專利名稱：親和色譜基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和色譜領(lǐng)域，更具體地涉及含配體單體或二聚體的分離基質(zhì)。本發(fā)明還涉及用上述基質(zhì)分離目標蛋白的方法，其優(yōu)勢在于增加的能力和洗脫PH。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白代表全球各公司在制造或開發(fā)方面的最普遍性生物制藥產(chǎn)品。高商業(yè)需求和由此的這種特殊治療市場價值已導(dǎo)致制藥公司需重視最大限度提高其相應(yīng)mAb制造過程的生產(chǎn)率同時控制相關(guān)費用。在多數(shù)情況下，將親和色譜法用作純化這些免疫球蛋白分子(如單克隆或多克隆抗體)的關(guān)鍵步驟之一。親和試劑中特別受關(guān)注的種類是能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白分子不變部分的蛋白，這種相互作用獨立于抗體對抗原的結(jié)合特異性。這類試劑可廣泛用在親和色譜中從不同的樣品回收免疫球蛋白，所述樣品為例如但不限于血清或血漿制品或細胞培養(yǎng)源性原料。這類蛋白的實例是葡萄球菌A蛋白，其含有能夠與來自不同物種的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?；谄咸亚蚓鶤蛋白(SpA)的試劑，由于其高親和力和選擇性，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，例如在親和色譜中用于捕獲和純化抗體以及用于檢測。目前，基于SpA的親和介質(zhì)可能是使用最廣泛的親和介質(zhì)，用于從不同的樣品(包括來自細胞培養(yǎng)物的工業(yè)原料)中分離單克隆抗體及其片段。因此，各種包含A蛋白-配體的基質(zhì)有市售，例如，以天然 A 蛋白的形式(例如 Protein A SEPHAROSE ,GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，也包括重組A蛋白的形式(例如rProtein A-SEPHAROSE , GE Healthcare)。更具體而言，在商業(yè)重組A蛋白產(chǎn)品中進行的遺傳操作旨在促進其附著于支持體。這些應(yīng)用，如其它的親和色譜應(yīng)用一樣，需要綜合考慮對污染物的明確去除。這些污染物可以是例如在色譜過程中吸附到固定相或基質(zhì)的非洗脫分子，例如非所需的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、細菌和病毒。通常在第一次洗脫所需產(chǎn)品后進行從基質(zhì)中對這些污染物的去除，以在后續(xù)使用前再生所述基質(zhì)。這種去除通常涉及稱為原地清洗(CIP)的程序，其中使用能夠從固定相洗脫污染物的物質(zhì)。這類物質(zhì)中經(jīng)常被使用的一種是流經(jīng)所述固定相的堿性溶液。目前最廣泛使用的清洗和消毒劑是氫氧化鈉， 其濃度范圍可以從0. IM至高達例如1M，視污染的程度和性質(zhì)而定。該策略與將基質(zhì)暴露于高于13的pH值相關(guān)。對于許多含有蛋白類親和配體的親和色譜基質(zhì)，這類堿性環(huán)境是非?？量痰臈l件，從而因配體對所處高PH條件的不穩(wěn)定而導(dǎo)致能力下降。廣泛的研究因此集中于工程蛋白配體的開發(fā)，該配體表現(xiàn)出耐受堿性pH值的改善能力。例如，Giilich 等(Susanne Giilich, Martin LinhuIt,Per-Ake Nygren, Mathias Uhlen, Sophia Hober，Journal of Biotechnology, 80 (2000), 169-178)建議將蛋白工程化以提高鏈球菌白蛋白結(jié)合域(ABD)在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性能。GUlich等創(chuàng)建了 ABD突變體，其中所有四個天冬酰胺殘基都分別被亮氨酸(一個殘基)、天冬氨酸(兩個殘基)和賴氨酸(一個殘基)置換。此外，GUlich等報告說，他們的突變體呈現(xiàn)出與天然蛋白相似的結(jié)合目標蛋白行為，而且經(jīng)過反復(fù)暴露在堿性條件下后，含有該工程配體的親和柱比用親本非工程配體制備的柱表現(xiàn)出更高的結(jié)合能力。由此得到的結(jié)論是，可以置換所有四個天冬酰胺殘基而對其結(jié)構(gòu)和功能沒有任何顯著影響。最近的工作表明，也可以對A蛋白(SpA)進行改造以實現(xiàn)類似性質(zhì)。US專利申請公布書2005/0143566中公開，當有至少一個天冬酰胺殘基被突變?yōu)槌劝滨０坊蛱於彼嵬獾陌被釙r，在PH值高達約13-14下，與親本SpA(例如SpA的B結(jié)構(gòu)域)或Z蛋白 (源自SpAB結(jié)構(gòu)域的合成構(gòu)建體(US 5，143，844))相比，該突變體具有更強的化學穩(wěn)定性。 作者表明，當將這些突變蛋白用作親和配體時，分離介質(zhì)可如預(yù)期地更耐受使用堿劑的清潔程序。US 2006/0194955顯示，所述突變配體可以更耐受蛋白酶從而減少在分離過程中配體的漏失。另一份公布書，US 2006/0194950表明，所述堿穩(wěn)定SpA域可以進一步被修飾， 使配體缺乏對Fab的親和力但保留對Fc的親和力，例如G29A突變體。過去所有A蛋白親和介質(zhì)都用含有5個IgG結(jié)合域的天然A蛋白來生產(chǎn)。利用重組技術(shù)，已生產(chǎn)了大量A蛋白構(gòu)建體，其所有都含有4個或5個IgG結(jié)合域。因此，本領(lǐng)域需要獲得含下述蛋白配體的分離基質(zhì)，該蛋白配體具有較低重復(fù)數(shù)目但具有與四聚體相似或增強的結(jié)合能力。發(fā)明簡述本發(fā)明的目的之一是提供親和分離基質(zhì)，其包含能夠結(jié)合免疫球蛋白(例如IgG、 IgA和/或IgM)的蛋白配體，優(yōu)選通過它們的Fc片段結(jié)合。這些配體以單體或二聚體呈現(xiàn)，并且與有較高重復(fù)數(shù)目的配體多聚體(例如五聚體配體)相比，具有更高的相對結(jié)合能力。本發(fā)明的另一目的是提供方法，該方法利用現(xiàn)有親和基質(zhì)去分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白。通過使用單體或二聚體親和配體，該方法出乎意料地實現(xiàn)了對目標分子的相對結(jié)合能力增強。此外，采用單體配體，洗脫PH值提高。因此，本發(fā)明提供了方法，該方法用于生產(chǎn)純化產(chǎn)品，例如純的免疫球蛋白組分或液體(免疫球蛋白已被從其中除去)，或者用于檢測樣品中免疫球蛋白的存在情況。本發(fā)明的配體呈現(xiàn)出增強的能力，這使這些配體成為對具成本效益的大規(guī)模經(jīng)營有吸引力的候選物。一個或多個以上定義的目的可如所附權(quán)利要求所述而實現(xiàn)。附圖簡述

圖1圖示，對Zl (虛線)、Z2(點線)和Z4(實線)在6分鐘停留時間記錄的穿透曲線。圖2 在Superdex 200 5/150GL上的分析性尺寸排阻色譜。Fc融合蛋白(實線) 和MAb 3(虛線)。圖3 不同MAb和Fc融合蛋白的洗脫pH值，低上樣量，加樣于不同的z_原型上。發(fā)明詳述^X術(shù)語“蛋白”在本文中用于描述蛋白及其片段。因此，任何呈現(xiàn)出三維結(jié)構(gòu)的氨基酸鏈都被包括在術(shù)語“蛋白”中，并相應(yīng)地包括蛋白片段。術(shù)語蛋白的“功能變體”本文中意指變體蛋白，其中，基本保留了與本發(fā)明相關(guān)的定義為親和力和穩(wěn)定性的功能。因此，那些與所述功能不相關(guān)的一個或多個氨基酸可以被替換。術(shù)語“親本分子””本文中用于指呈引人本發(fā)明突變之前的形式的相應(yīng)蛋白。術(shù)語“結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性”是指分子三維形式的完整性，而“化學穩(wěn)定性”是指耐受化學降解的能力。術(shù)語“結(jié)合Fc片段的”蛋白意指能夠結(jié)合免疫球蛋白Fc片段的蛋白。但是，不排除結(jié)合Fc片段的蛋白還可以結(jié)合其他區(qū)，例如免疫球蛋白的Fab區(qū)。在本說明書中，如果不提及它們的全名，氨基酸用常規(guī)單字母符號來表示。在本文，突變用被替換位置處的編號來定義，該編號前面是野生型或非突變氨基酸而后面是突變氨基酸。因此，舉例來說，在23位的天冬酰胺向蘇氨酸的突變表示為N23T。本發(fā)明的一方面涉及從液體分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白的方法，該方法包括(a)使所述液體與分離基質(zhì)接觸，所述基質(zhì)包含固定到支持體的配體；(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通過與所述配體的相互作用而吸附到所述基質(zhì)上；(c)洗滌所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任選步驟；和(d)通過使所述基質(zhì)與釋放所述蛋白的洗脫液接觸，來回收所述含免疫球蛋白的蛋白。該方法通過使用單體配體，提供所述配體對免疫球蛋白分子增強的結(jié)合能力，所述單體配體為例如葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域B或Z蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及從液體分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白方法，該方法包括(a)使所述液體與分離基質(zhì)接觸，所述基質(zhì)包含固定到支持體的配體；(b)使含免疫球蛋白的蛋白通過與所述配體的相互作用而吸附到所述基質(zhì)上；(c)洗滌所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任選步驟；和(d)通過使所述基質(zhì)與釋放所述蛋白的洗脫液接觸，來回收所述含免疫球蛋白的蛋白。該方法通過使用二聚體配體，提供所述配體對免疫球蛋白分子增強的結(jié)合能力，所述二聚體配體為例如葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域B或Z蛋白。所述結(jié)合免疫球蛋白的蛋白(即配體)可以是具有天然免疫球蛋白結(jié)合能力的任意蛋白，例如葡萄球菌A蛋白(SpA)或鏈球菌G蛋白(SpG)。有關(guān)其它此類蛋白的述評，參見例如Kronvall，G.，Jonsson, K. Receptins 新術(shù)語，用于不斷擴展范圍的具有結(jié)合哺乳動物蛋白特性的天然和改造的微生物蛋白(a novel term for an expanding spectrum of natural and engineered microbial proteins with binding properties for mammalian proteins), J. Mol. Recognit. 1999 Jan-Feb ； 12(1) :38_44。所述單體或二聚體配體可以包括一個或多個SpA的E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，所述配體包括A蛋白的結(jié)構(gòu)域B或工程Z蛋白。在一實施方案中，所述配體被賦予堿穩(wěn)定性，例如通過突變SpA結(jié)構(gòu)域B或Z蛋白中的至少一個天冬酰胺殘基為除谷氨酰胺外的氨基酸。如前面所討論，US專利申請公布書 2005/0143566公開，當有至少一個天冬酰胺殘基被突變?yōu)槌劝滨０坊蛱於彼嵬獾陌被釙r，該突變獲得了在高PH值條件下增強的化學穩(wěn)定性。此外，含有這些配體的親和介質(zhì)可以更耐受使用堿劑的清洗程序。US2006/0194955表明，所述突變配體還可更耐受蛋白酶從而減少在分離過程中配體的漏失。這些申請的公開內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合于本文中。在另一實施方案中，如此制備的配體缺失對抗體Fab部分的任何基本親和力，但具有對Fc部分的親和力。在某些實施方案中，所述配體的至少一個甘氨酸被丙氨酸置換。 US 2006/0194950表明，堿穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域可進一步被修飾，使得配體缺失對Fab的親和力但保留Fc親和力，例如通過G29A突變。該申請的公開內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合于本文中。 本文中使用的氨基酸編號是在本領(lǐng)域常規(guī)使用的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識別被突變的位置。在一個有利的實施方案中，結(jié)構(gòu)域B的堿穩(wěn)定性，通過使至少一個天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被醽韺崿F(xiàn)；并包括在堿穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域四位處氨基酸殘基的突變，例如G29A突變。在另一實施方案中，所述配體是Z蛋白，其中通過使至少一個天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被?，來實現(xiàn)堿穩(wěn)定性。在一個有利的實施方案中，通過使至少在23 位處的天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被?，來實現(xiàn)堿穩(wěn)定性。在另一實施方案中， 堿穩(wěn)定蛋白是在堿性條件下基本穩(wěn)定的天然蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，可使用常規(guī)分子生物學技術(shù)以任何次序來進行提供堿穩(wěn)定性的突變和由G向A的突變。此外，可以通過具有編碼突變蛋白配體的核酸序列的載體來表達所述配體?；蛘?，它們也可以通過蛋白合成技術(shù)來制備。用于合成預(yù)定序列的肽和蛋白的方法在本領(lǐng)域是眾所周知和一般可獲得的。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“葡萄球菌A蛋白的堿穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域B”意指基于SpA結(jié)構(gòu)域B的堿穩(wěn)定性蛋白，例如在US專利申請公布書2005/0143566和US2006/0194950中描述的突變蛋白；以及其他來源但具有功能性等同氨基酸序列的其他堿穩(wěn)定蛋白。技術(shù)人員理解的是，在被固定到支持體前，表達蛋白應(yīng)被純化到適當程度。這種純化方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且容易使用標準方法將基于蛋白的配體固定到支持體。 適宜的方法和支持體將在下面更詳細討論。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白包含至少約75%，例如至少約80% 或優(yōu)選至少約95%的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2中定義的序列，前提是天冬酰胺突變不發(fā)生在21位處。在本說明書中，SEQ ID NO 1定義SpA的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu IleLeu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe lie GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu AlaLys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys0SEQ ID NO :2定義稱為Z蛋白的蛋白Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu IleLeu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe lie GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu AlaLys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys0Z蛋白是衍生于SpA B結(jié)構(gòu)域的合成構(gòu)建體，其中四位的甘氨酸已被替換為丙氨酸，參見例如StMll等，1999年生物技術(shù)中的親和融合體聚焦A蛋白和G蛋白(Affinity fusions in biotechnology :focus on protein A and protein G),載于《生物過禾呈技術(shù)百科全書發(fā)酵、生物催化和生物分離(The Encyclopedia of Bioprocess Technology Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation)〉〉，Μ· C. Fleckinger 禾口 S. W. Drew 編輯， John Wiley 和 Sons Inc. , New York,8-22
在一個實施方案中，以上描述的突變蛋白由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2中定義的氨基酸序列組成，或為其功能性變體。本文所用術(shù)語“功能性變體”包括任何類似的序列， 其包含在以下氨基酸位置的一個或多個其它變化，所述位置不影響突變蛋白對免疫球蛋白的親和力或其在提高的PH值環(huán)境中改進的化學穩(wěn)定性。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明突變選自N23T ；N23T和N43E ；N28A ； N6A ； mis ;mis和N23T ；以及N6A和N23T ；其中，親本分子包含SEQ ID NO :2定義的序列。如上所述，為了獲得可用作在長時間的堿性條件下具有高結(jié)合能力的配體的突變體蛋白，避免 21位天冬酰胺殘基的突變。在一個實施方案中，3位的天冬酰胺殘基不被突變。在最有利的實施方案中，位于亮氨酸殘基和谷氨酰胺殘基之間的天冬酰胺殘基已被突變，例如徒變?yōu)樘K氨酸殘基。因此，在一個實施方案中，SEQ ID NO :2定義序列的23位天冬酰胺已被突變，例如突變?yōu)樘K氨酸殘基。在具體的實施方案中，SEQ ID NO :2定義序列的43位天冬酰胺已被突變，例如突變?yōu)楣劝彼?。在其中?3位氨基酸已被突變的實施方案中，似乎最有利的是與至少一個進一步的突變(例如N23T)相結(jié)合。SpA結(jié)構(gòu)域B和Z蛋白中的不同天冬酰胺殘基可對突變蛋白的親和力和穩(wěn)定性有不同的貢獻，這是相當意外的發(fā)現(xiàn)，特別是鑒于GUlich等人的上述教導(dǎo)，其中推論ABD的所有天冬酰胺殘基都可被突變而沒有任何內(nèi)部區(qū)別。因此，本發(fā)明包括上述討論的單體突變體蛋白。然而，這種蛋白單體可結(jié)合為多聚體蛋白，例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等。因此，本發(fā)明的另一方面是多聚體，其由至少一個本發(fā)明的突變蛋白和一個或多個其他單元(優(yōu)選也是本發(fā)明的突變蛋白)組成。因此，本發(fā)明為例如由兩個重復(fù)單元組成的二聚體。在一個實施方案中，本發(fā)明的多聚體包含由氨基酸段連接的單體單元，該氨基酸段優(yōu)選從0到15個氨基酸范圍，例如5-10個。而這種連接的性質(zhì)應(yīng)該優(yōu)選不使所述蛋白單元的空間構(gòu)象不穩(wěn)定。此外，所述連接應(yīng)該優(yōu)選在堿性環(huán)境中也足夠穩(wěn)定以不影響突變蛋白單元的性質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明單體配體包含SEQ ID NO 3的序列AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPhelleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCys ο在另一實施方案中，本發(fā)明二聚體配體包含SEQ ID NO 4的序列AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPhelleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCys。本發(fā)明意想不到的發(fā)現(xiàn)是，當比較配體的能力時，盡管對四聚體和二聚體獲得相當?shù)母邉討B(tài)結(jié)合能力，但單體具有最高的相對能力(mg Mab/mg配體)。概括地說，發(fā)現(xiàn)對具較少ζ-單元的配體得到較高的相對能力。我們的數(shù)據(jù)還證實，洗脫PH依賴于配體密度。 此外，與其他原型相比，在單體配體原型上純化的樣品用較高的PH洗脫，對易于在低pH時聚集的免疫球蛋白而言是優(yōu)勢。在此同時，單體、二聚體和四聚體對宿主細胞蛋白的清除率幾乎相等。本發(fā)明還意外發(fā)現(xiàn)，對于更大的蛋白(例如含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)，與四聚體相比，單體和二聚體的動態(tài)結(jié)合能力更高。此外，單體具有最高相對能力(即，表示為mg蛋白/mg配體的能力)。我們的研究表明，單體和二聚體中的動態(tài)結(jié)合能力增加并非主要是配體密度的效應(yīng)，但可能是由于因位阻(對于相對體積大的融合蛋白)的減少而引起的可利用結(jié)合位置的更高利用率和/或更快的動力學。理解的是，術(shù)語“含免疫球蛋白的蛋白”包括抗體、含抗體部分以及抗體片段的融合蛋白和突變抗體，只要它們基本保留了抗體的結(jié)合特性即可?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。優(yōu)選抗體為來自哺乳動物物種(例如人類)的IgG、IgA和/或IgM。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及親和分離基質(zhì)，所述基質(zhì)包含單體或二聚體配體， 其含偶聯(lián)到固相支持體的結(jié)合免疫球蛋白的蛋白。優(yōu)選的是，蛋白的至少一個天冬酰胺殘基已被突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被?。與由四聚體配體組成的基質(zhì)相比，本發(fā)明基質(zhì)呈現(xiàn)增強的結(jié)合能力。所述突變蛋白配體優(yōu)選是FC片段結(jié)合蛋白，可用于選擇性結(jié)合IgG、IgA 和/或IgM，優(yōu)選IgG。本發(fā)明的基質(zhì)可以包含如以上所述在其任一實施方案中的突變體蛋白作為配體。 在最優(yōu)選實施方案中，在固相支持體上存在的配體包括如上所述的單體。本發(fā)明基質(zhì)的固相支持體可以是任一合適的熟知種類。常規(guī)的親和分離基質(zhì)往往具有有機性質(zhì)，并且基于以下聚合物，其將親水表面暴露于所用水性介質(zhì)，即在其外部表面以及內(nèi)部表面(如果存在的化)暴露羥基(-0H)、羧基(-C00H)、酰胺基(-CONH2，可能以N-取代形式)、氨基(-NH2，可能以取代形式)、低聚或聚乙烯氧基(polyethylenoxy group)。在一個實施方案中，所述多聚物可例如基于多糖，例如葡聚糖、淀粉、纖維素、普魯蘭、瓊脂糖等，其已有利地交聯(lián)，例如用雙環(huán)氧化物、表鹵代醇、1，2，3_三鹵代取代的低級烴，以提供合適的孔隙度和剛性。在最優(yōu)選實施方案中，固相支持體是多孔瓊脂糖珠粒。 可容易地按標準方法制備在本發(fā)明中使用的支持體，例如反相懸浮凝膠法(S Hjerten Biochim Biophys Acta, 79 (2), 393-398 (1964)) 或者，基底基質(zhì)是市售產(chǎn)品，例如 SEPHAROSE FF(GE Healthcare)。在對大規(guī)模分離特別有優(yōu)勢的實施方案中，支持體被改造以增強其剛性，從而使所述基質(zhì)更適于高流速?；蛘?，固相支持體基于合成的多聚物，例如聚乙烯醇、聚羥烷基丙烯酸酯、聚羥烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物例如基于二乙烯基和單乙烯基取代苯的基質(zhì)的情況下，基質(zhì)表面往往經(jīng)親水化以將上述定義的親水基團暴露于周圍的水性液體。這些聚合物容易按標準方法生產(chǎn)，參見例如“通過懸浮聚合開發(fā)的基于苯乙烯的聚合物支持體(Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization) "(R Arshady =Chimica e L' Industria，70 (9)，70—75 (1988))。或者，使用市售產(chǎn)品，例如 Source (GE Healthcare)。在另一備選中，本發(fā)明的固相支持體包括無機性質(zhì)的支持體，例如二氧化硅、氧化鋯等。
在又一實施方案中，固相支持體呈另一種形式，例如表面、芯片、毛細管或過濾器等。
至于本發(fā)明基質(zhì)的形狀，在一個實施方案中，基質(zhì)呈多孔整料形式。在一個備選實施方案中，基質(zhì)呈珠狀或顆粒形式，可多孔或無孔。珠狀或顆粒形式的基質(zhì)，可用作填充床或呈懸浮形式。懸浮形式包括那些被稱為膨脹床和純懸浮液的形式，其中顆?；蛑榱？梢宰杂梢苿?。在整料、填充床和膨脹床的情況下，分離過程通常遵循常規(guī)色譜法用濃度梯度。 在純懸浮液的情況下，可使用間歇式的模式。配體可通過常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)利用例如存在于配體中的氨基和/或羧基連接到支持體。雙環(huán)氧化物、環(huán)氧氯丙烷、CNBr、N-羥基琥珀酰亞胺(MB)等都是著名的偶聯(lián)試劑。在支持體和配體之間，可以引入稱作間隔物的分子，這將提高配體的可用性并有利于配體向支持體的化學偶聯(lián)。或者，配體可通過非共價鍵合例如物理吸附或生物特異性吸附連接到支持體。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明的配體通過硫醚鍵偶聯(lián)到支持體。進行這種偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員容易使用標準的技術(shù)和設(shè)備來進行。在一個有利的實施方案中，配體首先被提供了末端半胱氨酸殘基以隨后用于偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也容易進行合適的純化步驟。在本發(fā)明的一些實施方案中，吸附步驟的條件可以是任何常規(guī)使用的，依照目標抗體的性質(zhì)例如其Pl作適當調(diào)整。任選的洗滌步驟可以用常用的緩沖液如PBS緩沖液來進行?？赏ㄟ^使用任何常用的緩沖液進行洗脫。在一個有利的實施方案中，在單體配體系統(tǒng)中，通過加入PH值在4. 0-4. 4(優(yōu)選4. 2-4. 4)范圍的洗脫液，實現(xiàn)抗體的回收。在一個類似的實施方案中，在二聚體配體系統(tǒng)中，通過加入PH值在3. 8-4. 2 (優(yōu)選3. 9-4. 0)范圍的洗脫液，實現(xiàn)抗體的回收。因此，這些實施方案的優(yōu)勢是，在洗脫過程中將目標抗體暴露在以下PH值，其通常高于常規(guī)與基于A蛋白的配體一起使用的pH值，這對于大多數(shù)抗體， 會導(dǎo)致由于PH值降低引起的變性風險較低，較少的聚集物和目標物的收率上升。本發(fā)明的方法可用于捕獲目標抗體，例如在例如用于治療或診斷用途的抗體的純化方案中的第一步。在一個實施方案中，至少有75%抗體被回收。在一個有利的實施方案中，在二聚體配體系統(tǒng)中使用PH為3. 8-4. 2范圍的洗脫液而在單體配體系統(tǒng)中使用pH為 4. 0-4. 4范圍的洗脫液，回收至少80%、例如至少90%、優(yōu)選至少95%的抗體。本發(fā)明方法可后續(xù)一步或多步其他步驟，例如其他色譜步驟。因此，在具體實施方案中，超過約98%的抗體被回收。如前所討論，對于SpA配體或者Z蛋白配體，當有至少一個天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０坊蛱於彼嵬獾陌被釙r，包含這些突變配體的親和介質(zhì)可以更耐受使用堿劑的清潔程序(US2005/0143566)。穩(wěn)定性增加意指突變蛋白對免疫球蛋白的初始親和力基本被保留延長的時間。因此，在堿性環(huán)境，其結(jié)合能力比親本分子下降得更慢。環(huán)境可被定義為堿性，意味著提高的PH值，例如超過約10，如高達約13或14，即從10-13或10-14，一般被稱為堿性條件。或者，條件可由NaOH濃度來定義，NaOH的濃度可高達約1. OMjn 0. 7M或特定地約0. 5M，相應(yīng)地在0. 7-1. OM范圍內(nèi)。因此，對免疫球蛋白的親和力即本發(fā)明配體的結(jié)合特性，和由此的基質(zhì)的能力，在用堿劑處理的時間內(nèi)基本不變。按照慣例，對于親和分離基質(zhì)的原地清洗處理，所用堿劑是 NaOH，其濃度高達0. 75M，如0. 5M。因此，在用0. 5M NaOH處理7. 5小時后，其結(jié)合能力將降至少于約70 %，優(yōu)選少于約50 %，更優(yōu)選少于約30 %，例如約28 %。本發(fā)明突變蛋白增強的化學穩(wěn)定性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地證實，例如通過用 0. 5M濃度的NaOH常規(guī)處理。在本文中，要了解的是，與上面所述的類似，“增加的”穩(wěn)定性意指保持初始穩(wěn)定性的時間比親本分子更長。在另一方面，本發(fā)明涉及分離免疫球蛋白(例如IgG、IgA和/或IgM)的方法，其中使用本發(fā)明的配體單體、二聚體或基質(zhì)。因此，本發(fā)明包括色譜方法，其中通過吸附到上述配體單體、二聚體或基質(zhì)，從液體中分離至少一種目標化合物。所需產(chǎn)品可以是經(jīng)分離的化合物或液體。因此，本發(fā)明的這一方面與親和色譜相關(guān)，親和色譜是廣泛使用和眾所周知的分離技術(shù)。簡而言之，在第一個步驟，使包含目標化合物(優(yōu)選是上述抗體)的溶液在以下條件下流經(jīng)分離基質(zhì)，所述條件允許目標化合物吸附到所述基質(zhì)上存在的配體。例如通過溶液中的PH值和/或鹽濃度(即離子強度)來控制這種條件。應(yīng)注意不要超過所述基質(zhì)的能力，即流速應(yīng)足夠慢以允許滿意的吸附。在這一步，溶液中的其他組分大體上將暢通地流過。任選的是，然后洗滌基質(zhì)，例如用水溶液，以除去殘留和/或松散結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明基質(zhì)最有利的是與使用添加劑(例如溶劑、鹽類或去垢劑或它們的混合物)的中間洗滌步驟一起使用。在下一步，使被稱為洗脫液的第二種溶液在提供解吸(即釋放目標化合物)的條件下流經(jīng)基質(zhì)。通常由PH、鹽濃度(即離子強度)、疏水性等的變化來提供這種條件。已知有多種洗脫方案，例如梯度洗脫和分步洗脫。也可以用包含競爭物質(zhì)的第二種溶液來進行洗脫，該競爭物質(zhì)將置換基質(zhì)上的所需抗體。關(guān)于親和色譜原理的全面評述，參見例如 Wilchek，M.和 Chaiken，I.，2000，親和色譜概述(An overview of affinity chromatography)，Methods Mol. Biol.，147 :1_6。
實施例下面，將通過實施例描述本發(fā)明，提供該實施例僅用于說明目的，因此不應(yīng)理解為限制所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍。本申請下文和其他地方給出的所有參考文獻都在此通過引用包含于本文中。實施例1本研究的目的是比較基于瓊脂糖的介質(zhì)原型的性能，所述瓊脂糖與堿穩(wěn)定性A蛋白(即SuRe配體結(jié)構(gòu)域)的單體、二聚體和四聚體固定化(以下分別稱為zl、z2和z4)， 所述比較通過如下進行-測定CHO細胞培養(yǎng)物中表達的兩種不同單克隆抗體的動態(tài)結(jié)合能力。-比較用各種配體獲得的洗脫pH-測量在10%穿透、樣品上樣量為動態(tài)結(jié)合能力的70%時對宿主細胞蛋白的清除率。1.實驗1. 1.介質(zhì)原型Mabklect SuRe 批次 312257 (配體密度 5. 6mg/ml)HFA35 Zl :U1975095(配體密度 1. 64mg/ml)
HFA35 Z2 :U1975098(配體密度 3. 46mg/ml)1. 2.化學試劑和樣品PBS 緩沖液，SIGMA, P4417_100TabNaOH, Merck, 1. 06649. 1000脫水檸檬酸三鈉，Merck,1. 06448. 1000MAb 1，宿主細胞澄清飼養(yǎng)層(host cell clarified feed, HCCF), 1. lmgMAb/mlMAb 2，宿主細胞澄清飼養(yǎng)層，1.8mg MAb/ml1.3.系統(tǒng)AKTAExplorer 100, AL E100.AKTAExplorer 10, HH E10S.分光光度計，UltroSpec3000pro.2.方法2. 1迎頭法用含MAb(MAb 1和MAb 2)的兩種不同宿主細胞澄清飼養(yǎng)層進行迎頭法。采用預(yù)編程Unicorn方法，由6個模塊組成1.用PBS緩沖液平衡，持續(xù)5CV。2.將飼養(yǎng)層上樣，直到MAb的穿透為大約80%。3.用PBS緩沖液洗出未結(jié)合材料，持續(xù)10CV。4.在從60mM檸檬酸鹽pH 6. 0至60mM檸檬酸鹽pH 3. 0的20CV梯度內(nèi)進行洗，。5.用 0. IM NaOH 以 0. 3ml/ 分鐘進行 CIP 15 分鐘。6.用PBS重新平衡。用處的紫外吸光度確定穿透。在迎頭法之前，將飼養(yǎng)層注射經(jīng)旁路流過色譜柱，以獲得與飼養(yǎng)層的MAb、宿主細胞蛋白(HCP)和其他組分相對應(yīng)的最大吸光值。從紫外曲線中減去在早期樣品上樣期間的“坪流過”值(對應(yīng)于飼養(yǎng)層中不與柱結(jié)合的組分)， 由此得到的吸光值用于依據(jù)等式1計算在5%、10%和80%穿透時的動態(tài)結(jié)合能力。等式1 :Qbx%= (Vx0^-V0)C0Ac其中Vx% =在穿透時的樣品上樣體積，C0 =樣品濃度(mg/ml)，Vc =幾何總體積和\ =外水體積。2. 2HCP 清除率將樣品上樣至最終上樣量為G!B1(1%值的70%。在洗出未結(jié)合材料后，用60mM檸檬酸鹽pH 3.5進行洗脫。合并洗脫流分，按1比10的量用0. 2M磷酸鈉、BSA、0. 5% tween PH 8.0稀釋。然后用Gyros方法分析樣品中的HCP含量。在280納米處測定上清液的吸光度。用朗伯-比爾定律(等式2)計算MAb濃度。然后通過用HCP濃度(ng/ml)除以MAb 濃度(mg/ml)獲得HCP濃度(以ppm計)。等式2 :A = C*1* ε其中C =蛋白濃度(mg/ml)，A = 280nm處的吸光度，L =路徑長度(cm) = 1, ε =消光系數(shù)(mg Hir1cnT1) =1.7。依據(jù)等式3計算收率等式3 :收率(<% ) = 100*作合并物*(合并物)/作上樣*01)
其中V合并物=合并流分的體積，C合并物=在合并物中的MAb濃度，V上樣=上樣到柱上的樣品體積和Ctl =樣品濃度(mg/ml)。2. 3利用分析件尺寸排阻餼譜法測定純度在SUPERDEX 200 5/150GL上，按照手冊用標準方法進行分析性尺寸排阻色譜法。 洗脫緩沖液是PBS pH 7. 4 (SIGMA)，樣品體積為25 μ L。通過對色譜圖進行積分來測定MAb純度。3.結(jié)果和討論3. 1迎頭法3. 1. IMAb 1計算了 5%、10%和80%穿透時的動態(tài)結(jié)合能力(DBC)。結(jié)果見表la。Mabklect SuRe (z4)和z2在5%和10%穿透的DBC是相等的，而zl的值較低。然而，如表Ib所示，含較少ζ單元的配體獲得了最高相對能力(即，表示為mg MAb/mg配體的能力)，即zl > z2 > z4。A1Q%/QB8Q%的比較被用作動力學的衡量(較高的值表示更快的動力學)。結(jié)果表明，與zl或z2相比，z4得到稍微較慢的動力學。在pH梯度中的洗脫，對z4和z2得到大致相同的洗脫pH(pH3.6_3.7)，而MAb自 zl中在稍微較高的pH洗脫(pH 4. 0)。還測定了在1至2. 4分鐘之間的不同停留時間的DBC。正如預(yù)期，在較低停留時間(即較高流速)時DBC下降。然而，z2 DBC的降低少于z4的，用zl得到進一步改善(表 la)。因此，為了最低的DBC下降，單體配體是優(yōu)選的。表la. MAb 1的迎頭法結(jié)果總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種從液體中分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白的方法，所述方法包括(a)使所述液體與分離基質(zhì)接觸，所述基質(zhì)包含固定到支持體的配體；(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通過與所述配體的相互作用而吸附到所述基質(zhì)上；(c)洗滌所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任選步驟；(d)通過使所述基質(zhì)與釋放所述蛋白的洗脫液接觸，來回收所述含免疫球蛋白的蛋白；改善之處在于，每一種所述配體基本由葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域B或Z蛋白或其功能性變體的單體組成。
2.一種從液體中分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白的方法，所述方法包括(a)使所述液體與分離基質(zhì)接觸，所述基質(zhì)包含固定到支持體的配體；(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通過與所述配體的相互作用而吸附到所述基質(zhì)上；(c)洗滌所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任選步驟；(d)通過使所述基質(zhì)與釋放所述蛋白的洗脫液接觸，來回收所述含免疫球蛋白的蛋白；改善之處在于，每一種所述配體基本由葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域B或Z蛋白或其功能性變體的二聚體組成。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述配體通過將至少一個天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被岫鴮A穩(wěn)定的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述配體具有對免疫球蛋白Fc部分的親和力，但缺乏對免疫球蛋白Fab部分的親和力。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述配體的至少一個甘氨酸已被丙氨酸置換。
6.權(quán)利要求4的方法，其中在四位的甘氨酸殘基已被改變?yōu)楸彼帷?br> 7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述配體是Z蛋白，其中已通過將至少一個天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被釋崿F(xiàn)堿穩(wěn)定性。
8.權(quán)利要求7的方法，其中已通過將至少23位的天冬酰胺殘基突變?yōu)槌劝滨０吠獾陌被釋崿F(xiàn)Z蛋白的堿穩(wěn)定性。
9.權(quán)利要求2的方法，其中通過加入pH為3.8-4. 2的洗脫液實現(xiàn)對含免疫球蛋白的蛋白的回收。
10.權(quán)利要求2的方法，其中使用pH為3.8-4. 2的洗脫液，回收至少80%、例如至少 90 %、優(yōu)選至少95 %的所述含免疫球蛋白的蛋白。
11.權(quán)利要求1的方法，其中通過加入PH為4.0-4. 4的洗脫液實現(xiàn)對含免疫球蛋白的蛋白的回收。
12.權(quán)利要求1的方法，其中使用pH為4.0-4. 4的洗脫液，回收至少80%、例如至少 90%、優(yōu)選至少95%的所述含免疫球蛋白的蛋白。
13.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是多克隆抗體。
15.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是融合蛋白，所述融合蛋白包含與另一種蛋白融合的免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及從液體中分離一種或多種含免疫球蛋白的蛋白的方法。所述方法包括首先使所述液體與分離基質(zhì)接觸，所述基質(zhì)包含固定到支持體的配體；使所述含免疫球蛋白的蛋白通過與所述配體的相互作用而吸附到所述基質(zhì)上；接著是洗滌所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任選步驟；和通過使所述基質(zhì)與釋放所述蛋白的洗脫液接觸，來回收所述含免疫球蛋白的蛋白。本方法較先前分離方法的改善之處在于，每一種所述配體基本由單體或二聚體SpA或Z蛋白或其功能性變體組成。
文檔編號C07K16/00GK102272145SQ201080004708
公開日2011年12月7日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者A·倫格勒夫, H·J·約翰遜, R·帕爾姆格倫 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司