)濕因子產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因而可能導(dǎo)致假陽性。乳酸脫氫酶(LDH)=LDH是另一種引人注意的瘧原蟲循環(huán)抗原，因其具有不同于人類紅細(xì)胞LDH的獨(dú)特理化和免疫化學(xué)性質(zhì)，在瘧疾診斷方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。不同種屬的瘧原蟲之間既具有各自的特異性，又具有交叉反應(yīng)，但都與人紅細(xì)胞和哺乳類LDH無交叉反應(yīng)，這些特性為瘧原蟲抗原檢測方法的建立提供了有利的理論依據(jù)。另外，LDH作為瘧疾診斷抗原，還有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)U)在各種瘧原蟲LDH之間不但有共同抗原表位，還具有種特異的抗原表位，因而能同時(shí)鑒別診斷惡性瘧和間日瘧；丨2] LDH僅由活蟲體產(chǎn)生，因此可用于鑒別蟲的死活，監(jiān)測治療效果及復(fù)燃情況。國外已有瘧原蟲LDH制成OptiMAL和ICT Malaria P. f/P. ν (ICT2)等免疫診斷試劑盒的報(bào)道，可同時(shí)診斷惡性瘧和間日瘧。但兩種方法都是利用惡性瘧原蟲的LDH來制備屬特異性抗體，通過排除法來診斷間日瘧。在層析條上包被兩株LDH單克隆抗體，一株為惡性瘧種特異性單克隆抗體，另一株為能與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲都反應(yīng)的屬特異性單克隆抗體，如兩條抗體帶均出現(xiàn)紅色反應(yīng)帶，即為惡性瘧或惡性瘧與間日瘧混合感染；如只有屬特異性單克隆抗體帶出現(xiàn)反應(yīng)，則為間日瘧感染。此種方法的缺點(diǎn)是當(dāng)兩條抗體帶均出現(xiàn)反應(yīng)時(shí)，無法對惡性瘧和混合感染進(jìn)行鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種雜交瘤細(xì)胞系4F6，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 3954。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。保藏日期 2010年6月25日。分類命名惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。一種雜交瘤細(xì)胞系2A5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC NO. 3955。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。保藏日期2010年6月25日。分類命名惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。一種雜交瘤細(xì)胞系1H12，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 3956。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。保藏日期2010年6月25日。分類命名惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。一種用于檢測間日瘧原蟲LDH的捕獲抗體4F6，由雜交瘤細(xì)胞系CGMCC NO. 3卯4分泌所得。一種用于檢測惡性瘧原蟲LDH的捕獲抗體2A5，由雜交瘤細(xì)胞系CGMCC NO. 3955分泌所得。一種用于檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲LDH的檢測抗體1H12，由雜交瘤細(xì)胞系 CGMCC N0. 3956 分泌所得。本發(fā)明所述單抗2A5能特異性結(jié)合惡性瘧原蟲LDH，不與間日瘧原蟲LDH結(jié)合；單抗4F6能特異性結(jié)合間日瘧原蟲LDH，不與惡性瘧原蟲LDH結(jié)合；而單抗1H12與兩種瘧原蟲LDH都能結(jié)合。三株單抗與其他哺乳動(dòng)物及寄生蟲的LDH反應(yīng)均為陰性，如人、鼠、兔紅細(xì)胞及弓形蟲、血吸蟲、華支睪吸蟲等。
本發(fā)明所述的三個(gè)單抗配對用于惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲抗原的鑒別檢測，主要是結(jié)合雙抗體夾心的膠體金免疫層析方法的檢測，其中單抗2A5作為捕獲惡性瘧原蟲LDH 抗體，單抗4F6作為捕獲間日瘧原蟲LDH抗體，單抗1H12結(jié)合膠體金顆粒作為檢測抗體。基于上述原理，本發(fā)明所述的單抗用于制備成可產(chǎn)業(yè)化的檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲抗原的試劑，該試劑可以是試紙的形式。所述的試紙可以是膠體金快速免疫層析檢測試紙。一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙，包括底板、樣品墊、聚酯纖維素墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品墊、聚酯纖維素墊、硝酸纖維素膜和吸水墊沿著底板的長度方向依次部分重疊并固定在底板上，聚酯纖維素墊上噴涂有一層膠體金-抗體 1H12復(fù)合物；硝酸纖維素膜上分布有第一檢測帶、第二檢測帶和質(zhì)控帶，其中第一檢測帶是在硝酸纖維素膜上噴涂抗體2A5形成，第二檢測帶是在硝酸纖維素膜上噴涂抗體4F6形成，質(zhì)控帶是在硝酸纖維素膜上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成；其中所述的膠體金-抗體 1H12復(fù)合物由抗體1H12包被在膠體金顆粒上制得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明所說的檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲抗原的試紙操作簡單，快速，敏感、特異，可用于瘧疾早期、快速診斷。本發(fā)明試紙與現(xiàn)有同類檢測瘧原蟲的試紙相比，由于同時(shí)使用抗惡性瘧原蟲LDH種特異性抗體和抗間日瘧原蟲LDH種特異性抗體，所以本發(fā)明的方法既能鑒別診斷單純的間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲感染，又能鑒別診斷混合感染。因此，本發(fā)明為瘧疾診斷領(lǐng)域提供了一種可供選擇的新方法。


圖1是本發(fā)明單抗2A5對惡性瘧原蟲感染全血、間日瘧原蟲感染全血及正常紅細(xì)胞裂解抗原進(jìn)行免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量為34kDa ；其中條帶1是Marker，條帶2是正常血紅細(xì)胞裂解抗原，條帶3是惡性瘧原蟲全血裂解抗原，條帶4為間日瘧原蟲全血裂解抗原。圖2是本發(fā)明單抗4F6對惡性瘧原蟲感染全血、間日瘧原蟲感染全血及正常紅細(xì)胞裂解抗原進(jìn)行免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量為34kDa ；其中條帶1是Marker，條帶2是正常血紅細(xì)胞裂解抗原，條帶3是惡性瘧原蟲全血裂解抗原，條帶4為間日瘧原蟲全血裂解抗原。圖3是本發(fā)明單抗1H12對惡性瘧原蟲感染全血、間日瘧原蟲感染全血及正常紅細(xì)胞裂解抗原進(jìn)行免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量為34Da ；其中條帶1是Marker，條帶2是惡性瘧原蟲全血裂解抗原，條帶3是間日瘧原蟲全血裂解抗原，條帶4為正常血紅細(xì)胞裂解抗原。圖4是本發(fā)明膠體金快速免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1是樣品墊，2是聚酯纖維素墊、3是硝酸纖維素膜、4是吸水墊、5是第一檢測帶、6是第二檢測帶、7是質(zhì)控帶、8 是底板。圖5是本發(fā)明檢測瘧疾的膠體金快速免疫層析試紙對惡性瘧原蟲感染血樣、間日瘧原蟲感染血樣、混合感染血樣及正常人血樣的檢測結(jié)果，其中1是混合感染血樣，2是惡性瘧原蟲感染血樣，3是間日瘧原蟲感染血樣，4正常人血樣。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定
本例舉例描述本發(fā)明的惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲免疫層析法中所使用的抗瘧原蟲抗體材料的制備。1、瘧原蟲重組抗原的制備
(I) PCR擴(kuò)增惡性瘧原蟲LDH (PfLDH)和間日瘧原蟲LDH (PvLDH)基因 ①PCR擴(kuò)增PfLDH基因
以惡性瘧原蟲海南株基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增PfLDH基因片段，引物為 PfLDH-Pl :5，- CCTCGAATTCATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT -3，(SEQ NO. 1) PfLDH-P2 :5， - CCCTGTCGACTTAAGCTAATGC2CT TCAT TCTCT -3， (SEQ NO.2) 反應(yīng)在50 ml體系中進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為93 °C變性5分鐘，93 °C 50秒V 45秒V 60秒， 共30個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳顯示在約 951bp處有一特異擴(kuò)增條帶，分子量大小與已報(bào)道的惡性瘧原蟲Honduras株的LDH —致。②PCR擴(kuò)增PvLDH基因
以海南現(xiàn)場采集的間日瘧原蟲血樣提取的間日瘧原蟲基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增 PvLDH基因片段，引物為
PvLDH-Pl: 5，- ATATGAATTCATGACGCCGAAACCCAAA -3，(SEQ NO. 3) PvLDH-P2 :5，- GTACGGATCCTTAAATGAGCGCCTTCA -3，(SEQ NO. 4) 反應(yīng)在50 ml體系中進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為94°C變性5分鐘，94°C 45秒。C 60秒。C 45秒， 共30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳顯示在約 951bp處有一特異擴(kuò)增條帶，分子量大小與已報(bào)道的間日瘧原蟲Belem株的LDH —致。i2j重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
①惡性瘧原蟲LDH重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
PfLDH PCR產(chǎn)物用EcoR I +Sal I酶切后，用低融點(diǎn)瓊脂糖電泳回收，與經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶解的PGEX-4T-1表達(dá)質(zhì)粒連接，取約30 μ 1連接液轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，分別培養(yǎng)后，小量提取質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR及EcoR I +Sal I雙酶切鑒定，陽性重組克隆能擴(kuò)增出約951bp的目的片段，用EcoR I + Sal I雙酶切后可產(chǎn)生約4900bp及951bp兩條帶，而空載體酶切后只有 4900bp的一條帶。測定的惡性瘧原蟲海南株(FCC1/HN) LDH基因的全編碼區(qū)長為951bp， 無內(nèi)含子，預(yù)測編碼316個(gè)氨基酸，分子量為34kDa，結(jié)果表明PfLDH基因已被正確克隆到 PGEX-4T-1載體中，從而得到定名為pGEX-PfLDH的重組質(zhì)粒。②間日瘧原蟲LDH重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
PvLDH PCR產(chǎn)物用EcoRI+BamHI酶切后，用低融點(diǎn)瓊脂糖電泳回收，與經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶解的PET23a表達(dá)質(zhì)粒連接，取約30 μ 1連接液轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，分別培養(yǎng)后，小量提取質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR及EcoRI + BamHI I雙酶切鑒定，陽性重組克隆能擴(kuò)增出約951bp的目的片段， 用EcoRI + BamHI雙酶切后可產(chǎn)生約3600bp及951bp兩條帶，而空載體酶切后只有3600bp 的一條帶。測定的間日瘧原蟲海南株LDH基因的編碼區(qū)全長也為951bp，無內(nèi)含子，預(yù)測編碼316個(gè)氨基酸，分子量為34kDa，結(jié)果表明PvLDH基因已被正確克隆到PET23a載體中，從而得到定名為PET23a-PvLDH的重組質(zhì)粒。(3)重組蛋白表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物分析 ①PfLDH重組蛋白的表達(dá)及鑒定
將pGEX-PfLDH重組表達(dá)質(zhì)粒接種于Amp + LB中培養(yǎng)過夜，次日按1% (V/V)比例轉(zhuǎn)入新鮮的、添加氨卞青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中。37°C培養(yǎng)至0D590值達(dá)0. 7時(shí)，加IPTG 至終濃度為lmmol/ L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h收菌。經(jīng)SDS — PAGE檢測，可見重組子表達(dá)產(chǎn)物顯示為一條分子量約為60kDa的新的蛋白條帶，作為對照的空質(zhì)粒載體的表達(dá)產(chǎn)物則只顯示一條約^kDa的條帶。ELISA分析顯示，鼠抗惡性瘧原蟲血清能夠與pGEX-PfLDH表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，而與BL21和pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)產(chǎn)物無反應(yīng)。將工程菌的表達(dá)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗惡性瘧原蟲血清為抗體進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果顯示在60kDa 蛋白處出現(xiàn)一特異性反應(yīng)條帶，而PGEX-4T-1轉(zhuǎn)化的細(xì)菌則未見相應(yīng)的帶。用純化后的重組蛋白免疫小鼠，40天后以瓊脂擴(kuò)散法檢測效價(jià)達(dá)1:16。 Western-blot分析結(jié)果顯示該血清能識別惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲分子量約為34kDa處的蟲源蛋白，但與紅細(xì)胞則幾乎無反應(yīng)。②PvLDH重組蛋白的表達(dá)及鑒定
PvLDH重組蛋白的表達(dá)與鑒定基本方法同PfLDH，PvLDH表達(dá)的誘導(dǎo)溫度為37°C，最佳誘導(dǎo)時(shí)相0D590為0. 8時(shí)，IPTG誘導(dǎo)濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4.證。SDS-PAGE檢測顯示獲得分子量約34kDa的新的蛋白區(qū)帶。ELISA分析顯示，鼠抗間日瘧原蟲血清能夠與pET23a-PvLDH表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，而與BL21和pET23a轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)產(chǎn)物無反應(yīng)。Western blot分析結(jié)果顯示鼠抗間日瘧原蟲血清能特異識別工程菌表達(dá)產(chǎn)物在34kDa蛋白處條帶， 而pET23a轉(zhuǎn)化的細(xì)菌則未見相應(yīng)的帶，而重組蛋白免疫小鼠獲得血清能同時(shí)識別惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲分子量約為34kDa處的蟲源蛋白，但與紅細(xì)胞則幾乎無反應(yīng)。2、抗惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲LDH抗體的制備
分別制備抗惡性瘧原蟲和抗間日瘧原蟲LDH抗體，方法如下。使用6-8周齡的Balb/C小鼠作為免疫動(dòng)物。首先用純化的重組LDH (75 μ g)加等體積完全弗氏佐劑乳化后，皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。2周后，以在不完全弗氏佐劑中乳化的同樣劑量蛋白進(jìn)行追加免疫。追加免疫后2周，再次用不含弗氏佐劑的同樣劑量蛋白腹腔注射，以進(jìn)行加強(qiáng)免疫。末次免疫后，從動(dòng)物的尾靜脈采血并測試抗體效價(jià)。必要時(shí)， 可于處死動(dòng)物分離脾細(xì)胞前3天，再加強(qiáng)免疫一次。血清抗體效價(jià)達(dá)到足夠的水平后，處死動(dòng)物并分離脾細(xì)胞，按適當(dāng)比例將被免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合并在PEG-4000作用下融合之。以純化的重組蛋白包被微量滴定板，然后以間接ELISA法檢測雜交瘤陽性克隆， 并用有限稀釋法對檢出的陽性克隆進(jìn)行亞克隆。PfLDH組首先用重組融合蛋白進(jìn)行篩選，有20孔為陽性，經(jīng)pGEX_4T_l誘導(dǎo)菌、惡性瘧原蟲和紅細(xì)胞蛋白復(fù)篩，得到2株僅與惡性瘧原蟲蟲體蛋白發(fā)生反應(yīng)，而與PGEX-4T-1 誘導(dǎo)菌和紅細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞株，命名為IHlO和2A5。2A5經(jīng)2次亞克隆，IHlO經(jīng)3次亞克隆后，建立了穩(wěn)定的抗PfLDH雜交瘤細(xì)胞株。 兩種單克隆抗體與間日瘧原蟲蟲體抗原進(jìn)行ELISA和Wfestern blot反應(yīng)，均為陰性，表明兩單克隆抗體均為惡性瘧原蟲種特異性單克隆抗體，此組融合未篩選到能同時(shí)與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲反應(yīng)的屬特異性單克隆抗體。PvLDH組亦首先用重組蛋白進(jìn)行篩選，有四孔為陽性，經(jīng)pET23a誘導(dǎo)菌、間日瘧原蟲和紅細(xì)胞蛋白復(fù)篩，得到5株僅與間日瘧原蟲蟲體蛋白發(fā)生反應(yīng)，而與pET23a誘導(dǎo)菌和紅細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞株，命名為1D8、1H12、2E9、3F10和4F6。5株單克隆抗體經(jīng)2 3 次亞克隆后，建立了穩(wěn)定的抗PvLDH雜交瘤細(xì)胞株。五種單克隆抗體與惡性瘧原蟲蟲體抗原進(jìn)行ELISA和Wfestern blot反應(yīng)，1D8、4F6和3F10反應(yīng)陰性，為間日瘧原蟲種特異性單克隆抗體，2E9和1H12反應(yīng)陽性，為能同時(shí)與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲反應(yīng)的屬特異性單克隆抗體。對上述7種單克隆抗體進(jìn)行配對，檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲LDH抗原，結(jié)果顯示，優(yōu)選單抗為惡性瘧原蟲種特異性單克隆抗體2A5、間日瘧原蟲種特異性單克隆抗體4F6 和交叉反應(yīng)性單克隆抗體1H12，最終選擇此三種單抗進(jìn)行瘧原蟲快速檢測試劑盒的研制。ELISA試驗(yàn)表明，在體外培養(yǎng)條件下，得自雜交瘤培養(yǎng)物上清的抗體2A5、1H12和 4F6的效價(jià)分別為1 :512、1 :256和1 :256。在體內(nèi)培養(yǎng)條件下，得自動(dòng)物腹水液的抗體效價(jià)為分別1 :51200,1 :25600和1 :25600。進(jìn)一步的抗體分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2A5和1H12雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體類型為IgGl，4F6雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體類型為IgGh。對三株雜交瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察可見，它們的染色體數(shù)目范圍在92 110之間，并且大多數(shù)為端著絲點(diǎn)， 少數(shù)為亞中部及中央著絲點(diǎn)。三株單抗2A5、4F6和1H12分別對惡性瘧原蟲感染全血、間日瘧原蟲感染全血及正常紅細(xì)胞裂解抗原進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示單抗2A5僅與惡性瘧原蟲全血裂解抗原中分子量約34kDa的條帶結(jié)合(圖1)；單抗4F6僅與間日瘧原蟲全血裂解抗原中分子量約34kDa的條帶結(jié)合(圖2)；單抗1H12可同時(shí)與惡性瘧原蟲全血裂解抗原和間日瘧原蟲全血裂解抗原中分子量約34kDa的條帶結(jié)合(圖3)；三株單抗均不與正常血紅細(xì)胞裂解抗原發(fā)生反應(yīng)。實(shí)施例2 本發(fā)明檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析試紙 1、1H12單克隆抗體的純化和膠體金標(biāo)記
用 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 柱(Amersham)純化 1H12 單克隆抗體腹水。采用檸檬酸三鈉還原法制備20-30nm膠體金溶液。以0. IM碳酸鉀調(diào)膠體金pH值為7. 2，加入適量單克隆抗體1H12，室溫?cái)嚢?0min，然后加入BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)室溫?cái)嚢?0min ； 溶液高速離心后棄上清，沉淀用20mmol/L TBS(pH 8. 2)溶解，4°C保存?zhèn)溆谩Ｖ谱鹘饦?biāo)墊時(shí)，取膠體金-抗體結(jié)合物原液anl，用稀釋液稀釋至Hml。將聚酯纖維素膜浸泡在膠體金-抗體溶液10分鐘，37°c烤干后熱合封口并置于4°C下保存?zhèn)溆谩?、抗體固相硝酸纖維素膜的制備
用固相溶液(0. 02mol/L PB, pH8. 0)將純化的2A5和4F6單克隆抗體稀釋至2. 5mg/ ml,同時(shí)取羊抗小鼠IgG用固相溶液稀釋至ang/ml。將三種抗體分別點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜 iOA5、4F6和羊抗小鼠IgG分別加樣于第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線處)，然后將硝酸纖維素膜置于封閉液(1%脫脂奶粉)中37°C孵育1小時(shí)，在洗滌液(0. 02mol/L PB, ρΗ7· 0) 中將負(fù)載固相化抗體的硝酸纖維素膜浸洗二次，然后室溫風(fēng)干并置4°C下保存。3、免疫層析檢測試紙的制作
如圖4所示，一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙，包括PVC底板8、樣品墊1、聚酯纖維素墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4，所述樣品墊1、聚酯纖維素墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4沿著底板8的長度方向依次部分重疊并固定在底板8上，聚酯纖維素墊2上噴涂有一層膠體金-抗體1H12復(fù)合物；硝酸纖維素膜3上分布有第一檢測帶5、第二檢測帶6和質(zhì)控帶7，其中第一檢測帶5是在硝酸纖維素膜3上噴涂抗體2A5形成，第二檢測帶6是在硝酸纖維素膜3上噴涂抗體4F6形成，質(zhì)控帶7是在硝酸纖維素膜3上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成；其中所述的膠體金-抗體1H12復(fù)合物由抗體1H12包被在膠體金顆粒上制得。首先將PVC底板8平鋪于臺面上，輕輕揭開板中端的保護(hù)膜，將硝酸纖維素膜粘附于其上；然后揭開硝酸纖維素膜下緣的保護(hù)膜，將聚酯纖維素墊粘附于其上，聚酯纖維素墊覆蓋在硝酸纖維素膜上Imm ；再揭開薄板最下端的保護(hù)膜，將樣品墊1粘附于其上，樣品墊覆蓋在聚酯纖維素墊上3mm ；再揭開板上端的保護(hù)膜，將吸水墊4粘附于其上，吸水墊4 覆蓋在硝酸纖維素膜上2mm ；最后在自動(dòng)切條機(jī)上將貼好的PVC底板8切成3mm寬的測試條，將每個(gè)測試條裝入卡式塑料盒內(nèi)，置于鋁箔袋中，并加入干燥劑，熱合封口，即完成免疫層析檢測板的制作。4、本發(fā)明試紙對瘧疾血樣進(jìn)行檢測。從真空包裝袋中取出檢測試紙，置于干凈平坦的臺面上，用一次性毛細(xì)吸管垂直滴入 ομ 1全血標(biāo)本于加樣孔中，再滴入3滴緩沖液，15分鐘內(nèi)讀取測試結(jié)果。陽性反應(yīng)為質(zhì)控線出現(xiàn)陽性的前提下，兩條檢測線至少一條出現(xiàn)紅色。僅第一檢測線呈紅色判斷為惡性瘧原蟲感染，僅第二檢測線呈紅色判斷為間日瘧原蟲感染，第一和第二檢測線同時(shí)呈紅色判斷為惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲混合感染。陰性反應(yīng)則只有一條紅色的質(zhì)控線(圖5)。在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，我們使用本發(fā)明的方法共檢測了門診可疑瘧疾患者血液樣品258份。以鏡檢法檢查的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，并對自制檢測條及國外OptiMAL試劑盒(荷蘭 DiaMed AG公司生產(chǎn))檢測瘧原蟲感染的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如下列表1所示。表1.自制檢測條和OptiMAL試劑盒檢測瘧疾的比較
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞系4F6，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC NO. 3卯4。
2.一種雜交瘤細(xì)胞系1H12，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC NO. 3956。
3.一種用于檢測間日瘧原蟲LDH的捕獲抗體4F6，其特征在于由雜交瘤細(xì)胞系CGMCC NO. 3954分泌所得。
4.一種用于檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲LDH的檢測抗體1H12，其特征在于由雜交瘤細(xì)胞系CGMCC NO. 3956分泌所得。
5.一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙，其特征在于包括底板(8)、 樣品墊(1)、聚酯纖維素墊(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)，所述樣品墊(1)、聚酯纖維素墊(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)沿著底板(8)的長度方向依次部分重疊并固定在底板(8)上，聚酯纖維素墊(2)上噴涂有一層膠體金-抗體1H12復(fù)合物；硝酸纖維素膜(3) 上分布有第一檢測帶(5)、第二檢測帶(6)和質(zhì)控帶(7)，其中第一檢測帶(5)是在硝酸纖維素膜(3 )上噴涂抗體2A5形成，第二檢測帶(6 )是在硝酸纖維素膜(3 )上噴涂抗體4F6形成， 質(zhì)控帶(7)是在硝酸纖維素膜(3)上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成；其中所述的膠體金-抗體1H12復(fù)合物由抗體1H12包被在膠體金顆粒上制得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測瘧原蟲的膠體金快速免疫層析檢測試紙及抗體和細(xì)胞株。本發(fā)明的檢測試紙包括底板、樣品墊、聚酯纖維素墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品墊、聚酯纖維素墊、硝酸纖維素膜和吸水墊沿著底板的長度方向依次部分重疊并固定在底板上，聚酯纖維素墊上噴涂有一層膠體金-抗體1H12復(fù)合物；硝酸纖維素膜上分布有第一檢測帶、第二檢測帶和質(zhì)控帶，其中第一檢測帶是在硝酸纖維素膜上噴涂抗體2A5形成，第二檢測帶是在硝酸纖維素膜上噴涂抗體4F6形成，質(zhì)控帶是在硝酸纖維素膜上噴涂羊抗小鼠IgG1抗體形成。本發(fā)明所說的檢測試紙操作簡單，快速，敏感、特異，可用于瘧疾早期、快速診斷。
文檔編號C07K16/20GK102229913SQ20111013852
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者吳英松, 廖小青, 徐偉文, 李明, 王萍, 羅樹紅, 郝文波 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)