專利名稱：優(yōu)化的Fc變體及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的優(yōu)化的Fc變體，產(chǎn)生它們的工程改造(engineering)方法，以及 它們的應(yīng)用，具體而言用于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，抗體 由配對(duì)的多肽重鏈和多肽輕鏈構(gòu)成。每條鏈由分離的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此上 述蛋白通稱免疫球蛋白。每條鏈由兩個(gè)不同的區(qū)組成，稱為可變區(qū)及恒定區(qū)。在抗體間輕 鏈和重鏈可變區(qū)顯示了明顯的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示了較少的序列 多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā)重要的生化反應(yīng)。在人類中有五種不同類型的抗 體，包括IgA (其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4)以及IgM。盡管在V區(qū)可能存在微小的差異，但是在這些類型的抗體間區(qū)別特征是它 們的恒定區(qū)。

圖1顯示了 IgGl抗體，在此用于舉例說(shuō)明免疫球蛋白的大致結(jié)構(gòu)特征，IgG抗 體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個(gè)相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 組成，從N-末端到C-末端依次為Vh-C y I-C Y2-CY3,分別稱為重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū) Yl結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)Y 2結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)Y 3結(jié)構(gòu)域。IgG輕鏈由兩個(gè)相連的免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域組成，從N-末端到C-末端依次為VfCy分別稱為輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié) 構(gòu)域?？贵w的可變區(qū)含有該分子的抗原結(jié)合決定基，并因此決定了抗體對(duì)其靶抗原的特 異性。因?yàn)槠渑c同一類型中其它抗體序列差別最明顯，所以命名為可變區(qū)。大多數(shù)序列可變 性存在于互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)?？偣灿?個(gè)⑶Rs，每條重鏈和輕鏈各有3個(gè)，命名為Vh⑶R1、 Vh CDR2、Vh CDR3、Vl CDRUVl CDR2 及 V1^ CDR3。在 CDRs 外的可變區(qū)稱為骨架(FR)區(qū)。盡 管不像CDRs —樣變化眾多，但是在不同抗體間FR區(qū)存在序列可變性?？偟膩?lái)說(shuō)，抗體的結(jié) 構(gòu)特征提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，在其上真正的抗原結(jié)合多樣性(CDRs)能得到暴露，通過(guò) 免疫系統(tǒng)以獲得對(duì)廣泛抗原的特異性?？色@得來(lái)自多種不同生物體可變區(qū)片段的許多高分 辨率結(jié)構(gòu)，一些可變區(qū)是非結(jié)合狀態(tài)的，一些與抗原形成復(fù)合物?？贵w可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu) 特征得到充分鑒定(Morea 等·，1997，Biophys Chem 68 :9_16 ；Morea 等·，2000，Methods 20 :267-279)，抗體的保守特征已用于發(fā)展許多抗體工程技術(shù)(Maynard等.，2000，Annu Rev Biomed Eng 2:339-376)。例如，可將來(lái)自一種抗體，如鼠抗體的CDRs移植入另一種 抗體的骨架區(qū)，如人抗體。在本領(lǐng)域稱為“人源化”的該過(guò)程能從非人抗體中能產(chǎn)生具更低 免疫原性的抗體治療劑。存在著包含可變區(qū)的片段，其缺少抗體其它區(qū)域，包括諸如包含Vh-C γ 1和Vh-Q的抗原結(jié)合片段(Fab)、包含Vh和\的可變區(qū)片段(Fv)、包含在同一鏈中 連接在一起的Vh和\的單鏈可變區(qū)片段(scFv)以及多種其它可變區(qū)片段(Little等.， 2000，Immunol Today 21 :364_370)?？贵w的Fc區(qū)與許多Fc受體及配體相互作用，行使一系列重要的功能，稱為效 應(yīng)器功能。如圖1所示，IgG Fc區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域C γ2、C 和進(jìn)入C 的N-末端鉸 鏈。對(duì)于IgG類而言，一類重要的Fc受體家族是Fc γ受體(Fe YRs)。這些受體介導(dǎo)抗 體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞臂之間的識(shí)別(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220 ;Ravetch 等.，2001，Annu Rev Immunol 19 :275_290)。在人類中，該蛋白質(zhì)家族包 含 Fc γ RI (CD64)，包括同種型(isoform) Fc y RIa、Fc y RIb 和 Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，包 括同種型 Fc y RIIa(包含同種異型(allotype) H131 和 R131)、Fc y RIIb (包含 Fc y RIIb-I 和 Fc y RIIb-2)以及 Fc γ RIIc ；禾口 Fc y RIII (CD16)，包括同種型 Fc γ RIIIa(包含同種 異型 V158 禾口 F158)禾口 Fc γ RIIIb (包括同種異型 Fc γ RIIIb-NAl 和 Fc y RIIIb_NA2) (Jefferis等，2002，Immunol Lett 82:57-65)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fc結(jié)合的胞 外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和可介導(dǎo)某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體在不同的免疫 細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、 血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞以及Y YT細(xì)胞。Fe/ Fc Y R復(fù)合物的形成招募這些效應(yīng)細(xì)胞至結(jié)合抗原的位點(diǎn)，通常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件以及 隨后重要的免疫應(yīng)答發(fā)生，諸如釋放炎癥介質(zhì)、B細(xì)胞活化、細(xì)胞內(nèi)吞作用、吞噬作用及細(xì) 胞毒性攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬細(xì)胞效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的一種可能 機(jī)制。在細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達(dá)Fc γ Rs的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗 體并隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞溶胞作用，稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC) (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) (Raghavan等·，1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ;Ghetie 等.，2000，Annu Rev Immunol 18 :739_766 ;Ravetch 等.，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。在細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達(dá)Fc γ Rs的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞 識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致對(duì)靶細(xì)胞的吞噬作用，稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo) 的細(xì)胞吞噬作用(ADCP) (antibody dependent cell-mediated phagocytosis)。已解出 Λ Fc y Rs的胞外結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)，包括Fc γ RIIa(pdb登記號(hào)1H9V) (Sondermann等·， 2001，J Mol Biol 309 :737_749) (pdb 登記號(hào) 1FCG) (Maxwell 等.，1999，Nat Struct Biol 6 437-442) ,Fc y RIIb(pdb 登記號(hào) 2FCB) (Sondermann 等·，1999, Embo J 18 :1095_1103)； 以及 Fc yRIIIb (pdb 登記號(hào) 1E4J) (Sondermann 等·，2000，Nature 406 267-273.)。所有 Fc y Rs結(jié)合Fc上相同區(qū)域，位于C γ 2結(jié)構(gòu)域的N-末端和前述鉸鏈區(qū)，如圖2所示。該相 互作用可很容易地通過(guò)結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定(Sondermann等.，2001，J Mol Biol 309 :737_749)，并 已解出與人Fc γ RIIIb胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc的數(shù)種結(jié)構(gòu)(pdb登記號(hào)1E4K) (Sondermann 等·，2000，Nature 406 :267_273·) (pdb 登記號(hào) IIIS 和 IIIX) (Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)，也解出人 IgE Fc/Fc ε RI α 復(fù)合物結(jié)構(gòu)(pdb 登記號(hào) 1F6A) (Garman 等.，2000，Nature 406 259-266)。不同IgG亞類對(duì)Fc y Rs具有不同親和力，IgGl和IgG3 —般較IgG2和IgG4能更 充分地與受體結(jié)合(Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57_65)。所有 Fc y Rs 結(jié)合 IgG Fc上相同的區(qū)域，亦具有不同的親和力高親和力受體Fc γ RI對(duì)IgG具有ΙΟΛΓ1的Kd，反之低親和力受體Fc YRII和Fc γ RIII通常分別以10_6和lO—V的Kd結(jié)合。FcyRIIIa 與Fc γ RIIIb胞外結(jié)構(gòu)域具有96%同一性，但是Fc Y RIIIb沒(méi)有胞內(nèi)信號(hào)域。此外，盡管 FcyRI, Fcy RIIa/c和Fc Y RIIIa是免疫復(fù)合物觸發(fā)激活作用的正調(diào)節(jié)物，通過(guò)具有含有 免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域而得到鑒定，但是FcYRIIb含有免疫受體 酪氨酸抑制基序列(ITIM)并因此而具有抑制性。因此，前者稱為激活性受體而Fc γ RIIb 稱為抑制性受體。在不同的免疫細(xì)胞中受體也具有不同的表達(dá)譜和表達(dá)水平。然而，在人 蛋白質(zhì)組中另一種復(fù)雜性水平是存在著許多Fc γ R多態(tài)性。與臨床意義特別相關(guān)的多態(tài) 性是V158/F158Fc y RIIIa0人IgGl與V158同種異型的結(jié)合較與F158同種異型的結(jié)合具 更高親和力。不同親和力以及推測(cè)其對(duì)ADCC和/或ADCP的影響已顯示了是抗-CD20抗 體利妥昔單抗(Rituxan , IDEC Pharmaceuticals Corporation的注冊(cè)商標(biāo))功效的重 要決定因素。具有V158同種異型的患者對(duì)利妥昔單抗治療響應(yīng)良好；然而，具有低親和力 F158同種異型的患者響應(yīng)不良(Cartron等，2002，Blood 99 :754_758)。大約10-20%的 人是V158/V158純合子，45%是V158/F158雜合子，以及35-45%的人是F158/F158純合子 (Lehrnbecher 等.，1999，Blood 94 :4220_4232 ；Cartron 等.，2002，Blood 99 :754_758)。 因此80-90%的人是不良應(yīng)答者，它們具有至少一個(gè)F158 Fc γ RIIIa等位基因。圖1顯示了 Fc上重疊但分離的位點(diǎn)，其作為與補(bǔ)體蛋白Clq作用的界面。同樣 地，F(xiàn)C/FcyR結(jié)合介導(dǎo)了 ADCC，F(xiàn)c/Clq結(jié)合介導(dǎo)了補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(⑶C)。Clq與 絲氨酸蛋白酶Clr形成復(fù)合物，再與Cls形成Cl復(fù)合物。雖然Clq與兩種IgGs的結(jié)合就 足以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，但是其能結(jié)合6種抗體。類似于Fc與Fc γ Rs的相互作用，不同IgG亞 類對(duì)Clq具有不同親和力，IgGl和IgG3—般較IgG2和IgG4能更充分地與Fc γ Rs結(jié)合 (Jefferis 等.，2002，Immunol Lett 82 :57_65)。當(dāng)前沒(méi)有獲得 Fc/Clq 復(fù)合物結(jié)構(gòu)；但是， 誘變研究已將人IgG上與Clq的結(jié)合位點(diǎn)定位于包含殘基D270、K322、K326、P329和P331， 以及 E333 的區(qū)域(Idusogie 等·，2000，J Immunol 164 :4178_4184 ；Idusogie 等，2001，J Immunol 166 :2571_2575)。圖1顯示了 Fc上C Y2和C Y3結(jié)構(gòu)域之間的位點(diǎn)，其介導(dǎo)與新生受體FcRn的 相互作用，它們的結(jié)合使胞吞的抗體從內(nèi)涵體再循環(huán)回血液中(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181_220 ;Ghetie 等·，2000，Annu Rev Immunol 18:739-766)。該 過(guò)程結(jié)合基于較大尺寸的全長(zhǎng)分子不被腎濾過(guò)，產(chǎn)生了有利的抗體血清半衰期，該半衰期 變化范圍從一周到三周。在抗體轉(zhuǎn)運(yùn)中Fc與FcRn的結(jié)合也扮演著關(guān)鍵角色。Fc上結(jié)合 FcRn的結(jié)合位點(diǎn)也是細(xì)菌蛋白A和G的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)在蛋白純化過(guò)程中使用蛋白A或 蛋白G親和層析，這些蛋白質(zhì)的牢固結(jié)合通常用作為純化抗體的手段。因此，對(duì)于抗體的 臨床性能及其純化而言，F(xiàn)c上該區(qū)域的保真度具有重要作用。已獲得的大鼠Fc/FcRn復(fù) 合物結(jié)構(gòu)(Martin等.，2001，Mol Cell 7 :867_877)，以及Fc與蛋白A和G的復(fù)合物結(jié)構(gòu) (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20 :2361_2370 ；Sauer-Eriksson 等· , 1995, Structure 3 265-278 ；Tashiro 等.，1995，Curr Opin Struct Biol 5 :471_481)提供了對(duì) Fc 與這些 蛋白相互作用的了解。在Fc區(qū)起關(guān)鍵作用的是存在于N297的保守的N-糖基化，如圖1所示。對(duì)于抗體 而言，該糖，或有時(shí)稱為寡糖的，扮演著關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能角色，并且是使用哺乳動(dòng)物表達(dá) 系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的主要原因之一。雖然不應(yīng)限制于一種理論，但據(jù)信該糖結(jié)構(gòu)上的用途可穩(wěn)定或增溶Fe，決定C γ 3與C γ 2結(jié)構(gòu)域間特定角度或柔性程度，阻止兩個(gè)C γ 2結(jié)構(gòu)域橫越 中心軸的相互聚集，或這些的組合。Fc與Fc γ R以及Clq的有效結(jié)合需要這種修飾，N297 糖組成的改變或消除影響這些蛋白的結(jié)合(Umana等.，1999，Nat Biotechnoll7 :176_180 ； Davies 等.，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Mimura 等，2001，J Biol Chem 276 45539-45547. ；Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 :16478_16483 ;Shields 等.，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 ；Shields 等·，2002，J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Simmons 等.，2002，J Immunol Methods 263 133-147)。然而，即使與Fc γ Rs有任何特異性接觸，該 糖的參與也少(Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)，表明在介導(dǎo) Fc/Fc γ R 結(jié)合中Ν297糖的功能角色可能是通過(guò)在決定Fc構(gòu)象中其所扮演的結(jié)構(gòu)角色來(lái)實(shí)現(xiàn)的。該 結(jié)論通過(guò)所收集到的四個(gè)不同F(xiàn)c糖型的晶體結(jié)構(gòu)而得到支持，這些結(jié)構(gòu)顯示了寡糖影響 7 Cy 2 構(gòu)象并因此影響 Fc/Fc y R 界面(Krapp 等·，2003，J Mol Biol 325 :979_989)。上述所討論的抗體特征一特異于靶，能介導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制及在血清中的長(zhǎng)半衰 期一使得抗體可有效地用于治療。單克隆抗體可用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥和心血 管病。目前已有超過(guò)10種抗體產(chǎn)品上市，并有數(shù)百種產(chǎn)品正在開(kāi)發(fā)中。除抗體外，在研究 和治療中發(fā)現(xiàn)Fc融合體這類抗體樣蛋白用途廣泛(Chamow等.，1996，Trends Biotechnol 14:52-60 ；Ashkenazi 等，1997，Curr Opin Immunol 9 :195_200)。Fc 融合體是一種蛋白質(zhì)， 其中一個(gè)或多個(gè)多肽可操作地連接Fe。Fc融合體使抗體的Fc區(qū)與受體的靶結(jié)合區(qū)、配體 或一些其它蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并因此有利于其效應(yīng)器功能和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。后者 的角色是用于介導(dǎo)靶識(shí)別，并因而在功能上與抗體可變區(qū)相似。因?yàn)镕c融合體與抗體在結(jié) 構(gòu)和功能上重疊，所以在本發(fā)明中對(duì)于抗體的討論可直接擴(kuò)展至Fc融合體。盡管具有這樣廣泛的用途，對(duì)于臨床使用而言，抗體并不是優(yōu)化的?？贵w的兩個(gè)主 要缺點(diǎn)是它們并不理想的抗癌效力和它們過(guò)分苛求的生產(chǎn)必備條件。本發(fā)明解決了這些缺 陷。存在許多可能的抗體破壞腫瘤細(xì)胞機(jī)制，包括通過(guò)阻斷必需的生長(zhǎng)途徑以抗增 殖、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)、增強(qiáng)的下調(diào)作用和/或受體的轉(zhuǎn)換(turnover)、CDC、ADCC、 ADCP 以及啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答(adaptive immune response) (Cragg 等·，1999，Curr Opin Immunol 11 :541_547 ;Glennie 等.，2000，Immunol Today 21:403-410)?？鼓[瘤效力可 基于這些機(jī)制的組合，而且在臨床治療中它們各自的重要性依腫瘤的不同而不同。盡管是 抗腫瘤武器的兵工廠，但是抗體作為抗癌劑的效果卻并不令人滿意，具體而言是它們的高 成本。患者腫瘤響應(yīng)數(shù)據(jù)顯示了相對(duì)于常規(guī)的單一試劑細(xì)胞毒素化學(xué)療法而言，在治療成 功率上單克隆抗體僅提供了很少的改善。舉例來(lái)說(shuō)，在全部復(fù)發(fā)的低度非霍奇金淋巴瘤患 者中只有一半對(duì)抗-CD20抗體利妥昔單抗響應(yīng)(McLaughlin等·，1998，J Clin Oncol 16 2825-2833)。在166個(gè)臨床患者中，6%顯示了完全響應(yīng)，42%顯示了部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持 續(xù)時(shí)間大約為12個(gè)月。曲妥單抗(Here印tin Genentech的注冊(cè)商標(biāo))，一種用于治療 乳腺癌轉(zhuǎn)移的抗_HER2/neU抗體，具有較低的療效。對(duì)222個(gè)受試患者使用曲妥單抗的總 響應(yīng)率僅有15%，其中8個(gè)完全響應(yīng)，26個(gè)部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持續(xù)時(shí)間和存活時(shí)間為9-13 個(gè)月(Cobleigh等.，1999，J Clin Oncol 17:2639-2648)。目前對(duì)于抗癌治療而言，在死 亡率上任何小的改善都意味著成功。因此，特別需要增強(qiáng)抗體破壞靶癌細(xì)胞的能力。一種用于增強(qiáng)抗體抗腫瘤效力的有希望的方法是通過(guò)增加它們介導(dǎo)諸如ADCC、ADCP和CDC的細(xì)胞毒性效應(yīng)器功能的能力。對(duì)于抗體抗癌活性而言，F(xiàn)cyR-介導(dǎo)的效應(yīng) 器功能的重要性已在小鼠中得到證實(shí)(Clynes等.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95: 652-656 ；Clynes等.,2000,Nat Med 6 :443_446)，并在基于細(xì)胞的測(cè)定中證實(shí)了與靶細(xì)胞 毒性相關(guān)的Fc與特定FcyRs之間相互作用的親和力(Shields等.，2001，J Biol Chem 276 :6591-6604 ;Presta 等.，2002，Biochem Soc Trans 30 :487_490 ;Shields 等.，2002，J Biol Chem277 =26733-26740) 此外，已觀察到人臨床療效與它們的同種異型一Fc γ RIIIa 的高親和力多態(tài)型(V158)或低親和力多態(tài)型(F158)之間的相互關(guān)系(Cartron等.，2002， Blood 99 :754-758)。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)暗示了對(duì)于與特定Fc γ Rs結(jié)合而言，在患者體內(nèi) 具有Fc區(qū)優(yōu)化的抗體能更好地介導(dǎo)效應(yīng)器功能并因此能更有效地破壞癌細(xì)胞。在激活與 抑制受體之間的平衡要得到重點(diǎn)考慮，并應(yīng)由Fc產(chǎn)生最佳的效應(yīng)器功能，對(duì)諸如FcyRI、 Fc y RIIa/c以及Fc y RIIIa的激活受體而言應(yīng)具有增強(qiáng)的親和力，還應(yīng)減少對(duì)抑制性受體 FcyRIIb的親和力。此外，因?yàn)镕c YRs能介導(dǎo)抗原攝入和通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的加工過(guò)程， 所以增強(qiáng)Fc/Fc y R親和力也能改善抗體治療能力以引發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。具有不同目的的誘變研究已用于Fe，通常對(duì)丙氨酸進(jìn)行取代(稱為丙氨酸掃描) 或通過(guò)序列同源性取代指導(dǎo)操作(Duncan等·，1988，Nature 332 :563_564 ；Lund等·， 1991，J Immunol 147 :2657_2662 ；Lund 等.，1992，Mol Immunol 29 :53_59 Jefferis 等， 1995，Immunol Lett 44 111-117 ;Lund 等.，1995，F(xiàn)aseb J 9 :115_119 Jefferis 等.， 1996，Immunol Lett 54 101-104 ;Lund 等，1996，J Immunol 157 :4963_4969 ;Armour 等， 1999，Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Shields 等.，2001，J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis 等.,2002, Immunol Lett 82 :57_65)(us 5, 624, 821 ；us 5, 885, 573 ；pct wo 00/42072 ；PCT WO 99/58572)。大多數(shù)取代減少或消除了與Fc γ Rs的結(jié)合。另一方面，在 獲得具有更高Fc γ R親和力的Fc變體方面已取得了一些成功(參見(jiàn)例如US 5，624，821 和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的235位上用人氨基酸 進(jìn)行取代(谷氨酸到亮氨酸突變)，該小鼠抗體與人Fc γ RI的結(jié)合增加了 100倍(Duncan 等·，1988，Nature 332 :563_564) (US 5，624，821)。Shields 等使用丙氨酸掃描誘變來(lái)定 位對(duì)Fc γ R結(jié)合起重要作用的Fc殘基，然后通過(guò)用非丙氨酸突變對(duì)所選定的殘基進(jìn)行取代 (Shields 等.，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 ;Presta 等.，2002，Biochem Soc Trans 30 487-490) (PCT WO 00/42072)。該研究公開(kāi)了一些突變，包括 S298A、E333A 和 K334A，顯 示了與激活受體Fc γ RIIIa增強(qiáng)的結(jié)合以及減少了與抑制性受體Fc γ RIIb的結(jié)合。組合 這些突變以獲得雙重和三重突變的變體，在結(jié)合方面其顯示了累加的改善。在該研究中所 公開(kāi)的最好的變體是S298A/E333A/K334A三重突變體，其與F158 Fc γ RIIIa的結(jié)合大約增 加了 1.7倍，與Fc γ RIIb的結(jié)合減少了 5倍，且ADCC增加了 2. 1倍。使用工程改造后的糖型(engineered glycoform)也已實(shí)現(xiàn)了 Fc對(duì)Fc γ R增 強(qiáng)的親和力，該糖型產(chǎn)生自工程改造的或變異的細(xì)胞系中抗體的表達(dá)(Umana等.，1999， Nat Biotechnol 17 :176_180 ;Davies 等，2001，Biotechnol Bioeng 74 288-294 ；Shields 等.，2002，J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Shinkawa 等.，2003，J Biol Chem 278 3466-3473)。該方法產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)上增加的抗體與Fc γ RIIIa結(jié)合并介導(dǎo)ADCC的能力。盡 管在實(shí)踐中存在諸如在大規(guī)模生產(chǎn)條件下表達(dá)菌株生長(zhǎng)效率的局限性，用于增強(qiáng)Fc/Fc γ R 親和力以及效應(yīng)器功能的該方法仍然是有前途的。實(shí)際上，對(duì)于優(yōu)化效應(yīng)器功能來(lái)說(shuō)，將這些可選的糖型技術(shù)與本發(fā)明的Fc變體結(jié)合可提供累加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。盡管需要更強(qiáng)的效應(yīng)器功能，對(duì)于某些抗體治療劑而言，減少或消除效應(yīng)器功能也許是其所需的。通常認(rèn)為治療性抗體其作用機(jī)理包括阻斷或拮抗但不殺死具有靶抗原的 細(xì)胞。這樣的話耗盡靶細(xì)胞并不是所需的并認(rèn)為存在著副作用。例如，抗CD4抗體阻斷T 細(xì)胞上CD4受體的能力使其能有效地抗炎，甚至它們招募Fc γ R受體的能力也可指導(dǎo)免疫 系統(tǒng)攻擊靶細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞損耗(Reddy等.，2000，J Immunol 164:1925-1933)。對(duì)于 稱為放射綴合物的放射標(biāo)記的抗體以及稱為免疫毒素的綴合毒素的抗體而言，效應(yīng)器功能 也許是一道難題。這些藥物可用于破壞癌細(xì)胞，但是通過(guò)Fc與Fc γ R相互作用所招募的免 疫細(xì)胞使得健康的免疫細(xì)胞接近致死性的負(fù)載物(放射物或毒素)，導(dǎo)致正常淋巴組織連 同靴癌細(xì)胞一起損耗(Hutchins 等·，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984; White等.，2001，Annu Rev Med 52:125-145)。通過(guò)使用IgG同種型有可能解決該問(wèn)題， 該IgG同種型無(wú)法充分地招募補(bǔ)體或效應(yīng)細(xì)胞，例如IgG2及IgG4?？蛇x的解決方案是開(kāi) 發(fā)能減少或消除結(jié)合能力的Fc變體(Alegre等·，1994，Transplantation 57 1537-1543 ； Hutchins 等·，1995,Proc Natl Acad Sci USA 92 11980-11984 ；Armour 等·，1999,Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Reddy 等.，2000，J Immunol 164 :1925_1933 ;Xu 等.，2000，Cell Immunol 200 16-26 ；Shields等·，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604) (US 6，194，551 ；US 5, 885, 573 ；PCT WO 99/58572)。對(duì)于減少或消除效應(yīng)器功能而言，主要的考慮是其它重要 的抗體特性不被干擾。應(yīng)改造Fc變體，以不僅消除與Fc γ Rs和/或Clq的結(jié)合，而且還能 保持抗體的穩(wěn)定性、可溶性和結(jié)構(gòu)的整體性(integrity)，以及能保持與諸如FcRn和蛋白A 及G的其它重要Fc配體相互作用的能力。本發(fā)明解決了抗體的另一個(gè)主要缺點(diǎn)，即它們過(guò)分苛求的生產(chǎn)必備條件(Garber， 2001，Nat Biotechnol 19 184-185 ；Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779)?？贵w應(yīng) 當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，且目前市售抗體與其它高度需求的生物治療藥物基本上耗盡了 所有可用的制造能力。有數(shù)百種生物制劑正在開(kāi)發(fā)中，其中大多數(shù)是抗體，迫切需要更有效 及更便宜的生產(chǎn)方法。不足的抗體制造能力具有三方面的下游效應(yīng)。首先，對(duì)于生產(chǎn)者而 言顯著增加了產(chǎn)品成本，即傳遞給患者的成本。其次，其阻礙了批準(zhǔn)的抗體產(chǎn)品的工業(yè)化生 產(chǎn)，限制了患者高度需求的治療劑的可用性。最后，因?yàn)榕R床試驗(yàn)需要大量還無(wú)利可圖的蛋 白質(zhì)，所以不足的供給阻止了抗體市場(chǎng)化的成長(zhǎng)過(guò)程。已研究用于嘗試解決該問(wèn)題的可選的生產(chǎn)方法。正尋求將轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物作為 可能的更便宜及更高產(chǎn)的系統(tǒng)(Chadd等.，2001，Curr Opin Biotechnol 12 :188_194)。然 而，該表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生明顯不同于人糖蛋白的糖基化型(glycosylation patterns)。其可 導(dǎo)致效應(yīng)器功能減少或甚至缺失，因?yàn)槿缟纤懻?，該糖結(jié)構(gòu)能顯著地影響Fc γ R和補(bǔ)體 的結(jié)合。非人糖型潛在的巨大問(wèn)題可能是免疫原性；對(duì)于免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，糖是抗原性的關(guān)鍵 來(lái)源，并且非人糖型的存在具有相當(dāng)大的引發(fā)抗體中和治療的機(jī)率，或更嚴(yán)重地引起有害 的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物生產(chǎn)的抗體的療效和安全性仍無(wú)法確定。細(xì)菌 表達(dá)是另一種引人注目的解決抗體生產(chǎn)難題的方案。在諸如大腸桿菌的細(xì)菌中表達(dá)提供了 一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的節(jié)省成本和高效的方法。對(duì)于諸如抗體等復(fù)合物蛋白質(zhì)而言，在細(xì) 菌表達(dá)中存在許多障礙，包括這些復(fù)合物分子的折疊和組裝、正確形成二硫鍵以及缺乏糖 基化時(shí)的溶解性、穩(wěn)定性和功能性，因?yàn)樵诩?xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)不被糖基化。已成功地在大腸桿菌中表達(dá)出能結(jié)合抗原的全長(zhǎng)非糖基化抗體(Simmons等.，2002，J Immunol Methods 263:133-147)，因此在缺乏真核侶伴蛋白手段下，細(xì)菌性表達(dá)抗體的折疊、組裝和正確形成 二硫鍵可能發(fā)生。然而，用于治療的細(xì)菌性表達(dá)抗體的最終功效仍為缺乏糖基化而困擾，其 導(dǎo)致缺乏效應(yīng)器功能并可導(dǎo)致不良的穩(wěn)定性和溶解性。對(duì)于在高濃度下需要長(zhǎng)期臨床使用 的劑型而言，很可能存在更多問(wèn)題。對(duì)于上述可選的生產(chǎn)方法而言，具有有利溶解特性(solution property)以及介 導(dǎo)效應(yīng)器功能的能力的非糖基化(aglycosylatecOFc將有效地使之成為可能。通過(guò)克服非 糖基化Fc結(jié)構(gòu)和功能上的缺點(diǎn)，抗體可在細(xì)菌中以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物中生產(chǎn)，具有減少 的免疫原性危險(xiǎn)，以及在諸如癌癥的臨床應(yīng)用中具有所需細(xì)胞毒性的效應(yīng)器功能。本發(fā)明 描述了利用蛋白質(zhì)工程方法來(lái)開(kāi)發(fā)具有效應(yīng)器功能的穩(wěn)定、可溶的Fc變體。當(dāng)前，在本領(lǐng) 域中并不存在這樣的Fc變體?？傊枰哂性鰪?qiáng)的治療特性的抗體。設(shè)計(jì)優(yōu)化或增強(qiáng)的Fc變體是符合該需求 的有前途的方法。雖然，設(shè)計(jì)具有所需特性的Fc變體的真正障礙在于預(yù)測(cè)無(wú)數(shù)可能性中的 哪些氨基酸修飾可實(shí)現(xiàn)所需目的，和對(duì)于抗體而言效率低的生產(chǎn)和篩選方法。實(shí)際上，對(duì)于 不完全成功的現(xiàn)有技術(shù)而言，其基本前提之一是使用類似于Fc設(shè)計(jì)的方法，因此更多地涉 及諸如丙氨酸掃描的嘗試(hit-or-miss)方法或使用不同的表達(dá)菌株來(lái)產(chǎn)生糖型。在這些 研究中，可進(jìn)行完全或部分隨機(jī)的Fc修飾希望能獲得具有有利特性的變體。本發(fā)明提供了 多種工程方法，其中許多基于更完善和更有效的技術(shù)，可用于克服這些障礙以便開(kāi)發(fā)對(duì)于 所需特性優(yōu)化的Fc變體。所述的工程方法提供了指導(dǎo)Fc修飾的設(shè)計(jì)策略、用于設(shè)計(jì)有利 Fc變體的計(jì)算篩選方法、用于確定對(duì)試驗(yàn)研究有用的抗體的文庫(kù)產(chǎn)生方法以及用于確定具 有有利特性Fc變體的一系實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了 Fc變體，其許多與治療相關(guān)的特性得到優(yōu)化。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的Fc位置，在該位置上氨基酸修飾可用于產(chǎn)生優(yōu)化 的 Fc 變體。所述 Fc 位置包括 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332，其 中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。本發(fā)明描述在任一所述新的Fc位置上 的任何氨基酸修飾，以便產(chǎn)生優(yōu)化的Fc變體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供計(jì)算篩選的Fc變體。計(jì)算篩選的Fc變體是一種通過(guò) 在本文中所描述的計(jì)算篩選計(jì)算所預(yù)測(cè)的變體，對(duì)于優(yōu)化所需特性而言，計(jì)算篩選較隨機(jī) 方法具有更有效的潛力?？梢?jiàn)，計(jì)算篩選可作為試驗(yàn)篩選的前奏或替代品，因此所述的計(jì)算 篩選的Fc變體被認(rèn)為是新的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用一種或多種本文所述的實(shí)驗(yàn)方法鑒定的Fc變 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330或332，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方 式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種取代，選自L234D、L234E、L234N， L234Q、L234T、L234H、L234Y、L2341、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、 L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、 S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q,S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式
是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體選自V264L、V264I、 F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W, F241W/F243W/ V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V264I、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/ V264T、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/ V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、I332E、L328M/I332E、P244H、 P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、V264I/I332E、F241E/F243R/V262E/ V264R/I332E、F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241 E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E、S239Q/I332E, S239E、D265G、 D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/ A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、A330Y、I332D、N297S、N297D、N297S/I332E、 N297D/I332E、N297E/I332E、D265Y/N297D/I332E、D265Y/N297D/T299L/I332E、D265F/ N297E/I332E、L328I/I332E、L328Q/I332E、I332N、I332Q、V264T、V264F、V240I、V263I、 V266I、T299A、T299S、T299V、N325Q, N325L、N325I、S239D、S239N、S239F、S239D/I332D、 S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、 S239N/I332D、 S239N/I332E、 S239N/I332N、 S239N/I332Q、 S239Q/I332D、 S239Q/I332N、 S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、A330Y/I332E、 V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234D、L234E、L234N、L234Q、 L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、 L235Y、L235I、L235V、L235F、S239T、S239H、S239Y、V240A、V240T、V240M、V263A、V263T、 V263M、V264M、V264Y、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、 Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、 N325T、N325V、N325H、L328D/I332E、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328V/ I332E、 L328T/I332E、 L328H/I332E、 L3281/I332E、 L328A、 I332T、 I332H、 I332Y、 I332A、 S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239E/V264I/ S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/ I332E、 S239D/D265I/N297D/I332E、 S239D/D265L/N297D/I332E、 S239D/D265F/N297D/ I332E、 S239D/D265Y/N297D/I332E、 S239D/D265H/N297D/I332E、 S239D/D265T/N297D/ I332E、V264E/N297D/I332E、Y296D/N297D/I332E、Y296E/N297D/I332E、Y296N/N297D/ I332E、Y296Q/N297D/I332E、Y296H/N297D/I332E、Y296T/N297D/I332E、N297D/T299V/ I332E、N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E、N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/ A330Y/I332E、 S239N/A330Y/I332E、 S239D/A330L/I332E、 S239N/A330L/I332E、 V264I/ S298A/I332E、 S239D/S298A/I332E、 S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/ V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/I332E，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式是 Kabat 的 EU標(biāo)引方式。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與一種或多種Fc γ Rs的結(jié)合具有更強(qiáng)親和力的Fc變 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對(duì)Fc γ R的親和力增加超過(guò)1倍。在 一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對(duì)Fc γ R的親和力增加超過(guò)5倍。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對(duì)Fc γ R的親和力增加在5倍至300 倍之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位 置選自:234、235、239、240、243、264、266、328、330、332 和 325，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式 是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取 代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、 S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q、L328D、 L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q 和 N325T，其中 Fc 區(qū)中殘基 編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體選自V264I、 F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、 S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、 S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/ I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/ A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、 L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/ I332E、 L328I/I332E、 S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/ I332E、 S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/ I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/ I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/I332E，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方 式是Kabat的EU標(biāo)引方式。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有FcYRIIIa-倍數(shù)Fc γ RIIb-倍數(shù)比率大于 1 1的Fc變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體具有Fc γ RIIIa-倍數(shù)Fc γ RIIb-倍 數(shù)比率大于11 1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體具有在11 1至86 1之 間的FcYRIIIa-倍數(shù)FcYRIIb-倍數(shù)比率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少 一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自234、235、239、240、264、296、330和1332，其中 Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包 含至少一種氨基酸取代，選自L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、 V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332D 和 I332E，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方 式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體選自I332E、V264I/ I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E, Y296Q, A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、 A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、 L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/ I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在存在效應(yīng)細(xì)胞條件下能更有效地介導(dǎo)效應(yīng)器功能 的Fc變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽更能介導(dǎo)ADCC。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導(dǎo)ADCC增加超過(guò)5倍。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導(dǎo)ADCC增加5-50倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變 體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自234、235、239、240、243、264、266、328、 330、332和325，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、 L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、 V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q, L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、 I332E、I332N、I332Q和N325T，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè) 最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述 Fc 變體選自V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、 V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/ I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/ I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/ I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/ I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、 N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、 S239N/A330Y/ I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/ I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V2641/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/ V264I/A330L/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與一種或多種Fc γ Rs的結(jié)合具有較弱親和力的Fc 變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方 式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，所在位點(diǎn)選自L234D、
L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239E、S239N、S239Q,S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q,S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、
N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、P329F、 A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y 和 I332A，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/ F243W/V262A/V264A, F241L/V262I、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T、 F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、 F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/ P245A/P247V、P247G、F241 E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/ I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、 A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、N297S/I332E、 I332N、I332Q, V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q, N325L、N325I、S239N、S239F、 S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、 L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239H、 S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、 Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、 N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/I332E、L328A、 I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在存在效應(yīng)細(xì)胞條件下能更低效地介導(dǎo)ADCC的Fc 變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方 式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選 自:L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、 L235F、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、 F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、 V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、 V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、 D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、 Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、 T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、 N325E、N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、 P329F、A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y 和 I332A, 其中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc 變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I 、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/ V264T、F241E/F243R/V262E/V264R 、F241E/F243Q/V262T/V264E 、F241R/F243Q/ V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、 W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/ V262T/V264R/I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、 Y296Q, T299I、A327N、S267Q/A327S, S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、 N297S/I332E、I332N、I332Q、V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、 S239N、S239F、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、 L235F、S239H、S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、 E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、 N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/ I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y 和 I332A，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式是 Kabat 的 EU 標(biāo) 引方式本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供相對(duì)于親本Fc多肽的非糖型具有改良的功能和/或 溶解特性的Fc變體。本文中改良的功能性包括但不限于與Fc配體的結(jié)合親和力。本文中 改良的溶解特性包括但不限于穩(wěn)定性和溶解性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非糖基化Fc變體 較糖基化親本Fc多肽與Fc γ R的結(jié)合所具有的親和力是可比的或更大。在一個(gè)可選的實(shí)施 方案中，所述Fc變體與Fc γ R的結(jié)合所具有的親和力是在親本Fc多肽糖基化型的0. 4-倍 范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 239、241、243、262、264、265、296、297、330 和 332，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式是 Kabat 的 EU標(biāo)引方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，選自S239D、 S239E、F241Y、F243Y、V262T、V264T、V264E、D265Y、D265H、Y296N、N297D、A330Y 和 I332E，其 中Fc區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體 選自N297D/I332E、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/ N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、V264E/N297D/ I332E、Y296N/N297D/I332E 和 N297D/A330Y/I332E，其中 Fc 區(qū)中殘基編號(hào)方式是 Kabat 的 EU標(biāo)引方式。本發(fā)明也提供了用于設(shè)計(jì)優(yōu)化的Fc變體的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用 于指導(dǎo)Fc優(yōu)化的設(shè)計(jì)策略。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用于設(shè)計(jì)Fc變體的計(jì)算篩選方 法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試文庫(kù)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提 供用于獲得優(yōu)化的Fc變體的實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選方法。本發(fā)明提供了編碼本文所述Fc變體的分離的核酸。本發(fā)明提供了包含所述核酸 的載體，任選地，可操作地連接調(diào)控序列。本發(fā)明提供了包含該載體的宿主細(xì)胞，以及用于 生產(chǎn)和任選地回收該Fc變體的方法。本發(fā)明提供了包含本文所公開(kāi)的Fc變體的新抗體及Fc融合體。所述新抗體及Fc 融合體可在治療產(chǎn)品中使用。本發(fā)明提供了包含抗體及Fc融合體以及生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的載體或稀釋 劑的組合物，所述抗體及Fc融合體包含本文所述的Fc變體。本發(fā)明提供了包含本文所公開(kāi)的Fc變體的抗體及Fc融合體的治療與診斷用途。本發(fā)明還涉及1. 一種包含F(xiàn)c變體部分的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少一種氨 基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調(diào)節(jié)與Fc γ R的結(jié)合。2.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述調(diào)節(jié)是所述抗體對(duì)所述FcyR親和力的增加。3.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至 少一種取代，所述人序列位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、 265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333 和 334 組成的組。4.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一 種取代，所述人序列位置選自由 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332
組成的組。5.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體包含在位置332的取代。6.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中至少一種取代位于選自由239、264、297和330的 位置，附帶條件是如果所述序列基本上是人的，所述取代不是S239A、V264A、N297A、N297Q、 A330D、A330Q、A330K,或 A330S。7.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234E、 234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、 235I、235V、235F、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、 241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、 262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、 264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、 267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、 297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、 325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327N、327L、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、 328I、328V、328T、328H、328A、329F、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332E、 332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。8.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、264I、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/264I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、 241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、 328F、332E、328M/332E、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、264I/332E、 241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Q/262T/264E/332E、241R/243Q/262T/264R/332E、 241E/243Y/262T/264R/332E、298A/332E、239EI332E、239Q/332E、239E、265G、265N、 239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、 329F、330L、330Y、332D、297S、297D、297S/332E、297D/332E、297E/332E、265Y/297D/332E、 265Y/297D/299L/332E、265F/297E/332E、328I/332E、328Q/332E、332N、332Q、264T、264F、 240I、263I、266I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239D、239N、239F、239D/332D、 239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、 239N/332E、239N/332N、239NI332Q、239Q/332D、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、 264I/330L/332E、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、 235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239T、239H、239Y、240A、240T、240M、263A、 263T、263M、264M、264Y、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、 298H、299H、330V、330I、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325T、325V、325H、328D/332E、 328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328V/332E、328T/332E、328H/332E、328I/332E、328A、 332T、332H、332Y、332A、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239E/264I/298A/330Y/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265V/297D/332E、 239D/265I/297D/332E、239D/265L/297D/332E、239D/265F/297D/332E、 239D/265Y/297D/332E,239D/265H/297D/332E,239D/265T/297D/332E,264E/297D/332E, 296D/297D/332E,296E/297D/332E,296N/297D/332E,296Q/297D/332E,296H/297D/332E, 296T/297D/332E,297D/299V/332E,297D/299I/332E,297D/299L/332E,297D/299F/332E, 297D/299H/332E、297D/299E/332E、297D/330Y/332E、297D/298A/330YI332E、 239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。9.根據(jù)項(xiàng)7所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置組成的組的 位置，進(jìn)一步包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、 329、331、333、334 和 339 組成的組。10.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc YR是Fc YRIIIa。11.根據(jù)項(xiàng)10所述的抗體，其中所述Fc γ RIIIa是V158或F158Fc γ RIIIa的同種異型。12.根據(jù)項(xiàng)2所述的Fc變體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和 力較所述的親本Fc多肽高約5倍。13.根據(jù)項(xiàng)12所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和力 較所述親本Fc多肽高約5-約300倍。14.根據(jù)項(xiàng)12所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包 含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和 325組成的組。15.根據(jù)項(xiàng)14所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、 234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、 264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、 332Q和325T組成的組。16.根據(jù)項(xiàng)15所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、 332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、 328I/332E、328Q/332E、264T、2401、2661、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、 239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、 330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、234I、235D、 235S、235Y、235I、239T、240M、264Y、330I、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、 328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、 239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、 239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 和 239D/264I/330L/332E 組成的 組。17.根據(jù)項(xiàng)15所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組組成的組的位置，進(jìn)一步包含至少一種取代。18.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或猴子的。19.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結(jié)合是未改變的。20.根據(jù)項(xiàng)19所述的抗體，其中所述Fc配體選自由Clq、FcRn、蛋白A和蛋白G組 成的組。21.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的抗體，其中⑶C不受影響。22.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結(jié)合是改變的。23.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc γ RIIIa倍數(shù)Fc γ RIIb倍 數(shù)比率大于1。24.根據(jù)項(xiàng)23所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc y RIIIa倍數(shù)Fc y RIIb 倍數(shù)比率大于約11 1。25.根據(jù)項(xiàng)24所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc y RIIIa倍數(shù)Fc y RIIb 倍數(shù)比率在約11 1-約86 1。26.根據(jù)項(xiàng)23所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含 至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、264、296、330和1332組成的組。27.根據(jù)項(xiàng)26所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234Υ、 234I、235I、239D、239E、239N、239Q、240A、240M、264I、264Y、296Q、330L、330Y、330I、332D 和 332E組成的組。28.根據(jù)項(xiàng)27所述的抗體，其中所述Fc變體選自由332E、264I/332E、239E/332E、 239Q/332E、296Q、330L、330Y、332D、239D、239D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、 330L/332E、264I/330L/332E、234Y、234I、235I、240A、240M、264Y、330I、239D/330L/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。29.根據(jù)項(xiàng)26所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進(jìn)一步包含一種或多種取代。30.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中相對(duì)于親本Fc多肽所述Fc變體與至少一種Fc γ R 的結(jié)合具有減少的親和力。31.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc YR是Fc YRIIIa。32.根據(jù)項(xiàng)31所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、 239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、 244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、 264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、 266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、 296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、 313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、 328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。33.根據(jù)項(xiàng)31所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、243L/262I/264ff,241Y/243Y/262T/264T,241E/243R/262E/264R,241E/243Q/262T/264E, 241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、 244H/245A/247V,247G,241E/243R/262E/264R/332E,241E/243Y/262T/264R/332E,265G, 265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、 327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、 325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、 263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、 299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、 328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。34. 一種包含親本Fc多肽變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少 一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能。35.根據(jù)項(xiàng)34所述的抗體，其中所述效應(yīng)器功能是ADCC。36.根據(jù)項(xiàng)35所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽改善。37.根據(jù)項(xiàng)36所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約5 倍。38.根據(jù)項(xiàng)37所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約 5_約50倍。39.根據(jù)項(xiàng)37所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包 含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和 325組成的組。40.根據(jù)項(xiàng)39所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、 234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、 264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、 332Q和325T組成的組。41.根據(jù)項(xiàng)39所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、 332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、 328I/332E、328Q/332E、264T、2401、2661、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、 239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、 330Y/332E、2641/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、2341、235D、 235S、235Y、2351、239T、240M、264Y、3301、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、 328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、 239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、 239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 和 239D/264I/330L/332E 組成的 組。42.根據(jù)項(xiàng)39所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進(jìn)一步包含至少一種取代。43.根據(jù)項(xiàng)39所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或 猴子的。
44.根據(jù)項(xiàng)35所述的抗體，與所述親本Fc多肽比較其中所述Fc變體減弱了 ADCC。45.根據(jù)項(xiàng)44所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、 239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、 244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、 264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、 266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、 296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、 313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、 328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。46.根據(jù)項(xiàng)44所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、241E/243Q/262T/264E、 241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、 244H/245A/247V、247G、241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Y/262T/264R/332E、265G、 265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、 327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、 325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、 263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、 299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、 328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。47. 一種包含親本Fc多肽的非糖基化Fc變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc 區(qū)中包含至少一種氨基酸修飾，相對(duì)于所述親本Fc多肽的非糖基化型，所述非糖基化Fc變 體具有改善的穩(wěn)定性、溶解性或?qū)c配體的結(jié)合親和力。48.根據(jù)項(xiàng)47所述的抗體，與親本Fc多肽的非糖基化型比較，所述非糖基化Fc變 體具有改善的對(duì)Fc配體的結(jié)合親和力。49.根據(jù)項(xiàng)48所述的抗體，其中所述Fc配體是Fc y R050.根據(jù)項(xiàng)49所述的抗體，其中所述Fc γ R是Fc γ RIIIa051.根據(jù)項(xiàng)48所述的抗體，其中所述改善的結(jié)合親和力在親本Fc多肽的糖基化型 的0.4倍范圍內(nèi)。52.根據(jù)項(xiàng)47所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含 至少一種取代，所述人序列位置選自由239、241、243、262、264、265、296、297、330和332組 成的組。53.根據(jù)項(xiàng)52所述的抗體，其中所述Fc變體包含一種或多種取代，選自由239D、 239E、241Y、243Y、262T、264T、264E、265Y、265H、296N、297D、330Y 和 332E 組成的組。54.根據(jù)項(xiàng)52所述的抗體，其中所述Fc變體選自由297D/332E、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265Y/297D/332E、239D/265H/297D/332E、264E/297D/332E、296N/297D/332E 禾口 297D/330Y/332E 組成的組。55.根據(jù)項(xiàng)53所述的抗體，其中所述非糖基化Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置 的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、 331、333、334 和 339。56.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，包含含有所述Fc變體的Fc融合體。57.根據(jù)項(xiàng)1或56所述的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含工程改造的糖型。58.根據(jù)項(xiàng)57所述的抗體，其中所述工程改造的糖型改善了效應(yīng)器功能。59. 一種藥物組合物，包含根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。60. 一種治療需要所述治療的哺乳動(dòng)物的方法，包含施用項(xiàng)1的抗體。61. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由332D、332E、 332N或332Q組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列位置，其中所述抗體對(duì)靶抗原具有特異 性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。62. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由264Ι、264Τ 或264Υ組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列位置，其中所述抗體或Fc融合體對(duì)靶抗原具 有特異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR, EpCAM、MUCl、GD3、 CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。63. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由239D、239E、 239N、239Q或239T組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合 體對(duì)靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、 MUC1、GD3、CEA、CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。64. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由330Y、330L 或3301組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對(duì)靶抗原 具有特異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、 CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。65. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由2401或240Μ 組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對(duì)靶抗原具有特 異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。66. 一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含一種取代，選自297D，其中所述位 置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對(duì)靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自 由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR, TNF α 和VEGF組成的組。67. 一種根據(jù)項(xiàng)61、62、63、64、65或66所述的抗體，其中所述Fc變體還包含取代 298Α。附圖簡(jiǎn)述圖1.抗體結(jié)構(gòu)與功能。顯示的是全長(zhǎng)人IgGl抗體的模型，模型使用了來(lái)自pdb 登記號(hào) ICEl (James 等·，1999，J Mol Biol 289 293-301)的人源化 Fab 結(jié)構(gòu)和來(lái)自 pdb 登記號(hào) 1DN2 (DeLano 等·，2000，Science 287 1279-1283)的人 IgGl Fc 結(jié)構(gòu)。未顯示連接 Fab和Fc區(qū)的柔性鉸鏈。IgGl是異二聚體的同二聚體，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。標(biāo)記 了抗體包含的Ig結(jié)構(gòu)域，對(duì)于輕鏈而言包括八和Q，對(duì)于重鏈而言包括VH、CyI、CY2和 CY30標(biāo)記了 Fc區(qū)。標(biāo)記了相關(guān)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包括可變區(qū)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及Fc 區(qū)中Fc γ Rs、FcRn, Clq和蛋白A和G的結(jié)合位點(diǎn)。圖2. Fc/Fc YRIIIb復(fù)合物結(jié)構(gòu)1IIS。Fc顯示為灰色飄帶圖，F(xiàn)c γ RIIIb顯示為 黑色飄帶圖。Ν297糖顯示為黑色棒狀。圖 3.阿侖單抗(alemtuzumab) (Campath , Ilex Pharmaceuticals LP 的注冊(cè)商 標(biāo))抗體的重鏈氨基酸序列，闡明了位置編號(hào)順序(在氨基酸序列上的2行)和依照Kabat 的EU標(biāo)引方式的位置編號(hào)(在氨基酸序列下的2行)。Ig結(jié)構(gòu)域VH1、Cy1、鉸鏈、CY2和 C Y 3大致的起點(diǎn)也標(biāo)記于上述連續(xù)編號(hào)中。已觀察到許多Fc位點(diǎn)上的多態(tài)性，包括但不限 于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此此處顯示的序列與現(xiàn)有技術(shù)序列之間可能存 在著微小的差異。圖4.定位在Fc/Fc γ RIIIb復(fù)合物結(jié)構(gòu)IllS上的實(shí)驗(yàn)文庫(kù)殘基。Fc顯示為灰色 飄帶圖，F(xiàn)c γ RIIIb顯示為黑色飄帶圖。實(shí)驗(yàn)文庫(kù)殘基顯示為黑色球狀和棒狀。N297糖顯 示為黑色棒狀。圖5.人IgGl Fc序列，顯示了與Fc變體實(shí)驗(yàn)文庫(kù)設(shè)計(jì)相關(guān)的位點(diǎn)。該序列包括 鉸鏈區(qū)、C Y2結(jié)構(gòu)域和C Y3結(jié)構(gòu)域。殘基編號(hào)依照Kabat的EU標(biāo)引方式。與實(shí)驗(yàn)文庫(kù)相 關(guān)的位點(diǎn)加下劃線。因?yàn)橛^察到許多Fc位點(diǎn)上的多態(tài)性突變，所以此處顯示的序列與文獻(xiàn) 序列之間可能存在著微小的差異。圖6. 293T細(xì)胞中阿侖單抗的Fc變體和野生型(WT)蛋白的表達(dá)。含有阿侖單抗重 鏈基因(野生型或變體)的質(zhì)粒與含有阿侖單抗輕鏈基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染5天后收獲 培養(yǎng)液。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染的樣品而言，在SDS-PAGE凝膠上加載IOul培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分 析(Western analysis) 0用于蛋白質(zhì)印跡的探針是過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgGCJackson Immuno-Research，產(chǎn)品目錄#109-035-088)。WT 生型阿侖單抗；1-10 阿侖單抗變體。H 和L分別表示抗體重鏈和輕鏈。圖7.使用蛋白A層析純化阿侖單抗。在293T細(xì)胞中表達(dá)野生型阿侖單抗蛋白，轉(zhuǎn) 染5天后收獲培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液用PBS稀釋到1 1，并用蛋白A(PierCe，產(chǎn)品目錄#20334) 純化。0 純化前原始樣品；FT 流出液；E 洗脫液；C 濃縮的最終樣品。左圖顯示了 Simple 藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠，右圖顯示了使用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG標(biāo)記的蛋白質(zhì)印 跡。圖8.去糖基化抗體的產(chǎn)生。在293T細(xì)胞中表達(dá)阿侖單抗的野生型和變體，并用 蛋白A層析純化。抗體與肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37°C溫育24小時(shí)。對(duì)于每個(gè)抗體來(lái) 說(shuō)，平行進(jìn)行模擬處理樣品(-PNGase F)的試驗(yàn)。WT 野生型阿侖單抗；#15、#16、#17、#18、 #22 分別為阿侖單抗變體 F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/ F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R 和 I332E。相對(duì)于模擬處理的樣品，PNGase F處理的樣品遷移更快，代表了去糖基化重鏈。圖9.表達(dá)自293T細(xì)胞的阿侖單抗與其抗原的結(jié)合。融合有GST的⑶52肽抗原 在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)自大腸桿菌BL21 (DE3)。未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的樣品都繼續(xù)跑SDS-PAGE凝膠，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡來(lái)說(shuō)，來(lái)自Sotec (α-⑶52，Sotec)的阿侖單抗(終 濃度為2. 5ng/ul)或經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞(Campath，Xencor)的培養(yǎng)液(阿侖單抗終濃度約 為0. 1-0. 2ng/ul)作為一抗，過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG作為二抗。M 預(yù)染色的標(biāo)記物； U 未誘導(dǎo)GST-CD52的樣品；I 誘導(dǎo)GST-CD52的樣品。圖10.人V158Fc γ RIIIa胞外區(qū)的表達(dá)和純化。標(biāo)記的Fc γ RIIIa轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，3天后收獲含有分泌的Fc YRIIIa的培養(yǎng)液并用親和層析純化。1 培養(yǎng)液；2 流出 液；3 洗滌液；4-8 連續(xù)的洗脫液。simple藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果都 得到顯示。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡而言，膜用抗-GST抗體探針探測(cè)。圖11.使用實(shí)施例2所述的AlphaScreen 分析法確定實(shí)驗(yàn)文庫(kù)選擇的阿侖單抗 Fc變體與人V158Fc YRIIIa的結(jié)合。在存在競(jìng)爭(zhēng)性抗體(Fe變體或野生型阿侖單抗)情 況下，當(dāng)發(fā)光信號(hào)減少時(shí)觀察到特征性抑制曲線。磷酸鹽緩沖液(PBS)單獨(dú)作為陰性對(duì)照。 這些數(shù)據(jù)對(duì)最大和最小發(fā)光信號(hào)歸一化，所述最大和最小發(fā)光信號(hào)分別提供自低和高濃度 競(jìng)爭(zhēng)性抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合，所述擬合使用了非線性 回歸。這些擬合提供了每個(gè)抗體的IC50s，野生型和S239D用點(diǎn)線說(shuō)明。圖12. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Fc γ RIIb的結(jié) 合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖13. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Vall58Fc y RIIIa 的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖14. AlphaScreen 分析法測(cè)量了在背景利妥昔單抗(rituximab)中選擇的Fc 變體與人V158FC YRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬 合。PBS作為陰性對(duì)照。圖15. AlphaScreen 分析法測(cè)量了在背景曲妥單抗(trastuzumab)中選擇的Fc 變體與人V158 Fc γ RIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬 合。PBS作為陰性對(duì)照。圖16a_16b. AlphaScreen 分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體與人V158 Fc γ RIIIa (圖16a)及人Fc γ RIIb (圖16b)的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位 點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖17. AlphaScreen 分析法測(cè)量了在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體與人V158 Fc YRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。圖18. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人R131 Fc y RIIa 的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。圖19a和19b. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人 V158 FcYRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型(one site competition model)的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖20. AlphaScreen 分析法顯示了非糖基化阿侖單抗Fc變體與人V158 Fc γ RIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰 性對(duì)照。圖21. AlphaScreen 分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體糖基化型(實(shí)心符號(hào)， 實(shí)線)及非糖基化型(空心符號(hào)，打點(diǎn)的線)與人V158 FcYRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。圖22a_22b. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Fc y RIIIa 的V158(圖22a)及F158(圖22b)同種異型的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位 點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖23a_23d.圖23a和23b顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與V158 Fc γ RIIIa (圖 23a)及 F158 Fc γ RIIIa(圖 23b)結(jié)合的 SPR Kd' s 與 AlphaScreen IC50' s 之間的相 關(guān)性。圖23c和23d顯示了對(duì)于選擇的阿侖單抗Fc變體與V158 Fc γ RIIIa(圖23c)及 F158 Fc YRIIIa(圖23d)結(jié)合而言，SI3R與AlphaScreen 測(cè)定的較野生型改良的倍數(shù)的結(jié) 果之間的相關(guān)性。結(jié)合數(shù)據(jù)列于表62中。通過(guò)數(shù)據(jù)的線代表了數(shù)據(jù)的線性擬合，r2值表示 這些擬合的顯著性。圖24a_24b.在背景阿侖單抗中選擇的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測(cè)定。使用基 于DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測(cè)定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測(cè)量ADCC，描述于實(shí)施例7，使用 DoHH-2淋巴靶細(xì)胞和50倍過(guò)量的人PBMCs。圖24a是顯示了用于指示lOng/ml阿侖單抗抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC 條顯示了在缺乏抗體條件下細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)水平。對(duì)于指明的阿侖單抗抗體而言，圖24b 顯示了 ADCC對(duì)抗體濃度的劑量依賴性，對(duì)最小和最大熒光信號(hào)歸一化，所述最小和最大熒 光信號(hào)分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)S形劑量-響應(yīng)模型的擬合， 所述擬合使用了非線性回歸。圖25a_25b.在背景利妥昔單抗中選擇的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測(cè)定。使用 DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測(cè)定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測(cè)量ADCC，描述于實(shí)施例7，使用 WIL2-S淋巴靶細(xì)胞和50倍過(guò)量的人PBMCs。圖25a是顯示了用于指示lng/ml利妥昔單抗 抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體條件下細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)水平。對(duì) 于指明的利妥昔單抗抗體而言，圖25b顯示了 ADCC對(duì)抗體濃度的劑量依賴性，對(duì)最小和最 大熒光信號(hào)歸一化，所述最小和最大熒光信號(hào)分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代 表了數(shù)據(jù)對(duì)S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖26a_26c.在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測(cè)定。使用 DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測(cè)定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測(cè)量ADCC，描述于實(shí)施例7，使用 BT474和Sk-Br-3乳腺癌靶細(xì)胞和50倍過(guò)量的人PBMCs。圖26a是顯示了用于指示lng/ml 曲妥單抗抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體的條件下細(xì)胞毒性的基 礎(chǔ)水平。對(duì)于指明的曲妥單抗抗體而言，圖26b和26c顯示了 ADCC對(duì)抗體濃度的劑量依賴， 對(duì)最小和最大熒光信號(hào)歸一化，所述最小和最大熒光信號(hào)分別提供自低和高濃度抗體的基 線。曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27a_27b.選擇的Fc變體介導(dǎo)結(jié)合和激活補(bǔ)體的能力。圖27a顯示 AlphaScreen 分析法測(cè)量的選擇的阿侖單抗Fc變體與Clq的結(jié)合。數(shù)據(jù)對(duì)最大和最小發(fā) 光信號(hào)歸一化，所述最大和最小發(fā)光信號(hào)分別提供自低和高濃度競(jìng)爭(zhēng)性抗體的基線。曲線 代表了數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27b顯示了基于 細(xì)胞測(cè)定法測(cè)量的選擇的利妥昔單抗Fc變體介導(dǎo)CDC的能力。使用Amar藍(lán)(Amar Blue) 來(lái)監(jiān)測(cè)人血清補(bǔ)體(Quidel，San Diego, CA)對(duì)Fc變體和野生型利妥昔單抗調(diào)理的WIL2-S 淋巴細(xì)胞的溶胞作用而實(shí)現(xiàn)CDC測(cè)定。對(duì)于指明的利妥昔單抗抗體而言，顯示了補(bǔ)體介導(dǎo)的溶胞作用對(duì)抗體濃度的劑量依賴性，對(duì)最小和最大熒光信號(hào)歸一化，所述最小和最大熒 光信號(hào)分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對(duì)S形劑量-響應(yīng)模型的擬合， 所述擬合使用了非線性回歸。圖28. AlphaScreen 分析法測(cè)量的選擇的阿侖單抗Fc變體與細(xì)菌蛋白A的結(jié)合， 描述于實(shí)施例9。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì) 照。圖29. AlphaScreen 分析法測(cè)量的選擇的阿侖單抗Fc變體與小鼠Fc y RIII的結(jié) 合，描述于實(shí)施例10。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰 性對(duì)照。圖30. AlphaScreen 分析法測(cè)量的選擇的曲妥單抗Fc變體與人V158Fc y RIIIa 的結(jié)合，所述曲妥單抗Fc變體在293Τ和CHO細(xì)胞中表達(dá)，描述于實(shí)施例11。歸一化數(shù)據(jù)， 曲線代表數(shù)據(jù)對(duì)單位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性模型的擬合。PBS作為陰性對(duì)照。圖31a_31c.顯示了改良的抗-⑶20抗體的序列。利妥昔單抗的輕鏈和重鏈序列分 別呈現(xiàn)于圖31a和圖31b中，獲得自US 5，736，137的翻譯的序列3。圖31b中相關(guān)位置用 粗體表示，包括 S239、V240、V2641、N297、S298、A330 和 1332。圖 31c 顯示了改良的抗-CD20 抗體重鏈序列，具有粗體X” X2> X3、X4、X5、X6和Z1所指定的可變區(qū)位置。序列下的表格提 供了對(duì)于那些位置而言可能的取代。改良的抗-⑶20抗體序列包含至少一種非野生型氨基 酸，可能的取代選自對(duì)&、^3、&、&和&的取代。這些改良的抗-⑶20抗體序列也可包 含Z1的取代。這些位置依照Kabat的EU標(biāo)記方式編號(hào)，因此并不相應(yīng)于序列中連續(xù)的順 序。發(fā)明詳述為了能更徹底地理解發(fā)明，以下列出一些定義。上述定義意在包含語(yǔ)法等同成分。本文中使用的“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”意指細(xì)胞介導(dǎo)的反 應(yīng)，其中表達(dá)Fc y Rs的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體并隨后引起對(duì)靶 細(xì)胞的溶胞作用。本文中使用的“ADCP”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用”意指細(xì)胞介導(dǎo)的 反應(yīng)，其中表達(dá)Fc y Rs的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體并隨后引起對(duì) 靶細(xì)胞的吞噬作用。本文中的“氨基酸修飾”意指多肽序列中氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中優(yōu) 選的氨基酸修飾是取代。"TT本文中“抗體”意指由基本上為公認(rèn)的免疫球蛋白基因的全部或部分所編碼的一 種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)。所述公認(rèn)的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa( κ) κ、Iambda(A) λ和重鏈基因座，其中包含了無(wú)數(shù)的可變區(qū)基因，以及分別編碼IgM、IgD、 IgG、IgE 和 IgA 同種型的恒定區(qū)基因 mu( μ) μ ,delta( δ ) δ >gamma(y) γ ,sigma(o ) σ、 alpha(a) α。本文中的抗體意指包括全長(zhǎng)抗體和抗體片段，和來(lái)自任意生物體可稱為天 然抗體的，工程抗體，或?yàn)樵囼?yàn)、治療目的或其它如下所進(jìn)一步規(guī)定的目的而重組產(chǎn)生的抗 體。因此，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體(mAb)。制備和純化單克隆及多克隆抗體的方 法為本領(lǐng)域所公知，描述于如 Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual 中(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。如本文所概述，“抗體”明確地包括本文中所描述的Fc變體，“全長(zhǎng)”抗體包括本文中描述的Fc變體片段，以及本文中描述的與 其它蛋白質(zhì)融合的Fc變體。在一些實(shí)施方案中，抗體可以是中和性的、或抑制性的、或刺激性的抗體，在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，如本文所描述，與親本抗體(如，當(dāng)非天然存在變體用作為本文中的計(jì)算分 析的出發(fā)點(diǎn)時(shí))相比時(shí)，或與原始的野生型抗體相比時(shí)，通過(guò)變體抗體與受體親和力的增 加來(lái)測(cè)定刺激活性。因此，本文中“中和(neutralization)”、“中和(neutralize) ”、“中和 (neutralizing)，，以及語(yǔ)法等同成分意指抑制或減少抗體的生物效應(yīng)，在一些情況下通過(guò) 與抗原結(jié)合(如競(jìng)爭(zhēng)性地)消除或減弱結(jié)合的生物效應(yīng)，或通過(guò)結(jié)合以導(dǎo)致結(jié)合的生物效 應(yīng)減弱。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體片段，為本領(lǐng)域所公知，諸如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc或 抗體的抗原結(jié)合的其它亞序列，例如，單鏈抗體(例如Fv)、嵌合抗體等，或通過(guò)修飾完整抗 體或使用重組DNA技術(shù)重新合成的那些抗體而產(chǎn)生的抗體片段。具體優(yōu)選的是如本文所 述的Fc變體。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包含能做為激動(dòng)劑或拮抗劑抗體的多克隆抗體和單克隆抗體 (mAbs) ο如本文所概述，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合Fc受體。本文中“特異性結(jié)合”意指 具有結(jié)合常數(shù)至少為KT4-KT6M-1,優(yōu)選為Ι Τ-Ι ΤΜ—1的LC抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，本發(fā)明的抗體是人源化的。使用通用的單克隆抗體技術(shù)，人們可制備事實(shí)上抗已得到 鑒定的任意靶抗原的人源化抗體[Stein, Trends Biotechnol. 15 :88_90 (1997)]。非人 (如，鼠)抗體的人源化型是免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如as Fv, Fe, Fab, Fab' , F(ab' ) 2或其它抗體的抗原結(jié)合序列)的嵌合分子，所述片段含有衍生自非人免 疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受者的抗體)，其中接受者的互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基為來(lái)自諸如具有所需特異性、親和力以及能力的小鼠、大鼠或兔的 非人物種(供體的抗體)CDR的殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)殘 基為相應(yīng)的非人殘基所取代。人源化抗體也可包含既不在接受者抗體中也不在被引入的 CDR或骨架區(qū)序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。一般而言，人源化的抗體可包含至少一個(gè)、以及通常為 兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部的結(jié)構(gòu)，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白 的那些CDR區(qū)，全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體最好 也包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)[Jones等.， Nature 321 :522_525(1986) ；Riechmann 等·，Nature 332 :323_329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. BIOL. 2 :593_596 (1992)]。人源化非人抗體的方法為本領(lǐng)域眾所周知。 一般而言，人源化抗體引入了一個(gè)或多個(gè)非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基 通常稱為引入殘基(import residues)，其一般來(lái)自引入的可變區(qū)。采用Winter與其同 事的方法[Jones 等.，同上；Riechmann 等.，同上；以及 Verhoeyen 等.，Science，239 1534-1536 (1988)]，通過(guò)用嚙齒動(dòng)物⑶Rs或⑶R序列取代人抗體的相應(yīng)序列，人源化可基 本上得到完成。人源化小鼠單克隆抗體的其它實(shí)例也為本領(lǐng)域所公知，例如，結(jié)合人蛋白 C
，白介素 2 受體[Queen 等· ,Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. 86 10029-33 (1989])，以及人表皮生長(zhǎng)因子受體2的抗體[Carter等·， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 :4285_9 (1992)]。因此，上述人源化抗體為嵌合抗體(美國(guó) 專利第4，816，567號(hào))，其中基本上小于完整的人可變區(qū)已為來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所取代。實(shí)際中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些⑶R殘基和可能有一些FR殘基為來(lái)自 嚙齒動(dòng)物抗體中的相似位點(diǎn)所取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是基于人序列的，因此人序列被用作為 “堿基”序列，抗諸如大鼠、小鼠和猴子的序列。為確定與原序列或結(jié)構(gòu)的同源性，前體或親 本Fc的氨基酸序列與本文所列的人Fc序列直接比較。在序列比對(duì)后，使用一種或多種本 文所述的同源性比對(duì)程序(例如在物種之間使用保守殘基)來(lái)確定與人Fc原序列中特定 氨基酸等價(jià)的殘基，為維持比對(duì)的進(jìn)行應(yīng)考慮到必需的插入和缺失(即，避免通過(guò)任意的 缺失或插入而排除保守殘基)。保守殘基的排列優(yōu)選上述殘基應(yīng)100%保守。然而，大于 75%或少至50%的保守殘基的比對(duì)也足夠用于確定等價(jià)殘基(在本文中有時(shí)稱為“相應(yīng)的 殘基”)。對(duì)于已通過(guò)X-射線結(jié)晶學(xué)測(cè)定三維結(jié)構(gòu)的Fc片段而言，等價(jià)殘基也可通過(guò)確定 三維結(jié)構(gòu)水平上的同源性而得到確定。等價(jià)殘基確定為親本或前體特定氨基酸殘基的兩個(gè) 或更多個(gè)主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對(duì)N，CA對(duì)CA，C對(duì)C以及0對(duì)0)在比對(duì)后處于0. 13nm 范圍內(nèi)以及優(yōu)選在0. Inm內(nèi)的那些。在最佳模型已定向并定位以給出Fc變體片段非氫蛋 白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊后，比對(duì)得到實(shí)現(xiàn)。明確地包括于“抗體”定義范圍內(nèi)的是非糖基化抗體。本文使用的“非糖某化杭 體”意指在Fc區(qū)297位缺少糖附著的抗體，其中編號(hào)方式依照Kabat的EU系統(tǒng)。非糖基 化的抗體可以是去糖基化的抗體，其是一種Fc糖已去除的抗體，例如以化學(xué)或酶的方法去 除?？蛇x地，所述非糖基化抗體可以是非糖基化或未糖基化的抗體，其是一種無(wú)Fc糖表達(dá) 的抗體，例如通過(guò)突變一種或多種編碼糖基化型的殘基或通過(guò)在諸如細(xì)菌的不將糖附著到 蛋白質(zhì)上的生物體中表達(dá)。明確地包括于“抗體”定義范圍內(nèi)的是含有Fc變體部分的全長(zhǎng)抗體。本文中“全 意指構(gòu)成抗體的天然生物學(xué)類型的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。舉例來(lái)說(shuō)，在包括
人和小鼠的大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，IgG類的全長(zhǎng)抗體是一種四聚體并由相同的兩對(duì)兩條免疫 球蛋白鏈組成，每對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域\和Q， 每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH、CyI、CY2和CY3。在一些哺乳動(dòng)物中，例如在駱駝 (camel)和美洲駝(llamas)中，IgG抗體可僅由兩條重鏈組成，每條重鏈包含一個(gè)附著在Fc 區(qū)上的可變區(qū)。本文中使用的‘ εΤ’意指屬于抗體類的多肽，其基本上為公認(rèn)的免疫球蛋白 Y基因所編碼。在人中，該類包含IgGl、IgG 2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG 3。本文中使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20種天然存在的氨基酸之一或 任一非天然類似物，它們可位于特別規(guī)定的位置。本文中“蛋白質(zhì)”意指至少兩個(gè)共價(jià)連接 的氨基酸，其包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和肽。蛋白質(zhì)可由天然存在的氨基酸和肽鍵構(gòu)成，或由 合成的肽模擬物結(jié)構(gòu)構(gòu)成，該肽模擬物即“類似物”，特別是當(dāng)將LC肽施用于患者時(shí)，如類 肽(peptoid)(參見(jiàn)，Simon 等·，PNAS USA 89(20) :9367 (1992))。因此本文中使用的“氨 基酸”或“肽殘基”意指天然存在和合成的氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于本發(fā)明目的而言，高苯基 丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的氨基酸?！鞍被帷币舶ㄖT如脯氨 酸和羥脯氨酸的亞氨基酸殘基。側(cè)鏈可以是(R)或(S)構(gòu)型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基 酸以(S)或L-構(gòu)型存在。如果使用非天然存在的側(cè)鏈，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延遲體內(nèi)降解。本文中“計(jì)算篩詵方法(computational screening method) ”意指用于設(shè)計(jì)蛋白 質(zhì)中一種或多種突變的任何方法，其中所述方法使用了計(jì)算機(jī)來(lái)評(píng)估可能的氨基酸側(cè)鏈取 代相互之間和/或與蛋白質(zhì)的其它部分相互作用的能量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，能量 評(píng)估涉及能量計(jì)算，能量計(jì)算涉及一些對(duì)一種或多種氨基酸修飾的打分方法。所述方法可 涉及物理或化學(xué)能項(xiàng)(energy term)，或可涉及基于已有知識(shí)-、統(tǒng)計(jì)學(xué)-、序列的能項(xiàng)等。 所述計(jì)算由在本文中稱為“計(jì)算篩詵計(jì)算(computational screening calculations) ”的 計(jì)算篩選方法組成。本文中使用的“效應(yīng)器功能”意指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體相互作用產(chǎn)生的 生化反應(yīng)。效應(yīng)器功能包括但不限于ADCC、ADCP和⑶C。本文中使用的“效應(yīng)細(xì)胞”意指表 達(dá)一種或多種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)器功能的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括但不 限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、 大顆粒淋巴細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞以及灃T細(xì)胞，以及可來(lái)自任何生物體包 括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。本文中“^1”意指任意形式的一組Fc變體，包括 但不限于一列核酸或氨基酸序列，一列在可變位置的核酸或氨基酸取代，包含編碼庫(kù)序列 的核酸的物理文庫(kù)，或包含F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)的物理文庫(kù)，所述Fc變體蛋白質(zhì)以純化或未純化 的形式存在。本文中使用的“Fc”、“Fc區(qū)”、“Fe多肽”等意指于本文定義的抗體,其包括包含除 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域第一恒定區(qū)外的抗體恒定區(qū)的多肽。因此，F(xiàn)c指IgA、IgD和IgG免疫球 蛋白結(jié)構(gòu)域的最后兩個(gè)恒定區(qū)，IgE和IgM免疫球蛋白的最后三個(gè)恒定區(qū)，和這些結(jié)構(gòu)域的 N-末端連接的柔性鉸鏈。對(duì)于IgA和IgM而言，可包括J鏈。對(duì)于IgG來(lái)說(shuō)，如圖1所示， Fc包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域C γ 2和C γ 3以及C γ 1和C γ 2之間的鉸鏈。盡管Fc區(qū)的邊界 可改變，人IgG重鏈Fc區(qū)通常規(guī)定為在其羧基末端包含殘基C226或P230，其中編號(hào)方式依 照Kabat的EU標(biāo)引方式。Fc可指分離的該區(qū)域，或在上下文的抗體、抗體片段或Fc融合體 中的該區(qū)域。Fc可以是抗體、Fc融合體，或包含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的 是Fc變體，其是非天然存在的Fc變體。本文中使用的“Fe融合體”意指其中一個(gè)或更多個(gè)多肽可操作地連接Fc的蛋白 質(zhì)。在本文中Fc融合體與現(xiàn)有技術(shù)中所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫粘合素”、“Ig融合體”、“Ig嵌合 體，，以及“受體球蛋白”(有時(shí)加破折號(hào))(Chamow等· , 1996,Trends Biotechnol 14 :52_60 ； Ashkenazi 等.，1997，Curr Opin Immunol 9 195-200)的含義是相同的。Fc 融合體將免疫 球蛋白Fc區(qū)與融合伴侶(fusion partner)結(jié)合，一般而言，所述融合伴侶可以是任何蛋白 質(zhì)，包括但不限于，受體的靶結(jié)合區(qū)、粘合素分子、配體、酶或某些其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域。Fc融合體非Fc-部分的作用是介導(dǎo)靶結(jié)合，因此其功能類似于抗體的可變區(qū)。本文中使用的“Fe γ受體”或“Fe y R”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且基本上為Fc γ R 基因所編碼的蛋白質(zhì)家族的任何成員。在人類中，該家族包括但不限于Fc YRI (CD64)，包 含亞類 Fc y RIa、Fc y RIb 和 Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，包含 Fc γ RIIa(包括同種異型 Η131 和 R131)、Fc y RIIb (包括 Fc y RIIb-I 禾口 Fc y RIIb-2)禾口 Fc y RIIc ；以及 Fc y RIII (CD16)， 包含但不限于發(fā)Fc y RIIIa(包括同種異型V158和F158)和Fc y RIIIb (包括同種異型 Fc γ RIIIb-NAl 和 Fc YRIIIb-NA2) (Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57_65)，也包括任何未被發(fā)現(xiàn)的人Fc Y Rs或Fc Y R亞類或同種異型。Fc y R可來(lái)自任何生物體，包括但不限 于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠Fc y Rs包括但不限于Fc y RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、 FcyRIII (CD16)以及Fc γ RIII-2 (CD16-2)，也包括任何未被發(fā)現(xiàn)的小鼠Fc γ Rs或Fc γ R 亞類或同種異型。本文中使用的“Fe配體”意指來(lái)自仵何牛物體的一種分子,優(yōu)詵一種多肽,其與抗體的Fc區(qū)結(jié)合以形成Fc-配體復(fù)合物。Fc配體包括但不限于Fc y Rs、Fc y Rs、Fc y Rs、 FcRn、Clq、C3、甘露聚糖結(jié)合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G以及病 毒Fc γ R。Fc配體可包括未被發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合Fc的分子。本文中使用的“Μ”意指一種屬于抗體類的多肽，其基本上為公認(rèn)的免疫球蛋白 Y基因所編碼。在人類中，該類包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG3。本文中“免疫球蛋白(Ig) ”意指由基本上為免疫球蛋白基因所編碼的 一個(gè)或多個(gè)多肽組成的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括但不限于抗體。免疫球蛋白可具有許多 結(jié)構(gòu)型，包括但不限于全長(zhǎng)抗體、抗體片段和單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本f中“免瘡球蛋白 iM^HM”意指為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域技術(shù)人員所確定的作為分離的結(jié)構(gòu)實(shí)體而存在的免疫 球蛋白的區(qū)域。Ig結(jié)構(gòu)域通常具有特征性的多層(sandwich)折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)?？贵wIgG 類中已知的Ig結(jié)構(gòu)域VH、CY 1、C γ 2、C γ 3、Vl以及Cl。本文中使用的“親本多肽”或“前體多肽”(包括Fc親本或前體)意指一種隨后被 修飾以產(chǎn)生變體的多肽。所述親本多肽可以是天然存在多肽，或天然存在多肽的變體或工 程型。親本多肽可指該多肽自身、包含該親本多肽的組合物或編碼其的氨基酸序列。因此， 本文中使用的“親本Fc多肽”意指未修飾的Fc多肽，其可修飾以產(chǎn)生變體，在本文中使用 的“親本抗體”意指未修飾的抗體，其可修飾以產(chǎn)生抗體變體。如上所概述，F(xiàn)c分子的某些位置可得到改變。本文中使用的“位置”意指在蛋白質(zhì) 序列中的位置。位置可按順序編號(hào)，或依據(jù)已確定的方式編號(hào)，例如Kabat的EU標(biāo)引方式。 舉例來(lái)說(shuō)，位置297是人抗體IgGl中的一個(gè)位置。如上所述，一般通過(guò)與其它親本序列比 對(duì)確定相應(yīng)的位置。本文中使用的“_”意指在蛋白質(zhì)中的位置以及與之相關(guān)的氨基酸同一性。例 如，Daragine 297 (也稱為N297)是在人抗體IgGl中的一種殘基。本文中使用的“I^M”意指與給定抗體可變區(qū)特異性結(jié)合的分子。靶抗原可以 是蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)或其它化合物。本文中使用的“靶細(xì)胞”意指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。本文中使用的“可變區(qū)”意指包含一個(gè)或多個(gè)基本上為任一 Vk、νλ和/或Vh基 因所編碼的Ig結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域，所述的VK、νλ和/或Vh基因分別構(gòu)成了免疫 球蛋白κ、λ和重鏈的基因座。本文中使用的“變體多肽”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本多肽序列 的多肽序列。變體多肽可指多肽自身、包含該多肽的組合物或編碼其的氨基序列。優(yōu)選地， 與親本多肽相比該變體多肽具有至少一個(gè)氨基酸修飾，如與親本多肽相比約1到約10個(gè)氨 基酸修飾，以及優(yōu)選約1到約5個(gè)氨基酸修飾。本文中該變體多肽序列與親本多肽序列優(yōu) 選具有至少約80%的同源性，最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%的同源性。 因此，本文中使用的“Fe變體”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本Fc序列的Fc序列。Fc變體可以僅包含F(xiàn)c區(qū)，或可存在于上下文的抗體、Fc融合體或其它基本上由Fc編 碼的多肽中。Fc變體可指Fc多肽自身、包含該Fc變體多肽的組合物或編碼其的氨基酸序 列。對(duì)于本發(fā)明中討論的所有位置而言，免疫球蛋白重鏈的編號(hào)方式依照EU標(biāo)引方 式(Kabat 等·，1991，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 5 片反·，United States Public Health Svice， National Institutes of Health， Bethesda)。 "Kabat 的 EU標(biāo)引方式”指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)方式。本發(fā)明的Fc變體可對(duì)不同的特性進(jìn)行優(yōu)化?？蓛?yōu)化的特性包括但不限于對(duì)Fc YR 增強(qiáng)或減少的親和力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)化本發(fā)明的Fc變體對(duì)人激活的Fc y R、 優(yōu)選 Fc y RI,Fc y RIIa,Fc y RIIc,Fc y RIIIa 和 Fc y Rlllb，最優(yōu)選 Fc y RIIIa 具有增強(qiáng)的 親和力。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)化Fc變體對(duì)人抑制性受體Fc y RIIb具有減 少的親和力。這些優(yōu)選的實(shí)施方案預(yù)期能提供在人中具有增強(qiáng)治療特性的抗體和Fc融合 體，例如增強(qiáng)的效應(yīng)器功能以及更強(qiáng)的抗癌效力。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，優(yōu)化本發(fā)明的 Fc 變體以對(duì)人 Fc y R，包括但不限于 Fc γ RI、Fc γ RIIa,Fc γ RIIb、Fc γ RIIc、Fc γ RIIIa 和 Fc YRIIIb具有減少或消除的親和力。這些實(shí)施方案預(yù)期能提供在人中具有增強(qiáng)治療特性 的抗體和Fc融合體，例如減少的效應(yīng)器功能以及減少的毒性。優(yōu)選的實(shí)施方案包含優(yōu)化結(jié) 合人Fc γ R的Fe，另一方面，在可選的實(shí)施方案中本發(fā)明的Fc變體對(duì)于來(lái)自非人生物體的 Fc γ Rs具有增強(qiáng)或減少的親和力，非人生物體包括但不限于小鼠、大鼠、兔子和猴子。對(duì)與 非人Fc γ R的結(jié)合進(jìn)行優(yōu)化的Fc變體可用于試驗(yàn)?zāi)康摹Ｅe例來(lái)說(shuō)，對(duì)于不同疾病而言，所 獲得的小鼠模型能夠測(cè)試諸如有效性、毒性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的特定候選藥物特性。在本 領(lǐng)域中公知一種稱為異種移植術(shù)的方法可將癌細(xì)胞移植或注射如小鼠中以模擬人癌癥。對(duì) 包含對(duì)一種或多種小鼠Fc y Rs優(yōu)化的Fc變體的抗體或Fc融合體進(jìn)行測(cè)試可提供與該抗 體或Fc融合體有效性、其作用機(jī)理等相關(guān)的有價(jià)值的信息。本發(fā)明的Fc變體也可優(yōu)化以 增強(qiáng)非糖基化型的功能性和/或溶解性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非糖基化Fc 變體較親本Fc多肽的非糖基化型對(duì)Fc配體的結(jié)合具有更大的親和力。所述Fc配體包括 但不限于Fc YRs、Clq、FcRn以及蛋白A和G，且可來(lái)自任何來(lái)源包括但不限于人、小鼠、大 鼠、兔子或猴子，優(yōu)選人。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí)施方案中，該優(yōu)化的Fc變體較親本Fc多 肽的非糖基化型可更穩(wěn)定和/或更易溶解。得到改造或預(yù)測(cè)顯示任一上述優(yōu)化特性的Fc 變體在本文中稱為“優(yōu)化的Fc變體”。本發(fā)明的Fc變體可來(lái)自不同來(lái)源的親本Fc多肽。該親本Fc多肽可基本上為一種 或多種Fc基因所編碼，所述Fc基因來(lái)自任意生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、駱 駝、美洲駝、單峰駱駝、猴子，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人和小鼠。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該 親本Fc多肽包含抗體，稱為親本抗體。所述親本抗體可以是完全人抗體，例如獲得自使用 轉(zhuǎn)基因小鼠(Bruggemann 等.,1997, Curr Opin Biotechnol 8 :455_458)或人抗體文庫(kù)夕卜 加選擇方法所產(chǎn)生的抗體(Griffiths 等.，1998，Curr Opin Biotechnol 9:102-108)。所 述親本抗體勿需天然存在。舉例來(lái)說(shuō)，該親本抗體可以是工程抗體，包括但不限于嵌合抗體 和人源化抗體(Clark，2000，Immunol Today 21 :397_402)。所述親本抗體可以是基本上為 一種或多種天然抗體基因所編碼的抗體的工程變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該親本抗體已得 到親和力成熟，所述技術(shù)為本領(lǐng)域所公知?？蛇x地，該抗體可以用某些其它方法進(jìn)行修飾，例如于2003年3月3日提交的USSN 10/339788中所描述的方法。本發(fā)明的Fc變體可基本上為屬于任一抗體類型的免疫球蛋白基因所編碼。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在抗體或Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體包含屬于抗體IgG類 型的序列，該IgG類型包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，在抗體或 Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體包含屬于抗體IgA (包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、 IgG或IgM類型的序列。本發(fā)明的Fc變體可包含超過(guò)一條的蛋白鏈。換句話說(shuō)，在抗體或 Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體是單體或寡聚體，包括同_或異-寡聚體。本發(fā)明的Fc變體可以與其它Fc變體結(jié)合，包括但不限于改變了效應(yīng)器功能的變 體。在抗體或Fc融合體中上述結(jié)合可提供附加的、協(xié)同的或新的特性。在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的Fc變體可以與其它已知的Fc變體結(jié)合(Duncan等，1988，Nature 332 563-564 ； Lund等，1991，J Immunol 147 :2657_2662 ;Lund等·，1992，Mol Immunol 29 53-59 ；Alegre φ . ，1994, Transplantation 57 :1537—1543 ；Hutchins 等.，1995, Proc Natl Acad Sci USA 92 :11980-11984 Jefferis 等.，1995，Immunol Lett 44 :111_117 ;Lund 等·，1995， Faseb J 9 :115_119 Jefferis 等·，1996，Immunol Lett 54 :101_104 ；Lund 等·，1996，J Immunol 157 :4963-4969 ;Armour 等·，1999，Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Idusogie 等·， 2000，J Immunol 164 :4178_4184 ；Reddy 等.，J Immunol 2000，164 1925-1933 ；Xu 等·， 2000,Cell Immunol 20016-26 ;Idusogie等·，2001，J Immunol 166 2571-2575 ；Shields 等，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 Jefferis 等.，2002，Immunol Lett 82:57-65; Presta 等·，2002，Biochem Soc Trans 30 487-490)(US 5,624, 821 ；US 5，885，573 ；US 6, 194, 551 ；PCT WO 00/42072 ；PCT WO 99/58572)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的 Fc變體摻入到包含一種或多種工程糖型的抗體或Fc融合體中。本文中使用的“工程糖型 (enRineerd Rlycoform)，，意指與Fc多肽其價(jià)連接的糖組合物，其中所述糖組合物在化學(xué) 特性上與親本Fc多肽不同。工程糖型可用于不同用途，包括但不限于增強(qiáng)或減少效應(yīng)器 功能?？赏ㄟ^(guò)任何方法產(chǎn)生工程糖型，例如通過(guò)使用工程的或變體表達(dá)菌株，通過(guò)與一種 或多種酶共表達(dá)，例如β 1-4-Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII)，通過(guò)在不同生物體或 來(lái)自不同生物體的細(xì)胞系中表達(dá)Fc多肽，或通過(guò)在Fc多肽得到表達(dá)后修飾糖類。用于產(chǎn) 生工程糖型的方法為本領(lǐng)域所公知，包括但不限于(Umafia等.，1999，Nat Biotechnol 17 176-180 ；Davies 等，2001，Biotechnol Bioeng 74 288-294 ；Shields 等.,2002, J Biol Chem 277 26733-26740 ；Shinkawa 等.,2003, J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602, 684 ；USSN 10/277, 370 ；USSN 10/113, 929 ；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCT WO 02/30954A1 ；Potelligent 技術(shù)(Biowa，INC.， Princeton, N. J.) ；GlycoMAb 糖基化工程技術(shù)(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)) 0工程糖型通常指不同的糖或寡糖；因此Fc多肽，例如抗體或Fc融合體可 包含工程糖型?？蛇x地，工程糖型可指包含不同糖或寡糖的Fc多肽。因而，本發(fā)明的Fc變 體與其它Fc修飾的組合，以及與未被發(fā)現(xiàn)的Fc修飾的組合預(yù)期可達(dá)到產(chǎn)生新的具有優(yōu)化 特性的抗體或Fc融合體的目的。本發(fā)明的Fc變體可供抗體使用。本文中使用的“本發(fā)明的抗體”意指包含本發(fā)明 Fc變體的抗體。實(shí)際上，本發(fā)明可供包含F(xiàn)c的任何蛋白質(zhì)使用，因此本發(fā)明的Fc變體的應(yīng) 用不限于抗體。本發(fā)明Fc變體可供Fc融合體使用。本文中使用的“本發(fā)明的Fc融合體”指的是包含本發(fā)明Fc變體的Fc融合體。Fc融合體可包含可操作地與細(xì)胞因子、可溶性受體結(jié) 構(gòu)域、粘附分子、配體、酶、肽或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接的本發(fā)明Fc變體，對(duì)Fc融 合體的描述包括但不限于 US 5，843，725 ；US 6，018，026 ；US 6，291，212 ；US 6，291，646 ；US 6，300，099 ；US 6，323，323 ；PCT WO 00/24782 ；以及(Chamow等·，1996，Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi 等.，1997, Curr Opin Immunol 9 195-200)。事實(shí)上本發(fā)明的抗體和融合體可靶向于任何抗原，包括但不限于如下所列的蛋 白質(zhì)、屬于下列蛋白質(zhì)的亞基、結(jié)構(gòu)域、基序和表位:CD2 ；CD3, CD3E, CD4, CDl 1, CD11A， CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 蛋白)， CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4， IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，α-干擾素、β-干擾素、γ-干 擾素；TNF-α , TNF^ 2, TNFc, TNFa β , TNF-RI, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF，LIGHT, VEGI, 0X40L, TRAIL 受體-1，Al 腺苷受體，淋巴 毒素 β 受體，TACI，BAFF-R, EPO ；LFA-3, ICAM—l，ICAM—3，EPCAM, β 1_ 整聯(lián)蛋白、β 2_ 整 聯(lián)蛋白、α4/β7_整聯(lián)蛋白、α2_整聯(lián)蛋白、α3_整聯(lián)蛋白、α4_整聯(lián)蛋白、α 5_整聯(lián) 蛋白、α 6-整聯(lián)蛋白、α ν-整聯(lián)蛋白、0￥03-整聯(lián)蛋白、？6 1 -3，角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 VLA-I, VLA-4, L-選擇蛋白，抗獨(dú)特型抗體(anti-id)，E-選擇蛋白，HLA, HLA-DR，CTLA-4， T 細(xì)胞受體，B7-1，B7-2，VNR 整聯(lián)蛋白(VNR integrin)，TGF-β 1，TGF-β 2，嗜酸細(xì)胞活 化趨化因子1，BLyS(B-淋巴細(xì)胞刺激物)，補(bǔ)體C5，IGE，因子VII，CD64，CBL, NCA 90， EGFR(ErbB-I)，Her2/neu (ErbB-2)，Her3 (ErbB-3)，Her4 (ErbB-4)，組織因子，VEGF, VEGFR, 內(nèi)皮素受體，VLA-4，半抗原NP-加帽或NIP-加帽蛋白，T細(xì)胞受體α/β，E-選擇蛋白， 地高辛，胎盤(pán)堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸類PLAP堿性磷酸酶，鐵傳遞蛋白受體，癌胚抗原 (CEA)，CEACAM5, HMFG ΡΕΜ，粘蛋白 MUC1，MUC18，類肝素酶(h印aranase) I，人心臟肌球蛋 白，腫瘤相關(guān)糖蛋白-72 (TAG-72)，腫瘤相關(guān)抗原CA 125，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，高 分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)，癌相關(guān)抗原，Gcoprotein Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa)， 表達(dá) Lewis Y 相關(guān)糖的月中瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen expressing Lewis Y relatedcarbohydrate)，人巨細(xì)胞病毒(HCMV) gH包膜糖蛋白，HIV GP120, HCMV，呼吸合胞 病毒RSV F，RSVF Fgp, VNR整聯(lián)蛋白，IL-8，細(xì)胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原，Hep B GP120, CMV， gpllbllla，HIV IIIB GP120 V3環(huán)，呼吸合胞病毒(RSV) Fgp，單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋 白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上述列出的靶不僅指特定的蛋白質(zhì)及生物分子，而且還 指包含它們的生化途徑或各種途徑。例如，當(dāng)提及的CTLA-4作為靶抗原時(shí)，意味著配體和 受體組成了 T細(xì)胞共刺激途徑，包括CTLA-4、B7-l、B7-2、CD28，并且任何其它未被發(fā)現(xiàn)的配 體或受體也是靶對(duì)象。因此本文中使用的靶不僅指特定的生物分子，也指與所述靶以及所 述靶所屬的生化途徑的成員相互作用的一組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解任一上 述的靶抗原、配體或它們相應(yīng)的生化途徑能可操作地與本發(fā)明的Fc變體連接以便產(chǎn)生Fc 融合體。因此，舉例來(lái)說(shuō)，靶向EGFR的Fc融合體能通過(guò)可操作地將Fc變體與EGF、TGF α 或任何其它已發(fā)現(xiàn)或未被發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合EGFR的配體連接而得到構(gòu)建。因此，本發(fā)明的Fc 變體能可操作地與EGFR連接以便產(chǎn)生能結(jié)合EGF、TGFa或任何其它已發(fā)現(xiàn)或未被發(fā)現(xiàn)的 可結(jié)合EGFR的配體的Fc融合體。因而，事實(shí)上任何多肽，無(wú)論是配體、受體或一些其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括但不限于上述靶和組成它們相應(yīng)的生化途徑的蛋白質(zhì)，能可操 作地與本發(fā)明的Fc變體連接以便開(kāi)發(fā)Fc融合體。 在臨床試驗(yàn)或在開(kāi)發(fā)研制中批準(zhǔn)使用的許多抗體和Fc融合體都可受益于本發(fā)明 的Fc變體。所沭抗體和Fc融合體在本文中稱為“臨床產(chǎn)物和候詵物”。因此在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供一系列臨床產(chǎn)物和候選物使用。例如，靶向CD20的 許多抗體可受益于本發(fā)明Fc變體。例如本發(fā)明的Fc變體可供抗體使用，所述抗體基本 上類似于利妥昔單抗(Rituxan IDEC/Genentech/Roche)(參見(jiàn)，例如 US 5，736，137)， 一種批準(zhǔn)用于治療非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗⑶20抗體；HuMax-⑶20，一種目前正由 Genmab 開(kāi)發(fā)的抗 CD20 抗體，一種描述于 US 5，500，362 的抗 CD20 抗體，AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), 以 及 HumaLYM(Intracel)0 許 多抗體，其靶向表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，包括EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、 Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)，可受益于本發(fā)明的Fc變體。例如本發(fā)明的Fc變體可供 抗體使用，所述抗體基本上類似于曲妥單抗(Here印tin Genentech)(參見(jiàn)，例如US 5，677，171)，一種批準(zhǔn)用于治療乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗體；目前正由Genentech 開(kāi)發(fā)的 pertuzumab (rhuMab_2C4，Omnitagr )；一種描述于 US 4，753，894 的抗 Her2 抗 體；西妥昔單抗(Erbitux Imclone) (US 4, 943, 533 ；PCT WO 96/40210)，一種在臨床 試驗(yàn)中用于治療多種癌癥的嵌合抗EGFR抗體；目前正由Abgenix/Immunex/Amgen開(kāi)發(fā) 的 ABX-EGF (US 6，235，883)；目前正由 Genmab 開(kāi)發(fā)的 HuMax-EGFr (USSN 10/172，317)； 425、EMD55900、EMD62000 和 EMD72000 (Merck KgaA) (US 5558864 ；Murthy 等.1987，Arch Biochem Biophys. 252(2) :549_60 ;Rodeck 等.，1987，J Cell BiochemI. 35(4) :315_20 ； Kettleborough 等.,1991, Protein Eng. 4 (7) 773-83) ；ICR62 (institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045 ；Modjtahedi 等.，1993，J. Cell Biophys. 1993，22(1-3) 129-46 ；Modjtahedi 等.，1993，Br J Cancer. 1993，67 (2) :247_53 ；Modjtahedi 等，1996， Br J Cancer,73(2) 228-35 ；Modjtahedi 等，2003，Int J Cancer,105(2) :273_80)； TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba) (US 5, 891, 996 ；US 6, 506, 883 ；Mateo 等，1997，Immunotechnology, 3 (1) :71_81)； mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (JungbIuth 等· 2003，Proc Natl Acad Sci USA. 100(2) :639_44) ；KSB_102(KS Biomedix)； MRl-I (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2)；以及 SClOO (Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供阿侖單抗 (Campath Millenium)使用，阿侖單抗是一種目前已批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì) 胞性白血病的人源化單克隆抗體。本發(fā)明的Fc變體可供多種抗體或Fc融合體使用， 所述抗體或Fc融合體基本上類似于其它臨床產(chǎn)物和候選物，包括但不限于莫羅單抗 (muromonab) -CD3 (Orthoclone 0KT3 )，一種由 Ortho Biotech/Johnson&Johnson 開(kāi)發(fā)的 抗 CD3 抗體，替伊莫單抗(ibritumomab tiaxetan) (Zevalin )，一種由 IDEC/Schering AG開(kāi)發(fā)的抗CD20抗體，吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg ) — 種由 Celltech/Wyeth 開(kāi)發(fā)的抗 CD33 (p67 蛋白)抗體，alefacept (Amevive )，一種 由Biogen開(kāi)發(fā)的抗LFA-3 Fc融合體，由Centocor/Lilly開(kāi)發(fā)的阿昔單抗(abciximab) (ReoPro ),由 Novartis 開(kāi)發(fā)的巴利昔單抗(basiIiximab) (Simulect ),由 Medlmmune開(kāi)發(fā)的帕利珠單抗(palivizumab) (Synagi )，英夫利昔單抗(infliximab) (Remicade )，一種由Centocor開(kāi)發(fā)的抗TNF α抗體，阿達(dá)木單抗(adalimumab) (Humira )，一種由 Abbott開(kāi)發(fā)的抗TNFa抗體，他111化3(16"1，一種由061丨6吐開(kāi)發(fā)的抗1順0抗體，依那西 普(etanerc印t) (Enbrel )，一種由 Immunex/Amgen 開(kāi)發(fā)的抗 TNF α Fc 融合體，ABX-CBL， 一種正由Abgenix開(kāi)發(fā)的抗CD147抗體，ABX-IL8，一種正由Abgenix開(kāi)發(fā)的抗IL8抗 體，ΑΒΧ-ΜΑ1，一種正由 Abgenix 開(kāi)發(fā)的抗 MUC18 抗體，Pemtumomab (R1549，9CIY-muHMFGl)， 一種正由Antisoma開(kāi)發(fā)的抗MUCl抗體，Therex(R1550)，一種正由Antisoma開(kāi)發(fā)的抗 MUCl 抗體，正由 Antisoma 開(kāi)發(fā)的 AngioMab (AS1405)，正由 Antisoma 開(kāi)發(fā)的 HuBC-Ι，正由 Antisoma 開(kāi)發(fā)的 Thioplatin (AS1407)，Antegren (那他珠單抗)，一種正由 Biogen 開(kāi) 發(fā)的抗a-4-i3-l(VLA-4)和a-4-β _7抗體，VLA-1單抗，一種正由Biogen開(kāi)發(fā)中的抗 VLA-I整聯(lián)蛋白抗體，LTBR單抗，一種正由Biogen開(kāi)發(fā)的抗淋巴毒素β受體(LTBR)抗 體，CAT-152, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 開(kāi)發(fā)的抗 TGFβ 2 抗體，J695, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 和 Abbott 開(kāi)發(fā)的抗 IL-2 抗體，CAT-192，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 和 Genzyme 開(kāi)發(fā)的抗 TGF β 1 抗體，CAT-213， 一種正由Cambridge Antibody Technology開(kāi)發(fā)的抗嗜酸細(xì)胞活化趨化因子1抗體， LymphoStat-B , 一禾中正由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences INC 開(kāi)發(fā)的抗Blys 抗體，TRAIL-RlmAb, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences, INC 開(kāi)發(fā)的抗 TRAIL-Rl 抗體，Avastin (貝伐單抗，rhuMAb-VEGF)，一 種正由Genentech開(kāi)發(fā)的抗VEGF抗體，一種正由Genentech開(kāi)發(fā)的抗HER受體家族抗體， 抗組織因子(ATF)，一種正由Genentech開(kāi)發(fā)的抗組織因子抗體，Xolair (Omalizumab)， 一種正由 Genentech 開(kāi)發(fā)的抗 IgE 抗體，Raptiva (Efalizumab), 一種正由 Genentech 禾口 Xoma 開(kāi)發(fā)的抗 CDlla 抗體，正由 Genentech 禾口 Millenium Pharmaceuticals 開(kāi)發(fā) 的MLN-02抗體(以前稱為L(zhǎng)DP-02)，HuMax CD4，一種正由Genmab開(kāi)發(fā)的抗CD4抗體， HuMax-ILl5, 一種正由 Genmab 禾口 Amgen 開(kāi)發(fā)的抗 IL15 抗體，正由 Genmab 禾口 Medarex 開(kāi) 發(fā)的 HuMax-布洛芬(Inflam)，HuMax-Cancer, 一種正由 Genmab 和 Medarex 以及 Oxford GcoSciences開(kāi)發(fā)的抗類肝素酶I抗體，正由Genmab和Amgen開(kāi)發(fā)的HuMax-Lymphoma， 正由 Genmab 開(kāi)發(fā)的 HuMax-TAC，IDEC-131，一種正由 IDEC Pharmaceuticals 開(kāi)發(fā)的抗 CD40L抗體，IDEC-151(克立昔單抗)，一種正由IDEC Pharmaceuticals開(kāi)發(fā)的抗CD4抗 體，IDEC-114，一種正由 IDEC Pharmaceuticals 開(kāi)發(fā)的抗 CD80 抗體，IDEC-152，一種正由 IDEC Pharmaceuticals開(kāi)發(fā)的抗CD23抗體，正由IDEC Pharmaceuticals開(kāi)發(fā)的抗巨噬細(xì) 胞移動(dòng)因子(MIF)抗體，BEC2，一種正由Imclone開(kāi)發(fā)的抗獨(dú)特型抗體，IMC-1C11，一種正由 Imclone開(kāi)發(fā)的抗KDR抗體，DClOl，一種正由Imclone開(kāi)發(fā)的抗f Ik-I抗體，正由Imclone 開(kāi)發(fā)的抗VE鈣粘蛋白抗體，CEA-Cide (labetuzumab)，一種正由Immunomedics開(kāi)發(fā)的 抗癌胚抗原(CEA)抗體，LymphoCide (依帕珠單抗)，一種正由Immunomedics開(kāi)發(fā)的抗 CD22 抗體，正由 Immunomedics 開(kāi)發(fā)的 AFP-Cide,正由 Immunomedics 開(kāi)發(fā)的 MyelomaCide, 正由 Immunomedics 開(kāi)發(fā)的 LkoCide,正由 Immunomedics 開(kāi)發(fā)的 ProstaCide, MDX-010, 一 種正由Medarex開(kāi)發(fā)的抗CTLA4抗體，MDX-060，一種正由Medarex開(kāi)發(fā)的抗CD30抗體， 正由 Medarex 開(kāi)發(fā)的 MDX-070，正由 Medarex 開(kāi)發(fā)的 MDX-018，Osidem (IDM-I)，一種正 由 Medarex 和 Immuno-Designed Molecules 開(kāi)發(fā)的抗 Her2 抗體，HuMaX _CD4，一種正由Medarex和Genmab開(kāi)發(fā)的抗CD4抗體，HuMax_IL15，一種正由Medarex和Genmab開(kāi)發(fā)的 抗 IL-15 抗體，CNTO 148，一種正由 Medarex 和 Centocor/J&J 開(kāi)發(fā)的抗 TNF α 抗體，CNTO 1275，一種正由Centocor/J&J開(kāi)發(fā)的抗細(xì)胞因子抗體，MORlOl和M0R102，正由MorphoSys 開(kāi)發(fā)的抗細(xì)胞間粘附因子-I(ICAM-I)(⑶54)抗體，M0R201，一種正由MorphoSys開(kāi)發(fā)的 抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR-3)抗體，Nuvion(visilizumab)，一種正由Protein Design Labs開(kāi)發(fā)的抗CD3抗體，HuZAF ，一種正由Protein Design Labs開(kāi)發(fā)的抗γ干擾 素抗體，正由Protein Design Labs開(kāi)發(fā)的抗α 5 β 1整聯(lián)蛋白抗體，正由Protein Design Labs開(kāi)發(fā)的抗IL-12，ING-1，一種正由Xoma開(kāi)發(fā)的抗Ep-CAM抗體，以及MLN01，一種正由 Xoma開(kāi)發(fā)的抗β 2整聯(lián)蛋白抗體。應(yīng)用Fc變體于上述抗體及Fc融合體的臨床產(chǎn)物和候選物中不應(yīng)受它們明確組成 所約束。本發(fā)明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產(chǎn)物中，或摻入到基本上與它們類似 的抗體和Fc融合體中。本發(fā)明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產(chǎn)物的人源化的、親 和力成熟的、工程的或以一些其它方法修飾的型式中。此外，無(wú)需使用上述臨床產(chǎn)物和候選 物的完整多肽來(lái)構(gòu)建摻入本發(fā)明的Fc變體的新的抗體或Fc融合體；例如僅使用臨床產(chǎn)物 或候選物抗體的可變區(qū)，基本上相似的可變區(qū)，或可變區(qū)的人源化的、親和力成熟的、工程 的或修飾的型式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供抗體或Fc融合體使用，所述 抗體或Fc融合體能結(jié)合上述臨床產(chǎn)物和候選物之一的相同表位、抗原、配體或受體。本發(fā)明的Fc變體可供不同抗體和Fc融合體使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的 抗體或Fc融合體是一種治療、診斷或研究試劑，優(yōu)選是一種治療試劑?？蛇x地，本發(fā)明的 抗體和Fc融合體可用于農(nóng)業(yè)或工業(yè)用途。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體組 成可用實(shí)驗(yàn)方法篩選的文庫(kù)。該文庫(kù)可以是一列核苷酸或氨基酸序列，或可以是編碼文庫(kù) 序列的核酸或多肽的物理組合物。Fc變體可供單克隆或多克隆抗體組合物使用。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體可用于殺死具有靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌細(xì) 胞。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗(antagonize)或 激動(dòng)(agonize)靶抗原，例如用于拮抗細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗或?qū)拱锌乖⑺谰哂性摪锌乖?靶細(xì)胞。本發(fā)明的Fc變體可用于不同的治療目的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用Fc變體 蛋白質(zhì)于患者以治療與抗體相關(guān)的病癥。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，“患盍”包括人和其它動(dòng) 物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。因此本發(fā)明的抗體和Fc融合體可用于治療人和牲畜。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者是人。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“治療” 意指對(duì)于疾病或病癥包括治療性處理，也包括預(yù)防性或抑制性方法。因此，舉例來(lái)說(shuō)，在疾 病發(fā)作前成功施用抗體或Fc融合體以產(chǎn)生疾病治療作用。如其它實(shí)例，在疾病臨床表現(xiàn)后 成功施用優(yōu)化的抗體或Fc融合體以抗疾病癥狀，包含了疾病的治療?！爸委煛币舶诩膊?發(fā)作后施用優(yōu)化的抗體或Fc融合體蛋白質(zhì)以便根除疾病。在發(fā)作以及臨床癥狀發(fā)生后成 功地施用試劑，有可能消除臨床癥狀并改善疾病，包含了治療該疾病。那些“需要治療的”包 括已經(jīng)患有疾病或病癥的哺乳動(dòng)物，也包括那些易患疾病或病癥的那些，包括疾病或病癥 要得到預(yù)防的那些。本文中“抗體相關(guān)的病癥”或“抗體應(yīng)答的病癥”或“病癥”或“疾病”意 指通過(guò)施用包含本發(fā)明的抗體或Fc融合體的藥物組合物可得到改善的病癥?？贵w相關(guān)的病癥包括但不限于自身免疫性疾病、免疫性疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、和包括 癌癥的腫瘤件以及瘤形成疾病。本文中“癌癥”和“癌件的”指的是或描沭為哺乳動(dòng)物中的牛 理狀態(tài)，其一般通過(guò)未調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)得到鑒定。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚 細(xì)胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、腺瘤、黑素瘤以 及非白血性白血病或淋巴惡性腫瘤。上述癌癥更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(如，鱗狀上 皮細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌以及肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì) 胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺 癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲 狀腺癌、肝癌、肛門(mén)癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤，也包括頭癌和頸癌。此外，本發(fā)明 的Fc變體可用于治療的病癥包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤 瘡、濕疹、心肌炎和其它心肌病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞增生 以及骨髓基質(zhì)瘤；骨質(zhì)丟失；變形性骨炎(Paget’ sdisease)、破骨細(xì)胞瘤；多發(fā)性骨髓瘤、 乳腺癌、失用型骨質(zhì)減少；營(yíng)養(yǎng)不良、牙周病、家族性脾性貧血、朗罕氏細(xì)胞組織細(xì)胞增多 病、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、皮質(zhì)醇增多癥、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多發(fā) 性骨纖維性發(fā)育不良、牙周再建以及骨折；肉樣瘤??；多發(fā)性骨髓瘤；溶骨癌(osteolytic bone cancers)、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛治療和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直 性脊椎炎和其它脊椎關(guān)節(jié)??；移植排斥、病毒感染、血液瘤以及類瘤形成病癥例如何杰金氏 淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(Burkitt' s淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞性白血 病、蕈樣肉芽腫病、外套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性巨大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴 瘤、毛細(xì)胞性白血病以及淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞腫瘤、包括B細(xì)胞急性 成淋巴細(xì)胞性非白血性白血病/淋巴瘤、也T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性非白血性白血病/淋 巴瘤，胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞腫瘤，包括外周T細(xì)胞非白血性白血病、成熟T細(xì)胞非白血 性白血病/T細(xì)胞淋巴瘤以及大顆粒狀淋巴細(xì)胞性白血病、朗罕氏細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、諸 如急性骨髓性粒細(xì)胞性白血病的骨髓瘤形成，包括成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化 的急性骨髓性白血病、急性前髓細(xì)胞性白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病、和急性單核細(xì) 胞性白血病、脊髓發(fā)育不良綜合征、慢性骨髓增生病，包括慢性髓細(xì)胞性白血病、中樞神經(jīng) 系統(tǒng)腫瘤，如腦腫瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞 瘤和視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波氏肉瘤、睪 丸癌、子宮、陰道或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、以及血管系統(tǒng)腫瘤(血管肉 瘤和hemagiopericytoma)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、脊椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎 性腸疾病(IBD)、敗血癥和敗血癥性休克、節(jié)段性回腸炎、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病 (GVHD)、異源胰島移植排斥(allogenic islet graft rejection)、血液惡性腫瘤諸如多發(fā) 性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、腫瘤相關(guān)的炎癥、 周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘性病。 在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或Fc變體施用于患病的患者，所述疾病涉及 蛋白質(zhì)的不適當(dāng)表達(dá)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，其意指包括以異常蛋白質(zhì)為特征的疾病和病癥，例 如基于改變蛋白質(zhì)存在的數(shù)量、存在突變蛋白質(zhì)，或兩者的疾病或病癥。蛋白質(zhì)過(guò)量可基于 任何原因，包括但不限于在分子水平上過(guò)表達(dá)、在作用部位出現(xiàn)持續(xù)很久或蓄積、或相對(duì)于 正常增加了蛋白質(zhì)活性。以蛋白質(zhì)減少為特征的疾病和病癥也包括在該定義內(nèi)。所述減少可基于任何原因，包括但不限于在分子水平上減少的表達(dá)、在作用部位出現(xiàn)減小或減少、蛋 白質(zhì)的突變體形式、或相對(duì)于正常減少了蛋白質(zhì)活性。上述相對(duì)于蛋白質(zhì)正常表達(dá)、出現(xiàn)或 活性的蛋白質(zhì)過(guò)多或減少可得到測(cè)定，所述的測(cè)定在開(kāi)發(fā)和/或臨床試驗(yàn)本發(fā)明的抗體和 Fc變體中可扮演一個(gè)重要角色。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體僅作為治療活性劑施用于患者。可 選地，本發(fā)明的抗體或Fc融合體與一種或多種其它治療劑聯(lián)合施用，包括但不限于細(xì)胞毒 素劑、化學(xué)治療劑、細(xì)胞活素類、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管生成劑、保心藥 或其它治療劑。上述分子以合適的化合物形式和量存在，以有效地用于預(yù)期目的。有經(jīng)驗(yàn) 的醫(yī)師可憑經(jīng)驗(yàn)確定其它用于本文治療劑的合適劑量。本發(fā)明的抗體和Fc融合體可伴隨 一種或多種其它治療方案施用。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的抗體或Fc融合體隨同化學(xué)療法、放射 療法或兩者一起施用于患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可聯(lián)合一種或 多種可能包含或可能不包含本發(fā)明Fc變體的抗體或Fc融合體施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體與化學(xué)治療劑一起施用。本 文中使用的“4ii^iiiiM”意指在癌癥治療中使用的化合物。化學(xué)治療劑的實(shí)例包括 但不限于諸如硫替派和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide) (CYTOXAN )的烷基化劑；諸如 白消安、英丙舒凡和嗪消安的烷基磺酸鹽類；諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美 妥多巴(meturedopa)和烏瑞多巴(uredopa)的氮丙啶類；乙烯亞胺類和甲基蜜胺類 (methylamelamines)包括六甲密胺、三亞胺嗪、trietylenephosphoramide、三亞乙基硫化 磷酰胺和trimethylolomelamine ；氮芥類諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷 雌氮芥、異磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥鹽酸化物、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥膽甾醇、 潑尼莫司汀、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥；諸如卡氮芥、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫 司汀、雷莫司汀的硝脲類；諸如aclacinomysins、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博 來(lái)霉素、放線菌素C、刺孢霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔 紅霉素、地托比星、6-重氮基-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、 麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、派來(lái)霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、 三鐵阿霉素、羅比多星、鏈黑霉素、鏈唑霉素，殺結(jié)核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星 的抗生素；諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代謝物；諸如二甲葉酸、氨甲葉酸、蝶 酰三谷氨酸、曲美沙特的葉酸類似物；諸如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤的 嘌呤類似物；諸如鹽酸環(huán)胞苷、氮雜胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧 氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU的嘧啶類似物；諸如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、 美雄烷、睪內(nèi)酯的雄激素；諸如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦的抗腎上腺素；諸如frolinic acid的葉酸補(bǔ)充劑；乙酰葡醛酸內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基戊酮酸；安吖啶；bestrabucil ； 比山群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine ；依利醋銨；依托格魯；硝 酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他 丁 ；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰胼(2-ethyl hydrazide)；丙卡巴胼；PSK ; 雷佐生；施佐非蘭；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；烏拉坦； 長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine ；阿糖 胞苷(”Ara-C")；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N. J.)禾口紫杉蔽(TAXOTERE ,Rhne-Pou 1 enc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；諸如順鉬和卡鉬的鉬類似物；長(zhǎng)春堿；鉬；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng) 春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-Il ；拓 樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins ；卡培他濱；胸 腺嘧啶核苷酸合酶抑制劑(諸如拓優(yōu)得)；諸如celicoxib (CELBREX, MK-0966 (VIOXX ) 的cox-2抑制劑；以及任一上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在腫瘤上產(chǎn)生調(diào)節(jié)或抑 制激素結(jié)果的抗激素劑也包括于該定義中，諸如抗雌激素類包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、 抑制4 (5)-咪唑的芳香酶、4-羥泰米芬、曲沃昔芬、ke0Xifene、LY 117018，奧那司酮和托瑞 米芬(法樂(lè)通)；以及抗雄激素類諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞 林；以及任一上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物?；瘜W(xué)治療劑或其它細(xì)胞毒素劑可作為前藥施用。本文中使用的“·”意指藥學(xué)上 活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與母體藥物相比其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較小的細(xì)胞毒性，并且 可被酶活化或轉(zhuǎn)化為更具活性的母體形式。參見(jiàn)，例如Wilman，1986，Biochemical Society Transactions,615th Meeting Belfast,14 :375_382 ；禾口 Stella 等.，“Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery,Borchardt 等.，(ed.) =247-267,Humana Press，1985?？晒┍景l(fā)明使用的前藥包括但不限于含有磷酸 鹽前藥、含有硫代硫酸鹽前藥、含有硫酸鹽前藥、含肽前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前 藥、含有內(nèi)酰胺前藥、含有任選地取代的苯氧基乙酰胺前藥或含有任選地取代的苯乙 酰胺前藥、5-氟胞嘧啶和其它的5-氟脲嘧啶前藥，上述前藥能轉(zhuǎn)化為更具活性的細(xì)胞毒性 游離藥物。用于與本發(fā)明的抗體和Fc融合體一起使用并衍生自前藥形式的細(xì)胞毒性藥物 的實(shí)例包括但不限于任一上述化學(xué)治療劑。本發(fā)明的抗體和Fc融合體可結(jié)合其它治療方案。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，要用 抗體或Fc融合體治療的患者也可接受放射治療。放射治療可依據(jù)本領(lǐng)域所采用的和本領(lǐng) 域技術(shù)員所公知的常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。上述治療包括但不限于銫、銥、碘或鈷輻射。該放射 治療可全身照射，或可對(duì)體內(nèi)或體表上特定部位或組織局部定向照射，該特定部位或組織 例如肺、膀胱或前列腺。一般而言，放射治療每隔約1-2周時(shí)間以脈沖形式進(jìn)行。然而，放射 治療可間隔更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行。例如，對(duì)患有頭癌和頸癌的患者進(jìn)行放射治療可間隔約6-7周。 任選地，放射治療可以單劑量或多劑量、連續(xù)劑量的形式進(jìn)行。有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師可憑經(jīng)驗(yàn)確定 用于本文的放射治療的合適劑量。依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體或Fc融合 體以及一種或多種其它抗癌療法用于治療離體癌細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)預(yù)計(jì)到上述離體治療可應(yīng)用于 骨髓移植，以及具體地應(yīng)用于自體骨髓移植。舉例來(lái)說(shuō)，如上所述在受體患者中可用抗體或 Fc融合體與一種或多種其它抗癌療法治療含有癌細(xì)胞的細(xì)胞或組織，以在移植前排除或基 本上排除癌細(xì)胞。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)預(yù)計(jì)到本發(fā)明的抗體和Fc融合體還可與諸如外科手術(shù)的其它 治療技術(shù)聯(lián)合使用。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體與細(xì)胞因子一起施用。本文 中使用的“細(xì)胞因子”意指一種細(xì)胞群所釋放的對(duì)其它細(xì)胞起細(xì)胞間介質(zhì)作用的蛋白質(zhì)的 通稱。上述細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子、單核因子以及傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括諸如 人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨?；松L(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素的生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素； 胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)的糖蛋白激素；肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤 壞死因子-α和β ；苗勒氏抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；諸如NGF-β的神經(jīng)生長(zhǎng)因子；血小板生長(zhǎng)因 子；諸如RGF-α和TGF-β的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)；胰島素樣生長(zhǎng)因子_1和II ；促紅細(xì)胞 生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；諸如α、β、Υ-干擾素的干擾素；諸如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-CSF (CM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF (G-CSF)的集落刺激因子(CSFs)；諸如IL-1、 IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-15 的白 介素(ILs)；諸如TNF-α或THF-β的腫瘤壞死因子；以及其它多肽因子，包括LIF和試劑 盒配體(kit ligand)(KL)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括天然來(lái)源或重組細(xì)胞培 養(yǎng)基來(lái)源的蛋白質(zhì)，以及天然序列細(xì)胞因子生物學(xué)上的活性等價(jià)物。其它許多治療劑可供與本發(fā)明的抗體和Fc融合體一起施用。在一個(gè)實(shí)施方 案中，抗體或Fc融合體與抗血管生成劑一起施用。本文中使用的“抗血管生成劑”意 指一種可阻斷或以某種程度干擾血管發(fā)育的化合物。例如，抗血管生成因子可以是一 種小分子或蛋白質(zhì)，例如是一種抗體、Fc融合體或細(xì)胞因子，其能結(jié)合與血管發(fā)生有關(guān) 的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體。本文中優(yōu)選的抗血管生成因子是能結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子(VEGF)的一種抗體。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，抗體或Fc融合體與能誘導(dǎo)或增強(qiáng)獲 得性免疫應(yīng)答的治療劑一起施用，例如一種能靶向CTLA-4的抗體。在一個(gè)可選的實(shí)施 方案中，抗體或Fc融合體與酪氨酸激酶抑制劑一起施用。本文中使用的“酪氨酸激酶 抑制劑”意指一種在某種程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。上述抑制 劑的實(shí)例包括但不限于喹唑啉(quinazoline)，諸如PD153035，4_ (3_氯苯胺基)喹唑 啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，諸如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706 ； 吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并(2，3-d)嘧啶；姜黃素(curcumin)(姜黃素，4， 5_雙(4-氟代苯胺基)鄰苯二甲酰二胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制劑； PD-0183805 (Warner-Lambert)；反義分子(如，與ErbB編碼核酸結(jié)合的那些)；喹啉(US 5,804,396) ；tryphostins(US 5,804, 396) ；ZD6474(Astra Zeneca) ；PTK-787(Novartis/ Schering A G)；諸如 Cl-1033 (Pfizer)的全 ErbB 抑制劑；Affinitac (ISIS 3521 ； Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼(STI571，Gleevec Novartis) ；PKI166 (Novartis)； GW2016(GLAXO SmithKline) ；Cl-1033(Pfizer) ；EKB-569(Wyeth) ；Semaxinib(Sugen)； ZD6474 (AstraZeneca) ；PTK-787(Novartis/Schering AG) ；INC-I Cll(Imclone) ； 或如在下列任一專利申請(qǐng)中所述的抑制劑:US 5，804，396 ；PCT WO 99/09016 (American Cyanimid) ；PCT WO 98/43960 (American Cyanamid) ；PCT WO 97/38983(Warner-Lambert)； PCT WO 99/06378(Warner-Lambert) ；PCT WO 99/06396(Warner-Lambert) ；PCT WO 96/30347 (Pfizer,Inc) ；PCT WO 96/33978 (AstraZeneca) ；PCT W096/3397(AstraZeneca)； PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib(IRESSA , ZD1839, AstraZeneca),禾口 0SI-774(Tarceva , OSI Pharmaceuticals/Genentech)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體與另外的治療化合物偶聯(lián) 或可操作地連接。所述治療化合物可以是一種細(xì)胞毒素劑、化學(xué)治療劑、毒素、放射性同位 素、細(xì)胞因子或其它治療活性劑?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備抗體或Fc融合體 與細(xì)胞毒素劑的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰-3-(2-聯(lián)硫基吡啶)_丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰-4-(N-maleimid0methyl)環(huán)己烷-1-羧酸鹽、巰醇亞胺(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍 生物(諸如二甲基己二亞酰胺化氯化氫)、活化酯類(諸如二琥珀酰辛二酸鹽)、醛類(諸 如戊二醛)、二疊氮基化合物(諸如二(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二胺)、二重氮基衍生物 (諸如二 _ (對(duì)-重氮基苯甲?；?“乙二胺)、二異氰酸鹽類(諸如tolyene 2,6- 二異氰酸 鹽)以及雙活化氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2，4_ 二硝基苯)。例如，可根據(jù)Vitetta等.， 1971, Science 238 1098中所述方法制備蓖麻毒素免疫毒素。碳14標(biāo)記的1_異硫代氰氧 基芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的典 型的螯合劑(cheating agent) 0參見(jiàn)PCT WO 94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì) 胞毒類藥物的可裂解接頭。舉例來(lái)說(shuō)，可使用對(duì)酸敏感的接頭、對(duì)肽酶敏感的接頭、二甲基 接頭或含有二硫化物的接頭(Chari等·，1992，Cancer Research 52:127-131)?？蛇x地， 所述抗體或Fc融合體可操作地與治療劑連接，如通過(guò)重組技術(shù)或肽合成。如上已描述了用于偶聯(lián)到本發(fā)明抗體和Fc融合體上的化學(xué)治療劑。在一個(gè)可選 的實(shí)施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯(lián)到或可操作地連接到毒素上，包括但不限于小 分子毒素和細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。小分子 毒素包括但不限于刺孢毒素(calicheamicin)、美登素(US 5，208，020)、trichothene和 CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯(lián)到一種或多種美登素分 子上(如，每抗體分子約1-10個(gè)美登素分子)。例如，美登素也可轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，其 可還原為May_SH3并與修飾的抗體或Fc融合體反應(yīng)(Chari等.，1992，Cancer Research 52:127-131)以產(chǎn)生美登素_抗體或美登素-Fc融合體偶聯(lián)物。另一種感興趣的偶聯(lián)反 應(yīng)包含將抗體或Fc融合體偶聯(lián)到一種或多種刺孢毒素分子上。所述刺孢毒素抗生素家 族在亞皮摩爾濃度下能產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂物。可使用的刺孢毒素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不 限于 Y/、α 2\ α 3、N-乙?；?γ/、PSAG 禾口 G11, (Hinman 等.，1993，Cancer Research 53 3336-3342 ；Lode 等·，1998，Cancer Research 58 2925-2928)(US 5，714，586 ；US 5，712，374 ；US 5，264，586 ；US 5，773，001)。多拉司他汀(Dolastatin) 10 類似物，——如 可供本發(fā)明 Fc 變體偶聯(lián)使用的 auristatin E (AE)和 monomethylauristatin E(MMAE) (Doronina 等.,2003, Nat Biotechnol 21(7) 778-84 ；Francisco 等.,2003 Blood 102(4) :1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素非結(jié)合活性片 段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒 素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美國(guó)商陸蛋白(ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ 和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻瘋樹(shù)毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制物、白樹(shù)毒 素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及單端孢霉烯族毒素。參見(jiàn)，例如，PCT WO 93/21232。本發(fā)明也涉及一種本發(fā)明的抗體或Fc融合體與具有溶核活性的化合物形成的 偶聯(lián)物或融合體，所述化合物例如核糖核酸酶或諸如脫氧核糖核酸酶(Dnase)的DNA核酸 內(nèi)切酶。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可偶聯(lián)或可操作地連接放 射性同位素以形成放射性偶聯(lián)物。許多放射性同位素可用于產(chǎn)生抗體和Fc融合體的放射 性偶聯(lián)物。實(shí)例包括但不限于，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射 性同位素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可偶聯(lián)“受體”(諸如鏈霉抗生物素蛋白)用作為腫瘤前靶(pretargeting)，其中所述抗體-受體或Fc融合體-受體偶聯(lián)物 施用于患者，接著使用清除劑從循環(huán)系統(tǒng)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用偶聯(lián)細(xì)胞毒素 劑(如，放射性核苷酸)的“配體”(如，抗生物素蛋白)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述 抗體或Fc融合體偶聯(lián)或可操作地連接于酶以便進(jìn)行抗體依賴性酶介導(dǎo)前藥療法(ADEPT)。 ADEPT可通過(guò)將所述抗體或Fc融合體與前藥激活酶偶聯(lián)或可操作地連接而進(jìn)行，該前藥激 活酶可轉(zhuǎn)化前藥(如，肽?；瘜W(xué)治療劑，參見(jiàn)PCT WO 81/01145)為活化的抗癌藥物。參見(jiàn)， 例如PCT WO 88/07378和US 4，975，278。用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括任何能以 使得前藥轉(zhuǎn)化為更具活性、細(xì)胞毒性形式的這樣一種方式激活前藥的酶。用于本發(fā)明方法 中的酶包括但不限于用于將含有磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有 硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將無(wú)毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥 物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、 羧肽酶以及組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)的蛋白酶，其可用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化為游離 藥物(free drug) ；D-丙氨酰基羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代物的前藥；諸如β -半乳 糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶的糖裂解酶，用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；β "內(nèi)酰胺酶，用于 將α "內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素 G酰胺酶，用于將在其胺的氮原子處分別用苯氧基乙?；虮揭阴；〈苌乃幬镛D(zhuǎn)化 為游離藥物?？蛇x地，在本領(lǐng)域中也已知為“抗體酶(abzymes)”的具有酶活性的抗體可用 于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化為活性的游離藥(參見(jiàn)，例如Massey，1987，Nature 328 =457-458) 0 可制備抗體-抗體酶和Fc融合體_抗體酶偶聯(lián)物用于遞送抗體酶至腫瘤細(xì)胞群中。應(yīng)當(dāng) 預(yù)料到在本文中還有本發(fā)明抗體和Fc融合體的其它修飾。例如，所述抗體或Fc融合體可 連接有多種非蛋白質(zhì)聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇 的共聚物。 應(yīng)當(dāng)預(yù)料到用本發(fā)明抗體或Fc融合體與一種或多種治療活性劑配制的藥物 組合物。通過(guò)將所述具有所需純度的抗體或Fc融合體與任選的藥學(xué)上可接受載體、賦 形劑或穩(wěn)定劑混合制備用于存儲(chǔ)的本發(fā)明的抗體和Fc融合體的劑型(Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed.，1980)，為凍干劑型或水溶液形 式?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑所使用的劑量或濃度對(duì)于接受者是無(wú)毒的，包括緩沖液 諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐 劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯己雙銨、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、苯酚、丁基 orbenzyl醇、諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯的烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類、兒茶酚、雷瑣酚、環(huán) 己醇、3-戊醇以及間甲酚)；低分子量(低于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白；諸如聚乙烯吡咯酮的親水聚合物、諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 組氨酸、精氨酸或賴氨酸的氨基酸、單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精、諸如 EDTA的螯合劑、諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇的糖類、甜味劑和其它調(diào)味劑、諸如微晶 纖維素、乳糖、玉米及其它淀粉的充填劑、粘合劑、添加劑、著色劑、諸如鈉的成鹽反離子金 屬?gòu)?fù)合物(如鋅_蛋白質(zhì)復(fù)合物)和/或諸如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)的非 離子表面活性劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述包含本發(fā)明的抗體或Fc融合體的藥物組 合物以水溶形式存在，諸如以藥學(xué)上可接受的鹽存在，其意指包括酸和堿加成鹽?！八帉W(xué)上 可接受的酸加成鹽”指的是那些保持游離堿生物有效性且是非生物學(xué)或在其它方面不需要的鹽類，與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的無(wú)機(jī)酸以及諸如乙酸、丙酸、羥乙酸、丙 酮酸、草酸、馬來(lái)酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、枸櫞酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲 磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、水楊酸等的有機(jī)酸所加成的。“藥學(xué)上可接受的堿加成鹽”包括 那些衍生自諸如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等的無(wú)機(jī)堿類的那些。特別優(yōu)選的 是銨、鉀、鈉、鈣和鎂鹽。衍生自藥學(xué)可接受的有機(jī)無(wú)毒堿類包括伯、仲和叔胺、取代的胺包 括天然存在的取代的胺、環(huán)胺以及陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、 三丙胺和乙醇胺。用于體內(nèi)給藥的劑型優(yōu)選無(wú)菌的。通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜或其它方法可容易地 達(dá)到無(wú)菌目的。本文所公開(kāi)的抗體和Fc融合體也可配制為免疫脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種小的囊狀 體，包含不同類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑，用于遞送治療劑予哺乳動(dòng)物。通過(guò)諸如描 述于 Epstein 等.，1985，Proc Natl Acad Sci USA, 82 3688 ；Hwang 等.，1980，Proc Natl Acad Sci USA, 77 4030 ；US 4，485，045 ；US 4，544，545 ；和 PCT WO 97/38731 中的本領(lǐng)域公 知方法可制備含有所述抗體或Fc融合體的脂質(zhì)體。具有增強(qiáng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開(kāi)于 US5, 013，556。脂質(zhì)體的組分通常以雙分子層的形式排列，類似于生物膜的脂質(zhì)排列方式。 可將包含卵磷脂、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā) 法制備得到特別有用的脂質(zhì)體。通過(guò)具有確定孔徑的過(guò)濾器將脂質(zhì)體擠出以產(chǎn)生具有所 需直徑的脂質(zhì)體?；瘜W(xué)治療劑或其它治療活性劑可任選地包含于脂質(zhì)體中(Gabizon等.， 1989，J National Cancer Inst 81 :1484)。抗體、Fc融合體和其它治療活性劑也可包被于微膠囊中，通過(guò)包括但不限于凝聚 技術(shù)、界面聚合法(例如使用羥甲基豆素或明膠微膠囊或聚(甲基丙烯酸酯)微膠囊)、 膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微膠囊、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)以及粗乳狀 液(macroemulsion)的方法制備得至Li。上述技術(shù)公開(kāi)于Remington‘ s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed.，1980?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑合適的 實(shí)例包括固相疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)以成型制品的形式存在，如薄膜或微膠 囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙 烯醇))、聚交酯(US 3，773，919)、L-谷氨酸和鬩一 γ乙基-谷氨酸酯的共聚物、非降解乙 烯-醋酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注 射微球體)的可降解乳酸_乙醇酸共聚物、聚-D-(-)_3-羥基丁酸以及ProLease ,(可從 Alkermes購(gòu)得)，其是一種由所需生物活性分子摻入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基 質(zhì)組成的基于微球體的遞藥系統(tǒng)。在制劑中本發(fā)明的治療活性抗體或Fc融合體的濃度可從約0. 1變化為100重 量％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體或Fc融合體的濃度在0. 003-1. 0摩爾的范圍 內(nèi)。為了治療患者，可給予本發(fā)明的抗體或Fc融合體的治療有效劑量。本文中“治療有效 劑量”意指對(duì)于其所施用的能產(chǎn)生效果的劑量。精確的劑量將依賴于治療的目的，并可為 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用公知技術(shù)所確定。劑量范圍可為0.01-100mg/kg體重或更大，例 如0. 1、1、10或50mg/kg體重，優(yōu)選l-10mg/kg。如本領(lǐng)域所公知，對(duì)于抗體或Fc融合體降 解、全身性或局部性遞藥和新蛋白酶合成速率，以及年齡、體重、大致健康狀況、性別、飲食、 給藥時(shí)間、藥物相互作用以及病癥的嚴(yán)重程度而言，調(diào)整可以是必須的，并可由本領(lǐng)域那些 技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)確定。
包含本發(fā)明抗體或Fc融合體的藥物組合物優(yōu)選以無(wú)菌水溶液形式施用，可以 多種方法進(jìn)行，包括但不限于經(jīng)口、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、耳內(nèi)(intraotically)、經(jīng)皮、局 部(如凝膠劑、油膏劑、洗劑、霜?jiǎng)┑?、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)(如，AERx 吸入技術(shù)，購(gòu)自 Aradigm，或Inhance 肺遞藥系統(tǒng)，購(gòu)自Inhale Therapeutics)、經(jīng)陰道、腸胃外、經(jīng)直腸或 眼內(nèi)施用。在一些實(shí)例中，例如對(duì)于治療創(chuàng)傷、炎癥等而言，所述抗體或Fc融合體可直接以 溶液或噴霧劑的形式應(yīng)用。如本領(lǐng)域所公知，可依據(jù)導(dǎo)入方式相應(yīng)地配制所述藥物組合物。工程方法本發(fā)明提供了可用于產(chǎn)生Fc變體的工程方法。阻礙先前Fc工程嘗試的主要障礙 在于僅有隨機(jī)修飾已成為可能，部分是由于無(wú)效的工程策略及方法，以及由于抗體生產(chǎn)和 篩選的低通量特性。本發(fā)明描述了能克服這些缺陷的工程方法。涉及多種設(shè)計(jì)策略、計(jì)算 篩選方法、文庫(kù)產(chǎn)生方法和實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選方法。這些策略、途徑、技術(shù)和方法可單獨(dú)應(yīng)用 或以不同的組合方式應(yīng)用以設(shè)計(jì)優(yōu)化的Fc變體。設(shè)計(jì)策略產(chǎn)生對(duì)所需特性優(yōu)化的Fc變體的最有效方法是針對(duì)目的指導(dǎo)工程研究計(jì)劃。因 此，本發(fā)明教導(dǎo)了可用于設(shè)計(jì)優(yōu)化的Fc變體的設(shè)計(jì)策略。設(shè)計(jì)策略的使用意在指導(dǎo)Fc工 程改造，但基于用于設(shè)計(jì)Fc變體的設(shè)計(jì)策略，并不意在將其限制為特定的優(yōu)化特性。初一 想，其可能看來(lái)像是違反直覺(jué)，然而其有效性是得自可確定蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和功能的微妙相互作用的龐大的復(fù)雜性。盡管可盡力預(yù)測(cè)對(duì) 于設(shè)計(jì)目的而言重要的蛋白質(zhì)位置、殘基、相互作用等，但是時(shí)常地關(guān)鍵的某些因素卻無(wú)法 預(yù)測(cè)。通常無(wú)法預(yù)測(cè)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性以及功能的影響是否是有利的或不利 的。然而卻有無(wú)數(shù)的對(duì)蛋白質(zhì)有損或有害的氨基酸修飾存在。因此通常地，最好的工程方 法來(lái)自產(chǎn)生可通常聚焦于設(shè)計(jì)目的而不導(dǎo)致有害效應(yīng)的蛋白質(zhì)變體。因此，設(shè)計(jì)策略主要 的目標(biāo)在于產(chǎn)生特性多樣性(quality diversity)。在一個(gè)過(guò)分簡(jiǎn)單化的水平(simplistic level)上，其可被認(rèn)為是人們所偏愛(ài)的可能性的疊加。例如，對(duì)如下所述的Fc糖或特定的 結(jié)構(gòu)域_結(jié)構(gòu)域夾角的微擾，對(duì)于產(chǎn)生優(yōu)化的Fc變體而言是有效的設(shè)計(jì)策略，盡管事實(shí)上 無(wú)法充分理解糖和結(jié)構(gòu)域_結(jié)構(gòu)域夾角如何決定Fc的特性。減少有害氨基酸數(shù)量的修飾 即為篩選，即通過(guò)特性多樣性篩選，這些設(shè)計(jì)策略可具有實(shí)用性。因此本發(fā)明中所教導(dǎo)的設(shè) 計(jì)策略的真實(shí)價(jià)值在于它們能直接將工程研究計(jì)劃應(yīng)用于產(chǎn)生有價(jià)值的Fc變體。在實(shí)驗(yàn) 后可確定任一所產(chǎn)生變體的特定價(jià)值。提供了一種用于設(shè)計(jì)Fc變體的設(shè)計(jì)策略，其中在Fc與所述的Fc配體的界面上通 過(guò)設(shè)計(jì)氨基酸修飾改變了 Fc與一些Fc配體的相互作用。本文中Fc配體可包括但不限于 Fc y Rs、Clq、FcRn、蛋白A或G等。通過(guò)在能量方面探查位于對(duì)結(jié)合界面產(chǎn)生影響的Fc位 置的有利取代，可設(shè)計(jì)變體，對(duì)新的界面構(gòu)象采樣，其中一些與Fc配體的結(jié)合可得到改善， 一些與Fc配體的結(jié)合減少了，以及一些可具有其它有利特性。上述新的界面構(gòu)象起因可能 在于，例如，形成該界面的殘基與Fc配體的直接作用，或由于諸如側(cè)鏈或主鏈構(gòu)象微擾的 氨基酸修飾所引起的間接作用?？蛇x擇據(jù)信在確定界面的構(gòu)象中扮演重要角色的位置為可 變位置。例如，可選擇這樣一組殘基作為可變位置，該殘基與Fc配體直接接觸的任意殘基 在一定距離范圍內(nèi)，例如5埃(A)，優(yōu)選I-IOA0提供了一種用于產(chǎn)生Fc變體的額外設(shè)計(jì)策略，其中在N297的Fc糖構(gòu)象得到優(yōu)化。在上下文中使用的優(yōu)化意在包括N297糖構(gòu)象和組成的改變，其產(chǎn)生了所需特性， 例如增加或減少了對(duì)Fc γ R的親和力。通過(guò)所觀察到的糖結(jié)構(gòu)和構(gòu)象顯著地影響了 Fe/ Fc YR 以及 Fc/Clq 結(jié)合，支持了上述策略(Umana 等.，1999，Nat Biotechnol 17:176-180; Davies 等.，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Mimura 等.，2001，J Biol Chem 276 45539-45547. ；Radaev 等，2001，J Biol Chem 276 16478-16483 ；Shields 等.,2002, J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Shinkawa 等·，2003，J Biol Chem 278 :3466_3473)。但是， 該糖并不具體接觸Fc γ Rs。通過(guò)在能量方面探查對(duì)糖有影響的位置上的有利取代，可設(shè)計(jì) 變體的特性多樣性，對(duì)新的糖類構(gòu)象采樣，其中一些改善了與一種或多種Fc配體的結(jié)合， 但另一些減少了。雖然大多數(shù)接近Fe/糖界面的突變似乎改變了糖構(gòu)象，但是已顯示了一 些突變改變了糖基化組合物(Lund 等.，1996，J Immunol 157 :4963_4969 Jefferis 等.， 2002，Immunol Lett 82 :57_65)。提供了另一種用于產(chǎn)生Fc變體的設(shè)計(jì)策略，其中C γ 2和C γ 3結(jié)構(gòu)域之間的夾 角得到優(yōu)化。在上下文中使用的優(yōu)化意在描述C γ 2-C γ 3結(jié)構(gòu)域夾角的構(gòu)象改變，其產(chǎn)生 了所需特性，例如增加或減少了對(duì)Fc γ R的親和力。所述夾角是Fc/Fc y R親和力的重要 決定因素(Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16478-16483)，且許多 Fc/Fc γ R 界面遠(yuǎn) 端的突變通過(guò)調(diào)節(jié)該夾角而影響了結(jié)合的可能性(Shields等.，2001，J Biol Chem 276 6591-6604)。通過(guò)在能量方面探查在確定C γ 2-C γ 3夾角以及相對(duì)于彼此之間的結(jié)構(gòu)域柔 性中似乎扮演著一種關(guān)鍵角色的有利取代位置，可設(shè)計(jì)變體的特性多樣性，對(duì)新的夾角和 柔性水平采樣，對(duì)于所需Fc特性而言其中一些得到了優(yōu)化。提供了另一種用于產(chǎn)生Fc變體的設(shè)計(jì)策略，其中再改造Fc以消除對(duì)糖基化的結(jié) 構(gòu)與功能依賴性。該設(shè)計(jì)策略包括在缺乏Ν297糖的條件下優(yōu)化Fc結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和 /或Fc功能(例如Fc對(duì)一種或多種Fc配體的親和力)。在一種方法中，暴露于溶劑的位 置在缺乏糖基化的條件下得到改造，使它們穩(wěn)定、在結(jié)構(gòu)上與Fc結(jié)構(gòu)相容、且不具有聚集 的傾向。在抗體中C Υ2僅是未配對(duì)的Ig結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)圖1)。因此Ν297糖覆蓋了通常作 為蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)與其它Ig結(jié)構(gòu)域相互作用界面的暴露的疏水區(qū)，維持了 Fc穩(wěn)定性以及 結(jié)構(gòu)整體性，并阻止了 C Υ2結(jié)構(gòu)域越過(guò)中心軸的聚集。用于優(yōu)化非糖基化Fc的方法可包 括但不限于設(shè)計(jì)通過(guò)摻入在內(nèi)部面向C γ 2-C γ 2 二聚體軸的極性和/或荷電的殘基以增強(qiáng) 非糖基化Fc穩(wěn)定性和/或溶解性的氨基酸修飾，以及通過(guò)設(shè)計(jì)直接增加非糖基化Fc/Fc y R 界面或非糖基化Fc與其它一些Fc配體的界面的氨基酸修飾。提供了另一種用于設(shè)計(jì)Fc變體的設(shè)計(jì)策略，其中C Y2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象得到優(yōu)化。 在上下文中使用的優(yōu)化意在描述C γ 2結(jié)構(gòu)域夾角的構(gòu)象改變，其產(chǎn)生了所需特性，例如增 加或減少了對(duì)Fc γ R的親和力。通過(guò)在能量方面探查對(duì)C γ 2構(gòu)象發(fā)生影響的C γ 2位置上 的有利取代，可設(shè)計(jì)變體的特性多樣性，對(duì)新的C y 2構(gòu)象采樣，其中一些可達(dá)到設(shè)計(jì)目的。 上述新的C Y2構(gòu)象起因可能在于，例如，通過(guò)對(duì)變體采樣所得的可選的主鏈構(gòu)象?？蛇x擇 如任意位置的可變位置，據(jù)信在確定C Y2結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、柔性、功能等的過(guò)程中其 扮演著一種重要角色。例如，C γ 2疏水核心殘基，其是部分或全部地與溶劑隔絕的C γ 2殘 基，可得到再改造?？蛇x地，可考慮非核心(noncore)殘基，或認(rèn)為對(duì)決定主鏈結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性 或柔性重要的殘基。提供了另一種用于Fc優(yōu)化的設(shè)計(jì)策略，其中通過(guò)調(diào)節(jié)Fc與所述Fc配體之間的靜電作用的修飾改變了與Fc γ R、補(bǔ)體或其它一些Fc配體的結(jié)合。上述修飾可認(rèn)為是對(duì)Fc的 整體靜電特性的優(yōu)化，并包括了用荷電氨基酸取代中性氨基酸、用中性氨基酸取代荷電氨 基酸或用帶相反電荷(即反向電荷)的氨基酸取代荷電氨基酸。上述修飾可用于影響Fc 和一種或多種Fc配體之間的結(jié)合親和力的改變，所述Fc配體例如Fc y Rs。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，使用用于計(jì)算靜電勢(shì)的多種眾所周知的方法之一來(lái)選擇可影響結(jié)合的靜電取 代位置。在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，庫(kù)侖定律用于產(chǎn)生作為在蛋白質(zhì)中該位置功能的靜電勢(shì)。 另外的實(shí)施方案包括了使用德拜-休克爾標(biāo)度(Debye-Huckel scaling)來(lái)計(jì)算離子強(qiáng)度 的影響，以及在更復(fù)雜的實(shí)施方案中使用諸如泊松-玻耳茲曼(Poisson-Boltzmarm)計(jì)算。 上述靜電計(jì)算可使位置突出并暗示了可達(dá)到設(shè)計(jì)目的的特定氨基酸修飾。在某些情況下， 可預(yù)計(jì)這些取代對(duì)結(jié)合不同的Fc配體具有不同的影響，例如可增強(qiáng)與激活性的Fc y Rs的 結(jié)合，或減少對(duì)抑制性Fc y Rs的結(jié)合親和力。計(jì)算篩選在數(shù)量龐大的可能發(fā)生的修飾中預(yù)測(cè)何種氨基酸修飾能達(dá)到所需目的的過(guò)程 中，主要障礙是很難獲得有價(jià)值的Fc變體。實(shí)際上，對(duì)先前已失敗的產(chǎn)生具有重要臨 床價(jià)值Fc變體的Fc工程嘗試而言，一個(gè)主要的原因是迄今為止Fc工程方法都與嘗試 (hit-or-miss)方法相關(guān)。本發(fā)明提供了使Fc變體定量和系統(tǒng)工程改造成為可能的計(jì)算篩 選(computational screening)方法。這些方法通常使用原子水平打分函數(shù)、側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異 構(gòu)體采樣(side chain rotamer sampling)以及先進(jìn)的優(yōu)化方法以精確獲取蛋白質(zhì)序列、 結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系。計(jì)算篩選通過(guò)對(duì)產(chǎn)生的龐大多樣性過(guò)濾使探查靶位置完整序 列區(qū)的可能性能夠?qū)崿F(xiàn)。對(duì)于允許激活性Fc優(yōu)化以達(dá)到所需目的的穩(wěn)定的、合適的折疊以 及功能性序列而言，計(jì)算篩選變體文庫(kù)可有效地使之富集。因?yàn)橹丿B序列約束了蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和功能，而在文庫(kù)中大量候選物卻占據(jù)著“無(wú)用的”序列區(qū)。舉例來(lái)說(shuō)， 大部分序列區(qū)編碼未折疊、錯(cuò)誤折疊、無(wú)完全折疊、部分折疊或聚集的蛋白質(zhì)。其對(duì)于Fc工 程特別相關(guān)，因?yàn)镮g結(jié)構(gòu)域是小β片層結(jié)構(gòu)，已證實(shí)其的工程是非常必需的(Quirm等.， 1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :8747_8751 ；Richardson 等.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99 =2754-2759)。甚至看上去在β片層表面上無(wú)害的取代都能導(dǎo)致嚴(yán)重的堆積沖 突，明顯地破壞了折疊平衡(Smith等·，1995，Science 270 :980_982)；順便提及，丙氨酸是 一種最不利的β片層構(gòu)成者M(jìn)inor等.，1994，Nature 371 =264-267) 0 β片屋穩(wěn)定性和 特異性的決定因素是處于極大數(shù)量的微妙相互作用之間的一種微妙平衡。計(jì)算篩選能夠產(chǎn) 生主要由有效序列區(qū)組成的文庫(kù)，并因此增加了鑒定對(duì)設(shè)計(jì)目的優(yōu)化的蛋白質(zhì)的機(jī)率。事 實(shí)上計(jì)算篩選產(chǎn)生了增加的命中率，從而減少了應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法篩選的變體數(shù)量。Fc工程的 另外障礙是需要有效設(shè)計(jì)具相互關(guān)系或聯(lián)系的突變。例如，迄今為止所觀察到的具有最大 Fc/Fc y R親和力增加的是S298A/E333A/K334A，可通過(guò)將三種分別在丙氨酸掃描中得到的 較好突變結(jié)合而獲得之(Shields等.，2001，J Biol Chem 276:6591-6604)。計(jì)算篩選在 一次試驗(yàn)中就能產(chǎn)生上述三重變體而無(wú)須進(jìn)行三次單獨(dú)的試驗(yàn)，此外還能測(cè)試在那些位置 所有20種氨基酸而不僅是丙氨酸的功能性。計(jì)算篩選可通過(guò)將組合問(wèn)題減少到實(shí)驗(yàn)上所 能處理的數(shù)量以處理上述復(fù)雜性。從廣義上看，計(jì)算篩選具有四個(gè)步驟1)選擇并制備蛋白質(zhì)模板結(jié)構(gòu)，2)選擇 可變位置、在那些位置應(yīng)當(dāng)考慮的氨基酸和/或選擇旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體以模擬所考慮的氨基酸，3)計(jì)算能量，以及4)優(yōu)化組合。該計(jì)算篩選更詳細(xì)過(guò)程描述如下。將蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 作為起點(diǎn)(starting point)。鑒定要被優(yōu)化的位置，其可以是完整蛋白序列或其子集 (subset (s))0在每個(gè)位置上選擇所考慮的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)被考慮 的氨基酸可為具有稱為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的容許(allowed)構(gòu)象的離散集合所代表。計(jì)算所考慮 的每個(gè)氨基酸與其它所考慮的每個(gè)氨基酸之間、以及其與蛋白質(zhì)的其余部分，包括與該蛋 白質(zhì)主鏈和不變殘基之間相互作用能量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，計(jì)算所考慮的每個(gè)氨 基酸側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與其它所考慮的每個(gè)氨基酸側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(amino acid side chain rotamer)之間、以及其與蛋白質(zhì)的其余部分，包括與該蛋白質(zhì)主鏈和不變殘基之間相互作 用能量。接著用一或更多組合搜索算法來(lái)鑒定具有最低能量的序列和/或具有低能量的序 列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的計(jì)算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation (PDA )技術(shù)，該技術(shù)描述于 US 6，188，965 ；US 6，269，312 ；US 6，403，312 ； USSN 09/782, 004；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的計(jì)算篩選方法基本 上類似于 Sequence Prediction Algorithm (SPA )技術(shù)，該技術(shù)描述于(Raha 等.，2000， Protein Sci 9 1106-1119)、USSN 09/877，695 和 USSN 10/071，859 中。在另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所用的計(jì)算篩選方法描述于2003年3月3日提交的，標(biāo)題為“抗體優(yōu)化”的 USSN 10/339788中。在一些實(shí)施方案中，可使用不同計(jì)算篩選方法的組合，包括PDA. 技術(shù) 與SPA 技術(shù)的組合，也包括這些計(jì)算方法與其它設(shè)計(jì)工具的組合。同樣地，這些計(jì)算方法 可同時(shí)使用或以任一次序順序使用。模板結(jié)構(gòu)作為計(jì)算篩選計(jì)算的輸入量。本文中“樽板結(jié)構(gòu)”意指要被優(yōu)化的蛋白 質(zhì)的部分或全部結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。所述模板結(jié)構(gòu)可以是任何三維結(jié)構(gòu)(即，一組蛋白質(zhì)原子的三 維坐標(biāo))已公知或可計(jì)算、估計(jì)、模擬、創(chuàng)造或測(cè)定的蛋白質(zhì)。使用包括但不限于X-射線晶 體學(xué)技術(shù)、核磁共振(NMR)技術(shù)、從頭建模法以及同源建模法可測(cè)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。如 果對(duì)于沒(méi)有用實(shí)驗(yàn)方法解出結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而言優(yōu)化是所需的，那么可產(chǎn)生一種合適的結(jié)構(gòu) 模型以作為計(jì)算篩選計(jì)算的模板。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)同源模型的方法為本領(lǐng)域所公知，這些 方法可供本發(fā)明使用。參見(jiàn)例如，Luo，等· 2002，Protein Sci 11 :1218_1226，Lehmann和 Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4) :371_5· ；Lehmann 等·，2000，Biochim Biophys Acta 1543(2) :408_415 ;Rath 禾口 Davidson，2000，Protein Sci，9(12) 2457-69 ；Lehmann φ . ,2000, Protein Eng 13(1) :49_57 ;Desjarlais 禾口 Berg，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(6) 2256-60 ；Desjarlais 和 Berg,1992, Proteins 12(2) 101-4 ；Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54 :73_97 ;Henikoff 和 Henikoff，1994，J Mol Biol 243(4) :574-8 ;Morea 等，2000，Methods 20:267-269。使用對(duì)接(docking)方法也可獲得 蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合物?？勺鳛槟０褰Y(jié)構(gòu)的合適的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括但不限于，所有那些在 Protein Data Base 中所發(fā)現(xiàn)的，該P(yáng)rotein Data Base 數(shù)據(jù)庫(kù)為 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB，原來(lái)稱為 Brookhaven National Lab)所編輯禾口維 護(hù)。所述模板結(jié)構(gòu)可以是天然存在或工程蛋白質(zhì)的。所述模板結(jié)構(gòu)也可以是基本上為 來(lái)自任意生物體的蛋白質(zhì)所編碼的蛋白質(zhì)的，所述任意生物體優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。所述模板結(jié)構(gòu)可包含許多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)型的任意一種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述 模板結(jié)構(gòu)包含F(xiàn)c區(qū)或Fc結(jié)構(gòu)域或Fc片段。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述模板結(jié) 構(gòu)包含結(jié)合有一種或多種Fc配體的Fc或Fc結(jié)構(gòu)域或Fc片段，優(yōu)選為Fc/Fc y R復(fù)合體。 模板結(jié)構(gòu)中的Fc可糖基化或不糖基化。所述模板結(jié)構(gòu)可包含多于一條的蛋白鏈。所述模板 結(jié)構(gòu)可額外含有非蛋白質(zhì)組分，包括但不限于小分子、底物、輔因子、金屬、水分子、輔基、聚 合物以及糖。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述模板結(jié)構(gòu)是多個(gè)或一組模板蛋白質(zhì)，例如諸如 獲得自NMR的一組結(jié)構(gòu)?？蛇x地，所述一組模板結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生自一組相關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)，或 人工創(chuàng)建的結(jié)構(gòu)集合。所述組合物和模板結(jié)構(gòu)的來(lái)源基于工程目的。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于增加 人Fc/Fc y R親和力而言，人Fc/Fc y R復(fù)合體結(jié)構(gòu)或其衍生物可作為模板結(jié)構(gòu)?？蛇x地，非 組合的Fc結(jié)構(gòu)可作為模板結(jié)構(gòu)。如果所述目的是為了增加人Fc對(duì)小鼠Fc γ R的親和力， 則模板結(jié)構(gòu)可以是與小鼠Fc γ R結(jié)合的人Fc結(jié)構(gòu)或模型。在設(shè)計(jì)計(jì)算前可修飾或改變所述模板結(jié)構(gòu)。用于制備模板結(jié)構(gòu)的許多方法描述于 US 6，188，965 ；US 6，269，312 ；US 6，403，312 ；USSN 09/782，004 ；USSN 09/927，790 ；USSN 09/877, 695 ；USSN 10/071，859，USSN 10/218，102 ；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091 以 及PCT WO 02/25588中。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果其不包括在所述結(jié)構(gòu) 中，則可添加額外的氫原子。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化以釋放張力 (strain)，包括基于范德華沖突(clashes)、不利鍵角以及不利鍵長(zhǎng)的張力?？蛇x地，所述模 板結(jié)構(gòu)可用其它方法改變，諸如手動(dòng)地改變，包括受控或隨機(jī)微擾。也可在計(jì)算篩選后的步 驟中進(jìn)行模板修飾，包括能量計(jì)算以及組合優(yōu)化步驟。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述模板 結(jié)構(gòu)在計(jì)算篩選計(jì)算前或過(guò)程中不被修飾。一旦獲得模板結(jié)構(gòu)，可變位置就被選定。本文中“可變位置”意指在計(jì)算篩選計(jì)算 中氨基酸同一性允許得到改變的位置。如本領(lǐng)域所公知，僅在某些可變位置上允許考慮氨 基酸修飾，可減少計(jì)算的復(fù)雜性并使計(jì)算篩選能更直接適應(yīng)設(shè)計(jì)目的。在計(jì)算篩選中一種 或多種殘基可位于可變位置。選定作為可變位置的位置可以是有助于或推測(cè)有助于要優(yōu)化 的蛋白質(zhì)特性的那些，所述蛋白質(zhì)特性例如對(duì)Fc γ R的Fc親和力、Fc穩(wěn)定性、Fc溶解性等 等?？勺兾恢蒙系臍埢鶎?duì)特定的蛋白質(zhì)特性可有利亦可不利。例如，位于Fc/Fc γ R界面處 的殘基與介導(dǎo)結(jié)合相關(guān)，因此該位置在設(shè)計(jì)計(jì)算中可改變旨在提高Fc/Fc γ R親和力。如另 一實(shí)例，具有暴露疏水側(cè)鏈的殘基可能是導(dǎo)致不利聚集的原因，因此在設(shè)計(jì)計(jì)算中該位置 可改變旨在增加溶解性?？勺兾恢每梢允桥c作為特定蛋白質(zhì)特性決定因素的相互作用直接 相關(guān)的那些位置。例如，F(xiàn)c的Fc γ R結(jié)合位點(diǎn)可規(guī)定為包括能接觸特定Fc γ R的所有殘基。 本文中“_”意指在Fc殘基的至少一個(gè)原子與所結(jié)合的Fc γ R的至少一個(gè)原子之間的某 些化學(xué)相互作用，所具有的化學(xué)相互作用包括但不限于范德華相互作用、氫鍵相互作用、靜 電相互作用以及疏水相互作用。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，可變位置可包括與蛋白質(zhì)性質(zhì) 間接相關(guān)的那些位置，即上述位置可鄰近于已知或推測(cè)有助于Fc性質(zhì)的殘基。例如，F(xiàn)c的 Fc γ R結(jié)合位點(diǎn)可規(guī)定為包括所有位于特定距離內(nèi)的Fc殘基，例如4-1(^ (^1 范德華接觸 內(nèi)的任一 Fc殘基。因此在該情況下，不但可選擇直接與Fc γ R接觸的殘基作為可變位置， 也可選擇與接觸Fc γ R的殘基接觸并因此間接影響結(jié)合的那些作為可變位置。所述特定位 置的選定依賴于所要采用的設(shè)計(jì)策略。在模板結(jié)構(gòu)中一個(gè)或多個(gè)不是可變的位置可以是漂浮的(floated)。本文中“湩浮位置“意指在計(jì)算篩選計(jì)算中于此允許改變氨基酸構(gòu)象而非氨基酸同一性的位置。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述漂浮位置可具有親本氨基酸同一性。例如，漂浮位置可位于與可變位置 殘基具有極小距離內(nèi)的位置，例如5A。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，漂浮位置可具有非親本氨 基酸同一性。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)目的是為了評(píng)估特定突變的能量或結(jié)構(gòu)結(jié)果時(shí)，上述實(shí)施方案可 供本發(fā)明。既不是可變的位置也不是漂浮的位置的那些位置稱為固定的(fixed)位置。本文 中“M^^”意指在計(jì)算篩選計(jì)算中于此氨基酸同一性和構(gòu)象保持不變的位置?？梢允?固定的位置包括與所要優(yōu)化的性質(zhì)不相關(guān)的已知或推測(cè)的殘基。在該情況下，推測(cè)通過(guò)改 變這些位置，幾乎不會(huì)或完全不會(huì)獲得所要優(yōu)化的性質(zhì)。固定位置也可包括已知或推測(cè)該 處殘基對(duì)維持固有的折疊、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和/或生物學(xué)功能起重要作用的位置。例 如，對(duì)于與特定Fc配體相互作用的殘基或編碼糖基化位點(diǎn)的殘基而言，位置可以是固定的 以便確保與Fc配體的結(jié)合及適當(dāng)?shù)奶腔髯圆皇芪_。同樣地，如果穩(wěn)定性得到優(yōu)化， 其可有益于使直接或間接與諸如Fc γ R的Fc配體相互作用的位置固定，使得結(jié)合不受微 擾。固定位置也可包括結(jié)構(gòu)上重要的殘基，諸如二硫鍵中的半胱氨酸，對(duì)于決定主鏈構(gòu)象而 言起關(guān)鍵作用的殘基，如脯氨酸或甘氨酸，關(guān)鍵的氫鍵結(jié)合殘基以及形成有利堆積相互作 用的殘基。在計(jì)算篩選中下一個(gè)步驟是在每個(gè)特定可變位置選擇一組考慮認(rèn)為可能的氨基 酸同一性。在可變位置的該組可能的氨基酸在本文中稱為“考虎的氨基酸”。本文中使用 的“a^M”指20種天然氨基酸和任何非天然或合成類似物的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，考 慮到所有20種天然氨基酸?？蛇x地，在給定的可變位置上也考慮氨基酸的子集或甚至僅考 慮一種氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)員應(yīng)當(dāng)理解，在可變位置上僅考慮特定氨基酸的同一性有利于 計(jì)算，因?yàn)槠錅p少了搜尋的組合復(fù)雜性。此外，在可變位置上僅考慮特定氨基酸可適用于針 對(duì)特定設(shè)計(jì)策略的計(jì)算。例如，對(duì)于優(yōu)化非糖基化Fc穩(wěn)定性而言，在糖基化不存在情況下 暴露于溶劑的非極性Fc殘基處僅允許考慮極性氨基酸是有利于計(jì)算的。非天然氨基酸，包 括合成的氨基酸以及天然氨基酸的類似物，也可以是考慮的氨基酸。例如參見(jiàn)，Chiri等.， 2003, Science, 301 (5635) :964_7 ；和 Chin 等.，2003，Chem Biol. 10(6) :511_9。許多方法可單獨(dú)或組合地使用以選擇在每個(gè)位置上應(yīng)當(dāng)考慮的氨基酸。舉例來(lái) 說(shuō)，可基于暴露于溶劑的程度來(lái)選擇在給定可變位置處考慮的氨基酸組。疏水或非極性氨 基酸通常位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部或核內(nèi)(core)，其難以接近或幾乎難以接近溶劑。因此在核 內(nèi)可變位置，有利之處在于可僅考慮或主要考慮非極性氨基酸，諸如丙氨酸、纈氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。親水或極性氨基酸通常位于蛋白 質(zhì)的外部或表面，其具有顯著程度的溶劑可及性。因此在可變表面位置，有利之處在于可 僅考慮或主要考慮極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸以及組氨酸。某些位置是部分暴露或部分埋藏的，無(wú)法明確是 蛋白質(zhì)核內(nèi)或表面位置，在某種意義上作為位于核內(nèi)與表面殘基之間的邊界殘基。因此在 上述可變邊界位置，有利之處在于可同時(shí)考慮非極性和極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸?？赏ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù) 人員主觀評(píng)價(jià)或圖像檢查(visual inspection)模板結(jié)構(gòu)來(lái)確定可變位置處溶劑暴露的程度，或可通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的多種算法進(jìn)行之。通過(guò)計(jì)算方法，諸如計(jì)算溶劑可及表 面區(qū)域或使用評(píng)估相對(duì)于溶劑可及表面的Ca -C β向量方向的算法，可輔助或完全決定可 變位置所要考慮的氨基酸類型的選擇，上述計(jì)算方法概述于US 6，188，965 ；6, 269，312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091和PCTWO 02/25588中。在一個(gè)實(shí)施方案，每個(gè)可變位置可明確地分類為 核內(nèi)、表面或邊界位置，或是基本上類似于核內(nèi)(core)、表面或邊界的分類。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，允許在可變位置通過(guò)假設(shè)驅(qū)動(dòng)一組氨基酸的選擇。由 于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)主觀評(píng)價(jià)或圖像檢查模板結(jié)構(gòu)，所以應(yīng)當(dāng)考慮在 可變位置所假設(shè)的氨基酸類型。例如，如果推測(cè)在可變位置氫鍵相互作用有利，則可考慮具 有形成氫鍵能力的極性殘基，即使該位置位于核內(nèi)。同樣地，如果猜測(cè)在可變位置疏水堆積 相互作用有利，則可考慮具有形成有利堆積相互作用的非極性殘基，即使該位置在表面上。 其它通過(guò)假設(shè)驅(qū)動(dòng)方法的實(shí)例可涉及主鏈柔性或蛋白質(zhì)折疊的結(jié)果。本領(lǐng)域公知某些殘 基，例如脯氨酸、甘氨酸以及半胱氨酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性中起重要作用。較所有其它氨 基酸而言，甘氨酸能加強(qiáng)主鏈柔性，脯氨酸對(duì)主鏈的約束超過(guò)了所有其它氨基酸，以及半胱 氨酸可形成二硫鍵。因此，包括一種或多種這些氨基酸類型可有利于實(shí)現(xiàn)所需的設(shè)計(jì)目的。 可選地，從所考慮的氨基酸列表中排除一種或多種這些氨基酸類型也是有利于實(shí)現(xiàn)所需的設(shè)計(jì)目的。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，氨基酸的子集可被選擇以使覆蓋范圍最大化。在該情 況下，在可變位置可考慮具有類似于模板結(jié)構(gòu)中氨基酸性質(zhì)的額外氨基酸。例如，如果模板 結(jié)構(gòu)中可變位置的所述殘基是大疏水殘基。則在該位置可考慮額外的大疏水氨基酸。可選 地，氨基酸的子集可被選擇以使多樣性最大化。在該情況下，在可變位置可考慮具有不同于 模板結(jié)構(gòu)中那些氨基酸性質(zhì)的氨基酸。例如，如果模板結(jié)構(gòu)中可變位置的所述殘基是大疏 水殘基，則可考慮小疏水性、極性等的氨基酸。本領(lǐng)域公知在設(shè)計(jì)計(jì)算過(guò)程中，一些計(jì)算篩選方法僅需要確定所考慮氨基酸的同 一性。即，不需要關(guān)于所述氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象或可能構(gòu)象的信息。其它優(yōu)選的方法利用了 一組離散的側(cè)鏈構(gòu)象，稱為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，其對(duì)于每個(gè)氨基酸而言是要考慮的。因此，在每個(gè) 可變和漂浮位置可考慮一組旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體可獲得自公開(kāi)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)(參 見(jiàn)例如，Lovel 等.，2000，Proteins Structure Function and Genetics 40 :389_408 ； Dunbrack 禾口 Cohen,1997, Protein Science 6 :1661_1681 ；Demaeyer 等.,1997, Folding and Design 2 53-66 ；Tuffery φ . ,1991, J Biomol Struct Dyn 8 1267—1289，Ponder 禾口 Richards, 1987, J Mol Biol 193:775-791)。本領(lǐng)域公知旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)可以是不依賴 于主鏈的或依賴于主鏈的。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體也可獲得自分子力學(xué)或從頭計(jì)算，以及使用其它方 法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了一種柔性旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型(參見(jiàn)Mendes等.，1999， Proteins Structure,Function,and Genetics 37:530—543)。同樣地，可使用人工產(chǎn)生的 旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，或?qū)τ诿總€(gè)氨基酸和/或可變位置擴(kuò)大所設(shè)置的選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，至 少一種不是能量低的構(gòu)象包括于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體列中。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，模板結(jié)構(gòu)中 可變位置殘基的所述旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體包括于該可變位置許可的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體列中。在一個(gè)可選的 實(shí)施方案中，僅提供了在可變位置所考慮的每個(gè)氨基酸的同一性，在設(shè)計(jì)計(jì)算過(guò)程中并不 使用每個(gè)氨基酸的特定構(gòu)象態(tài)。即，對(duì)于計(jì)算篩選而言，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的使用不是必需的。
實(shí)驗(yàn)信息可用于指導(dǎo)可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選擇。 本領(lǐng)域公知誘變實(shí)驗(yàn)通常用于確定在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中某些殘基的作用，例如，哪幾個(gè) 蛋白質(zhì)殘基在決定穩(wěn)定性中起作用，或哪幾個(gè)殘基構(gòu)成了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的界 面。獲得自上述實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在本發(fā)明中是有用的。例如，對(duì)于增加Fc/Fc γ R親和力而言， 可變位置可包括其上突變已顯示能影響結(jié)合的可變的所有位置。同樣地，上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 可用于指導(dǎo)在可變位置所容許的氨基酸類型的選擇。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些類型的氨基酸取 代是有利的，可考慮相似類型的那些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在可變位置可考慮額外氨 基酸，其具有類似于那些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)是有利的氨基酸的性質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，如果在Fc/Fc y R 界面可變位置的根據(jù)實(shí)驗(yàn)突變?yōu)榇笫杷畾埢徽J(rèn)為是有利的話，那么在計(jì)算篩選中，使用 者可選擇在該位置包括額外的大疏水氨基酸。本領(lǐng)域公知展示和其它選擇技術(shù)可結(jié)合隨機(jī) 誘變以產(chǎn)生一列或多列對(duì)所選定特性有利的氨基酸取代。獲得自上述實(shí)驗(yàn)工作中的上述一 列或數(shù)列氨基酸取代可供本發(fā)明使用。例如，在上述實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的不變位置在計(jì)算篩選 計(jì)算中可排除作為可變位置，反之發(fā)現(xiàn)能更容易接受突變或能順利響應(yīng)突變的位置可選擇 作為可變位置。同樣地，來(lái)自上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可用于指導(dǎo)在可變位置所容許的氨基酸類型 的選擇。例如，如果某些類型的氨基酸在實(shí)驗(yàn)淘選中出現(xiàn)更頻繁，可考慮那些氨基酸的相似 類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，在可變位置可考慮額外的氨基酸，其具有類似于那些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 是有利的氨基酸的性質(zhì)。例如，如果在位于Fc/Fc y R界面的可變位置所選擇的突變被發(fā)現(xiàn) 是不荷電的極性氨基酸，使用者可選擇在該位置上包括額外的不荷電的極性氨基酸，或可 能包括荷電的極性氨基酸。序列信息也可用于指導(dǎo)可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選 擇。本領(lǐng)域公知一些蛋白質(zhì)具有共同的結(jié)構(gòu)骨架(scaffold)以及在序列上是同源的。該 信息可用于獲得對(duì)蛋白質(zhì)家族中特定位置的了解。本領(lǐng)域公知序列比對(duì)通常用于確定哪幾 個(gè)蛋白質(zhì)殘基是保守的以及哪幾個(gè)是非保守的。換言之，通過(guò)蛋白質(zhì)序列的比較和對(duì)比比 對(duì)，可觀察到位置上的可變性程度，亦可觀察到位置上天然出現(xiàn)的氨基酸類型。獲得自上述 分析的數(shù)據(jù)在本發(fā)明中是有用的。使用序列信息來(lái)選擇可變位置及在可變位置所考慮的氨 基酸的好處具有幾方面。對(duì)于可變位置的選擇而言，使用序列信息主要的優(yōu)點(diǎn)在于可獲得 對(duì)哪幾個(gè)位置是更能容許突變以及哪幾個(gè)位置是較少容許突變的了解。因此序列信息可幫 助確保特性多樣性，即對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性等無(wú)害的突變?cè)谟?jì)算上被采樣。所述相同的優(yōu) 點(diǎn)適用于在可變位置使用序列信息來(lái)選擇所考慮的氨基酸類型。即，出現(xiàn)在蛋白質(zhì)序列比 對(duì)中的氨基酸組可視為根據(jù)進(jìn)化預(yù)篩選的，對(duì)于與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、功能等 的相容性而言，其較隨機(jī)篩選的具有更高機(jī)率。因此更高的特性多樣性在計(jì)算上被采樣。在 可變位置使用序列信息來(lái)選擇所考慮的氨基酸類型的第二種好處是某些比對(duì)可提供較隨 機(jī)序列可具有較小免疫原性的序列。舉例來(lái)說(shuō)，如果在給定可變位置所考慮的氨基酸是在 人蛋白質(zhì)序列比對(duì)中在該位置所出現(xiàn)的氨基酸組，則那些氨基酸可視為根據(jù)性質(zhì)(nature) 預(yù)篩選的，如果所述優(yōu)化的蛋白質(zhì)用作為人治療劑，則那些氨基酸用于不產(chǎn)生或產(chǎn)生低的 免疫應(yīng)答。序列的來(lái)源可廣泛多變，包括一種或多種已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括但不限于Kabat數(shù) 據(jù)庫(kù)(Johnson 和 Wu，2001 ,Nucleic Acids Res 29:205-206 Johnson 和 Wu，2000，Nucleic Acids Res 28 :214_218)、IMGT 數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT，the international ImMunoGeneTicsinformation system ； Lefranc 等.,1999, Nucleic Acids Res 27 :209_212 ；Ruiz φ.,2000 Nucleic Acids Re. 28 219~221 ；Lefranc φ . ,2001, Nucleic Acids Res 29: 207-209 ；Lefranc 等·，2003，Nucleic Acids Res 31:307-310)和 VBASE、SwissProt、 GenBank和Entrez、以及EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)序列信息可獲得自、編譯自和/ 或產(chǎn)生自來(lái)自任意生物體的天然存在的蛋白質(zhì)的序列比對(duì)，所述生物體包括但不限于哺乳 動(dòng)物。蛋白質(zhì)序列信息可獲得自私人編譯的數(shù)據(jù)庫(kù)。在本領(lǐng)域中公知眾多基于序列的比對(duì) 程序和方法，所有的這些程序和方法可供本發(fā)明使用以產(chǎn)生包含F(xiàn)c和Fc配體的蛋白質(zhì)的 序列比對(duì)。一旦進(jìn)行了比對(duì)，序列信息可用于指導(dǎo)可變位置的選擇。上述序列信息可固有地 或以其它方式涉及所給定位置的可變性。本文中的可變性應(yīng)區(qū)別于可變位置?？勺冃灾冈?序列比對(duì)中在所給定位置出現(xiàn)的氨基酸類型顯示出的變化程度?？勺兾恢茫俅沃厣?，是使 用者所選擇的在計(jì)算篩選計(jì)算過(guò)程中以改變氨基酸同一性的位置?？勺冃钥蔀樯镄畔?學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所定性確定。也有為本領(lǐng)域所公知的定量確定可變性的方法，其可供本 發(fā)明使用。最優(yōu)選的實(shí)施方案測(cè)量了信息熵(Information Entropy)或香農(nóng)熵(Shannon Entropy)。可變位置可基于獲得自密切相關(guān)的蛋白質(zhì)序列或較不密切相關(guān)的序列的序列信 息以選擇。使用序列信息來(lái)選擇可變位置可廣泛地供本發(fā)明使用。例如，如果在模板結(jié)構(gòu) 中Fc/Fc γ R界面位置是色氨酸，且在比對(duì)中觀察到在多于90%的序列中色氨酸位于該位 置，可能有益于該位置的固定。反之，如果發(fā)現(xiàn)另一個(gè)界面位置具有較高水平的可變性，例 如如果在該位置觀察到五種不同的氨基酸，每種具有大約20%的頻率，則該位置可被選擇 作為可變位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)排列的蛋白質(zhì)序列的圖像檢查可取代或有助于對(duì) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖像檢查。序列信息也可用于在可變位置指導(dǎo)所考慮的氨基酸的選擇。上 述序列信息可涉及在給定的位置一個(gè)氨基酸、多個(gè)氨基酸或氨基酸類型(例如極性或非極 性、荷電或不荷電)固有地或以其它方式出現(xiàn)的頻率的多少。在一個(gè)實(shí)施方案中，在可變 位置所考慮的氨基酸組可包含在比對(duì)中在該位置所觀察到的氨基酸組。因此，在計(jì)算篩選 計(jì)算中所述位置特異性比對(duì)信息可直接用于產(chǎn)生在可變位置上所考慮的氨基酸列。上述 策略為本領(lǐng)域眾所周知；參見(jiàn)例如Lehmann和Wyss，2001，Curr Opin Biotechnol 12(4) 371-5 ；Lehmann φ . ,2000, Biochim Biophys Acta 1543(2) :408_415 ;Rath 禾口 Davidson， 2000，Protein Sci，9(12) :2457_69 ；Lehmann 等.，2000，Protein Eng 13(1) :49_57 ； Desjarlais禾口Berg，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(6) :2256_60 ；Desjarlais禾口Berg， 1992, Proteins 12(2) : 101-4 ;Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff 和 Henikoff，1994，J Mol Biol 243(4) :574_8。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，在一 個(gè)或多個(gè)可變位置所考慮的氨基酸組可包含于比對(duì)中最頻繁觀察到的氨基酸組。因此，特 定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于在確定是否氨基酸或氨基酸類型的頻率能證明其包含于該氨基酸組中，所述 氨基酸組為可變位置上所考慮的。本領(lǐng)域公知在比對(duì)中使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)計(jì)算在任一位置 序列多樣性以及在某一位置每個(gè)氨基酸出現(xiàn)的頻率或概率，可對(duì)序列比對(duì)分析。接著，上述 數(shù)據(jù)可用于確定哪幾種氨基酸類型要考慮。在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)一個(gè)比對(duì)位置 所觀察到的一種氨基酸次數(shù)的數(shù)量計(jì)數(shù)，然后除以該比對(duì)中的序列的總數(shù)而計(jì)算出這些出 現(xiàn)頻率。在其它的實(shí)施方案中，通過(guò)多種可能的機(jī)制對(duì)每個(gè)序列、位置或氨基酸對(duì)計(jì)數(shù)程序的貢獻(xiàn)進(jìn)行權(quán)重(weighted)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)在所述比對(duì)中相對(duì)于其它序 列的其多樣性權(quán)重進(jìn)行每個(gè)比對(duì)序列對(duì)頻率統(tǒng)計(jì)的貢獻(xiàn)的權(quán)重。用于實(shí)現(xiàn)該目的的常用策 略是 Henikoff 和 Henikoff (Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff和Henikoff，1994，J Mol Biol 243:574-8)所推薦的序列權(quán)重系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述每個(gè)序列對(duì)所述統(tǒng)計(jì)表的貢獻(xiàn)依賴于其對(duì)靶序列的相似性程度，即 所使用的模板結(jié)構(gòu)，使得對(duì)該靶序列具有更高相似性的序列得到更高的權(quán)重。相似性測(cè)量方法的實(shí)例包括，但不限于，序列同一性、BLOSUM相似性打分、PAM矩陣相似性打分和BLAST 打分。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述每個(gè)序列對(duì)統(tǒng)計(jì)表的貢獻(xiàn)依賴于其已知的物理或功 能特性。這些特性包括但不限于熱和化學(xué)穩(wěn)定性、活性的貢獻(xiàn)以及溶解性。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)優(yōu) 化非糖基化Fc的溶解性時(shí)，在比對(duì)中的那些序列應(yīng)當(dāng)是已知最能溶解的(例如參見(jiàn)Ewert 等.，2003，] 01 Biol 325 :531-553)，可對(duì)所計(jì)算的頻率貢獻(xiàn)更多。在序列比對(duì)中無(wú)論什么標(biāo)準(zhǔn)在可變位置用于選擇所考慮的氨基酸組，使用序列信 息來(lái)選擇考慮的氨基酸可廣泛地應(yīng)用于本發(fā)明中。例如，通過(guò)置換暴露的非極性表面殘基 以優(yōu)化Fc溶解性，所考慮的氨基酸可被選擇作為氨基酸組，或那些符合某一標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸 的子集，就是在蛋白質(zhì)序列比對(duì)中在該位置所觀察到的。作為另一個(gè)實(shí)例，可主觀地對(duì)源自 序列比對(duì)的一列氨基酸添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸以最大化覆蓋范圍。例如，在可變位 置可考慮具有類似于那些在序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的性質(zhì)的額外氨基酸。例如，如果在 序列比對(duì)中觀察到已知的或推測(cè)能結(jié)合Fc γ R的Fc位置具有不荷電的極性氨基酸，則在計(jì) 算篩選計(jì)算中使用者可選擇在該位置以包括額外不荷電的極性氨基酸，或荷電的極性氨基 酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，將序列比對(duì)信息與能量計(jì)算組合，討論如下。例如，擬能量 (pseudo energies)可源自產(chǎn)生打分函數(shù)的序列信息。使用基于序列的打分函數(shù)可明顯有 助于減少計(jì)算的復(fù)雜性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解單獨(dú)使用基于序列的打分函數(shù)可 能是不適當(dāng)?shù)?，因?yàn)樵谕蛔冎g序列信息通常顯示易誤解的相互關(guān)系，在實(shí)際上可導(dǎo)致結(jié) 構(gòu)上的不一致。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單獨(dú)使用基于結(jié)構(gòu)的能量計(jì)算方法或與基 于序列的打分函數(shù)組合使用。即，優(yōu)選的實(shí)施方案并不單獨(dú)依賴于序列比對(duì)信息作為分析 步驟。能量計(jì)算涉及氨基酸修飾打分方法。通過(guò)一種或多種打分函數(shù)，相互作用的能量 得到測(cè)量。多種打分函數(shù)可供本發(fā)明用于計(jì)算能量。打分函數(shù)可包括許多勢(shì)(potentials)， 在本文中稱為打分函數(shù)的能項(xiàng)，包括但不限于范德華勢(shì)、氫鍵勢(shì)、原子溶劑化勢(shì)或其它溶劑 化勢(shì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向勢(shì)、靜電勢(shì)、扭角勢(shì)和熵勢(shì)。至少一種能項(xiàng)被用于對(duì)每個(gè)可變或漂浮位 置打分，盡管取決于所述位置、所考慮的氨基酸以及其它需要考慮的事項(xiàng)，所述能項(xiàng)可能不 同。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用了使用一種能項(xiàng)的打分函數(shù)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用含 有多于一種能項(xiàng)的打分函數(shù)計(jì)算能量，例如描述范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的能 項(xiàng)，以及它們的組合。在額外的實(shí)施方案中，額外的能項(xiàng)包括但不限于熵項(xiàng)、扭角能以及基 于已知的能量。在US 6, 188, 965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790；USSN 09/877, 695 ；USSN 10/071，859，USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091以及PCT WO 02/25588中描述了多種打分函數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，打分函數(shù)無(wú)需受限于物理化學(xué)能項(xiàng)。例如，基于所知的勢(shì)可供本發(fā)明的計(jì)算篩選 方法學(xué)應(yīng)用。上述基于所知的勢(shì)可源自蛋白質(zhì)序列和/或結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，包括但不限于穿織 (threading)勢(shì)、參考能量、擬能量、基于同源性的能量以及源自序列比對(duì)的序列偏移。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種打分函數(shù)得到改良以包括用于免疫原性的模型，諸如源自肽 與MHC (主要組織相容性復(fù)合體)結(jié)合數(shù)據(jù)的函數(shù)，其可用于鑒定潛在的免疫原性序列(參 見(jiàn)例如 USSN 09/903，378 ；USSN 10/039，170 ；USSN 60/222，697 ；USSN 10/339788 ；PCT WO 01/21823和PCT WO 02/00165)。在一個(gè)實(shí)施方案中，序列比對(duì)信息能用于對(duì)氨基酸取代物 打分。舉例來(lái)說(shuō)，不管所述蛋白質(zhì)的來(lái)源是否是人類、猴子、小鼠或其它，蛋白質(zhì)序列的比較 結(jié)果在本發(fā)明的計(jì)算篩選方法學(xué)中可用于提示氨基酸突變或?qū)Π被嵬蛔兇蚍帧Ｔ谝粋€(gè)實(shí) 施方案中，本領(lǐng)域公知在計(jì)算分析過(guò)程中一種或多種打分函數(shù)可得到優(yōu)化或“訓(xùn)練”，接著 使用優(yōu)化的系統(tǒng)再運(yùn)行分析過(guò)程。上述改變的打分函數(shù)可獲得自例如，通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 訓(xùn)練的打分函數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，許多力場(chǎng)，其由一種或多種能項(xiàng)組成，可作為 打分函數(shù)。力場(chǎng)包括但不限于從頭(ab inito)力場(chǎng)或量子力場(chǎng)、半經(jīng)驗(yàn)(semi-empirical) 力場(chǎng)以及分子力場(chǎng)?；谝阎幕蚴褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)方法的打分函數(shù)可供本發(fā)明使用。這些方法 可用于評(píng)估序列和三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的匹配，并因此對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保真度而言，可 用于對(duì)氨基酸取代打分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)分別計(jì)算突變序列打分的分子動(dòng)力學(xué)計(jì) 算可用于計(jì)算篩選序列?？捎枚喾N方式來(lái)表示氨基酸以便進(jìn)行有效的能量計(jì)算。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所考慮的氨基酸表示為如前所述的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，在每個(gè)可變以及漂浮位置上計(jì)算每個(gè) 可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與其它可變以及漂浮異構(gòu)體、固定位置殘基、以及主鏈結(jié)構(gòu)和任何非蛋 白質(zhì)原子的相互作用的能量(或分?jǐn)?shù))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)可變和漂浮位置 上每條側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的兩組相互作用能量在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和固定原子之間的相互作用能 量(“單重”能量)，以及在可變和漂浮位置旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與在每個(gè)其它可變和漂浮位置上的 所有其它可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體之間的相互作用能量(“雙重”能量)進(jìn)行計(jì)算。在一個(gè)可選 的實(shí)施方案中，對(duì)于固定位置以及可變和漂浮位置計(jì)算單重和雙重能量。在一個(gè)可選的實(shí) 施方案中，所考慮的氨基酸并不表示為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。計(jì)算篩選的一個(gè)重要組成部分是鑒定一種或多種具有有利分?jǐn)?shù)的序列，即具有低 能量的序列。從極大數(shù)量的可能性中確定一組低能量序列是非同尋常的，組合優(yōu)化算法可 用于解決該難題。對(duì)于組合優(yōu)化算法而言，通過(guò)調(diào)查在典型的計(jì)算篩選計(jì)算中所考慮的 可能性的數(shù)量來(lái)闡明其所需要的。對(duì)于所給定的設(shè)計(jì)問(wèn)題而言，旋轉(zhuǎn)構(gòu)象集合(rotamer sets)的離散(discrete)特性容許對(duì)可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體序列進(jìn)行簡(jiǎn)單計(jì)算。主鏈長(zhǎng)度η 與m(每個(gè)位置可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù))組合可具有mn條可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體序列，具有隨著 序列長(zhǎng)度而指數(shù)式增長(zhǎng)的數(shù)量。對(duì)于特別簡(jiǎn)單計(jì)算而言，有可能去檢查每條可能的序列以 便鑒定最優(yōu)序列和/或一種或多種有利序列。然而，對(duì)于典型的設(shè)計(jì)問(wèn)題而言，可能序列 的數(shù)量(高達(dá)108°或更多)是足夠大的，以致很難對(duì)每條可能序列進(jìn)行檢查。然后，多種 組合優(yōu)化算法可用于鑒定優(yōu)化序列和/或一種或多種有利序列。組合優(yōu)化算法可分為兩 類(1)如果它們收斂(converge)的話，能保證返回全局極小值能量構(gòu)型的那些，和(2)并 不能保證返回全局極小值能量構(gòu)型，但總是能返回溶液構(gòu)型的那些。第一類算法的實(shí)例包 括但不限于死端消除法(Dead-End Elimination) (DEE)和分支與邊界法(Branch&Bound)(B&B)(包括分支(Branch)和終止(Terminate)) (Gordon 和 Mayo，1999，Structure Fold Des 7:1089-98)。第二類算法的實(shí)例包括但不限于蒙特卡羅法(Monte Carlo) (MC)、自洽 平均法(self-consistent mean field) (SCMF)、玻耳茲曼采樣法(Boltzmann sampling) (Metropolis 等.，1953，JChem Phys 21 1087)、模擬退火法(Kirkpatrick 等.，1983， Science，220 :671-680)、遺傳算法(GA)以及快速和精確側(cè)鏈拓樸學(xué)及能量精化(FASTER) (Desmet，等.，2002，Proteins，48 :31_43)。一種組合優(yōu)化算法可單獨(dú)使用或與其它組合優(yōu) 化算法共同使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，適用于組合優(yōu)化算法的策略用于尋找全局極小值 能量構(gòu)型(global minimum energy configuration)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述 策略用于尋找一種或多種低能量或有利序列。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述策略用 于尋找全局極小值能量構(gòu)型，接著用于尋找一種或多種低能量或有利序列。例如，概述 于USSN 6，269，312，優(yōu)選的實(shí)施方案利用了死端消除(DEE)法和蒙特卡羅法。在其它實(shí) 施方案中，在其它搜索方法中使用禁忌搜索算法(tabu search algorithms)或?qū)⑵渑c 死端消除法(DEE)和/或蒙特卡羅法組合(參見(jiàn)Modern Heuristic Search Methods, V. J. Rayward-Smith 等編輯，1996，John WILEY&Sons Ltd. ；USSN 10/218，102 ；和 PCT WO 02/25588)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用遺傳算法；參見(jiàn)例如USSN 09/877，695和 USSN 10/071,859。作為另外的實(shí)例，其更充分地描述于US 6, 188,965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091和PCT WO 02Λ5588中，可達(dá)到全局(global)最優(yōu)值，接著進(jìn)一步對(duì)可能 出現(xiàn)的進(jìn)行計(jì)算處理，其產(chǎn)生了額外的優(yōu)化序列。在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)計(jì)算無(wú)需組 合。即，在單個(gè)可變位置能量計(jì)算單獨(dú)用于評(píng)估氨基酸取代。對(duì)于其它計(jì)算而言，優(yōu)選在多 于一個(gè)的可變位置上評(píng)估氨基酸取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在組合優(yōu)化前計(jì)算所有 可能的相互作用能。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí)施方案中，在組合優(yōu)化過(guò)程中視需要可進(jìn)行能 量計(jì)算。文庫(kù)產(chǎn)生本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生文庫(kù)的方法，所述文庫(kù)可隨后用實(shí)驗(yàn)方法篩選以挑選優(yōu)化 的Fc變體。本文中使用的“文庫(kù)”意指一種或多種Fc變體的組。文庫(kù)可指以任何形式存 在的變體組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫(kù)是一列核酸或氨基酸序列，或在可變位置的一列 核酸或氨基酸取代物。例如，如下用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)例提供了在可變位置的氨基酸取代 物的文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)是至少一種序列的一列(a list)，所述序列是對(duì)所需特 性優(yōu)化的 Fc 變體。例如參見(jiàn)，F(xiàn)ilikov 等.，2002，Protein Sci 11 1452-1461 和 Luo 等.， 2002，Protein Sci 11:1218-1226。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，文庫(kù)可確定為組合的列，意 指對(duì)于每個(gè)可變位置產(chǎn)生一列氨基酸取代物，暗示每個(gè)取代物要與在所有其它可變位置上 所有其它設(shè)計(jì)的取代物組合。在該情況下，在所有可變位置的所有可能性的組合的擴(kuò)大產(chǎn) 生了大的清楚定義的文庫(kù)。文庫(kù)可指多肽的物理組合物，所述多肽包含F(xiàn)c區(qū)或一些結(jié)構(gòu)域 或該Fc區(qū)片段。因此文庫(kù)可指以純化或未純化形式存在的抗體或Fc融合體的物理組合物。 文庫(kù)可指編碼該文庫(kù)序列的核酸的物理組合物。所述核酸可以是編碼該文庫(kù)成員的基因、 具有任意可操作連接的核酸的編碼該文庫(kù)成員的基因、或編碼該文庫(kù)成員和任意其它可操 作地連接的調(diào)節(jié)序列、可選標(biāo)記、融合構(gòu)建體和/或其它元件的表達(dá)載體。例如，所述文庫(kù)可以是一組編碼Fc文庫(kù)成員的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物可隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法得 到表達(dá)、純化及篩選。作為另一個(gè)實(shí)例，所述文庫(kù)可以是展示文庫(kù)。上述文庫(kù)可以，例如，包 含一組編碼可操作地連接有一些融合伴侶的文庫(kù)成員的表達(dá)載體，所述融合伴侶能實(shí)現(xiàn)噬 菌體展示、核糖體展示、酵母展示、細(xì)菌表面展示等等?？墒褂幂敵鲂蛄谢騺?lái)自計(jì)算篩選的序列產(chǎn)生所述文庫(kù)。如上所討論，計(jì)算產(chǎn)生的 文庫(kù)明顯具有更多的穩(wěn)定性、正確折疊以及相對(duì)于隨機(jī)產(chǎn)生的文庫(kù)更多的功能序列。因 此，計(jì)算篩選增加了對(duì)所述設(shè)計(jì)目的優(yōu)化的蛋白質(zhì)的鑒別機(jī)率。文庫(kù)中的序列組通常，但 不總是，明顯地不同于親本序列，盡管在一些例子中所述文庫(kù)優(yōu)選含有親本序列。本領(lǐng)域 公知具有多種可使文庫(kù)源自計(jì)算篩選計(jì)算輸出的方法。例如，描述于US 6，403，312;USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 01/40091 和 PCT WO 02/25588 中的產(chǎn)生文庫(kù)的方法可供本發(fā)明使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，序列分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)的全局 最優(yōu)化序列(global optimum sequence)可包括于文庫(kù)中。例如，所有序列都在IOkcal/ mol內(nèi)的最低能量序列可作為文庫(kù)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，可以使用序列分?jǐn)?shù)在一定 范圍內(nèi)的一種或多種局部極小值序列(local minima sequence) 0在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述文庫(kù)序列獲得自過(guò)濾組(filtered set)。通過(guò)多種方法可產(chǎn)生上述列或組，為本領(lǐng) 域所公知，例如使用諸如蒙特卡羅、B&B或SCMF的算法。例如，在過(guò)濾組中上限為IO3或上 限為IO5的序列可包含在所述文庫(kù)。可選地，通過(guò)所有突變組合所限定的序列總數(shù)可用于 終止文庫(kù)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于重組序列的總數(shù)而言，優(yōu)選值范圍在10-102°，特別優(yōu)選值范圍 在100-109?？蛇x地，當(dāng)預(yù)先確定每個(gè)位置突變數(shù)達(dá)到時(shí)可強(qiáng)迫終止。在一些實(shí)施方案中， 并不進(jìn)行終止的序列包括在文庫(kù)中。在一些情況下其是所需的，例如以評(píng)估產(chǎn)生文庫(kù)的方 法，以提供對(duì)照或比較，或?qū)︻~外序列空間采樣。例如，在文庫(kù)中可包括親本序列，即使其沒(méi) 有進(jìn)行終止(cutoff)。聚類算法(Clustering algorithms)可用于將來(lái)自計(jì)算篩選方法的序列分類為具 有代表性的組。舉例來(lái)說(shuō)，描述于USSN 10/218，102和PCT WO 02/25588的聚類方法及其 應(yīng)用可供本發(fā)明使用。例如通過(guò)相似性可定義具有代表性的組。相似性的測(cè)量包括，但不 限于對(duì)序列相似性和能量相似性的測(cè)量。因此計(jì)算篩選的輸出序列可在局部極小值(local minima)周圍聚類，在本文中稱為序列的聚類組(clastered set)。例如，封閉序列空間的 序列組可與其它組區(qū)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在文庫(kù)中包括了一些、大多數(shù)或所有的序 列，在一聚類組或其子集范圍內(nèi)覆蓋范圍可最大化，所述序列組成一種或多種序列聚類組。 例如，通過(guò)在這些組所在文庫(kù)的范圍內(nèi)包括大多數(shù)的序列，有利于在一、二或三最低能量聚 類組范圍內(nèi)最大化覆蓋范圍。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，通過(guò)在文庫(kù)范圍內(nèi)僅包括在每一 聚類組范圍內(nèi)的序列子集，可對(duì)貫穿于序列聚類組多樣性采樣。例如，通過(guò)在文庫(kù)中包括來(lái) 自每個(gè)聚類組的最低能量序列，可對(duì)所有或大多數(shù)聚類組廣泛地采樣。序列信息可用于指導(dǎo)用于文庫(kù)產(chǎn)生的過(guò)濾計(jì)算篩選結(jié)果。如所討論的，通過(guò)比較 和對(duì)比蛋白質(zhì)序列的比對(duì)，在位置上的可變性程度以及可自發(fā)出現(xiàn)在該位置的氨基酸類型 可得到觀察。在本發(fā)明中獲得自上述分析的數(shù)據(jù)是有用的。已討論了使用序列信息的好處， 那些好處可同樣地適用于指導(dǎo)文庫(kù)產(chǎn)生的序列信息的使用。序列比對(duì)中出現(xiàn)的氨基酸組可 視為通過(guò)進(jìn)化預(yù)篩選的，對(duì)于與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、功能以及免疫原性的相容 性而言，其較隨機(jī)的具有更高機(jī)率。已討論了序列來(lái)源的多樣性，以及用于產(chǎn)生序列比對(duì)的方法，其可用在以序列信息來(lái)指導(dǎo)文庫(kù)的產(chǎn)生。同樣地，如上所討論，在比對(duì)中各種標(biāo)準(zhǔn) 可應(yīng)用于確定某些殘基的重要性或權(quán)重。這些方法也可供用序列信息來(lái)指導(dǎo)文庫(kù)的產(chǎn)生。 使用序列信息從計(jì)算篩選結(jié)果中指導(dǎo)文庫(kù)產(chǎn)生可供本發(fā)明廣泛使用。在一個(gè)實(shí)施方案中， 序列信息用于從計(jì)算篩選輸出中過(guò)濾序列。換言之，一些取代從計(jì)算輸出(computational output)中減去以產(chǎn)生文庫(kù)。例如所產(chǎn)生的計(jì)算篩選計(jì)算或各種計(jì)算的輸出可被過(guò)濾使得 該文庫(kù)僅包括符合某些標(biāo)準(zhǔn)的那些氨基酸，或那些氨基酸的子集，例如在序列比對(duì)中在該 位置上所觀察到的。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，序列信息用于將序列添加到計(jì)算篩選輸出 中。即，序列信息用于指導(dǎo)額外氨基酸的選擇，所述氨基酸被添加到計(jì)算輸出中以產(chǎn)生文 庫(kù)。例如，對(duì)于給定位置而言，來(lái)自計(jì)算篩選計(jì)算的氨基酸輸出組可得到擴(kuò)大以包括一種或 多種氨基酸，所述氨基酸在蛋白質(zhì)序列比對(duì)中在該位置被觀察到。在一個(gè)可選的實(shí)施方案 中，基于序列比對(duì)信息，一種或多種氨基酸可添加到或從計(jì)算篩選序列輸出中減去以便最 大化覆蓋范圍或多樣性。舉例來(lái)說(shuō)，具有類似于那些在序列比對(duì)中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸的性質(zhì) 的額外的氨基酸可添加入文庫(kù)中。例如，如果在序列比對(duì)中觀察到位置上具有不荷電極性 氨基酸，在該位置的額外的不荷電極性氨基酸可包括于該文庫(kù)中?？蓪?duì)文庫(kù)處理以進(jìn)一步產(chǎn)生隨后文庫(kù)。因此，來(lái)自計(jì)算篩選計(jì)算的輸出可視為初 級(jí)文庫(kù)(primary library)。所述初級(jí)文庫(kù)可與來(lái)自其它計(jì)算或其它文庫(kù)的其它初級(jí)文庫(kù) 組合，使用隨后的計(jì)算、序列信息或其它分析或?qū)嶒?yàn)處理以產(chǎn)生隨后文庫(kù)，在本文中稱為二 級(jí)文庫(kù)。從所述描述中應(yīng)當(dāng)理解，上述討論的使用序列信息以指導(dǎo)或過(guò)濾文庫(kù)自身是從初 級(jí)文庫(kù)產(chǎn)生二級(jí)文庫(kù)的一種方法。在文庫(kù)范圍內(nèi)，二級(jí)文庫(kù)的產(chǎn)生給使用者以對(duì)參數(shù)更多 的控制。能使實(shí)驗(yàn)篩選更有效率，并可容許來(lái)自實(shí)驗(yàn)結(jié)果的反饋以更容易得到解釋，提供了 更有效的設(shè)計(jì)/實(shí)驗(yàn)循環(huán)。許多方法可用于從初級(jí)文庫(kù)產(chǎn)生二級(jí)文庫(kù)。例如USSN 10/218，102和PCT WO 02/25588中所描述的用于產(chǎn)生二級(jí)文庫(kù)的方法可供本發(fā)明使用。通常出現(xiàn)在初級(jí)文庫(kù)中 的一些選擇步驟以一些方式進(jìn)行處理。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，出現(xiàn)了選擇步驟，在該 步驟中一些組的初級(jí)序列被選擇以形成二級(jí)文庫(kù)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，選擇步驟 是計(jì)算步驟，通常還包括一個(gè)選擇步驟，其中一些初級(jí)文庫(kù)的子集被選擇并接著進(jìn)行進(jìn)一 步的計(jì)算分析，包括進(jìn)一步的計(jì)算篩選和諸如“在計(jì)算機(jī)環(huán)境中”改組或重組的技術(shù)(參 見(jiàn)，例如 US 5, 830, 721 ；US 5, 811, 238 ；US 5，605，793 和 US 5，837，458、易錯(cuò) PCR，例如使 用修飾的核苷酸；包括使用多個(gè)盒式的已知誘變技術(shù)；以及DNA改組(Crameri等.，1998， Nature 391 288-291 ；Coco 等.，2001，Nat Biotechnol 19 354-9 ；Coco 等.，2002，Nat Biotechnol，20 1246-50)，異源 DNA 采樣(US 5, 939, 250) ； ITCHY(Ostermeier 等.，1999， Nat Biotechnol 17:1205-1209) ；StEP (Zhao 等.，1998，Nat Biotechnol 16:258-261)， GSSM(US 6，171，820和US 5，965，408)；體內(nèi)同源重組，連接酶輔助基因裝配，末端互 補(bǔ) PCR，前融合(profusion) (Roberts 禾口 Szostak，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 12297-12302)；酵母 / 細(xì)菌表面展示(Lu 等.，1995，Biotechnology 13:366-372) ；Seed 和 Aruffo, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(10) :3365_3369 ；Boder 和 Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15:553-557)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，出現(xiàn)的選擇步驟是一種實(shí)驗(yàn)步驟， 例如如下的任一文庫(kù)篩選步驟，其中一些初級(jí)文庫(kù)的子集被選擇并接著用實(shí)驗(yàn)方法重新組 合，例如使用一種如下討論的定向進(jìn)化(directed evolution)方法，以形成二級(jí)文庫(kù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如US 6，403，312所概述的產(chǎn)生并處理初級(jí)文庫(kù)。二級(jí)和隨后文庫(kù)的產(chǎn)生可供本發(fā)明廣泛使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，不同的初級(jí)文 庫(kù)可組合產(chǎn)生二級(jí)或隨后文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二級(jí)文庫(kù)可通過(guò)在高度突變或高度 保守的位置對(duì)序列多樣性采樣而產(chǎn)生?？煞治鲈摮跫?jí)文庫(kù)以確定在模板蛋白質(zhì)中哪些氨基 酸位置具有高突變頻率，以及哪些位置具有低突變頻率。例如，在計(jì)算篩選中顯示了大量 突變多樣性的蛋白質(zhì)中的位置在后一輪設(shè)計(jì)計(jì)算中可得到固定。當(dāng)在第一輪時(shí)，同樣大小 的過(guò)濾組在第一文庫(kù)中很大程度上保守的位置上將顯示多樣性?？蛇x地，二級(jí)文庫(kù)可通過(guò) 在具有眾多突變的位置上改變氨基酸而產(chǎn)生，但是使突變頻率不超過(guò)某水平的位置保持不 變。該討論并不意味著約束文庫(kù)的產(chǎn)生，即初級(jí)文庫(kù)隨后產(chǎn)生二級(jí)文庫(kù)。應(yīng)當(dāng)理解，初 級(jí)和二級(jí)文庫(kù)可進(jìn)一步得到處理以產(chǎn)生三級(jí)文庫(kù)、四級(jí)文庫(kù)等?？梢?jiàn)，文庫(kù)產(chǎn)生是一種迭代 過(guò)程。例如，將多種額外步驟應(yīng)用于一種或多種二級(jí)文庫(kù)可構(gòu)建三級(jí)文庫(kù)；例如，可進(jìn)行進(jìn) 一步計(jì)算處理，二級(jí)文庫(kù)可得到重組，或不同二級(jí)文庫(kù)的子集可得到組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，可通過(guò)組合二級(jí)文庫(kù)產(chǎn)生三級(jí)文庫(kù)。舉例來(lái)說(shuō)，分析了蛋白質(zhì)不同部分的初級(jí) 和/或二級(jí)文庫(kù)可組合產(chǎn)生三級(jí)文庫(kù)，該文庫(kù)處理蛋白質(zhì)的組合的部分。在一個(gè)可選的實(shí) 施方案中，來(lái)自初級(jí)文庫(kù)的變體可與來(lái)自另一個(gè)初級(jí)文庫(kù)的變體組合以提供組合的三級(jí)文 庫(kù)，具有較創(chuàng)建一個(gè)極長(zhǎng)過(guò)濾組更低的計(jì)算成本。這些組合可用于，例如，分析大的蛋白質(zhì)， 特別是大的多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，F(xiàn)c就是一個(gè)實(shí)例。因此將對(duì)上述二級(jí)文庫(kù)產(chǎn)生的描述應(yīng)用 于產(chǎn)生初級(jí)文庫(kù)之后的任意文庫(kù)，最后結(jié)果是得到最終文庫(kù)，該文庫(kù)可用實(shí)驗(yàn)方法篩選以 獲得對(duì)設(shè)計(jì)目的而言優(yōu)化的蛋白質(zhì)變體。這些實(shí)例并不意在將二級(jí)文庫(kù)的產(chǎn)生限制于要針 對(duì)任何特定應(yīng)用或本發(fā)明操作理論。反而，這些實(shí)例意在舉例說(shuō)明二級(jí)文庫(kù)，以及諸如三級(jí) 文庫(kù)等的隨后文庫(kù)的產(chǎn)生，其可廣泛地用于計(jì)算篩選方法學(xué)中，用于產(chǎn)生文庫(kù)。實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)和篩選Fc變體文庫(kù)的方法。所述的方法無(wú)意將本發(fā)明限 制于任何特定應(yīng)用或操作理論。反而，所提供的方法意在舉例說(shuō)明通常一種或多種Fc變 體或一種或多種Fc變體文庫(kù)可用實(shí)驗(yàn)方法產(chǎn)生并篩選以獲得最優(yōu)化的Fc變體。Fc變體 可在任意背景中得到生產(chǎn)和篩選，無(wú)論Fc區(qū)、結(jié)構(gòu)域或其片段，或包含F(xiàn)c的更大的多肽是 否在本文中明確定義為抗體或Fc融合體。用于抗體分子生物學(xué)、表達(dá)、純化以及篩選的 常規(guī)方法描述于 Antibody Engineering, Duebel 禾口 Kontermann 編輯，Springer-Verlag, Heidelbergjooi5H^sHayhurstipGeorgioujooLCurr Opin Chem Biol 5:683—689; Maynard 禾口 Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2:339—76 中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)序列用于創(chuàng)建編碼序列成員的核酸，接著所述 核酸可克隆入宿主細(xì)胞，如果需要的話，表達(dá)并分析。因此，編碼每個(gè)成員蛋白質(zhì)序列的核 酸，特別是DNA可得到制備。使用眾所周知的方法完成這些實(shí)驗(yàn)。例如，描述于Molecular Cloning-Α Laboratory Manual，第 3 片反·(Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)， 以 及 Current Protocols in Molecular Biology (John ffiley&Sons)的多種方法可供本發(fā)明使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解對(duì)于包含大量序列 的文庫(kù)而言，恰當(dāng)序列的產(chǎn)生可能花費(fèi)巨大并且耗費(fèi)時(shí)間。因此，有多種技術(shù)可用于有 效產(chǎn)生本發(fā)明的文庫(kù)?？晒┍景l(fā)明使用的上述方法描述于或引用于US 6,403,312;USSN09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 01/40091 和 PCT WO 02/25588 中。上述方法包括但不限于基因裝配方法、基于PCR的方法和使用PCR變化形式的方法、基 于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法、諸如那些用于改組合成的匯集寡核苷酸的方法(pooled oligo method)、易錯(cuò)擴(kuò)增方法和使用具有隨機(jī)突變寡聚物的方法、經(jīng)典的定位誘變方法、盒式突 變以及其它擴(kuò)增和基因合成方法。本領(lǐng)域公知有多種商業(yè)上可獲得的試劑盒以及用于基因 裝配、誘變、載體亞克隆等等的方法，上述商品可供本發(fā)明使用以產(chǎn)生編碼文庫(kù)Fc變體成 員的核酸。通過(guò)培養(yǎng)用核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，優(yōu)選用含有編碼Fc變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化，在合適條件下誘導(dǎo)或引發(fā)蛋白質(zhì)的表達(dá)可生產(chǎn)本發(fā)明的Fc變體。所述適于表達(dá)的條件 可隨著表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的選擇而變化，并可容易地為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方 法而確定?？墒褂迷S多合適的宿主細(xì)胞，包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞以及 酵母。例如，多種可供本發(fā)明使用的細(xì)胞系描述于ATCC 細(xì)胞系目錄，可從美國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心獲得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)Fc變體，包括在該系統(tǒng)中 使用諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的病毒將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？墒褂萌魏尾溉閯?dòng) 物細(xì)胞，特別優(yōu)選人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。合適的細(xì)胞也包括已知的研究 細(xì)胞，包括但不限于Jurkat T細(xì)胞、NIH3T3、CH0、C0S和293細(xì)胞。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí) 施方案中，文庫(kù)蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞中得到表達(dá)。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域所眾所周知，包括 大腸桿菌(E. coli)、枯草芽孢桿菌、乳脂鏈球菌(Str印tococcus cremoris)和鏈鎖狀球菌 (Streptococcus lividans)。在可選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體在昆蟲(chóng)細(xì)胞或酵母細(xì)胞中產(chǎn)生。 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)在體外表達(dá)Fc變體。體外翻譯系統(tǒng)源自原 核細(xì)胞(例如，大腸桿菌)和真核細(xì)胞(如，小麥胚(wheat germ)、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)，所述細(xì) 胞可獲得并可基于表達(dá)水平以及感興趣蛋白質(zhì)的功能而得到選擇。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)理解，體外翻譯是一些展示技術(shù)所必需的，例如核糖體展示。此外，F(xiàn)c變體可通過(guò)化學(xué) 合成方法產(chǎn)生。編碼本發(fā)明Fc變體的核酸可摻入表達(dá)載體中以便表達(dá)蛋白質(zhì)。許多表達(dá)載體可 用于蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)載體可包含染色體外自主復(fù)制載體或整合入宿主基因組的載體。應(yīng) 構(gòu)建與宿主細(xì)胞類型相容的表達(dá)載體。因此可供本發(fā)明使用的表達(dá)載體包括但不限于能使 蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母以及體外系統(tǒng)中表達(dá)的那些。本領(lǐng)域公知多 種表達(dá)載體可從商業(yè)上或以其它方式獲得，可供本發(fā)明用于表達(dá)Fc變體蛋白。表達(dá)載體通常包含與控制或調(diào)節(jié)序列、可選標(biāo)記、任意融合伴侶和/或額外元件 可操作地連接的蛋白質(zhì)。本文中“可操作地連接”意指所沭核酸與其它核酸序列以功能關(guān) 系放置。一般來(lái)說(shuō)，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸可操作地連接于編碼Fc變體的核酸的這些表 達(dá)載體，其通常適于宿主細(xì)胞使用以表達(dá)蛋白質(zhì)。一般而言，所述轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可包 括啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強(qiáng)子 或激活子序列。本領(lǐng)域也公知，表達(dá)載體通常含有選擇基因或標(biāo)記以容許對(duì)含有表達(dá)載體 的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞選擇。選擇基因?yàn)楸绢I(lǐng)域眾所周知并可隨著所使用的宿主細(xì)胞而改變。Fc變體能可操作地連接于融合伴侶，使所表達(dá)的蛋白質(zhì)的靶向、純化、篩選、展示 等能夠?qū)崿F(xiàn)。融合伴侶可通過(guò)接頭序列與Fc變體序列連接。所述接頭序列通常包含較少數(shù)量的氨基酸，一般少于10，盡管也可使用更長(zhǎng)的接頭。一般地，所選擇的接頭序列應(yīng)具有柔性并能抗降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，許多序列可用作為接頭。例如，常用的接頭序 列包含氨基酸序列GGGGS。融合伴侶可具有靶向作用或可以是信號(hào)序列，將Fc變體蛋白質(zhì) 與任一相關(guān)的融合伴侶送往所需的細(xì)胞位置或細(xì)胞外介質(zhì)。本領(lǐng)域公知某些信號(hào)序列可將 蛋白質(zhì)靶向分泌到培養(yǎng)基或位于細(xì)胞的內(nèi)外膜之間的壁膜間隙。融合伴侶也可以是編碼使 純化和/或篩選可能的肽或蛋白質(zhì)的序列。上述融合伴侶包括但不限于多組氨酸標(biāo)簽(His 標(biāo)簽)(例如H6和Hltl或其它用于固定化金屬親和層析(IMAC)系統(tǒng)(如，Ni+2親和柱)的標(biāo) 簽)GST融合體、MBP融合體、Str印標(biāo)簽、細(xì)菌酶BirA的BSP生物素化靶序列以及靶向抗體的附加表位(例如c-myc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽等等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上述標(biāo)記可用于 純化、篩選、或兩者。例如，F(xiàn)c變體可通過(guò)使用His標(biāo)簽將其固定在Ni+2親和柱上而得到純 化，接著在純化后同樣的His標(biāo)簽可用于將抗體固定在Ni+2包被的培養(yǎng)板上，以進(jìn)行ELISA 或其它結(jié)合測(cè)定(如下所述)。融合伴侶可使利用選擇方法篩選Fc變體成為可能(參見(jiàn) 如下)。能用于多種選擇方法的融合伴侶為本領(lǐng)域眾所周知，所有這些融合伴侶都可供本 發(fā)明使用。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)將Fc變體文庫(kù)的成員融合到基因III蛋白質(zhì)上，噬菌體展示能 i^iLliliffl (Kay ^ . , Phage display of peptides and proteins -.a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA,1996 ；Lowman 等，1991, Biochemistry 30 10832-10838 ； Smith，1985，Science 228:1315-1317)。融合伴侶能使Fc變體得到標(biāo)記?？蛇x地，融合 伴侶可結(jié)合表達(dá)載體上的特定序列，能使該融合伴侶和相關(guān)的Fc變體與編碼它們的核酸 共價(jià)或非共價(jià)連接。例如，USSN 09/642, 574 ；USSN 10/080, 376 ；USSN 09/792, 630 ；USSN 10/023，208 ；USSN 09/792，626 ；USSN 10/082，671 ；USSN 09/953，351 ；USSN 10/097，100 ； USSN 60/366, 658 ；PCT WO 00/22906 ；PCT WO 01/49058 ；PCT WO 02/04852 ；PCT WO 02/04853 ；PCT WO 02/08023 ；PCT WO 01/28702 ；和 PCT WO 02/07466 描述了這樣的融合伴 侶和技術(shù)，其可供本發(fā)明使用。本領(lǐng)域眾所周知向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源核酸的方法，所述方法可隨著所使用的宿 主細(xì)胞而變化。技術(shù)包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、1，5_ 二甲 基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒或噬菌體感 染、在脂質(zhì)體中多核苷酸的膠囊化(encapsulation)、以及直接將DNA微注射入細(xì)胞核。就 哺乳動(dòng)物而言，轉(zhuǎn)染可以是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)在表達(dá)后得到純化或分離。以本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的各種方法可分離或純化蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括色譜技術(shù)，包括離子 交換、疏水相互作用、親和力、大小或凝膠過(guò)濾、以及反相，在大氣壓或高壓下使用諸如FPLC 和HPLC的系統(tǒng)進(jìn)行。純化方法還包括電泳、免疫學(xué)技術(shù)、沉淀、透析以及色譜聚焦技術(shù)。超 濾和滲濾技術(shù)與蛋白質(zhì)濃縮也是有用的。本領(lǐng)域眾所周知許多天然蛋白質(zhì)結(jié)合Fc和抗體， 這些蛋白質(zhì)可供本發(fā)明用于純化Fc變體。例如，細(xì)菌蛋白A和G結(jié)合Fc區(qū)。同樣地，細(xì)菌 蛋白L結(jié)合某些抗體的Fab區(qū)，當(dāng)然抗體的靶抗原也能結(jié)合Fab區(qū)。通過(guò)特定的融合伴侶純 化通常能得到實(shí)施。例如，如果采用GST融合，則Fc變體蛋白質(zhì)可使用谷胱甘肽樹(shù)脂進(jìn)行 純化，如果使用His標(biāo)簽，則可使用Ni+2親和層析，或如果使用flag標(biāo)簽，則可使用固定化 抗-flag抗體。關(guān)于適合的純化技術(shù)的常規(guī)指導(dǎo)，參見(jiàn)Protein Purification principles and Practice，第 3 版·，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。所需的純化程度可基于 Fc 變體的篩選或用途而變化。在一些情況下無(wú)需要純化。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，如果Fc變體 被分泌，可直接從培養(yǎng)基中篩選。本領(lǐng)域眾所周知，一些選擇方法并不包括蛋白質(zhì)的純化。 因此，舉例來(lái)說(shuō)，如果Fc變體文庫(kù)制成噬菌體展示文庫(kù)，則不需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。Fc變體可使用多種方法篩選，包括但不限于使用體外分析法、體內(nèi)和基于細(xì)胞分 析法以及選擇技術(shù)的那些。在篩選程序中可利用自動(dòng)化和高通量篩選技術(shù)?？墒褂萌诤习?侶或標(biāo)記進(jìn)行篩選。如上已討論了融合伴侶的使用。本t中“標(biāo)記的”意指本發(fā)明的Fc奪 體具有一種或多種附在其上使篩選中的檢測(cè)成為可能的元件、同位素或化合物。一般而言， 標(biāo)記分成三類a)免疫標(biāo)記，可以是摻入作為融合伴侶的表位，該表位被抗體識(shí)別，b)同位 素標(biāo)記，可以是放射性同位素或重同位素，以及c)小分子標(biāo)記，可包括熒光和比色染料，或 諸如生物素的使其它標(biāo)記方法運(yùn)作的分子。標(biāo)記可以摻入化合物中任何位置，并可在蛋白 質(zhì)表達(dá)過(guò)程中在體外或體內(nèi)摻入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在體外分析法中Fc變體的功能和/或生物物理特性 得到篩選。對(duì)于篩選感興趣的特性而言，體外分析法可給予廣闊的動(dòng)態(tài)范圍?？珊Y選的Fc 變體特性包括但不限于穩(wěn)定性、溶解性和對(duì)Fc配體的親和力，例如對(duì)Fc YRs的?？赏瑫r(shí)或 分別篩選多種特性。取決于測(cè)定所需，蛋白質(zhì)可以是純化的或未純化的。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述篩選是用于Fc變體與蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子的結(jié)合的定性或定量的結(jié)合測(cè)定，這 些非蛋白質(zhì)分子已知或視為結(jié)合Fc變體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述篩選是用于測(cè) 量抗體或Fc融合體的靶抗原結(jié)合的結(jié)合測(cè)定。在一個(gè)可選地優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述篩選 是用于Fc變體與Fc配體結(jié)合的測(cè)定，F(xiàn)c配體包括但不限于Fc y Rs家族、新生受體FcRru 補(bǔ)體蛋白Clq、以及細(xì)菌蛋白A和G。所述Fc配體可來(lái)自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、 兔子和猴子?？墒褂枚喾N本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行結(jié)合分析，包括但不限于基于FRET(熒光 能量共振轉(zhuǎn)移)和BRET (生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移)的分析法、AlphaScreen (增強(qiáng)發(fā)光均 質(zhì)鄰近分析法(Amplified luminescent proximity homogeneous Assay))、閃爍鄰近分析 法(Scintillation proximity Assay)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、SPR(表面胞質(zhì)團(tuán)共 振(Surface ρlasmon Resonmce)，也已知為 BIAC0RE )、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry)、差不掃描量熱法(differential scanning calorimetry)、凝膠 電泳以及包括凝膠過(guò)濾的色譜法。這些方法和其它方法可利用某些Fc變體的融合伴侶或 標(biāo)記。可使用多種檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，包括但不限于發(fā)色的、熒光的、發(fā)光的或同位素標(biāo)記。Fc變體蛋白質(zhì)的生物物理特性，例如穩(wěn)定性和溶解性，通過(guò)使用多種本領(lǐng)域已知 的方法可得到篩選。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)量在折疊和非折疊狀態(tài)之間的熱力學(xué)平衡可得到 確定。例如，使用化學(xué)變性劑、加熱或PH方法，本發(fā)明的Fc變體蛋白質(zhì)可以解折疊，該轉(zhuǎn)換 可使用包括但不限于圓二色譜法、熒光光譜法、吸收光譜法、NMR波譜法、熱量測(cè)定法以及蛋 白質(zhì)水解法的方法來(lái)監(jiān)測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過(guò)使用這些技術(shù)和其它技術(shù)，折 疊和解折疊轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也可得到監(jiān)測(cè)。通過(guò)使用許多本領(lǐng)域公知的方法，F(xiàn)c變體蛋 白質(zhì)的溶解性和總體結(jié)構(gòu)完整性可得到定量或定性測(cè)定?？晒┍景l(fā)明用于鑒定Fc變體蛋 白質(zhì)生物物理特性的方法包括凝膠電泳、諸如大小排阻層析和反相高效層析的色譜法、質(zhì) 譜法、紫外吸收光譜分析法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、 超速離心分析法、動(dòng)態(tài)光散射法、蛋白質(zhì)水解法以及交聯(lián)法、濁度測(cè)量法、過(guò)濾阻滯分析法 (filter retardation assays)、免疫分析法、熒光染料結(jié)合分析法、蛋白質(zhì)染色法、顯微鏡法以及通過(guò)ELISA或其它結(jié)合分析法對(duì)聚集的檢測(cè)。使用X-射線晶體學(xué)技術(shù)分析結(jié)構(gòu)，也 可使用NMR波譜法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在規(guī)定的某一段時(shí)間后測(cè)定溶液蛋白質(zhì)量，可 測(cè)定穩(wěn)定性和/或溶解性。在該測(cè)定中，蛋白質(zhì)可以暴露于或可以不暴露于某些極端條件 下，例如提高溫度、低PH或存在變性劑。因?yàn)樾惺构δ芡ǔＰ枰€(wěn)定、可溶和/或適當(dāng)折疊 /結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，前述的功能和結(jié)合分析法也提供了用于執(zhí)行上述測(cè)量的方法。例如，包含 Fc變體的溶液可對(duì)其與靶抗原的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定，接著在極端溫度下暴露一段或多段規(guī) 定的時(shí)間，然后再測(cè)定與抗原的結(jié)合。因?yàn)轭A(yù)期解折疊和聚集的蛋白質(zhì)無(wú)法結(jié)合抗原，所以 保留的活性量提供了對(duì)Fc變體的穩(wěn)定性和溶解性的量度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用一種或多種基于細(xì)胞或體內(nèi)分析法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩 選。對(duì)于上述分析法，純化的或未純化的Fc變體蛋白質(zhì)通常作為外源物添加，使得細(xì)胞暴 露于屬于文庫(kù)的單個(gè)變體或變體庫(kù)。這些分析法通常，但并不總是，基于包含F(xiàn)c變體的抗 體或Fc融合體的功能；即抗體或Fc融合體結(jié)合靶抗原和介導(dǎo)某些生化反應(yīng)的能力，例如 效應(yīng)器功能、配體/受體結(jié)合抑制、細(xì)胞凋亡等等。上述分析法通常包括監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)抗體或 Fc融合體的應(yīng)答，例如細(xì)胞生存、細(xì)胞死亡、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化或諸如天然基因或報(bào)道基因細(xì) 胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活。例如，上述分析法可測(cè)量Fc變體引發(fā)ADCC、ADCP或⑶C的能力。對(duì)于 某些分析法而言，可能需要添加除靶細(xì)胞之外的額外的細(xì)胞或組分，例如血清組分或諸如 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的效應(yīng)細(xì)胞。上述額外的細(xì)胞可來(lái)自任何 生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子?？贵w和Fc融合體可引發(fā)表達(dá)了所述抗體靶抗原 的某些細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡，或它們可通過(guò)已添加到該分析中的免疫細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)靶細(xì)胞的攻 擊。用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡或生存能力的方法為本領(lǐng)域所公知，包括使用染料、免疫化學(xué)、細(xì)胞 化學(xué)和放射性試劑。例如，半胱天冬酶染色分析法能測(cè)定細(xì)胞凋亡，攝取或釋放放射性底物 或諸如alamar藍(lán)的熒光染料能監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)或激活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了基 于EuTDA的DELFIA 細(xì)胞毒性測(cè)定法(Perkin Elmer，MA)。可選地，可通過(guò)測(cè)量一種或多 種天然胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，例如乳酸脫氫酶的釋放，以監(jiān)測(cè)死亡或損傷的靶細(xì)胞。在基于細(xì) 胞的測(cè)定法中轉(zhuǎn)錄激活也可用作為分析功能的方法。在該情況下，通過(guò)對(duì)可能是增量調(diào)節(jié) 的天然基因或蛋白質(zhì)的分析以監(jiān)測(cè)應(yīng)答，例如可測(cè)定某些白細(xì)胞介素的釋放，或可選地通 過(guò)報(bào)道構(gòu)建體讀出結(jié)果?；诩?xì)胞的測(cè)定法也可包括對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的測(cè)定，該形態(tài)學(xué) 改變作為Fc變體存在的應(yīng)答。用于上述測(cè)定法的細(xì)胞類型可以是原核或真核的，可采用本 領(lǐng)域公知的多種細(xì)胞系?？蛇x地，使用已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染編碼所述Fc變體核酸的細(xì)胞，可進(jìn)行基于細(xì)胞的篩 選。即，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)并不作為外源物添加到細(xì)胞中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基 于細(xì)胞的篩選使用了細(xì)胞表面展示?？墒褂萌诤习閭H以使Fc變體在細(xì)胞表面得到展示 (ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12 :395_399)?？晒┍景l(fā)明使用的細(xì)胞表面展示方 法包括但不限于在細(xì)菌(Georgiou 等.，1997，Nat Biotechnol 15 :29_34 ；Georgiou 等.， 1993, Trends Biotechnol 11 6-10 ；Lee 等.，2000， Nat Biotechnol 18 645-648 Jun 等.，1998，Nat Biotechnol 16 :576_80)、酵母(Boder 和 Wittrup，2000，Methods Enzymol 328 430-44 ；Boder 和 Wittrup, 1997，Nat Biotechnol 15 :553_557)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (Whitehorn 等，1995，Bio/technology 13 1215-1219)上展示。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中， Fc變體蛋白質(zhì)并不在細(xì)胞表面展示，反而在細(xì)胞內(nèi)或在某些其它細(xì)胞區(qū)室中被篩選。例如，周質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞計(jì)數(shù)篩選(Chen等.，2001，Nat Biotechnol 19 :537_542)、蛋白質(zhì)片段 互補(bǔ)測(cè)定(Johnsson 和 Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 10340-10344.； Pelletier 等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146)以及酵母雙雜交篩選 (Fields和Song，1989，Nature 340:245-246)可供本發(fā)明使用?？蛇x地，如果多肽包含所 述Fc變體，例如抗體或Fc融合體，可賦予細(xì)胞一些可選擇的生長(zhǎng)有利條件，所述特性可用 于對(duì)Fc變體篩選或選擇。本領(lǐng)域公知，篩選方法的子集是對(duì)文庫(kù)的有利成員進(jìn)行選擇的那些。所述方法在 本文中稱為“^S^法”，這些方法可供本發(fā)明用于篩選Fc變體文庫(kù)。當(dāng)使用選擇方法篩 選文庫(kù)時(shí)，僅有那些有利的文庫(kù)成員，即符合某些篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到增殖、分離和/或觀察。應(yīng) 當(dāng)理解，因?yàn)閮H有最恰當(dāng)?shù)淖凅w得到觀察，所以通過(guò)單獨(dú)測(cè)定文庫(kù)成員的適合度(fitness) 的方法，能使大于該方法可篩選的那些的文庫(kù)得到篩選。通過(guò)任何方法、技術(shù)，或共價(jià)或非 共價(jià)地連接的融合伴侶、具有其基因型的Fc變體的表型(即具有編碼其核酸的Fc變體的 功能)，能使選擇得到實(shí)施。例如通過(guò)將文庫(kù)成員與基因III蛋白質(zhì)融合，能使噬菌體展示 用作選擇方法?？梢?jiàn)，變體蛋白質(zhì)的選擇或分離符合某些標(biāo)準(zhǔn)，例如對(duì)Fc γ R的結(jié)合親和 力，也用于選擇或分離編碼其的核酸。一旦分離了，所述編碼Fc變體的基因可接著被擴(kuò)增。 該分離和擴(kuò)增過(guò)程，稱為淘選(panning)，可重復(fù)進(jìn)行，容許有利的Fc變體在文庫(kù)中得到富 集。最后對(duì)附在其上的核酸進(jìn)行測(cè)序的核酸可供基因鑒定使用。本領(lǐng)域公知的多種選擇方法可供本發(fā)明用于篩選Fc變體文庫(kù)。這些方法包括但 ^·KT-UMliiΙΦM(Phage display of peptides and proteins -.a laboratory manual, Kay 等.,1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996 ；Lowman 等.,1991, Biochemistry 30 10832-10838 ；Smith, 1985, Science 228 1315-1317)和其衍生的方法，諸如選擇性噬 菌體感染(Malmborg 等.，1997，JMol Biol 273 :544_551)、選擇性感染噬菌體(Krebber 等·，1997，J Mol Biol 268 :619_630)以及延遲感染性淘選(Benhar 等，2000，J Mol Biol 301 :893-904)、細(xì)胞表面展示(ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol，12 :395_399)、 如在細(xì)菌(Georgiou 等，1997，Nat Biotechnol 15 29-34 ；Georgiou 等，1993， Trends Biotechnol 11 6-10 ；Lee ，2000， Nat Biotechnol 18 645-648 Jun 等.,1998, Nat Biotechnol 16 :576_80)、酵母(Boder 和 Wittrup,2000, MethodsEnzymol 328 :430_44 ； Boder 和 Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15 :553_557)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Whitehorn 等.， 1995，Bio/technology 13 :1215_1219)上展示、以及體外展示技術(shù)(Amstutz 等·，2001， Curr Opin Biotechnol 12 :400_405)，如多核糖體展示(Mattheakis 等.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :9022_9026)、核糖體展示(Hanes 等.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 :4937-4942)、mRNA 展示(Roberts 和 Szostak，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 12297-12302 ；Nemoto 等·，1997，F(xiàn)EBS Lett 414 405-408)和核糖體失活展示系統(tǒng)(Zhou 等，2002，J Am Chem Soc 124,538-543)。其它可供本發(fā)明使用的選擇方法包括不限于展示的方法，諸如體內(nèi)方法，包括但 不限于周質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞計(jì)數(shù)篩選(cytometric screening) (Chen等，2001，Nat Biotechnol 19 :537-542)、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)測(cè)定(Johnsson 和 Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :10340-10344 ;Pelletier等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 12141-12146)和 在選擇模式中使用的(Visintin等，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96 :11723_11728)酵母雙雜交篩選(Fields和Song，1989，Nature 340 :245_246)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，可 通過(guò)在表達(dá)載體上結(jié)合有特定序列的融合伴侶使選擇能夠進(jìn)行，因此能使該融合伴侶和相 關(guān)的Fc變體文庫(kù)成員與編碼它們的核酸共價(jià)或非共價(jià)連接。例如，USSN 09/642, 574 ；USSN 10/080，376 ；USSN 09/792，630 ；USSN 10/023，208 ；USSN 09/792，626；USSN 10/082，671 ； USSN 09/953,351 ；USSN 10/097, 100 ；USSN 60/366, 658 ；PCT WO 00/22906 ；PCT WO 01/49058 ；PCT WO 02/04852 ；PCT WO 02/04853 ；PCT WO 02/08023 ；PCT WO 01/28702 ；和 PCT W002/07466中描述了上述可供本發(fā)明使用的融合伴侶和技術(shù)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案 中，如果諸如抗體或Fc融合體的包含F(xiàn)c變體的多肽表達(dá)可賦予細(xì)胞一些生長(zhǎng)、復(fù)制或生存 的優(yōu)點(diǎn)，則可進(jìn)行體內(nèi)選擇。稱為“定向進(jìn)化(directed evolution) ”方法的選擇方法的子集是在選擇過(guò)程 中包括有利序列雜交(mating)或傳代(breading)的那些，有時(shí)有新突變摻入。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，定向進(jìn)化方法能使在文庫(kù)中最有利序列的鑒定更容易，并能增加所篩 選的序列的多樣性。許多定向進(jìn)化方法為本領(lǐng)域所公知，并可供本發(fā)明用于篩選Fc變 體文庫(kù)，包括但不限于DNA改組(PCT WO 00/42561 A3 ；PCT WO 01/70947 A3)、外顯子改 組(US 6，365，377 ；Kolkman 和 Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19 :423_428)、家族改組 (Crameri 等·，1998，Nature 391 :288_291 ；US 6，376，246)、RACHITT (Coco 等·，2001， Nat Biotechnol 19 :354_359 ；PCT WO 02/06469)、STEP 和隨機(jī)引發(fā)體外重組(Zhao 等·， 1998，Nat Biotechnol 16 :258_261 ；Shao 等.，1998，Nucleic AcidsRes 26 :681_683)、 核酸外切酶介導(dǎo)的基因裝配(US 6, 352, 842 ；US 6，361，974)、基因定位飽和誘變(Gene Site Saturation)Mutagenesis (US 6，358，709)、基因重裝配(Gene Reassembly ) (US 6，358，709)、SCRATCHY(Lutz 等.，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253)、 DNA 斷裂法(DNA fragmentation method) (Kikuchi 等.，Gene 236 :159-167)、單鏈 DNA 改組(Kikuchi等·，2000，Gene 243 133-137)以及AMEsystem 定向進(jìn)化蛋白質(zhì)工程技 術(shù)(應(yīng)用分子進(jìn)化)(US US 5, 824, 514 ；US 5, 817, 483 ；US 5, 814, 476 ；US 5，763，192 ； US5, 723，323)。在細(xì)胞、組織以及全生物體實(shí)驗(yàn)中，包含本發(fā)明Fc變體的抗體和Fc融合體的生物 學(xué)特性可得到鑒定。本領(lǐng)域公知，藥物常在動(dòng)物中測(cè)試，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、 貓、豬和猴子，以便測(cè)定藥物對(duì)疾病或疾病模型的處理的有效性，或測(cè)定藥物的藥物代謝動(dòng) 力學(xué)、毒性以及其它特性。所述動(dòng)物可稱為疾病模型。治療劑通常在小鼠中測(cè)試，包括但不 限于裸鼠、SCID小鼠、異種移植小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠(包括敲進(jìn)和敲除)。例如，預(yù)計(jì)作為抗 癌治療劑的本發(fā)明的抗體或Fc融合體可在小鼠癌模型中測(cè)試，例如在異種移植小鼠中。在 該方法中，腫瘤或腫瘤細(xì)胞系移植或注射入小鼠，隨后該小鼠用治療劑處理以測(cè)定抗體或 Fc融合體減緩或抑制癌生長(zhǎng)的能力。上述實(shí)驗(yàn)方法可提供有意義的數(shù)據(jù)用于確定所述抗體 或Fc融合體用作為治療劑的可能性。任何生物體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，皆可用于測(cè)試。例如因 為猴子與人的遺傳相似性，所以它們可以是合適的治療模型，并因此可用于測(cè)試本發(fā)明抗 體和Fc融合體的有效性、毒性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)或其它特性。對(duì)于正式批準(zhǔn)藥物而言，最終 必需在人類中測(cè)試本發(fā)明的抗體和Fc融合體，因此當(dāng)然要考慮這些實(shí)驗(yàn)。因此本發(fā)明的抗 體和Fc融合體可在人類中測(cè)試以確定它們的療效、毒性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和/或其它臨床 特性。實(shí)施例提供如下實(shí)施例以舉例說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例無(wú)意將本發(fā)明限制于任何特定應(yīng) 用或操作理論。對(duì)于所有討論于本發(fā)明中的位置而言，編號(hào)方式依照Kabat的EU標(biāo)引方式(Kabat 等·，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版·，United States Public Health Svice, National Institutes of Health, Bethesda)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解該慣例由免疫球蛋白序列的特定區(qū)域中非連續(xù)編號(hào)方式組成，能夠得到免疫球蛋白 家族保守位置的標(biāo)準(zhǔn)化參考。因此，通過(guò)EU標(biāo)引方式規(guī)定的任何給定免疫球蛋白的位置 無(wú)需與其連續(xù)序列對(duì)應(yīng)。圖3顯示了對(duì)于阿侖單抗抗體而言的連續(xù)的和EU標(biāo)引的編號(hào)方 案，以便更清楚地闡明該主題。也應(yīng)當(dāng)指出在許多Fc位置上已觀察到多態(tài)性，包括但不限 于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此在本發(fā)明序列和科學(xué)文獻(xiàn)序列之間可能存在 微小差別。實(shí)施例1. Fc文庫(kù)的計(jì)算篩選和設(shè)計(jì)進(jìn)行計(jì)算篩選計(jì)算以設(shè)計(jì)優(yōu)化的Fc變體。在幾次計(jì)算/實(shí)驗(yàn)循環(huán)中，對(duì)Fc變體 進(jìn)行計(jì)算篩選、構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)于每次連續(xù)循環(huán)而言，提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反饋入下一組計(jì) 算篩選計(jì)算和文庫(kù)設(shè)計(jì)中。所有的計(jì)算篩選計(jì)算和文庫(kù)設(shè)計(jì)呈現(xiàn)于實(shí)施例1中。對(duì)于每組 計(jì)算而言，提供了列出結(jié)果和提供有關(guān)信息和參數(shù)的表格。結(jié)合Fc γ Rs胞外域的Fc的幾種不同結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)用于計(jì)算篩選計(jì)算?？?公開(kāi)獲得的Fc/FcyR復(fù)合物結(jié)構(gòu)包括pdb登記號(hào)1E4K(Sondermann等.，2000，Nature 406 267-273.),以及 pdb 登記號(hào) IIIS 和 IIIX (Radaev 等·，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)。Fc γ RIIIb和Fc γ RIIIa的胞外區(qū)具有96 %同一性，因此使用Fe/ Fc YRIIIb結(jié)構(gòu)與使用Fc YRIIIa基本上等效。雖然如此，對(duì)于某些計(jì)算而言，通過(guò)在 IIIS和1Ε4Κ結(jié)構(gòu)中對(duì)D129G突變模建(稱為D129G IIIS和D129G 1Ε4Κ模板結(jié)構(gòu))，構(gòu) 建更精確的Fc/FcR y IIIa模板結(jié)構(gòu)。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，可獲得的Fc γ R序列信息， 前述的Fc/FcyR結(jié)構(gòu)，以及未結(jié)合復(fù)合物(pdb登記號(hào)1H9V) (Sondermann等.，2001， J Mol Biol 309 :737_749) (pdb 登記號(hào) 1FCG) (Maxwell 等·，1999，Nat Struct Biol 6 437-442)、Fc y RIIb (pdb 登記號(hào) 2FCB) (Sondermann 等.，1999，Embo J 18 1095-1103)和 Fc γ RIIIb (pdb 登記號(hào) 1 E4J) (Sondermann等.,2000, Nature 406 :267_273.)的結(jié)構(gòu)信息， 對(duì)與人Fc y Rllb、人F158 Fc y RIIIa和小鼠Fc γ RIII胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc結(jié)構(gòu)模建。通過(guò)圖像檢查前述Fc/Fc γ R和Fc γ R結(jié)構(gòu)，并使用溶劑可接觸性信息及序列信 息，可變位置和在那些位置要被考慮的氨基酸得到選擇。對(duì)于確定在此處取代可提供激活 性和抑制性受體之間區(qū)別的親和力的可變位置而言，F(xiàn)cs和Fc y Rs的序列信息是特別有用 的。事實(shí)上，對(duì)所有的C Y2位置都用計(jì)算方法進(jìn)行篩選。Fc結(jié)構(gòu)是兩條重鏈的同型二聚 體(在1IISUIIX和1E4K結(jié)構(gòu)中標(biāo)記的鏈A和B)，每條鏈包括鉸鏈和C γ 2-C γ 3結(jié)構(gòu)域 (顯示于圖2)。因?yàn)镕c γ R(在1IIS、IIIX和1Ε4Κ結(jié)構(gòu)中標(biāo)記的鏈C)不對(duì)稱結(jié)合Fc同型 二聚體，所以在設(shè)計(jì)計(jì)算中通常分別考慮每條鏈。對(duì)于某些計(jì)算而言，鄰近可變位置殘基 的Fc和/或Fc γ R殘基是漂浮的，即在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)計(jì)算中容許氨基酸構(gòu)象改變，但不容許 氨基酸同一性改變，以供構(gòu)象調(diào)整使用。在下表中列出了對(duì)每組計(jì)算相關(guān)的這些殘基。除非另有指示，所考慮的氨基酸通常屬于核內(nèi)(Core)、核內(nèi)XM (Core ΧΜ)、表面(Surface)、邊 界(Boundary)、邊界XM (Boundary ΧΜ)或所有20種分類的任一種。這些分類定義如下核 內(nèi)(Core)=丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸； 核內(nèi)XM(Core ΧΜ)=丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；表 面(Surface)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、 賴氨酸以及組氨酸；邊界(Boundary)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨 酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨 酸以及甲硫氨酸；邊界XM(Boundary ΧΜ)=邊界(Boundary)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天 冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；所有20種=所有20種天然存在的氨基酸。大多數(shù)計(jì)算依照兩種常規(guī)類型計(jì)算篩選方法之一進(jìn)行。在一種方法中，在可變位 置氨基酸的構(gòu)象表示為一組不受主鏈約束的側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，其來(lái)自Dimbrack&Cohen的 旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)(Dunbrack等.，1997，Protein Sci 6:1661-1681)。通過(guò)使用含有描述 范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的項(xiàng)(term)的力場(chǎng)(force field)，以及使用死端消 除(Dead End Elimination) (DEE)算法所確定的最優(yōu)(基態(tài))序列，在所選可變位置計(jì)算 所考慮的氨基酸的所有可能組合的能量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于主要在打分函數(shù) (scoring function)中存在錯(cuò)誤，外加蛋白質(zhì)中細(xì)小的構(gòu)象差異能導(dǎo)致明顯的穩(wěn)定性差異 的事實(shí)，所以所預(yù)測(cè)的最低能量序列并不必然是真實(shí)的最低能量序列。但是，所預(yù)測(cè)的基態(tài) 序列可能接近真實(shí)的基態(tài)，因此通過(guò)評(píng)估序列的能量(所述序列在序列空間和圍繞所預(yù)測(cè) 基態(tài)的能量方面是接近的)，額外有利的多樣性可得到探查。為實(shí)現(xiàn)該目的并產(chǎn)生文庫(kù)序 列多樣性，蒙特卡羅(Monte Carlo) (MC)算法可用于評(píng)估在所預(yù)測(cè)基態(tài)附近的1000個(gè)相似 序列的能量。在序列中可變區(qū)位置由取代占據(jù)，這樣的序列在1000個(gè)序列的組中的數(shù)量值 可反映該取代是如何有利。該計(jì)算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation (PDA )技術(shù)，描述于 US 6, 188, 965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ； USSN 09/927，790 ；USSN 10/218，102；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091 ；和 PCT WO 02/25588，為便于描述，在所有實(shí)施例中稱為PDA. 技術(shù)。列出這些計(jì)算結(jié)果的表格提供了 在所指定鏈上的每個(gè)可變位置(欄1)、在每個(gè)可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個(gè) 可變位置上野生型(WT)Fc氨基酸同一性(欄3)、在DEE基態(tài)(ground state)序列中每個(gè) 可變位置上氨基酸同一性(欄4)、以及在蒙特卡羅輸出中觀察到的氨基酸組和相應(yīng)的取代 占據(jù)(欄5)。其它計(jì)算方法利用了遺傳算法(GA)來(lái)篩選低能量序列，對(duì)于序列被采樣的那些， 在每輪“進(jìn)化”過(guò)程中計(jì)算能量。可變和漂浮位置(floated position)的氨基酸構(gòu)象表示 為一組側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，所述側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體源自不受主鏈約束的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)，所述 文庫(kù)使用了柔性旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型(Mendes等.，1999，Proteins 37:530-543)。使用含有描 述范德華、溶劑化(solvation)、靜電和氫鍵相互作用的項(xiàng)的力場(chǎng)計(jì)算能量。該計(jì)算產(chǎn)生了 具有300個(gè)序列的列(list)，預(yù)測(cè)其應(yīng)具有低能量。為便于結(jié)果分析和文庫(kù)產(chǎn)生，使用最近 令P居單鍵分級(jí)聚類算法(nearest neighbor single linkage hierarchical clustering algorithm)基于相似性分?jǐn)?shù)將序列分為相關(guān)的組，所述300個(gè)輸出序列通過(guò)計(jì)算聚類分 為10組相似序列(Diamond，1995，Acta Cryst D51 127-135)。即，所有組內(nèi)序列是最相似于同組內(nèi)所有其它的序列，并較少相似于其它組中的序列。來(lái)自這些十個(gè)簇(cluster) 的每一個(gè)中的最低能量序列用來(lái)代表每組，并作為結(jié)果呈現(xiàn)。該計(jì)算篩選方法基本上類似 于 Sequence Prediction Algorithm (SPA )技術(shù)，描述于(Raha 等.，2000，Protein Sci 9:1106-1119) ；USSN 09/877，695 ；和USSN 10/071，859，為便于描述，在所有實(shí)施例中稱為 SPA 技術(shù)。應(yīng)用計(jì)算篩選設(shè)計(jì)能量有利的相互作用，所述相互作用位于可變位置組的Fe/ FcyR界面，其介導(dǎo)或可能介導(dǎo)與Fc γ R的結(jié)合。因?yàn)樗鼋Y(jié)合界面包括了在兩條不同鏈上 的大量Fc殘基，并因?yàn)镕c γ Rs不對(duì)稱地結(jié)合Fe，所以殘基分為不同的相互作用可變位置 組，并設(shè)計(jì)為獨(dú)立的計(jì)算組。在許多情況下，選擇這些組作為將耦合的(coupled)殘基組， 即一種或多種殘基的能量取決于與一種或多種其它殘基的同一性。可使用不同的模板結(jié) 構(gòu)，在許多情況下，計(jì)算研究了在兩條鏈上的取代。對(duì)于大多數(shù)可變位置組而言，使用所描 述的利用了 PDA @和SPA 技術(shù)的計(jì)算篩選方法進(jìn)行計(jì)算。這些計(jì)算的結(jié)果和有關(guān)參數(shù)以 及信息列于如下表1-30。列出這些計(jì)算結(jié)果的表格提供了在所指定鏈上的每個(gè)可變位置(欄1)、在每個(gè) 可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個(gè)可變位置上的野生型(WT)Fc氨基酸同一性 (欄3)、以及對(duì)于來(lái)自每個(gè)聚類組的最低能量序列而言在可變位置上的氨基酸同一性(欄 4-13)。表1-59分為兩組，標(biāo)記如下，PDA 和SPA 技術(shù)。PDA 表的欄4顯示了在PDA 運(yùn)行過(guò)程中每個(gè)殘基在上限1000個(gè)序列中的出現(xiàn)頻率。因此，在表1的第一行，在位置328 處，當(dāng)使用邊界氨基酸作為該位置可變殘基組運(yùn)行時(shí)，在上限1000個(gè)序列中L出現(xiàn)330次、 M出現(xiàn)302次等。此外，包括在本發(fā)明組合物范圍內(nèi)的是在所列位置中具有任一所列氨基酸殘基的 抗體，所述抗體可單獨(dú)或以任意組合存在(注意優(yōu)選的組合列于權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)概述和 附圖中)。一個(gè)優(yōu)選的組合是處于基態(tài)的所列位置中所列的氨基酸殘基(有時(shí)在本文中稱 為“全局解(global solution)”，以區(qū)別于野生型)。同樣地，表格之間的殘基位置和在那 些殘基位置上的特定氨基酸可進(jìn)行組合。對(duì)于SPA 技術(shù)的表格而言，諸如表4、欄4是SPA 運(yùn)行結(jié)果，其產(chǎn)生了在六個(gè)所 列位置具有六個(gè)所列氨基酸的蛋白質(zhì)(例如，欄4是具有除239E、265G、267S、269Y、270T和 299S外的野生型序列的單一蛋白質(zhì))。因此，每一個(gè)這些單獨(dú)的蛋白質(zhì)都包括在本發(fā)明范 圍內(nèi)。此外，在表格內(nèi)及表格間SPA 蛋白質(zhì)之間的組合也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，每張表顯示了糖的存在或不存在，但明確包括的是相反序列；如表1列出了 非糖基化變體，但這些同樣的氨基酸改變可在糖基化變體上進(jìn)行。而且，每張表列出了所使用的模板結(jié)構(gòu)，以及“漂浮的”殘基，例如，表2使用了 PDA 運(yùn)行漂浮的C120，C132和C134。表權(quán)利要求
一種包含F(xiàn)c變體部分的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調(diào)節(jié)與FcγR的結(jié)合。
2.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述調(diào)節(jié)是所述抗體對(duì)所述FcYR親和力的增加。
3.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一 種取代，所述人序列位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、 266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333 和 334 組成的 組。
4.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取 代，所述人序列位置選自由 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332 組成的組。
5.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體包含在位置332的取代。
6.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中至少一種取代位于選自由239、264、297和330的位置， 附帶條件是如果所述序列基本上是人的，所述取代不是S239A、V264A、N297A、N297Q、A330D、 A330Q、A330K，或 A330S。
7.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234E、 234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、 235I、235V、235F、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、 241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、 262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、 264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、 267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、 297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、 325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327N、327L、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、 328I、328V、328T、328H、328A、329F、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332E、 332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。
8.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、264I、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/264I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、 241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、 328F、332E、328M/332E、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、264I/332E、 241E/243R/262E/264R/332E.241E/243Q/262T/264E/332E.241R/243Q/262T/264R/332E, 241E/243Y/262T/264R/332E、298A/332E、239EI332E、239Q/332E、239E、265G、265N、 239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、 329F、330L、330Y、332D、297S、297D、297S/332E、297D/332E、297E/332E、265Y/297D/332E、 265Y/297D/299L/332E、265F/297E/332E、328I/332E、328Q/332E、332N、332Q、264T、264F、 240I、263I、266I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239D、239N、239F、239D/332D、 239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、 239N/332E、239N/332N、239NI332Q、239Q/332D、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、 235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239T、239H、239Y、240A、240T、240M、263A、 263T、263M、264M、264Y、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、 298H、299H、330V、330I、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325T、325V、325H、328D/332E、 328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328V/332E、328T/332E、328H/332E、328I/332E、328A、 332T、332H、332Y、332A、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、 239E/264I/298A/330Y/332E,239D/297D/332E,239E/297D/332E,239D/265V/297D/332E, 239D/265I/297D/332E、239D/265L/297D/332E、239D/265F/297D/332E、 239D/265Y/297D/332E,239D/265H/297D/332E,239D/265T/297D/332E,264E/297D/332E, 296D/297D/332E,296E/297D/332E,296N/297D/332E,296Q/297D/332E,296H/297D/332E, 296T/297D/332E,297D/299V/332E,297D/299I/332E,297D/299L/332E,297D/299F/332E, 297D/299H/332E、297D/299E/332E、297D/330Y/332E、297D/298A/330YI332E、 239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。
9.根據(jù)項(xiàng)7所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置組成的組的位置， 進(jìn)一步包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、 331、333、334和339組成的組。
10.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗體，其中所述
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)化的Fc變體、產(chǎn)生它們的方法、以及包含優(yōu)化的Fc變體的抗體和Fc融合體。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101987871SQ20101027126
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者黨偉, 奧米德·韋法, 希爾·B·卡基, 斯蒂芬·K·多伯斯坦, 格雷戈里·A·拉扎爾, 約翰·R·德斯賈萊斯, 羅伯特·J·海斯, 阿瑟·J·奇里諾 申請(qǐng)人:贊科股份有限公司