專利名稱：一類降倍半萜過氧化合物及其制備方法和抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化合物領(lǐng)域，具體涉及一類源于真菌的具有抗腫瘤活性的降倍半 萜過氧化合物及其制備方法，以及這類降倍半萜過氧化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海洋占地球表面積70%，海洋微生物無論從數(shù)量上或是多樣性方面都相當豐富，美 國“國際海洋微生物普查”項目首席科學(xué)家米切爾 索金最近公布，海洋微生物的總量應(yīng)在 500 1000萬種，遠遠超出原來20萬種的估計，也遠遠超出全球動植物種類的總和。海洋微生物生活在特殊環(huán)境之中，例如高鹽度、高壓、低營養(yǎng)、低溫(特別是深海) 或局部高溫和無光照以及不同的生物之間的關(guān)系等等。在這些所謂生命的極限環(huán)境中，海 洋微生物已發(fā)展出獨特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也提供了在陸地微 生物中未遇到過的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)潛力，因而是多種多樣新穎化合物的極好資源。科技界 相信，海洋微生物將成為21世紀開發(fā)新型醫(yī)藥品的資源。紅樹林生態(tài)系是世界上最富多樣性、生產(chǎn)力最高的海洋生態(tài)系之一。紅樹林沼澤 區(qū)有充足的植物材料，有豐富的浮游藻類和浮游生物，這些條件正適合于微生物的繁殖。在 過去的十幾年里，紅樹林棲息地被證明是真菌新種屬的豐富來源，這形成了海洋真菌第二 大的生態(tài)學(xué)亞類。自從19 年從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來源， 它們在抗菌，抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑等有重要應(yīng)用。海洋微生物種類繁多， 來源廣泛，篩選獲得率高，根據(jù)John教授在2008年《Natural Product Reports))的報道， 2006年發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物新化合物中，海洋微生物是主要來源之一，成為當今國際上研究 白勺^^ ； ^^ ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌的一類降倍半萜過氧化合物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述降倍半萜過氧化合物的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述降倍半萜過氧化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
發(fā)明人由南海海洋真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的發(fā)酵培養(yǎng) 物中提取分離得到一類降倍半萜過氧化合物，結(jié)構(gòu)式如(I )或(II)本發(fā)明所用的真菌Talaromyces sp. HN21-3C,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC，中國武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號為CCTCC No =M 201(^66，保藏日為2010年10月15曰。上述降倍半萜過氧化合物的制備方法，包括以下步驟
(1)真菌Ti^arofflj^es sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266 的種子培養(yǎng)；
(2)真菌Ti^arofflj^es sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266 的發(fā)酵培養(yǎng)；
(3)將步驟(2)得到的發(fā)酵液和菌體離心，除去發(fā)酵液，得到菌絲體；
(4)將菌絲體用有機溶劑萃取，濃縮萃取液，得到浸膏，對浸膏進行色譜分離，以石油 醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫，收集10% 50%乙酸乙酯/石油醚洗脫液；
(5)將步驟(4)得到的洗脫液以30%的乙酸乙酯-石油醚為洗脫液進行凝膠柱層析分 離，重結(jié)晶純化，得到化合物I和II。其中，步驟(1)所述種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成及重量份數(shù)為葡萄糖0. 3 2. 5，酵母 提取物0. 03 0. 2，蛋白胨0. 1 0. 5，瓊脂1. 5 2. 5，氯化鈉1. 5 4，水100 ；制成試管 斜面，挑取菌株接入斜面，28 35°C培養(yǎng)7 10天。步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成及重量份數(shù)為葡萄糖0. 5 5，酵母提取 物0. 2 1，蛋白胨0. 5 2，氯化鈉1. 5 5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng) 基，于25 ;35°C靜置1 2個月。步驟(4)中所述有機溶劑為甲醇、乙酸乙酯或丙酮。上述降倍半萜過氧化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤為乳腺癌、前列 腺癌、子宮頸癌或肝癌。本發(fā)明經(jīng)試驗證明，降倍半萜過氧化合物I和II能有效抑制多種腫瘤細胞株的生 長，可用于制備抗腫瘤藥物，可以是藥物上可接受的任意一種劑型。與現(xiàn)有抗腫瘤藥物相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的降倍半萜過氧化合 物I和II來源于海洋真菌，海洋真菌種類繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡單，使得降 倍半萜過氧化合物I和II來源豐富、成本低廉；降倍半萜過氧化合物I和II抗腫瘤活性高， 應(yīng)用前景廣闊。
具體實施例方式
實施例1降倍半萜過氧化合物的制備方法a.H Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No :M 2010266 的種子培養(yǎng)
培養(yǎng)基組成按重量比為葡萄糖2. 5，酵母提取物0. 2，蛋白胨0. 5，瓊脂2. 5，氯化鈉 3. 5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，28°C培養(yǎng)10天；
b.真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No :M 2010266 的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量比為葡萄糖5%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，氯化鈉3. 5%，水 100 ；將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25 35°C靜置1個月；
c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液和菌體離心除去發(fā)酵液；
d.將離心得到的菌絲體用甲醇萃取多次，濃縮萃取液，將獲得的浸膏利用硅膠柱進行 色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；
e.收集10%— 50%乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30%的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再 以凝膠柱層析分離，重結(jié)晶純化，即得到無色顆粒晶體化合物I和II。 化合物I和II的試驗數(shù)據(jù)
化合物 I C14H2tlO4, HRESI-MS :275. 1292 (M+Na) + (計算值 275. 1259)，mp 232 °C . IR ν/cm1 (KBr) 3424，2952，2912，2888，1739，1723，1433，1324，1180，1132，1086， 1019，967, 817,739, 591, 509.
1H匪R (400 MHz, CDCl3)δ 4. 18 (t,J =2.8 Hz, 1H),2.95(ddd,J=17. 3;12. 0, ^L 5 Hz;,1H), 2. 75(ddd，J = 15. 2，14. 6，6. 7 Hz, 1H), 2. 61(dd,J=17. 37. 4 Hz,1H),2. 50 (ddd,j =15. 5，4. 8，2 5 Hz, 1H)，2. 36(dddd,J =14.1，8. 5:3.9，1.6 Hz,1H), 2. 29(dt,J = 14. 1，3.8 Hz,1H), 2. 06(td;,J=14.4，4. 7 Hz1H), 1 99 -1. 88 (m,2H),1. 66 (ddd,J =14. 4, 6.6，2. 5Hz,2H)，ι 52 (s3H), 1.32 (s，3H), 1.04(s,3H).13C匪R(101 MHz, CDCl3)δ 206. 98，206 65，91.00，81,.63，41.99，39. 36;37. 71，35. 84,，35· 73，32, 21，26. 42, 26. 21，24,.82，22. 00.
化合物 II C16H24O5, HRESI-MS 319. 1518 (M+Na) + (計算值 319. 1521)，mp 169°C .
IR ν/CnT1(KBr): 3434，2961，2881，1729，1459，1395，1370，1255, 1163, 1126:1102，1044，1013，965，900，810，623, 60￡i, 545，500，469.1H NMR (400 MHz, CDCl3):5 4. 87 (ddd,J = H-3，7 6，3. 8Hz,1H), LL 23 (td:J = 4.4, 2. 1 Hz, 1H), 2. 72-2. 59 (m,1H), 2,.46-2. 33(m,2H),2. 14 (s:1H), 2.07 (s, 3H), 2.05 -1.91 (m, 3H),1. 73-1.47(m,3H),,1. 39(s, 3H);1. 23 (s, 3H), 0. 95 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3)丨δ 207. 91,171. 02，90.02，76 02，71. 71，41.39:37. 40，35. 80， 35. 68，30. 53，27. 45，26. 25，25. 37，24.71,21.49，21. 27.
實施例2 MTT比色法檢測降倍半萜過氧化合物I和II抗腫瘤活性實驗 1.材料
1. 1 噻唑藍(MTT):用 0. 01mol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解 MTT (3-(4, 5-dimethythi azol-z-yl) 2，5-diphenyl-tetrazolium bromide, SIGMA)終濃度 5mg/mL，過濾除菌，分裝
后4°C避光保存。 1. 2靶細胞的制備人乳腺癌細胞系MDA-MB-435和MCF7、人前列腺癌細胞系 PC-3、子宮頸癌細胞系Hela、人肝癌細胞系H印G2和人正常乳腺細胞系MCF-10A的復(fù)蘇與培養(yǎng)。a.從液氮罐中取出人乳腺癌細胞系MDA-MB-435和MCF-7，人前列腺癌細胞系 PC-3,子宮頸癌細胞系Hela，人肝癌細胞系IfepG2和人正常乳腺細胞系MCF-10A的凍存管， 迅速置入37°C水浴箱中，不停搖動使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；
b.加DMEM完全培養(yǎng)液至10mL，IOOOrmp離心5min，棄上清；
c.重復(fù)以上操作一次；
d.以DMEM完全培養(yǎng)液吹打使細胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5%C02，37°C培養(yǎng)；
e.觀察細胞生長情況，及時更換培養(yǎng)液，分瓶。1.3細胞計數(shù)
a.選取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止，移入離心管中，加DMEM完 全培養(yǎng)基至IOmL ；
b.取10μ1細胞懸液滴入計數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計數(shù)四大格的細胞總數(shù)、除以 4，乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細胞數(shù)；
c.調(diào)整細胞數(shù)至lX105/mL。1. 4降倍半萜過氧化合物I和II的配制取降倍半萜過氧化合物I和II加入到 DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為50(^g/mL，超聲乳化，過濾除菌，4°C保存。2.試驗方法
a. 96孔板各孔加入人乳腺癌細胞系MDA-MB-435和MCF-7，人前列腺癌細胞系PC-3， 子宮頸癌細胞系Hela，人肝癌細胞系H印G2和人正常乳腺細胞系MCF-10A ΙΟΟμ (IX IO5/ mL),5% C02，37°C培養(yǎng) 4h。b.加入不同濃度受試對象100 μ ，對照加DMEM完全培養(yǎng)基100 μ ，繼續(xù)培養(yǎng) 48h。c.加入 MTT (5mg/mL)各 10 μ ，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。d.去除培養(yǎng)液。每孔加入DMS0100 μ ，輕輕振蕩5 lOmin，使顆粒溶解。e.酶聯(lián)免疫儀570nm下測定每孔OD值。f.計算抑制率
腫瘤細胞殺傷率％=[(對照組測定的平均OD值一加藥組測定的平均OD值)/對照 組測定的平均OD值]X 100%。g.以抑制率對藥物濃度的對數(shù)作圖，求得IC5tl值；以Ig c為橫坐標，抑制率為縱 坐標，求得IC5tl值。3.試驗結(jié)果
試驗結(jié)果顯示降倍半萜過氧化合物I和II均能有效抑制人乳腺癌細胞株MDA-MB-435 和MCF-7，人前列腺癌細胞株P(guān)C-3，子宮頸癌Hela，人肝癌細胞株H印G2，化合物I和II的 抑制腫瘤IC50值(Pg/mL)見表1。表1化合物I和II的體外細胞毒試驗結(jié)果(IC5tl Pg/mL). .......................................————— ................................................................1'" i ............................................................................MDA-MB-4352.64ν ”i ι·； < -. 1X -/ι ；·κ；MC1-7............................................................................................... < .63K 1 V^__ Cs Mt -Hi A""“mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmr^ {:’—_, !>' TH.-:’4.54
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權(quán)利要求
1. 一類降倍半萜過氧化合物，結(jié)構(gòu)式如(I)或(II):
2.一種真菌Ti^aro ,"^ sp. HN21-3C，于2010年10月15日在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏，保藏號為M 2010266o
3.權(quán)利要求1所述降倍半萜過氧化合物的制備方法，包括以下步驟(1)真菌Talaromyces sp. HN21-3C 的種子培養(yǎng)；(2)真菌Talaromyces sp. HN21-3C 的發(fā)酵培養(yǎng)；(3)將步驟(2)得到的發(fā)酵液和菌體離心，除去發(fā)酵液，得到菌絲體；(4)將菌絲體用有機溶劑萃取，濃縮萃取液，得到浸膏，對浸膏進行色譜分離，以石油 醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫，收集10% 50%乙酸乙酯/石油醚洗脫液；(5)將步驟(4)得到的洗脫液以30%的乙酸乙酯-石油醚為洗脫液進行凝膠柱層析分 離，重結(jié)晶純化，得到化合物I和II。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成 及重量份數(shù)為葡萄糖0.3 2. 5，酵母提取物0. 03 0.2，蛋白胨0. 1 0.5，瓊脂1.5 2. 5，氯化鈉1.5 4，水100 ；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，^ 35°C培養(yǎng)7 10天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基 組成及重量份數(shù)為葡萄糖0.5 5，酵母提取物0.2 1，蛋白胨0.5 2，氯化鈉1. 5 5，水100 ；將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C靜置1 2個月。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述有機溶劑為甲醇、乙酸 乙酯或丙酮。
7.權(quán)利要求1所述降倍半萜過氧化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌、前列腺癌、子宮頸癌或 肝癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類降倍半萜過氧化合物，分子式為C14H20O4或C16H24O5，該類化合物來源于海洋真菌Talaromycessp.HN21-3CCCTCCNo:M2010266。本發(fā)明還公開了該類化合物的制備方法，包括真菌的種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、分離菌絲體、有機溶劑萃取菌絲體、色譜分離、凝膠柱層析分離以及重結(jié)晶純化等步驟。本發(fā)明的降倍半萜過氧化合物可以用于制備抗腫瘤藥物，藥效顯著。
文檔編號C07D319/02GK102070598SQ201010594029
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者佘志剛, 劉亞月, 劉嵐, 朱勛, 李翰祥, 林永成, 江潔怡, 陸勇軍, 黎孟楓 申請人:中山大學(xué)