專利名稱：一種文蛤多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種文蛤多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
海洋生物的多樣性、海洋環(huán)境的獨(dú)特性以及海洋生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的新穎性使海洋成為創(chuàng)新藥物與功能性/保健食品的資源寶庫。自上世紀(jì)70年代以來，人們已經(jīng)從海洋生物中分離出數(shù)萬種新型活性物質(zhì)，包括肽類、蛋白質(zhì)類、多糖類、生物堿類、萜類、大環(huán)聚酯類等多種類型。其中，肽類是數(shù)量最龐大的一類化合物。現(xiàn)已證明，多種海洋肽類具有抗腫瘤、抗艾滋病、抗真菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生理活性。惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。目前，腫瘤化療技術(shù)已經(jīng)有所進(jìn)步，腫瘤患者生存時(shí)間明顯延長，特別是對(duì)白血病、惡性淋巴瘤等的治療有了突破，但對(duì)危害人類生命健康最嚴(yán)重的、占惡性腫瘤90%以上的實(shí)體瘤的治療還未能達(dá)到滿意的效果，普遍存在著治療有效率低、選擇性差、毒副作用大、易產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞耐藥等問題。因此， 尋找高效、低毒、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物仍是藥物治療的當(dāng)務(wù)之急。多肽類藥物因其分子量小、活性高、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，日益引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Didemnin B是Rinehart小組于1981年從海鞘Trididemnum solidum中分離獲得的具有抗病毒和細(xì)胞毒活性的環(huán)肽化合物，于1984年進(jìn)入I期臨床實(shí)驗(yàn)階段，是第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的海洋藥物。藥理研究結(jié)果表明，該化合物具有強(qiáng)烈的抗腫瘤活性，對(duì)L1210白血病細(xì)胞的IC5tl達(dá)到2ng/mL，同時(shí)其還具有顯著的抗P388白血病和B16黑色素瘤活性。 Dolastatin 10是Pettit小組從軟體動(dòng)物海兔Dolabellaauricularia中分離獲得的線性五肽，目前已開發(fā)了多種Dolastatins衍生物。Dolastatins類化合物能夠抑制微管聚合， 促進(jìn)其解聚，進(jìn)而干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，是一類新型的海洋生物來源的腫瘤細(xì)胞生長抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dolastatin 10能誘導(dǎo)多株細(xì)胞發(fā)生凋亡。更令人感興趣的是，近來發(fā)現(xiàn)作用于微管的藥物能明顯降低腫瘤血管的血流量，其中Dolastatin 10能降低腫瘤血管90 %的血流量。其具體機(jī)制尚不明了，可能與其影響腫瘤血管的微管功能有關(guān)，這無疑為實(shí)體瘤的治療提供了新手段和新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種文蛤多肽及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種文蛤多肽所述文蛤多肽N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa， 等電點(diǎn)為8. 85。所述文蛤多肽按如下步驟制備1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，每次在4°C靜置沉淀12小時(shí)；2)將步驟1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待
3)取步驟幻中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefast flow陽離子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為 0. IM NaCl的緩沖液的洗脫峰，待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩沖液；4)將步驟幻所得活性組分過Wienyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分別含濃度為2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為IM NaCl的緩沖液的洗脫峰， 待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5的緩沖液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的ReSOurCel5Q陰離子交換柱進(jìn)行分離，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的5. 5%時(shí)出現(xiàn)活性組分，即為N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多肽，其中 A 液為 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步驟1)中上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉淀。所述步驟1)中離心條件為lOOOOXg，離心20分鐘。文蛤多肽的制備方法1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，每次在4°C靜置沉淀12小時(shí)；2)將步驟1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待用；3)取步驟2~)中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefast flow陽離子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為 0. IM NaCl的緩沖液的洗脫峰，待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩沖液；4)將步驟幻所得活性組分過Wienyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分別含濃度為2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為IM NaCl的緩沖液的洗脫峰， 待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5的緩沖液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的ReSOurCel5Q陰離子交換柱進(jìn)行分離，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的5. 5%時(shí)出現(xiàn)活性組分，即為N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多肽，其中 A 液為 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步驟1)中上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉淀。所述步驟1)中離心條件為lOOOOXg，離心20分鐘。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1、多肽類藥物具有分子量小、無免疫原性、結(jié)構(gòu)簡單、活性高、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床方面有很好的應(yīng)用前景。
2、本發(fā)明從文蛤中提取多肽，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很高抑制活性的物質(zhì)。通過不斷優(yōu)化其為一分子量大小為15KDa的多肽類物質(zhì)。用MTT比色法檢測(cè)其抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)該化合物能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，但對(duì)正常細(xì)胞沒有抑制作用。該多肽能夠選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖的特點(diǎn)使其很有潛力成為新的抗癌藥物。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的文蛤多肽的SDS-PAGE電泳分析圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1文蛤體液抗腫瘤多肽的制備(1)取新鮮文蛤，開殼收集其體液，經(jīng)IOOOOXg離心20分鐘，去除沉淀。按照硫酸銨沉淀劑用量表向上清中緩慢加入已研磨成細(xì)粉末狀的硫酸銨至30%飽和度，4°C靜置12 小時(shí)，IOOOOXg離心20分鐘，分別收集沉淀和上清，再次向上清中加入硫酸銨至70%飽和度，4°C靜置12小時(shí)，IOOOOXg離心20分鐘，收集沉淀和上清，按上述方法再次向上清中加入硫酸銨至95%飽和度，4°C靜置12小時(shí)，IOOOOXg離心20分鐘，收集沉淀。(2)將活性組分所在的沉淀用純水溶解，微濾以去除不溶物，然后過5KDa和50KDa 超濾膜將其按分子量劃分成三部分。(3)取分子量在5_50KDa之間的活性部分對(duì)純水透析，然后對(duì)緩沖液充分透析， 將透析好的樣品過CM-kpharose fast flow陽離子交換柱，分別用含不同濃度0M、0. 1M、 0. 5M、2M的NaCl的緩沖液洗脫。所用緩沖液為0. 05M NaAc,pH5. 5緩沖液。將各洗脫峰對(duì)純水透析，冷凍干燥，各取少量用適量純水溶解，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，用MTT比色法檢測(cè)各組份活性，發(fā)現(xiàn)活性組分位于含有0. IM NaCl的洗脫液中，將活性組份置于_20°C保存。(4)將步驟(3)中活性組分用含有2. 5M NaCl的緩沖液充分透析，將透析好的樣品過Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，分別用含不同濃度2M、1M、0M的NaCl的緩沖液洗脫。所用緩沖液為0.05M NaAc，pH5. 5緩沖液。將各洗脫峰對(duì)純水透析，冷凍干燥，各取少量用適量純水溶解，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，用MTT比色法檢測(cè)各組份活性，發(fā)現(xiàn)活性組分位于含有IM NaCl的洗脫液中，將活性組份置于_20°C保存。(5)將步驟(4)中活性組分用A液溶解后，用快速蛋白液相色譜(FPLC)的 Resource 15Q陰離子交換柱進(jìn)行分離，采用梯度洗脫方法進(jìn)行活性組分洗脫。洗脫液為A 液和B液，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的100%，B液以每分鐘1.5%的速率上升，流速為lml/min。將各洗脫峰對(duì)純水透析，冷凍干燥，各取少量用適量純水溶解，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，MTT比色法檢測(cè)各組份活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)B液占總洗脫液體積的5. 5%時(shí)出現(xiàn)活性組分，將活性組分置于_20°C保存。所用A液為0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B液為IMNaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。(6)將步驟(5)中活性組分用A液溶解，經(jīng)高效液相色譜(HPLC) C-18反相柱檢測(cè)純度。洗脫液為Α液為0. l%TFA+99. 9%超純水，B液為0. l%TFA+99. 9%乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。起始濃度為A液90%，B液10%，B液濃度每分鐘上升1 %，流速為0. 5ml/min,當(dāng)B液占總洗脫液體積的43. 5%時(shí)出現(xiàn)洗脫峰。洗脫峰為單一峰，說明該組分為單一組分。此組分N-末端序列測(cè)定為IDEIQNTGGGTNFR，等電點(diǎn)由等電聚焦電泳測(cè)定為PI = 8. 85。(7)將此單一組分進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。取此單一組分進(jìn)行電泳，用分子量范圍在 14. 4-116KDa的蛋白Marker作為對(duì)照。5%的濃縮膠采用80V電壓，15%的分離膠采用120V 電壓。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色。6小時(shí)后，用脫色液脫色直至蛋白質(zhì)條帶清晰可見。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MKDa左右有單一的蛋白條帶(參見圖1)。實(shí)施例2 文蛤多肽體外抑制腫瘤細(xì)胞活性抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)人肺癌細(xì)胞(AM9)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-15)、人胰腺癌細(xì)胞(ASPC-I)可用來評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的活性強(qiáng)弱，操作簡便，重現(xiàn)性好。實(shí)驗(yàn)方法(MTT法)四氮唑鹽(MTT)是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞的線粒體中與NADH有關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臜(formazan)，而死細(xì)胞則沒有此功能。Formazan結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，該結(jié)晶的DMSO溶液在570納米處有最大吸收峰，所以，可通過檢測(cè)formazan結(jié)晶的量來評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。各種細(xì)胞株按照常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 5X IO4個(gè)細(xì)胞/毫升，按每孔180微升接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。樣品為上述實(shí)施例制備所得的文蛤多肽，其設(shè)定5個(gè)濃度梯度，即為 15，30，45，60，75 μ g/ml，每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)平行孔。陽性對(duì)照組為5-FU，陰性對(duì)照組為不含樣品的培養(yǎng)基。每孔各加樣品或?qū)φ?0微升。培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔各加入濃度為5mg/ml 的MTT 50微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，除去上清液。每孔各加入DMSO 150微升，在微量震蕩器上震蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570納米處的吸光值(0D值)。取四個(gè)平行孔的平均OD值按公式= (0D_對(duì)照-OD樣/OD_對(duì)照X 100%計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率aR%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活性組分在45ug/ml濃度時(shí)能夠強(qiáng)烈抑制人肺癌細(xì)胞(AM9)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、 人乳腺癌細(xì)胞(MCF-15)、人胰腺癌細(xì)胞(ASPC-I)的增殖，抑制率達(dá)到40%-80%，但是對(duì)人正常乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)、鼠成纖維細(xì)胞(OTH/3T;3)都沒有抑制作用，說明該物質(zhì)能夠選擇性的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
權(quán)利要求
1.一種文蛤多肽，其特征在于所述文蛤多肽N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa，等電點(diǎn)為8. 85。
2.按權(quán)利要求1所述的文蛤多肽，其特征在于所述文蛤多肽按如下步驟制備1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，每次在4°C靜置沉淀12小時(shí)；2)將步驟1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待用；3)取步驟幻中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefastflow陽離子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為0. IM NaCl的緩沖液的洗脫峰，待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩沖液；4)將步驟幻所得活性組分過WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分別含濃度為 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為IM NaCl的緩沖液的洗脫峰，待用； 所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5的緩沖液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的ReS0UrCel5Q陰離子交換柱進(jìn)行分離，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的5. 5%時(shí)出現(xiàn)活性組分，即為N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多肽，其中 A 液為 0. 02M Tris，ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris，ρΗ9· 0。
3.按權(quán)利要求2所述的文蛤多肽，其特征在于所述步驟1)中上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和度 ’離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉淀。
4.按權(quán)利要求2或3所述的文蛤多肽，其特征在于所述步驟1)中離心條件為 10000 X g，離心20分鐘。
5.一種權(quán)利要求1所述的文蛤多肽的制備方法，其特征在于文蛤多肽按如下步驟制備1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，每次在4°c靜置沉淀12小時(shí)；2)將步驟1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待用；3)取步驟幻中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefastflow陽離子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為0. IM NaCl的緩沖液的洗脫峰，待用；所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩沖液；4)將步驟幻所得活性組分過WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分別含濃度為 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的緩沖液洗脫，收集含濃度為IMNaCl的緩沖液的洗脫峰，待用； 所述緩沖液為0. 05M NaAc, pH5. 5的緩沖液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的ReS0UrCel5Q陰離子交換柱進(jìn)行分離，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的5. 5%時(shí)出現(xiàn)活性組分，即為N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多肽，其中 A 液為 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。
6.按權(quán)利要求5所述的文蛤多肽，其特征在于所述步驟1)中上清進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和度 ’離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉淀。
7.按權(quán)利要求5或6所述的文蛤多肽，其特征在于所述步驟1)中離心條件為 10000 X g，離心20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種文蛤多肽及其制備方法，所述文蛤多肽N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa。制備將文蛤體液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、反相層析后獲得一種分子量為15KDa的多肽。本發(fā)明還涉及該多肽在預(yù)防和/或治療惡性腫瘤的用途。本發(fā)明從文蛤中提取多肽，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很高抑制活性。通過不斷優(yōu)化其為一分子量大小為15KDa的多肽類物質(zhì)。用MTT比色法檢測(cè)其抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)該化合物能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，但對(duì)正常細(xì)胞沒有抑制作用。該多肽能夠選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖的特點(diǎn)使其很有潛力成為新的抗癌藥物。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102161699SQ20111003654
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者劉明, 林秀坤, 王惠, 王翠翠, 程林友, 鄭蘭紅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所