專利名稱：一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方 法，屬于生物學免疫方法的檢測技術領域。
背景技術：
醋酸潑尼松是一種腎上腺皮質激素類藥，具有抗炎、抗過敏、抗風濕、免疫抑制作 用。近幾年來，一些不法生產企業(yè)為牟取暴利，在未經獲得批準的情況下，在治療免疫性疾 病(例如紅斑狼瘡、關節(jié)炎、腎炎等等)的中藥中非法添加醋酸潑尼松等激素，患者在不知情 的情況下，短期內使用這些有問題的“純中藥制劑”，療效確實不錯，但是這些作用其實就是 激素的作用，但是長期使用或是突然停藥，問題就出來了 長期使用引起腎上腺抑制，誘發(fā) 柯興氏綜合癥(滿月臉、女性多毛、痤瘡、高血壓、骨質疏松、性功能紊亂等)；增加感染機會； 影響外傷愈合；增加消化道潰瘍出血和穿孔的可能性；生長發(fā)育遲緩、精神失調、白內障、 青光眼、骨骼壞死等等。突然停藥，導致內源性皮質激素過低(腎上腺萎縮)引起對激素反應 缺乏，病情迅速復發(fā)，甚至于惡化。一些急性腎功能不全的病人，突然停止使用激素非常危 險，甚至于致死。如果使用添加了激素的“純中藥制劑”，病人并不知情，而這些病人恰好又 是激素禁忌癥和慎用患者，例如活動性消化性潰瘍、骨折、高血壓、糖尿病、孕婦等，一旦使 用，危險就大了。所以，為了保證人民群眾的飲食用藥安全，我們必須加大力度打擊這種現 象。然而近年來，不法分子非法生產的手段日趨隱蔽，而且由于中藥成分比較復雜，檢測難 度較大，需要精密的分析儀器和專業(yè)技術人員，因而造成監(jiān)管部門監(jiān)督抽驗成本很大，收效 卻不甚理想。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服以上的不足，提供一種能快速、靈敏、簡便地檢測醋酸潑 尼松衍生物的醋酸潑尼松膠體金層析檢測試紙條及制備方法。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體 金層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成， 金標結合墊為吸附醋酸潑尼松衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用醋酸潑尼 松衍生物偶聯的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對 照線C線，兩條線豎向平行排列。襯板為不吸水的PCV韌性材料。包被膜為硝酸纖維素膜， 或混合纖維素膜。吸水墊為植物纖維棉紙。醋酸潑尼松衍生物的金標抗體為膠體金標記的 抗醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體復合物，偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體蛋白為牛血清白 蛋白BSA。一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，制備偶聯 醋酸潑尼松衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線；制備偶聯醋酸潑 尼松衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備醋酸潑尼松衍生物金標抗體，用于制備吸附醋酸潑尼松衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備 對照線C線，包括如下步驟
(A)將醋酸潑尼松衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯制備人 工合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應完全后，現配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25 ；等所有反應結束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經上述透析步驟最終所得的產品，經冷凍干燥為白 色絮狀產品，即為人工合成抗原；
(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體細胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白 濃度，備膠體金標記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min)，逐滴加入1%絡蛋白溶 液，使絡濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗醋酸潑尼松衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，重懸液為含 5%海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；
(E)將1:20-1:10稀釋的醋酸潑尼松衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈 中，27 °C保溫干燥，制備醋酸潑尼松衍生物金標結合墊；
(F)在包被膜上用醋酸潑尼松衍生物偶聯的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢 測線T線，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊、金標組合墊、包被膜和吸水墊依次粘附在襯板上，樣品墊 置于襯板的一端，吸水墊置于襯板的另一端，包被膜置于襯板的中間，金標結合墊置于樣品 墊和包被膜之間，即得到用于免疫檢測的醋酸潑尼松衍生物膠體金層析檢測試驗紙大板， 將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點
1、特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標記高特異性高親和力靜 電吸附的單克隆抗體為基礎制備而成；
2、簡便、快速、時效性強，使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和 儀器，可現場操作，將樣品用提取液混合后，取上清液進行檢測，在5min即可判定檢測結 果；
3、結果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測結果陽 性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯 示兩條紅色線T線和C線時，表示在被減樣品中不含被檢物。結果判定形象、直觀、準確、簡 單明了，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判；
4、制備方法采用噴涂工藝，簡單快速，噴涂均勻，干燥快。


圖1為本發(fā)明的剖面結構示意圖； 圖2為本發(fā)明的俯視結構示意圖中標號1-襯板、2-樣品墊、3-金標結合墊、4-包被膜、5-吸水墊、6-T線、7-C線。
具體實施例方式
為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳述，該實施 例僅用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。如圖1、圖2所示一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯 板1和在襯板1上依次銜接的樣品墊2、金標結合墊3、包被膜4和吸水墊5組成，金標結合 墊3為吸附醋酸潑尼松衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜4上有用醋酸潑尼松衍 生物偶聯的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線6，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照 線C線7，兩條線豎向平行排列。襯板1為不吸水的PCV韌性材料。包被膜4為硝酸纖維素 膜，或混合纖維素膜。吸水墊5為植物纖維棉紙。醋酸潑尼松衍生物的金標抗體為膠體金 標記的抗醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體復合物，偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體蛋白為牛 血清白蛋白BSA。制備偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢 測線T線6 ；制備偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備 醋酸潑尼松衍生物金標抗體，用于制備吸附醋酸潑尼松衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備對照線C線7，包括如下步驟
(A)將醋酸潑尼松衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯制備人 工合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應完全后，現配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25;等所有反應結束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經上述透析步驟最終所得的產品，經冷凍干燥為白 色絮狀產品，即為人工合成抗原；
(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體細胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白 濃度，備膠體金標記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min)，逐滴加入1%絡蛋白溶 液，使絡濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗醋酸潑尼松衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，重懸液為含(E)將1 :20-1:10稀釋的醋酸潑尼松衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈 中，27°C保溫干燥，制備醋酸潑尼松衍生物金標結合墊3 ；
(F)在包被膜4上用醋酸潑尼松衍生物偶聯的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式 檢測線T線6，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線7，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊2、金標組合墊3、包被膜4和吸水墊5依次粘附在襯板1 上，樣品墊2置于襯板1的一端，吸水墊5置于襯板1的另一端，包被膜4置于襯板1的中 間，金標結合墊3置于樣品墊2和包被膜4之間，即得到用于免疫檢測的醋酸潑尼松衍生物 膠體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條， 密封干燥保存。醋酸潑尼松膠體金層析試紙條的檢測反應原理醋酸潑尼松屬于小分子物質。 本發(fā)明采用競爭法，即樣品中的醋酸潑尼松和固定在包被膜4上的包被抗原M2-BSA競爭膠 體進標記的抗醋酸潑尼松單克隆抗體。當試紙條以樣品墊2末端浸入樣本后，樣品溶液沿 著試紙條通過毛細作用從下往上泳動，溶解金標墊上干燥的金標抗體，若待測樣品中不存 在待測藥物，則金標抗體會直接泳動到檢測線和硝酸纖維膜上的M2-BSA發(fā)生免疫反應，從 而膠體金顆粒發(fā)生聚集，形成紅色線條，然后其他未結合的金標抗體繼續(xù)通過毛細管作用 向前泳動，與對照線上的羊抗鼠二抗發(fā)生第二次免疫反應，同樣形成紅色線條，這樣包被膜 4上就會有兩條紅色線條，表示樣品為陰性。若待測樣品中存在待測藥品，則金標抗體首先 會和樣品中的檢測物發(fā)生免疫反應，當未發(fā)生反應的金標抗體有剩余時，才會在檢測線上 與M2-BSA發(fā)生免疫反應，形成紅色線條，其顏色強度弱于陰性時的線條強度；而當金標抗 體全部和樣品中的醋酸潑尼松發(fā)生免疫結合時，就不會再有抗體與對照線包被原結合，從 而檢測線就不會有紅色線條出現。對照線是為檢驗金標免疫層析方法本身是否存在待測藥 物，對照線都應該顯現。如果對照線不顯色，則說明試紙否有效而設定的，所以無論樣品中 是條失效。本發(fā)明特異性強，敏感度高，檢出最低限量可達到5ppb ；簡便、快速、時效性強， 無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內即可判定 檢測結果；結果顯示形象、直觀、準確；節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。
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權利要求
一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于由襯板(1)和在襯板(1)上依次銜接的樣品墊(2)、金標結合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)組成，金標結合墊(3)為吸附醋酸潑尼松衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜(4)上有用醋酸潑尼松衍生物偶聯的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線(6)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線(7)，兩條線豎向平行排列。
2.根據權利要求1所述一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，其 特征在于所述襯板(1)為不吸水的PCV韌性材料。
3.根據權利要求1或2所述一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙 條，其特征在于所述包被膜(4)為硝酸纖維素膜，或混合纖維素膜。
4.根據權利要求1所述一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，其 特征在于所述吸水墊(5)為植物纖維棉紙。
5.根據權利要求1所述一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，特 征在于醋酸潑尼松衍生物的金標抗體為膠體金標記的抗醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體 復合物，所述偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。
6.一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在 于制備偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線(6); 制備偶聯醋酸潑尼松衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備醋酸潑尼松 衍生物金標抗體，用于制備吸附醋酸潑尼松衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠 IgG抗體，用于制備對照線C線(7)，包括如下步驟(A)將醋酸潑尼松衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯制備人 工合成抗原；a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反應完全后，現配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0. 2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5°C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25;等所有反應結束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經上述透析步驟最終所得的產品，經冷凍干燥為白 色絮狀產品，即為人工合成抗原；(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體細胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白 濃度，備膠體金標記用；(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；(D)用0.lmol/LK2C03調節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min)，逐滴加入1%絡蛋白溶 液，使絡濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗醋酸潑尼松衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，所述重懸液 為含5%海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；(E)將1:20-1:10稀釋的醋酸潑尼松衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈 中，27°C保溫干燥，制備醋酸潑尼松衍生物金標結合墊(3)；(F)在包被膜(4)上用醋酸潑尼松衍生物偶聯的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線 式檢測線T線(6)，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線(7)，兩條線豎向平行排列；(G)試紙條的組裝將樣品墊(2)、金標組合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)依次粘附 在襯板(1)上，樣品墊(2)置于襯板(1)的一端，吸水墊(5)置于襯板(1)的另一端，包被 膜(4)置于襯板(1)的中間，金標結合墊(3)置于樣品墊(2)和包被膜(4)之間，即得到用 于免疫檢測的醋酸潑尼松衍生物膠體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成 2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速檢測醋酸潑尼松及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成，金標結合墊為吸附醋酸潑尼松衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用醋酸潑尼松衍生物偶聯的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列。其具體步驟制備人工結合抗原；制備醋酸潑尼松衍生物的單克隆抗體；制成膠體金溶液；獲得抗醋酸潑尼松衍生物單克隆抗體的膠體金標記物和金標結合墊。本發(fā)明具有特異性強，敏感度高，簡便、快速、時效性強，結果顯示形象、準確的優(yōu)點。
文檔編號C07K16/44GK101949925SQ201010516358
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權日2010年10月22日
發(fā)明者吳迪宏, 歐衛(wèi)軍 申請人:南通市伊士生物技術有限責任公司