專利名稱：表層親和色譜法的制作方法
免疫色譜法目前以兩種主要方式來進行。第一種為當(dāng)展開是通過被動擴散實現(xiàn)或由電化學(xué)誘發(fā)時，在凝膠中進行；第二種是在流體中進行。在使用凝膠的前種方式中，徑向免疫擴散是最常用的系統(tǒng)，其具有通常位于圓盤中的實驗?zāi)z，凝膠中存在中心孔，以及在環(huán)繞凝膠周圍有另外的孔?？寡寤蚩乖环旁谥行目?，抗原或抗血清被放在外圍孔。在凝膠中發(fā)生被動擴散，由于抗體-抗原絡(luò)合物的形成，在凝膠中可觀察到免疫絡(luò)合物的白色譜帶。在電化學(xué)系統(tǒng)中，使用電流誘發(fā)凝膠中抗體/抗原的遷移。
在流動基的系統(tǒng)中，抗體或抗原通常被固定在放置到液體流動系統(tǒng)如流動注射分析系統(tǒng)中的柱體中。補充的抗原或抗體被注入并流過柱體，在柱體中發(fā)生專一的相互作用。被注入的組分通常攜帶可在下游被檢測到的標(biāo)記物，從而產(chǎn)生信號?？商鎿Q地，流動發(fā)生在平面上，如同側(cè)流擴散免疫分析系統(tǒng)，流動是由膜浸潤/毛細管效應(yīng)而誘發(fā)的。
在新的方式下，固定組分和上述溶液中一種組分間在流體中發(fā)生等價免疫反應(yīng)，但該反應(yīng)發(fā)生在殘留于緩沖溶液中浸漬帶的表面上。在這種情況下，由于含一種免疫試劑的溶液具有較高密度，從而在帶的表面上發(fā)生流動，其中免疫試劑最初存在于帶的頂部，而帶本身立于緩沖溶液中。由于所述帶近乎豎直，該濃厚溶液沿著帶的表面緩慢向下滾動，從而將流動相中的試劑帶入浸漬帶表面上固定的試劑中。
因此，根據(jù)本發(fā)明我們提供一種親和色譜分析系統(tǒng)，其包括含生物試劑的固定組分和含補充生物試劑的流動組分，其特征在于固定組分被支承在浸漬帶或其它平面上，且所述高密度流動組分適合沿著浸漬帶向下流動。
為了能產(chǎn)生這種現(xiàn)象，必須滿足一定的標(biāo)準(zhǔn)。首先，當(dāng)其以層狀從表面上經(jīng)過時，濃厚溶液必須保持分離體的形式，而不是快速擴散到緩沖溶液的本體中。其次，浸漬帶必須具有一定的性質(zhì)，能夠?qū)L動表層產(chǎn)生引力，從而使得該流動相保持整體性。為了實現(xiàn)第一個標(biāo)準(zhǔn)，申請人認(rèn)真選擇了滾動相的組成，以包括聚合性試劑如蛋白質(zhì)和/或多糖，清潔劑和優(yōu)化pH值的緩沖劑；對于第二個標(biāo)準(zhǔn)，我們使用了即具有憎水性又具有可潤濕性的膜。
所述系統(tǒng)可被用作免疫色譜系統(tǒng)，且以競爭性或非競爭性免疫分析方式進行分析。在前一方式中，所述的固定色譜斑為抗體或抗原。對于固定抗體，使被標(biāo)記的抗原沉積在纖維素方片中所述色譜斑上的條帶中。將含抗原的一滴樣品加到該方片上，經(jīng)過適當(dāng)間隔(1-10min)后，將整個條帶浸入緩沖溶液。被標(biāo)記和未被標(biāo)記抗原的濃厚混合物流過抗體的色譜斑，發(fā)生結(jié)合競爭。若抗原固定在色譜斑處，那么被標(biāo)記的抗體取代纖維素方片上的被標(biāo)記的抗原，進行前述的分析。
當(dāng)捕獲抗體的色譜斑被固定在條帶上時，所述系統(tǒng)也可以非競爭免疫分析方式進行。被標(biāo)記的抗體沉積到第一個色譜斑上方的纖維素方片上。將所述條帶放置在含抗原的樣品溶液中，使得上部方片被浸入。發(fā)生誘導(dǎo)，在該過程中溶液內(nèi)的抗原被色譜斑上的固定抗體捕獲。同時，在將所述條帶插入樣品溶液5-10分鐘后，被標(biāo)記抗體在流過色譜斑的濃厚溶液中被再生。這種時間滯后使得抗原分子在到達含被標(biāo)記抗體的表層之前被捕獲到色譜斑上。該第二種抗體標(biāo)記了在色譜斑表面被捕獲的抗原。
另外，可使用任何標(biāo)記物。若熒光標(biāo)記物或有色標(biāo)記物用于抗體或抗原，那么熒光或有色譜斑會在第一次誘導(dǎo)后形成，使得分析成為單步驟系統(tǒng)。
若使用酶標(biāo)記物，那么在非競爭分析中使用調(diào)整順序的步驟。其中，將酶標(biāo)記的抗體加入到纖維素方片上，該方片固定在位于固定捕獲抗體色譜斑下方條帶的底部上。第二個纖維素方片也如前所述固定在該色譜斑上，但其含有用于酶的培養(yǎng)基加上生物高聚物如葡聚糖的干燥溶液。將所述條帶放置到前述樣品有限的體積中，從而不潤濕上部纖維素方片。被標(biāo)記抗體濃厚的再生濃溶液流過容器底部，并以分離層的形式停留在那兒。同時，溶液中的抗原被色譜斑上的抗體捕獲。在該誘導(dǎo)步驟結(jié)束時(5-10分鐘)使用浸漬帶攪拌溶液。這使得被標(biāo)記的抗體均勻分布在溶液中，然后抗體與色譜斑上被捕獲的抗原結(jié)合。最后，增加容器體積以潤濕上部纖維素方片。所述培養(yǎng)基被再生成流過色譜斑的濃厚溶液，當(dāng)培養(yǎng)基發(fā)生轉(zhuǎn)變時產(chǎn)生了有色譜斑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，我們提供了一種進行免疫色譜分析的方法，其包括使用前述的分析系統(tǒng)。
理論上，本發(fā)明新的表面色譜現(xiàn)象也可用作基因色譜法以分離其中組分對表面具有不同結(jié)合親和力的被分析物混合物。例如，已知生物聚合物如蛋白質(zhì)和DNA/RNA結(jié)合到硝酸纖維素上，從而其用在電泳后DNA-和蛋白質(zhì)-粘吸作用中。我們還觀察到抗體對表面的結(jié)合速度是pH敏感的[1]。因此應(yīng)當(dāng)將生物聚合物的混合物引入到硝酸纖維方片上方的纖維素條帶上。所用緩沖劑的pH和密度應(yīng)當(dāng)這樣，當(dāng)條帶被浸入第二種選擇用來優(yōu)化生物聚合物與表面的結(jié)合時，能夠確保形成表層色譜。在這些條件下，當(dāng)運動相層滾動經(jīng)過表面時，在生物分子和表面間會發(fā)生不同的結(jié)合相互作用。這會導(dǎo)致展開相中組分的分離。所述條帶然后可被除去，使用已知方法對膜進行處理以顯現(xiàn)出所述混合物的固定組分。
通過下述實施例對本方進行闡述。
實施例1
在本發(fā)明新的免疫色譜系統(tǒng)中，該系統(tǒng)我們稱之為表層免疫-色譜法(Surface Layer Immuno-Chromatography(SLLC))，通過已知方法使用專用于抗原如savinase的專一抗體對硝酸纖維素膜的小方片進行預(yù)處理，以形成固定試劑的色譜斑。該方片被粘到預(yù)處理后具有一個粘性表面的塑料條帶的表面上。在其上方粘接了第二個用信息酶堿性磷酸酯酶標(biāo)記的相同抗體的干燥溶液以及牛血清白蛋白(BSA)和Tween 20浸泡過的纖維素條帶。該沉積過程所用的溶液是Tris(pH9.3)，使用體積為10μl。該溶液的組成為0.1％w/v BSA、0.1％w/v Tween20、在Tris緩沖液中以1∶1000比例稀釋的酶標(biāo)記的抗體。儲存在室溫干燥器中的這種形式的試劑穩(wěn)定存在于條帶上至少14天。
為了進行上述分析，將Tris緩沖液中的savinase(0.3ml)溶液放置在測試管如常規(guī)96孔微滴定盤中。當(dāng)兩個方片均被樣品覆蓋時，將浸漬帶插入到孔中。潤濕后，纖維素方片中的試劑流入溶液。由于其較高的密度，該溶液然后沿著條帶表面以層狀向下流動，并最后經(jīng)過含固定抗體色譜斑的較低方片。在條帶插入和流動相到達時的時間間隔內(nèi)，本體溶液中的savinase分子已被較低色譜斑上的固定抗體捕獲。在流動相到達后，當(dāng)溶液流過色譜斑時，被標(biāo)記的抗體將結(jié)合到被捕獲的抗原分子上，如在常規(guī)夾心型ELLSA中。第一個誘導(dǎo)階段通常為15分鐘。
將所述條帶從孔中除去，并放置在含用于堿性磷酸(酯)酶、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)和硝基藍四氮唑鹽(NBT)的常用培養(yǎng)基混合物的孔中。1分鐘誘導(dǎo)后成為紫/藍色，其亮度與在第一個誘導(dǎo)步驟中色譜斑上被捕獲的savinase的量直接相關(guān)，從而與樣品中savinase的濃度相關(guān)。上部方片也被著色成紫/藍色。對該被分析物得到的條帶進行觀察表明分析結(jié)果。應(yīng)當(dāng)注意的是我們使用了12個這種牛角狀條帶，這可通過使用單一微滴定板對多達96個樣品/標(biāo)準(zhǔn)樣(8×12)進行分析。還應(yīng)當(dāng)指出的是在零標(biāo)點和5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)件間可清晰觀察到視覺差別。
實施例2與實施例1相同，將具有專一抗體色譜斑的硝酸纖維素膜的方片固定到塑料條帶的表面。在其下方放置第二個纖維素條帶(被切成0.4×0.6cm的方片以快速硬化濾紙)。該方片用5μl與信號酶堿性磷酸酯酶標(biāo)記的相同抗體在藍色葡聚糖(3％w/v)、葡聚糖(25w/v)中的稀溶液進行浸泡，所有溶液均指在疊氮化物的Tris緩沖劑中，pH＝9.3(含0.1％Tween 20和0.15(w/v)牛血清白蛋白)。將所用溶液在室溫下干燥30分鐘。將第三個快速硬化的濾紙疊放在第一個方片上方，并用堿性磷酸酯酶的培養(yǎng)液進行浸泡。這通過加入15μl 1％(w/v)藍色葡聚糖、1％(w/v)葡聚糖和BCIP-NBT原料溶液來制備。使其在環(huán)境溫度下干燥60分鐘，此時將方片粘到浸漬帶上。
預(yù)制備的浸漬帶然后被加入到含0.6ml標(biāo)準(zhǔn)液或樣品的微型試管中。10分鐘后在試管底部觀察到藍色溶液層。用所述條帶攪拌試管中的內(nèi)含物。從而使整個溶液形成均勻的藍色。再誘導(dǎo)5分鐘后，加入500μl的培養(yǎng)基緩沖溶液以覆蓋在浸漬帶上的頂部方片。最后誘導(dǎo)10分鐘后，除去所述的條帶并用水沖洗。
當(dāng)使用兔的抗-savinase抗體作為捕獲劑，并在savinase標(biāo)準(zhǔn)液存在下封存抗體，進行上述分析時可觀察后續(xù)的條帶。
得到的浸漬帶如

圖1所示，其中A＝零標(biāo)點，B＝10ng/ml的savinase標(biāo)準(zhǔn)液
權(quán)利要求
1.一種親和色譜分析系統(tǒng)，包括含生物試劑的固定組分和含補充生物試劑的流動組分，其特征在于固定組分被支承在浸漬帶或平面上，流動組分適于沿高密度浸漬帶向下流動。
2.如權(quán)利要求1的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于流動組分比本體溶液具有更高的密度。
3.如權(quán)利要求1的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于免疫試劑是抗原或抗體。
4.如權(quán)利要求1的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于流動組分保持為分離體。
5.如權(quán)利要求1的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于流動相的組分包括生物聚合物、清潔劑和具有優(yōu)化pH的緩沖液。
6.如權(quán)利要求1的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于固定組分具有吸引流動組分的性質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于吸引流動組分是通過膜實現(xiàn)的。
8.如權(quán)利要求7的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于所述膜既有憎水性又有可潤濕性。
9.如權(quán)利要求3的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于所述分析是使用被標(biāo)記的抗原或被標(biāo)記的抗體以及所補充的未被標(biāo)記的對應(yīng)成分的適當(dāng)組合，進行競爭性或非競爭性免疫分析。
10.如權(quán)利要求9的親和色譜分析系統(tǒng)，其特征在于標(biāo)記是熒光標(biāo)記或有色標(biāo)記。
11.一種進行親和色譜分析的方法，其包括使用如權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)。
12.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述浸漬帶基本上豎立于緩沖溶液中。
13.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于流動組分分配于鄰近浸漬帶上部或下部處。
14.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述方法包括分離分析物混合物。
15.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述組分對表面具有不同的結(jié)合親和力。
16.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述方法包括單一步驟分析。
17.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述方法包括分離生物聚合物。
18.如權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述生物聚合物選自蛋白質(zhì)和DNA/RNA。
19.一種親和色譜分析系統(tǒng)，或一種基本如實施例所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種親和色譜分析系統(tǒng)，其包括含生物試劑的固定組分和含補充生物試劑的流動組分，其特征在于固定組分被支承在浸漬帶或平面上，且流動組分適于沿高密度浸漬帶向下流動。本發(fā)明還公開了一種進行親和色譜分析的方法，其包括使用所述分析系統(tǒng)。
文檔編號G01N33/558GK1742202SQ200480002512
公開日2006年3月1日 申請日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者弗雷德里克·約翰·羅韋爾 申請人:桑德蘭大學(xué)