專利名稱：一種高純度兩性霉素b的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種利用兩性霉素B發(fā)酵液制備高純度兩性霉素B的方法。
背景技術(shù)：
^3B (Amphotericin B) ^ π 1 (Streptomyces nodosus) /fe^ 的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種黃色或橙黃色結(jié)晶粉。分子式為C46H73NO17,分子量為924. 09。兩性霉素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)在20世紀(jì)70年代，通過(guò)X-ray衍射技術(shù)得到了石角證(Mechlinski, W. ；C. P. Schaffner, P. Gann. & g. Avitabile, Structure and absolute configuration of the polyene macroIide antibiotic amphotericin B.Tetrahedron letter 44 :3873-3876 (1970)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下兩性霉素B臨床上主要用于治療系統(tǒng)性真菌感染，兩性霉素B的抗真菌原理為通過(guò)與真菌細(xì)胞膜上麥角固醇特異性結(jié)合，從而分解細(xì)胞膜，使得細(xì)胞內(nèi)容物外泄而導(dǎo)致 ^^iffllfi^t (Norman, Α. W. ， Spielvogel，Α. Μ. ，Wong, R. G. ，Plyene antibiotic-sterol interaction. Adv Lipid Res 14 :127-171 (1976))，用于隱球菌、球孢子菌、念球菌、毛霉菌、曲菌等引起的全身感染，是一種療效好但毒性也大的藥物。兩性霉素B傳統(tǒng)劑型的溶血性和腎松懈性副作用曾一度限制了該藥品的使用，但是近年來(lái)AmB脂質(zhì)體的發(fā)明，在保持抗菌活性不變的前提下，大大降低了毒副作用，使得該藥物在臨床上重新得到了廣泛應(yīng)用(Subira M，Martino R，et al，Lowdose amphotericin B lipid complex vs.conventional amphotericin amphotericin B for empirical antifungal therapy of neutropenic fever in patients with hematologic malignancies-a randomized, controlled trial. Eur J Haematol 72:342—7(2004))。 IE 如兩性霉素B的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中存在雜質(zhì)一樣，兩性霉素B藥品及脂質(zhì)體中雜質(zhì)的控制亦不容忽視。兩性霉素B已經(jīng)被美國(guó)藥典四版(United States Pharmacopoeia 24th Edition No. 1；34)、英國(guó)藥典2005版(British Pharmacopoeia 2005 Edition No. 141)以及中國(guó)藥典 2005版(Chinese Pharmacopoeia 2005 version)收載。兩性霉素B作為微生物代謝產(chǎn)物， 具有生物活性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差、有關(guān)物質(zhì)多等特點(diǎn)，所以其質(zhì)量的穩(wěn)定可控和質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)于保障人民的用藥安全至關(guān)重要。兩性霉素B是含37個(gè)碳原子組成的大環(huán)內(nèi)酯乳糖七烯類的抗生素，含有七個(gè)相連的雙鍵結(jié)構(gòu)，在其C-18上帶有一羧基基團(tuán)，決定了兩性霉素B幾乎不溶于水，在二甲亞砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中極微溶解，在無(wú)水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。由于兩性霉素B的溶解特性，很多用于兩性霉素B分離的工藝為溶媒提取結(jié)晶和物理分離。關(guān)于兩性霉素B的分離純化工藝，付瑞良等(抗生素工藝學(xué)下編[M].國(guó)家醫(yī)藥管理局，1992 28 30)公開(kāi)了一種兩性霉素B的提取方法，采用堿將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至10. 0-14. 0后，固液分離得到兩性霉素B提取液。將兩性霉素B提取液酸化調(diào)pH值至 5. 0-7.0，析出50%左右兩性霉素B產(chǎn)品。該方法得到的兩性霉素B產(chǎn)品純度較低(含量在50%左右)，即使再經(jīng)過(guò)反復(fù)結(jié)晶和重結(jié)晶，兩性霉素B甲酯、兩性霉素A及其它單雜的含量仍然較高。美國(guó)專利US4748117報(bào)道了一種不加有機(jī)溶劑而直接從發(fā)酵液中回收兩性霉素B 的分離方法。該方法在兩性霉素B發(fā)酵結(jié)束時(shí)，首先將發(fā)酵液加熱到120°C誘導(dǎo)兩性霉素B 晶體形成，然后冷卻并保持溫度為35°C，再加入溶菌酶溶解發(fā)酵液中的菌絲體，然后利用重力離心，從而獲得兩性霉素B。由于該工藝對(duì)發(fā)酵液質(zhì)量和分離設(shè)備要求嚴(yán)格，沒(méi)有脫熱源工序，得到的兩性霉素B純度低。美國(guó)專利US4177265公開(kāi)了一種兩性霉素B的結(jié)晶方法，該方法將兩性霉素B粗粉加入堿溶解，過(guò)濾，洗滌后得到濾液，再向?yàn)V液中加入DMF、水、甲醇和兩性霉素B晶種，在 50-52°C攪拌10分鐘后冷卻到5°C，16小時(shí)后過(guò)濾，得到兩性霉素B結(jié)晶粉(962 y /mg)。該方法應(yīng)用多種溶劑結(jié)晶，不利于溶劑回收和再利用，因此不適合規(guī)模化生產(chǎn)。美國(guó)專利US2908611報(bào)道了從發(fā)酵液中用極性溶劑如異丙醇、丁醇和丙酮，采用萃取法提取兩性霉素B，從而獲得了一種抗真菌混合物原液，濃縮后從中可分離兩性霉素 B。這些提取過(guò)程一般要求多級(jí)純化，操作費(fèi)用比較昂貴，同時(shí)這些工藝均屬于溶媒提取結(jié)晶工藝，使用的溶劑量，損耗大，造成兩性霉素B的生產(chǎn)成本較高。如何以最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)潔的步驟得到高純度兩性霉素B結(jié)晶粉，減少相關(guān)物質(zhì)，減少異源雜質(zhì)，在提高產(chǎn)品的安全性同時(shí)簡(jiǎn)化工藝、降低成本、提高產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力是本領(lǐng)域技術(shù)人員著力解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，得到高純度兩性霉素B。本發(fā)明通過(guò)加入助濾劑，提高發(fā)酵液濾速，通過(guò)固液分離去除雜質(zhì)含量高的濾液， 得到菌絲體。在菌絲體中加入乙醇?jí)A水溶解兩性霉素B，收集兩性霉素B的堿水提取液并通過(guò)膜過(guò)濾，脫色、除去熱源和大分子量雜質(zhì)和雜蛋白后，得到淡黃色凈化液。然后在凈化液中加入酸水得到兩性霉素B沉淀，將沉淀干燥后得到高純度兩性霉素B固體。具體地，本發(fā)明涉及一種高純度兩性霉素B的制備方法，包括下述步驟1)在兩性霉素B發(fā)酵液中加入酸性物質(zhì)和助濾劑，攪拌；2)固液分離，得兩性霉素B菌絲體；幻加入醇和堿水，攪拌；4)固液分離，得兩性霉素B提取液；
5)膜超濾，得凈化液；6)調(diào)節(jié)pH值彡7. 0，析出兩性霉素B結(jié)晶；7)固液分離，得兩性霉素B結(jié)晶粉。更具體地，本發(fā)明涉及一種高純度兩性霉素B的制備方法，包括下述步驟1)在常溫條件下，在兩性霉素B發(fā)酵液中加入酸性物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值至2. 0-4. 0，加入助濾劑，攪拌30分鐘-2小時(shí)；2)固液分離，得到兩性霉素B菌絲體；3) 5_30°C條件下，在兩性霉素B菌絲體中加入質(zhì)量百分比為40-80%的醇和pH值為9. 0-12. 0的堿水，攪拌1-3小時(shí)；4)固液分離，得到兩性霉素B提取液；5)將兩性霉素B提取液通過(guò)截留分子量為5000-30000Da的膜超濾，除去熱源、雜蛋白和色素等大分子量雜質(zhì)后得到凈化液；6)常溫下，用酸調(diào)節(jié)凈化液pH值至4. 5-7.0，析出兩性霉素B結(jié)晶；7)固液分離兩性霉素B結(jié)晶，得到兩性霉素B結(jié)晶粉。其中，步驟1)所述酸性物質(zhì)為有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，其中的有機(jī)酸優(yōu)選草酸或乙酸， 無(wú)機(jī)酸優(yōu)選鹽酸。助濾劑為珍珠巖或硅藻土，優(yōu)選為硅藻土。助濾劑用量為發(fā)酵液體積的 2% -10% (W/V)，優(yōu)選為5% -7% (W/V)。攪拌時(shí)間為30分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選為1-1. 5小時(shí)。其中，步驟2)中的兩性霉素B菌絲體為通過(guò)傳統(tǒng)的固液分離過(guò)程如離心、板框壓濾等方式得到兩性霉素B干燥的菌絲體。水溶性蛋白、發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的水溶性強(qiáng)的其他次級(jí)代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)位于發(fā)酵液中，隨著固液分離過(guò)程被舍棄。其中，步驟幻所述醇為甲醇或乙醇，所述堿水的量為菌絲重的2-6倍(V/W)，所述堿為氫氧化鉀、氫氧化鈉或有機(jī)堿。向兩性霉素B菌絲體中加入醇-堿水的量為菌絲重的2-10倍(V/W)，優(yōu)選為4-6倍。優(yōu)選乙醇-堿水溶液，其中乙醇的重量百分比優(yōu)選為 60%-70%。堿水為氫氧化鉀、氫氧化鈉或有機(jī)堿的水溶液，優(yōu)選為氫氧化鈉的水溶液。堿水的PH值優(yōu)選為11.0-12.0。堿水提取時(shí)的溫度為5-30°C，優(yōu)選為10_20°C。攪拌時(shí)間優(yōu)選為2-3小時(shí)。其中，步驟5)中的膜為陶瓷膜、不銹鋼膜、中空纖維膜或其他材質(zhì)的膜組件，優(yōu)選為陶瓷膜膜組件，截留分子量為5000-30000Da (膜孔徑為50-200nm)，更優(yōu)選 IOOOODa (200nm)的陶瓷膜。其中，步驟6)調(diào)節(jié)pH值所用的酸類為鹽酸、磷酸或有機(jī)酸，優(yōu)選鹽酸。調(diào)節(jié)凈化液PH值優(yōu)選5. 5-6. 5。其中，步驟7)的固液分離可以采用常規(guī)手段，如離心、板框壓濾等。按照上述7個(gè)步驟得到兩性霉素B結(jié)晶粉后，可以用真空干燥的方式在40-60°C條件下干燥至水分介于2. 0-5. 0%，進(jìn)而得到高純度兩性霉素B。本發(fā)明根據(jù)兩性霉素B的溶解特性篩選到合適的提取溶劑，首次采用膜過(guò)濾這一綠色環(huán)保工序從提取液中將目的產(chǎn)物分別進(jìn)行脫色、除雜和除熱源和富集。本發(fā)明取得了良好的技術(shù)效果1.固液分離過(guò)程中加入了助濾劑，提高了過(guò)濾速度，縮短了工藝周期。同時(shí)經(jīng)過(guò)固液分離舍棄了含色素和蛋白質(zhì)及其他極性大的雜質(zhì)，提高了提取液的質(zhì)量。
2.超濾膜分離技術(shù)的應(yīng)用，去除了大部分色素、熱源和大分子量雜質(zhì)和雜蛋白后， 提高了凈化液的澄清度和質(zhì)量。3.工藝簡(jiǎn)潔，對(duì)兩性霉素B純化行之有效，提高了產(chǎn)品純度，有效降低了色素比值，為生產(chǎn)藥用級(jí)原料及兩性霉素B脂質(zhì)體提供了更加安全的技術(shù)保障，適于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)高純度兩性霉素B。4.所得產(chǎn)品顏色為淺黃色，純度高。兩性霉素B面積歸一百分含量達(dá)到95%以上， 生物檢測(cè)效價(jià)達(dá)到970 y /mg以上，兩性霉素B甲酯小于2. 0%，兩性霉素A小于2. 0%，單雜小于0.5%，樣品回收率大于70%。


圖1 實(shí)施例1制備的兩性霉素B濾液的HPLC圖譜；圖2 實(shí)施例1制備的兩性霉素B結(jié)晶粉的HPLC圖譜；圖3 實(shí)施例2制備的兩性霉素B結(jié)晶粉的HPLC圖譜；圖4 實(shí)施例3制備的兩性霉素B結(jié)晶粉的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅用于闡述實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明所使用的兩性霉素B發(fā)酵液均為華藥新藥研發(fā)有限責(zé)任公司用微生物培養(yǎng)手段，得到的兩性霉素B發(fā)酵液。陶瓷膜為瑞通美邦生產(chǎn)的膜組件，型號(hào)為kml/frl， 鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為市售。本發(fā)明使用的高效液相色譜儀為996型檢測(cè)器，515泵 (Waters 公司)。實(shí)施例1取兩性霉素B發(fā)酵液50. 0L,發(fā)酵單位7. 6g/L。在發(fā)酵液中加入2500g珍珠巖，用草酸調(diào)節(jié)PH值至3. 0，攪拌30分鐘后真空抽濾，得到12. 3kg菌絲體。在菌絲體中加入40L 質(zhì)量百分比為60%的乙醇和用NaOH調(diào)節(jié)pH值至10. 5的堿水(乙醇用量為ML，堿水加入量為16L)，溫度維持在20°C攪拌1小時(shí)后真空抽濾，收集濾液(HPLC圖譜見(jiàn)附圖1)。將濾液通過(guò)孔徑為200nm，型號(hào)為kml/frl的陶瓷膜組件，進(jìn)行脫色、除蛋白和脫熱源，得到兩性霉素B凈化液。凈化液用乙酸調(diào)節(jié)pH值至6. 0-6. 5使兩性霉素B沉淀析出。離心分離結(jié)晶液得到兩性霉素B結(jié)晶粉。用真空干燥的方式在40-60°C條件下干燥至水分介于2. 0-5. 0%, 最后得到277. 8g淺黃色兩性霉素B結(jié)晶粉，樣品回收率為72. 6%。結(jié)晶粉面積歸一百分含量達(dá)到96. 5%，生物檢測(cè)效價(jià)達(dá)到970 y /mg,兩性霉素B甲酯小于2. 0%，兩性霉素A小于 2.0%，單雜小于0.5%。(HPLC圖譜見(jiàn)附圖2)。實(shí)施例2取兩性霉素B發(fā)酵液200. 0L,發(fā)酵單位8. 2g/L。在發(fā)酵液中加入IOOOOg硅藻土， 用乙酸調(diào)節(jié)PH值至2. 5，攪拌1小時(shí)后真空抽濾，得到50. Ikg菌絲體。在菌絲體中加入 200L質(zhì)量百分比為50%的甲醇和用NaOH調(diào)節(jié)pH值至11. 5的堿水(乙醇用量為100L，堿水加入量為100L)，溫度維持在30°C攪拌2小時(shí)后真空抽濾，收集濾液。將濾液通過(guò)孔徑為 50nm的陶瓷膜組件，進(jìn)行脫色、除蛋白和脫熱源，得到兩性霉素B凈化液。凈化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5-6.0使兩性霉素B沉淀析出。離心分離結(jié)晶液得到兩性霉素B結(jié)晶粉。用真空干燥的方式在40-60°C條件下干燥至水分介于2. 0-5. 0%，最后得到1232. 3g淺黃色兩性霉素B結(jié)晶粉，樣品回收率為75. 1%。結(jié)晶粉面積歸一百分含量達(dá)到97. 2%，生物檢測(cè)效價(jià)達(dá)到982 γ/mg，兩性霉素B甲酯小于2. 0%，兩性霉素A小于2. 0%，單雜小于0. 5%。 (見(jiàn)附圖3)。實(shí)施例3取兩性霉素B發(fā)酵液500. 0L,發(fā)酵單位7. 9g/L。在發(fā)酵液中加入27000g珍珠巖， 用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3. 5，攪拌2小時(shí)后真空抽濾，得到253. 7kg菌絲體。在菌絲體中加入 600L質(zhì)量百分比為70%的乙醇和用NaOH調(diào)節(jié)pH值至12. 0的堿水(乙醇用量為420L，堿水加入量為180L)，溫度維持在10°C攪拌3小時(shí)后真空抽濾，收集濾液。將濾液通過(guò)孔徑為 200nm的陶瓷膜組件，進(jìn)行脫色、除蛋白和脫熱源，得到兩性霉素B凈化液。凈化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5-6.0使兩性霉素B沉淀析出。離心分離結(jié)晶液得到兩性霉素B結(jié)晶粉。用真空干燥的方式在40-60°C條件下干燥至水分介于2. 0-5. 0%，最后得到四50. 6g淺黃色兩性霉素B結(jié)晶粉，樣品回收率為74. 1%。結(jié)晶粉面積歸一百分含量達(dá)到97.5%，生物檢測(cè)效價(jià)達(dá)到984 y /mg,兩性霉素A小于2. 0%，單雜小于0. 5 %，兩性霉素B甲酯小于2. 0 %。 (見(jiàn)附圖4)。
權(quán)利要求
1.一種高純度兩性霉素B的制備方法，包括下述步驟1)在兩性霉素B發(fā)酵液中加入酸性物質(zhì)和助濾劑，攪拌；2)固液分離，得兩性霉素B菌絲體；3)加入醇和堿水，攪拌；4)固液分離，得兩性霉素B提取液；5)膜超濾，得凈化液；6)調(diào)節(jié)pH值彡7.0，析出兩性霉素B結(jié)晶；7)固液分離，得兩性霉素B結(jié)晶粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括下述步驟1)在常溫條件下，在兩性霉素B發(fā)酵液中加入酸性物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值至2.0-4. 0，加入助濾劑，攪拌30分鐘-2小時(shí)；2)固液分離，得到兩性霉素B菌絲體；3)5-30°C條件下，在兩性霉素B菌絲體中加入質(zhì)量百分比為40-80%的醇和pH值為 9. 0-12. 0的堿水，攪拌1-3小時(shí)；4)固液分離，得到兩性霉素B提取液；5)將兩性霉素B提取液通過(guò)截留分子量為5000-30000Da的膜超濾，除去熱源、雜蛋白和色素等大分子量雜質(zhì)后得到凈化液；6)常溫下，用酸調(diào)節(jié)凈化液pH值至4.5-7.0，析出兩性霉素B結(jié)晶；7)固液分離兩性霉素B結(jié)晶，得到兩性霉素B結(jié)晶粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟1)所述酸性物質(zhì)為有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中有機(jī)酸為草酸或乙酸，無(wú)機(jī)酸為鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟1)所述助濾劑為珍珠巖或硅藻土，用量為2-10% (W/V)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟幻所述醇為甲醇或乙醇，所述堿水的量為菌絲重的2-6倍(V/W)，所述堿為氫氧化鉀、氫氧化鈉或有機(jī)堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟幻所述醇和堿水加入時(shí)的溫度為5-30°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟5)所述膜為陶瓷膜、不銹鋼膜、中空纖維膜或其他材質(zhì)的膜組件。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟6)所述酸為鹽酸、磷酸或有機(jī)酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟7)所述的經(jīng)固液分離得到兩性霉素B結(jié)晶粉后， 用真空干燥的方式在40-60°C條件下干燥至水分介于2. 0-5. 0%，得到高純度兩性霉素B。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用兩性霉素B發(fā)酵液制備高純度兩性霉素B的方法。本發(fā)明制備的兩性霉素B結(jié)晶粉的生物效價(jià)檢測(cè)含量大于970γ/mg，HPLC檢測(cè)含量大于95％，雜質(zhì)含量低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H1/08GK102382158SQ20101027345
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者任風(fēng)芝, 張雪霞, 李寧, 李曉露, 林毅, 王健, 王海燕, 蔣沁, 路新華, 高月麒 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司