專利名稱：一種文蛤提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自動物體中得到的提取物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種文蛤提取物及其制備方法與應(yīng)用。
海洋文蛤含有蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸、凝集素等多種成分，文蛤提取物中含有抑制腫瘤生長的活性物質(zhì)，因而常用于腫瘤的治療。上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院柯玲等觀察海洋文蛤提取物臨床治療肺癌的效果，發(fā)現(xiàn)它能夠?qū)ν砥诜伟┎∪烁纳瓢Y狀，延長病人生命，且無不良副反應(yīng)(海洋藥物，2，22-24，1987)；中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所陳漢源等報道文蛤提取物動物試驗和臨床試驗抗癌結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其對動物移植性S-180瘤的抑瘤率達到59％(腫瘤防治研究，4，3-7，1980)，對晚期肝癌、胃癌病人能明顯延長生存時間；安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所羅運滿等報道文蛤肉冷提取物的部分藥理作用，發(fā)現(xiàn)文蛤肉能明顯提高小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)，促進小鼠抗SRBC抗體生成能力，說明文蛤肉可增強小鼠體液和細胞免疫功能(中國海洋藥物，2，14-17，1996)。這些報道多以研究文蛤提取物的活性為目的，對提取物中活性成分及其提取方法，尤其是對于文蛤中何種成分具有抗腫瘤活性研究較少。
一種文蛤提取物，它是由包括下述步驟的方法制備的1)在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿，離心取上清液；2)0-4℃條件下，用10-40％硫酸銨溶液抽提上述上清液，離心，收集上清液并過濾后得到濾液；3)將濾液進行柱層析，收集在215和/或280nm下有吸收峰的多肽組分，干燥得成品。
在上述過程中，所述在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿時所用的是為文蛤肉1-3倍0℃的蒸餾水，勻漿時間為25-35分鐘。
所述用10-40％硫酸銨溶液抽提上清液分兩次進行，第一次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.5-1∶3；第二次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.2-1∶2，攪拌時間分別為0.5-1小時；離心后得到的上清液經(jīng)超濾后得到濾液。
所述柱層析中的填料為Sephadex G-25葡聚糖凝膠，流動相為蒸餾水；干燥采用冷凍干燥的方式。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備具有抑癌活性的文蛤提取物的方法。
一種制備文蛤提取物的方法，包括以下步驟1)在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿，離心取上清液；2)0-4℃條件下，用10-40％硫酸銨溶液抽提上述上清液，離心，收集上清液并過濾后得到濾液；3)將濾液進行柱層析，收集在215和/或280nm下有吸收峰的多肽組分，干燥得成品。
在上述過程中，所述在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿時所用的是為文蛤肉1-3倍0℃的蒸餾水，勻漿時間為25-35分鐘。
所述用10-40％硫酸銨溶液抽提上清液分兩次進行，第一次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.5-1∶3；第二次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.2-1∶2，攪拌時間分別為0.5-1小時；離心后得到的上清液經(jīng)超濾后得到濾液。
所述柱層析中的填料為Sephadex G-25葡聚糖凝膠，流動相為蒸餾水；干燥采用冷凍干燥的方式。
本發(fā)明的第三個目的是提供具有抑癌活性的文蛤提取物的應(yīng)用。
以治療有效量的上述文蛤提取物為活性成份的抑制腫瘤藥物，特別是治療肝癌、肺癌及乳腺癌的藥物，對腫瘤具有良好的抑制和治療作用。
具體應(yīng)用時，在藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備本發(fā)明藥物的用量一般為每天0.1-1.0mg/kg體重。
本發(fā)明通過現(xiàn)代生物分離技術(shù)，從文蛤中提取、分離純化活性肽，其提取方法及產(chǎn)品具有以下特性1、以新鮮的文蛤肉為原料，進行低溫勻漿和離心處理，確保文蛤多肽活性不受損失。
2、采用硫酸胺沉淀、超濾和柱層析技術(shù)相結(jié)合的方法，能夠得到較純的活性肽組分。經(jīng)勻漿、離心后得到的提取物中除多肽外，仍有大分子的蛋白質(zhì)，多糖等其他雜質(zhì)，通過硫酸胺分級沉淀，可以去除雜蛋白，通過超濾，既可以去除多糖等其他大分子雜質(zhì)，又可以進行濃縮，再經(jīng)過葡聚糖凝膠柱層析，可以達到脫鹽及去除其他小分子雜質(zhì)的目的。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
二、活性物質(zhì)對腫瘤細胞的抑制作用把上述文蛤活性肽提取物用蒸餾水溶解，配成20mg/ml母液，-20℃保存?zhèn)溆?。實驗時用培養(yǎng)基稀釋，最終用藥濃度為100μg/ml。將生長到對數(shù)期的不同腫瘤細胞用消化液消化成細胞懸液，并以每孔103-104個細胞，200μl的量接種到96孔培養(yǎng)板。24小時后，移去培養(yǎng)板孔中的培養(yǎng)基，換之以新鮮的活性肽藥液，每孔200μl。加藥處理后分別培養(yǎng)3天，然后每孔加入20μl的MTT溶液，37℃繼續(xù)培育4小時。小心去除孔內(nèi)培養(yǎng)物的上清，然后每孔加入200μl的DMSO，水平搖床上震蕩20分鐘，保證結(jié)晶充分溶解。在490nm處檢測各孔的光吸收值，計算抑制率。結(jié)果表明，對人肝癌細胞Hep G2的抑制率為63.1％，對人肺癌細胞的抑制率為54.7％，對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率為67.5％。
三、活性物質(zhì)對小鼠實體瘤的抑制作用采用小鼠右后肢皮下接種S180實體瘤細胞懸液，用上述提取物按6mg/kg體重靜脈給藥，結(jié)果表明對S180實體瘤的抑制率為59.2％。
實施例2一、活性物質(zhì)的提取取1000克新鮮文蛤肉，加入3000毫升冷卻至0℃的蒸餾水，用勻漿器勻漿25分鐘，在4℃條件下離心10分鐘，上清液加入3000毫升10％硫酸銨溶液，在4℃條件下攪拌提取1小時；在4℃下離心20分鐘；上清液再加入1000毫升25％硫酸銨溶液，在4℃條件下攪拌提取1小時；離心10分鐘；合并上清液，用超濾器將該土清液濃縮，分子截留量10000道爾頓；復(fù)將濃縮液進行Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱層析，用蒸餾水洗脫，收集在280nm下有吸收峰的多肽組分，合并，真空冷凍干燥，得文蛤活性肽提取物14.7克，得率1.47％。
二、活性物質(zhì)對腫瘤細胞的抑制作用按照實施例1所述MTT方法檢測，結(jié)果是本發(fā)明的提取物對人肝癌細胞Hep G2的抑制率為47.6％，對人肺癌細胞的抑制率為56.3％，對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率為53.1％。
三、活性物質(zhì)對小鼠實體瘤的抑制作用采用小鼠右后肢皮下接種S180實體瘤細胞懸液，用上述提取物按6mg/kg靜脈給藥，結(jié)果表明對S180實體瘤的抑制率為51.8％。
實施例3一、活性物質(zhì)的提取取500克新鮮文蛤肉，加入1000毫升冷卻至0℃的蒸餾水，用勻漿器勻漿35分鐘，在4℃條件下離心30分鐘，上清液加入800毫升10％硫酸銨溶液，在4℃條件下攪拌提取1小時；在4℃下離心50分鐘；上清液再加入800毫升40％硫酸銨溶液，在4℃條件下攪拌提取1小時；離心50分鐘；合并上清液，用超濾器將該上清液濃縮，分子截留量10000道爾頓；復(fù)將濃縮液進行Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱層析，用蒸餾水洗脫，收集在215下有吸收峰的多肽組分，合并，真空冷凍干燥，得文蛤活性肽提取物5.2克，得率1.04％。
二、活性物質(zhì)對腫瘤細胞的抑制作用按照實施例一所述MTT方法檢測，結(jié)果是本發(fā)明的提取物對人肝癌細胞Hep G2的抑制率為45％，對人肺癌細胞的抑制率為33.7％，對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率為47.2％。
三、活性物質(zhì)對小鼠實體瘤的抑制作用采用小鼠右后肢皮下接種S180實體瘤細胞懸液，用上述提取物按6mg/kg靜脈給藥，結(jié)果表明對S180實體瘤的抑制率為36.7％。
權(quán)利要求
1.一種文蛤提取物，它是由包括下述步驟的方法制備的1)在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿，離心取上清液；2)0-4℃條件下，用10-40％硫酸銨溶液抽提上述上清液，離心，收集上清液并過濾后得到濾液；3)將濾液進行柱層析，收集在215和/或280nm下有吸收峰的多肽組分，干燥得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文蛤提取物，其特征在于所述在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿時所用的是為文蛤肉1-3倍0℃的蒸餾水，勻漿時間為25-35分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文蛤提取物，其特征在于所述用10-40％硫酸銨溶液抽提上清液分兩次進行，第一次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.5-1∶3；第二次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.2-1∶2，攪拌時間分別為0.5-1小時；離心后得到的上清液經(jīng)超濾后得到濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文蛤提取物，其特征在于所述柱層析中的填料為Sephadex G-25葡聚糖凝膠，流動相為蒸餾水；干燥采用冷凍干燥的方式。
5.一種制備文蛤提取物的方法，包括以下步驟1)在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿，離心取上清液；2)0-4℃條件下，用10-40％硫酸銨溶液抽提上述上清液，離心，收集上清液并過濾后得到濾液；3)將濾液進行柱層析，收集在215和/或280nm下有吸收峰的多肽組分，干燥得成品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述在0-4℃下條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿時所用的是為文蛤肉1-3倍0℃的蒸餾水，勻漿時間為25-35分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用10-40％硫酸銨溶液抽提上清液分兩次進行，第一次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.5-1∶3；第二次上清液和硫酸銨溶液的重量比為1∶0.2-1∶2，攪拌時間分別為0.5-1小時；離心后得到的上清液經(jīng)超濾后得到濾液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述柱層析中的填料為SephadexG-25葡聚糖凝膠，流動相為蒸餾水；干燥采用冷凍干燥的方式。
9.一種抗腫瘤藥物，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的文蛤提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述藥物為治療肝癌的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述藥物為治療肺癌的藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述藥物為治療乳腺癌的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種文蛤提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種自動物體中得到的提取物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種文蛤提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種具有抑癌活性的文蛤提取物。一種文蛤提取物，它是由包括下述步驟的方法制備的1)在0－4℃條件下將文蛤肉用蒸餾水均漿，離心取上清液；2)0－4℃條件下，用10－40％硫酸銨溶液抽提上述上清液，離心，收集上清液并過濾后得到濾液；3)將濾液進行柱層析，收集在215和/或280nm下有吸收峰的多肽組分，干燥得成品。以治療有效量的上述文蛤提取物為活性成份的抑制腫瘤藥物，特別是治療肝癌、肺癌及乳腺癌的藥物，對腫瘤具有良好的抑制和治療作用。
文檔編號A61K35/56GK1451393SQ0211743
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月19日
發(fā)明者張榮慶, 王洪鐘, 謝莉萍, 王愛民, 李文役, 梁峰峨 申請人:清華大學(xué)