專利名稱：優(yōu)化的Fc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的經(jīng)優(yōu)化的Fc變體、生產(chǎn)它們的工程化方法、及其應(yīng)用，特別是用 于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特定抗原的免疫學(xué)蛋白質(zhì)。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物包括人和小鼠中，抗體 由成對的重鏈和輕鏈多肽鏈構(gòu)成。每條鏈由個(gè)別免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此這樣 的蛋白質(zhì)使用通稱免疫球蛋白。每條鏈由稱為可變區(qū)和恒定區(qū)的兩種不同區(qū)組成。輕鏈 和重鏈可變區(qū)在抗體間顯示明顯的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示較小的序 列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白質(zhì)以引發(fā)重要的生化事件。人類有五種不同類別的抗 體，包括IgA (其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3、和 IgG4)、和IgM。這些抗體類別之間的區(qū)別性特征是其恒定區(qū)，盡管可變區(qū)中可能存在細(xì)微 差異。

圖1顯示了 IgGl抗體，本文用作例子來描述免疫球蛋白的一般結(jié)構(gòu)特征。IgG抗體 為四聚體蛋白質(zhì)，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。IgG重鏈由四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以 Vh-Ch1-Ch2-CH3的順序從N-到C-末端連接，稱為重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)1、重鏈恒定區(qū)2、 和重鏈恒定區(qū)3。IgG ChU Ch2、和Ch3結(jié)構(gòu)域也分別稱為恒定區(qū)伽馬1 (C γ 1)、恒定區(qū)伽馬 2(Cy2)、和恒定區(qū)伽馬3 (C γ 3)。IgG輕鏈由兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以VfQ的順序 從N-到C-末端連接，分別稱為輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。抗體的可變區(qū)包含分子的抗原結(jié)合決定簇，因此決定了抗體對其靶抗原的特異 性?？勺儏^(qū)如此命名是因?yàn)樗c相同類別內(nèi)的其它抗體在序列上差別最明顯。大多數(shù)序列 可變性發(fā)生于互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)?？傆?jì)有6個(gè)⑶R，每條重鏈和輕鏈各三個(gè)，稱⑶R1、 Vh CDR2、Vh CDR3、Vl CDR1、VlCDR2、和VlCDR3。CDR外的可變區(qū)稱為框架(FR)區(qū)。盡管不像 CDR那樣多變，但不同抗體間FR區(qū)中的確存在序列可變性。總體上，抗體的這種特征性構(gòu) 造提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，免疫系統(tǒng)能夠在其上探測到實(shí)質(zhì)性的抗原結(jié)合多樣性(CDR) 以獲得對大批抗原的特異性。對于來自不同生物體的多種可變區(qū)片段，可獲得許多高分辨 率的結(jié)構(gòu)，一些是非結(jié)合的，一些與抗原復(fù)合。抗體可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特征已很好的表征 (Morea et al.，1997，Biophys Chem 68 :9_16 ；Morea et al.，2000，Methods 20 :267_279， 引入作為參考)，而且抗體的保守性特征已使大量抗體工程技術(shù)的開發(fā)成為可能(Maynardet al. ,2000, Annu Rev Biomed Eng 2 :339_376，引入作為參考)。例如，有可能將來自一 種抗體例如鼠抗體的CDR移植到另一種抗體例如人抗體的框架區(qū)上。本領(lǐng)域稱為“人源化” 的這一過程使得由非人抗體生成免疫原性更低的抗體治療劑成為可能。包含可變區(qū)的片 段能在沒有抗體其它區(qū)時(shí)存在，包括例如包含Vh-C y 1和Vh-Q的抗原結(jié)合片段(Fab)、包 含Vh和\的可變區(qū)片段(Fv)、包含在同一條鏈中連接在一起的Vh和\的單鏈可變區(qū)片段 (scFv)、以及多種其它可變區(qū)片段(Little et al. , 2000, ImmunolToday 21 :364_370，引入 作為參考)。 抗體的Fc區(qū)與許多Fc受體和配體相互作用，賦予一系列稱為效應(yīng)器功能的重要 的功能性能力。對于IgG，如圖1所示，F(xiàn)c區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域C γ 2和C γ 3以及通向C γ 2的N 末端鉸鏈。針對IgG類的一個(gè)重要的Fc受體家族為Fc伽馬受體(Fe y R)。這些受體介導(dǎo)抗 體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞分支(arm)之間的通訊(Raghavan et al. ,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 181-220 ；Ravetch etal.，2001，Annu Rev Immunol 19 :275_290)。在人類中，該蛋 白質(zhì)家族包括 Fc y RI (CD64)，包括同種型 Fc y RIa、Fc y Rib、和 Fc y RIc ；Fc γ RII (CD32)， 包括同種型Fc γ RIIa (包括同種異型Η131和R131)、Fc γ RIIb (包括FcyRIIb-I和 Fc y RIIb-2)、和Fc γ RIIc ；以及Fc y RIII (CD16)，包括同種型Fc y RIIIa(包括同種異型 V158 和 F158)和 Fc γ RIIIb (包括同種異型 Fc y RIIIb-NAl 和 Fc y RIIIb-NA2) (Jefferis et al. ,2002, Immunol Lett 82 :57_65，引入作為參考)。這些受體典型的具有胞外域、跨 膜區(qū)、和胞內(nèi)域，其中胞外域介導(dǎo)與Fc的結(jié)合，胞內(nèi)域可能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一些信號事件。這 些受體表達(dá)于多種免疫細(xì)胞中，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜 酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗格漢斯(Langerhans)細(xì)胞、天 然殺傷(NK)細(xì)胞、和γ δ T細(xì)胞。Fc/Fc γ R復(fù)合體的形成將這些效應(yīng)細(xì)胞募集到結(jié)合抗 原的部位，典型的導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號事件和重要的后續(xù)免疫反應(yīng)諸如炎癥介導(dǎo)物的釋放、 B細(xì)胞活化、胞吞作用、吞噬作用、和細(xì)胞毒性攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬細(xì)胞的效應(yīng)器功 能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的潛在機(jī)制。其中表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別 靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞裂解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的 細(xì)胞毒性(ADCC) (Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Bioll2 181-220 ；Ghetie et al. , 2000, Annu Rev Immunol 18 :739_766 ；Ravetch et al. , 2001, Annu Rev Immunol 19 =275-290,引入作為參考)。其中表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上 結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞的吞噬作用的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的 吞噬(ADCP)。已經(jīng)解析了人？0^1 胞外域的許多結(jié)構(gòu)，包括？(3^1 11￡1( (113登錄號1!1抓) (Sondermann etal.，2001，J Mol Biol 309 :737_749) (pdb 登錄號 1FCG) (Maxwell et al.， 1999, NatStruct Biol 6 :437_442)、Fc γ RIIb (pdb 登錄號 2FCB) (Sondermann et al.， 1999，Embo J18 :1095_1103)；禾口 Fc γ RIIIb (pdb 登錄號 1E4J) (Sondermann et al.，2000， Nature 406 :267_273，引入作為參考)。所有Fc γ R結(jié)合Fc上的相同區(qū)域，位于C γ 2結(jié)構(gòu) 域N末端和前面的鉸鏈，如圖2所示。此相互作用在結(jié)構(gòu)上得到很好的表征(Sondermann et al. ,2001, J Mol Biol 309 :737_749，引入作為參考)，并且已經(jīng)解析了與人Fc γ RIIIb 胞外域結(jié)合的人Fc的幾種結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1Ε4Κ) (Sondermann et al. ,2000, Nature 406 267-273) (pdb 登錄號 IIIS和 1IIX) (Radaev et al.，2001，J Biol Chem 276 :16469_16477， 引入作為參考)，同樣解析了人IgE Fc/Fc γ ε RI α復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1F6A)(Garman et al. ,2000, Nature 406 :259_266，引入作為參考)。不同IgG亞類對Fc γ R具有不同親和力，典型的，與IgG2和IgG4相比，IgGl和 IgG3基本上更好的結(jié)合所述受體。所有FcyR結(jié)合IgG Fc上的相同區(qū)域，然而具有不同 的親和力高親和力結(jié)合物Fc γ RI對IgGl的Kd為ΙΟ—Μ—1，而低親和力受體Fc γ RII和 FcyRIII通常分別以Kr6和1(Γ5結(jié)合。Fc γ RIIIa和Fc γ RIIIb的胞外域96%相同，然而 Fc YRIIIb沒有胞內(nèi)信號域。另外，盡管Fc γ RI、Fc γ RIIa/c、和Fc y RIIIa是免疫復(fù)合物 觸發(fā)的活化的正調(diào)節(jié)物，特征為具有含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞內(nèi)域， 而Fc γ RIIb具有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)，因此是抑制性的。因此，前者稱 為活化受體，而Fc γ RIIb稱為抑制受體。所述受體在不同免疫細(xì)胞上的表達(dá)樣式和水平方 面也有所不同。另一復(fù)雜性水平是人蛋白質(zhì)組中許多Fc γ R多態(tài)性的存在。具有臨床意 義的特別相關(guān)的多態(tài)性是V158/F158FCYRIIIa。與F 158同種異型相比，人IgGl以更高 親和力結(jié)合V158同種異型。已經(jīng)證明這種親和力差異，以及推測的其對ADCC和/或ADCP 的影響是抗 CD20 抗體 rituximab ( Rit:uxan , IDEC Pharmaceuticals Corporation 的注 冊商標(biāo))功效的重要決定因素。V158同種異型患者對rituximab治療反應(yīng)良好；然而，更 低親和力F158同種異型患者反應(yīng)很弱(Cartron et al.，2002，Blood99 :754_758，引入作 為參考)。大約10-20%的人是V158/V158純合的，45%是V158/F158雜合的，35-45%的人 是F158/F158 純合的(Lehrnbecher et al. , 1999, Blood 94 :4220_4232 ；Cartron et al.， 2002,Blood 99 :754_758，引入作為參考)。因此80-90%的人為弱反應(yīng)者，即他們具有至少 一個(gè)F158Fc y RIIIa等位基因。Fc上交疊但分開的部位，如圖1所示，用作與補(bǔ)體蛋白質(zhì)Clq的接觸面。Fc/Clq 結(jié)合以與Fc/Fc γ R結(jié)合介導(dǎo)ADCC相同的方式介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。Clq與絲 氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復(fù)合物，以形成Cl復(fù)合物。Clq能夠結(jié)合六個(gè)抗體，盡管結(jié)合兩 個(gè)IgG就足以激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。類似于Fc與Fc γ R的相互作用，不同IgG亞類對Clq具 有不同親和力，典型的，與IgG2和IgG4相比，IgGl和IgG3基本上更好的結(jié)合所述Fc γ R。 對于Fc/Clq復(fù)合物，目前沒有可獲得的結(jié)構(gòu)；然而，誘變研究已將人IgG上Clq的結(jié)合部 位定位到牽涉殘基D270、K322、K326、P329、和P331、以及E333 的區(qū)域(Idusogie et al.， 2000，J Immunol 164 4178-4184 ；Idusogie et al. ,2001, J Immunol 166 :2571_2575，引 入作為參考)。如圖1所示，F(xiàn)c上C γ 2和C γ 3結(jié)構(gòu)域之間的部位介導(dǎo)與初生兒受體FcRn的相互 作用，其結(jié)合將內(nèi)吞的(endocytosed)抗體從內(nèi)體(endosome)再循環(huán)回血流(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 181-220 ；Ghetieet al.，2000，Annu Rev Immunol 18 :739-766，引入作為參考)。與因全長分子的尺寸大而排除腎臟過濾偶聯(lián)，該過程導(dǎo)致范 圍為一至三周的良好抗體血清半衰期。Fc與FcRn的結(jié)合在抗體輸送中也扮演關(guān)鍵角色。Fc 上FcRn的結(jié)合部位也是細(xì)菌蛋白質(zhì)A和G結(jié)合的部位。在蛋白質(zhì)純化過程中采用蛋白質(zhì)A 或蛋白質(zhì)G親和層析，典型的利用這些蛋白質(zhì)的緊密結(jié)合作為純化抗體的手段。因此，F(xiàn)c上 該區(qū)域的保真度對抗體的臨床特性及其純化二者都是重要的?？色@得的大鼠Fc/FcRn復(fù)合 物的結(jié)構(gòu)(Martin et al. ,2001,Mol Cell7 :867_877，引入作為參考)，以及Fc與蛋白質(zhì)A 和 G 的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Deisenhofer，1981，Biochemistry 20 :2361_2370 ；Sauer-Eriksson et al. ,1995, Structure 3 :265_278 ；Tashiro et al. ,1995, Curr Opin Struct Biol 5 471-481，引入作為參考)提供了對Fc與這些蛋白質(zhì)的相互作用的了解。Fc區(qū)的關(guān)鍵特征是發(fā)生在N297的保守性N連接糖基化，如圖1所示。該碳水化 合物，或者有時(shí)稱為寡糖，對抗體扮演了至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)與功能角色，是抗體必須用哺乳動(dòng) 物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的基本原因之一。盡管不想局限于一種理論，但相信此碳水化合物的結(jié)構(gòu) 效果可能是穩(wěn)定或溶解Fc，決定C Y 3與C Y 2結(jié)構(gòu)域之間的特定角度或柔性水平，保持兩 個(gè)C Y 2結(jié)構(gòu)域不跨越中心軸互相聚集，或者上述的組合。Fc與Fc Y R和Clq的有效結(jié)合需 要該修飾，并且N297碳水化合物的組成改變或其消除影響與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合(Umafia et al. ,1999, Nat Biotechnol 17 176-180 ；Davies et al. ,2001, Biotechnol Bioeng 74288-294 ；Mimura et al.，2001，J Biol Chem276 :45539_45547；Radaev et al.，2001， J Biol Chem 276 16478-16483 ；Shieldset al. ,2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al. ,2002, J Biol Chem277 26733-26740 ；Simmons et al. ,2002, JImmunol Methods 263 :133-147，引入作為參考)。然而該碳水化合物與Fc y R的特異性接觸很小，若 有的話(Radaevet al. ,2001, J Biol Chem 276 :16469-16477，引入作為參考)，表明 N297 碳水化合物在介導(dǎo)Fc/Fc y R結(jié)合中的功能角色可能是通過其在決定Fc構(gòu)象中扮演的結(jié)構(gòu) 角色來發(fā)揮的。這得到了四種不同F(xiàn)c糖型(glycoform)的一組晶體結(jié)構(gòu)的支持，其顯示寡 糖的組成影響Cy2的構(gòu)象及作為結(jié)果的Fc/FcyR接觸面的構(gòu)象(Krapp et al. ,2003, J Mol Biol 325 :979-989，引入作為參考)。以上討論的抗體的特征-對靶物的特異性、介導(dǎo)免疫效應(yīng)器機(jī)制的能力、和長血 清半衰期-使抗體成為有力的治療劑。單克隆抗體在治療上用于多種病癥包括癌癥、炎癥、 和心血管疾病的治療。目前有超過十種抗體產(chǎn)品在出售，有數(shù)百種在開發(fā)。除了抗體之外， 在研究和治療中發(fā)現(xiàn)有越來越多作用的抗體樣蛋白質(zhì)是Fc融合物(Chamow et al.，1996， Trends Biotechnol 14 52~60 ；Ashkenazi et al. ,1997,Curr Opin Immunol 9:195—200, 引入作為參考)。Fc融合物是其中一種或多種多肽與Fc可操作連接的蛋白質(zhì)。Fc融合物 將抗體的Fc區(qū)及因此其有利的效應(yīng)器功能和藥動(dòng)學(xué)與受體、配體、或其它一些蛋白質(zhì)或蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的靶物結(jié)合區(qū)組合起來。后者的角色是介導(dǎo)靶物識(shí)別，因此其在功能上類似于 抗體可變區(qū)。由于Fc融合物與抗體的結(jié)構(gòu)和功能交疊，因此本發(fā)明中有關(guān)抗體的討論直接 擴(kuò)展到Fc融合物?？贵w破壞腫瘤細(xì)胞有許多可能的機(jī)制，包括通過阻斷所需生長途徑的抗增殖、導(dǎo) 致凋亡的胞內(nèi)信號、受體增強(qiáng)的下調(diào)和/或周轉(zhuǎn)(turnover)、⑶C、ADCC、ADCP、以及適應(yīng)性
(Cragg et al. , 1999, Curr Op in Immunol 11 541-547 ；Glennie et al.， 2000, Immunol Today 21 :403_410，引入作為參考)。抗腫瘤功效可能起因于這些機(jī)制的組 合，并且它們在臨床治療中的相對重要性似乎是癌癥依賴的。不考慮此抗腫瘤武器兵工廠， 抗體作為抗癌藥的效力是不能令人滿意的，特別是考慮到它們的高成本?；颊吣[瘤反應(yīng)數(shù) 據(jù)顯示單克隆抗體在治療效果中只提供了較之正常單藥劑細(xì)胞毒性化療劑的少量改善。例 如，僅有一半復(fù)發(fā)性低級非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤患者對抗⑶20抗體rituximab有反應(yīng) (McLaughlin et al. , 1998, J Clin0ncoll6 :2825_2833，引入作為參考)。在 166 名臨床患 者中，6%顯示完全反應(yīng)，42%顯示部分反應(yīng)，中值反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為大約12個(gè)月。用于治療 轉(zhuǎn)移性乳癌的抗HER2/neu抗體trastuzumab (Herceptin , Genentech的注冊商標(biāo))功效 更低。用trastuzumab治療222名受測患者時(shí)，總反應(yīng)率僅為15%，其中8個(gè)完全反應(yīng)，26個(gè)部分反應(yīng)，中值反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和存活期為9至13個(gè)月(Cobleigh et al.，1999，J Clin Oncol 17 :2639-2648，引入作為參考)。目前，對于抗癌療法，死亡率的任何微小改善均認(rèn) 為是成功。因此，存在增強(qiáng)抗體破壞靶癌細(xì)胞的能力的重大需要。FcyR介導(dǎo)的效應(yīng)器功能在抗體抗癌活性中的角色已在小鼠中論證(Clynes et al. , 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95 652-656 ；Clynes et al. ,2000, Nat Med 6 443-446，引入作為參考)，并且Fc與某些Fc y R之間相互作用的親和力與基于細(xì)胞的測 試中的靶向細(xì)胞毒性有關(guān)(Shields et al. ,2001, J Biol Chem 276 6591-6604 ；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30 :487_490 ；Shields et al.，2002，JBiol Chem 277 26733-26740，引入作為參考)。此外，已經(jīng)觀察到人臨床功效與其FcyRIIIa的高(V158)或 低(F158)親和力多態(tài)型同種異型之間的關(guān)聯(lián)(Cartron et al. ,2002,Blood 99 =754-758, 引入作為參考)。已經(jīng)針對不同目的對Fc進(jìn)行了誘變研究，其中有典型的變成丙氨酸(稱為 丙氨酸掃描)或者由序列同源性替代指導(dǎo)的替代(Duncan et al. , 1988, Nature 332 563-564 ；Lund et al.，1991，J Immunol147 :2657_2662 ；Lund et al.，1992，Mol Immunol 2953-59 Jefferis et al. ,1995, Immunol Lett 44 111-117 ；Lund et al.,1995, Faseb J 9 115-119 Jefferis et al.，1996，Immunol Lett54 101-104 ；Lund et al.， 1996，J Immunol 157 :4963_4969 ；Armour et al.，1999，Eur J Immunol 29 :2613_2624 ； Shields et al. ,2001, J Biol Chem276 :6591_6604)(US 5,624,821 ；US 5，885，573 ;PCT W0 00/42072 ；PCT W099/58572)，全部引入作為參考。大多數(shù)替代降低或消除與Fc Y R的 結(jié)合。然而，在獲得具有更高FcyR親和力的Fc變體方面已經(jīng)獲得了一些成功。(參見例 如US 5，624，821和PCT W0 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的位置 235替代人氨基酸(谷氨酸到亮氨酸的突變)，將小鼠抗體與人FcyRI的結(jié)合增強(qiáng)了 100 倍(Duncan et al. , 1988, Nature 332 :563_564) (US5, 624，821)。Shields 等用丙氨酸掃描 誘變來定位對Fc y R結(jié)合重要的Fc殘基，隨后用非丙氨酸突變替代挑選的殘基(Shields et al. ,2001,J Biol Chem276 :6591_6604 ；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30 487-490) (PCT W000/42072)，加入作為參考。還用通過在改造或變體細(xì)胞系中表達(dá)抗體而產(chǎn)生的改造糖型實(shí)現(xiàn)了 Fc對FcyR ±曾強(qiáng)的親和力(Urnaflaet al.，1999，Nat Biotechnol 17 176-180 ；Davieset al.，2001， Biotechnol Bioeng 74288-294 ；Shields et al. ,2002, J Biol Chem277 :26733_26740 ; Shinkawa et al. ,2003, J Biol Chem 278 :3466_3473，引入作為參考)。該方法已造成抗 體結(jié)合Fc yRIIIa和介導(dǎo)ADCC能力的增強(qiáng)?？贵w的另一種主要缺點(diǎn)是它們需要生產(chǎn)要求(Garber，2001，Nat Biotechnol 19: 184-185 ；Dove, 2002, Nat Biotechnol 20 :777_779，引入作為參考)?？贵w必須在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)，并且目前市售的抗體連同其它高需求生物治療劑本質(zhì)上耗費(fèi)了所有可用的 生產(chǎn)能力。開發(fā)中的數(shù)百種生物制劑中，大多數(shù)是抗體，急需更有效且更廉價(jià)的生產(chǎn)方法。 抗體生產(chǎn)能力不足的后續(xù)影響是三重的。首先，它顯著提高生產(chǎn)商的商品成本，該成本轉(zhuǎn)移 到患者身上。第二，它阻礙已批準(zhǔn)的抗體產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)，限制高需求治療劑對患者的可用 性。最后，因?yàn)榕R床試驗(yàn)需要大量尚不能盈利的蛋白質(zhì)，供給不足阻礙增長中的抗體供應(yīng)渠 道向市場發(fā)展。
已經(jīng)在企圖緩和該問題的嘗試中探索了替代性生產(chǎn)方法。正在尋求轉(zhuǎn)基因植物和 動(dòng)物作為可能更廉價(jià)且能力更高的生產(chǎn)系統(tǒng)(Chadd et al.，2001，Curr Op in Biotechnol 12:188-194，引入作為參考)。然而，這樣的表達(dá)系統(tǒng)卻可能生成明顯不同于人糖蛋白的糖 基化樣式。這可能導(dǎo)致效應(yīng)器功能降低乃至缺乏，因?yàn)槿缫陨纤懻摰?，碳水化合物結(jié)構(gòu)能 顯著影響Fc y R和補(bǔ)體結(jié)合。非人糖型的潛在更大問題可能是免疫原性；碳水化合物是對 免疫系統(tǒng)而言抗原性的關(guān)鍵來源，非人糖型的存在有引發(fā)中和治療劑的抗體的重大機(jī)會(huì)， 或者更糟的是引起不良免疫反應(yīng)。因此，由轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物生成的抗體的功效和安全性 仍不確定。細(xì)菌表達(dá)是解決抗體生產(chǎn)問題的另一種有吸引力的辦法。細(xì)菌例如大腸桿菌中 的表達(dá)提供了有成本效益且能力高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)諸如抗體，細(xì)菌 表達(dá)有許多障礙，包括這些復(fù)雜分子的折疊與組裝、正確二硫化物形成、以及缺乏糖基化時(shí) 的溶解度、穩(wěn)定性、和功能性，因?yàn)樵诩?xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)是不糖基化的。已經(jīng)在大腸桿菌 中成功表達(dá)了結(jié)合抗原的全長未糖基化抗體(Simmons et al. ,2002, J Immunol Methods 263 :133-147，引入作為參考)，因此，在缺乏真核陪伴機(jī)制時(shí)由細(xì)菌表達(dá)的抗體有可能折 疊、裝配、和形成正確二硫化物。然而，由細(xì)菌表達(dá)的抗體用作治療劑的最終效用仍然受糖 基化缺乏的阻礙，它導(dǎo)致缺乏效應(yīng)器功能并可能導(dǎo)致弱穩(wěn)定性和溶解度。對于在高濃度配 制，對于臨床應(yīng)用要求的長時(shí)段，這很可能更成問題?？傊枰哂性鰪?qiáng)的治療特性的抗體。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了優(yōu)化了許多治療學(xué)相關(guān)特性的Fc變體。這些Fc變體通常包含于變 體蛋白質(zhì)內(nèi)，其優(yōu)選包含抗體或Fc融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的Fc位置，在此可以進(jìn)行氨基酸修飾以生成優(yōu)化的 Fc 變體。所述 Fc 位置包括 230、240、244、245、247、262、263、266、273、275、299、302、313、 323、325、328、和332，其中Fc區(qū)殘基的編號為Kabat中的EU索引(EU index)。本發(fā)明描 述了在任何所述新的Fc位置的任何氨基酸修飾，目的是生成優(yōu)化的Fc變體。本發(fā)明的又一目的是提供本文已經(jīng)表征的Fc變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變 體在選自下組的位置包含至少一個(gè)氨基酸替代221、222、223、224、225、227、228、230、231、 232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、 262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、 283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、 304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、 335、336、和337，其中Fc區(qū)殘基的編號為Kabat中的EU索引。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述Fc變體包含至少一個(gè)選自下組的替代D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、 H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、 P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、 P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、 E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、 L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、 L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、 L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q,S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q,S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E293G、E293H、E293I、E293L、E293M、E293N、E293P、E293R、E293S、E293T、E293V、E293W、E293Y、E294F、E294G、E294H、E294I、E294K、E294L、E294M、E294P、E294R、E294S、E294T、E294V、E294W、E294Y、Q295D、Q295E、Q295F、Q295G、Q295H、Q295I、Q295M、Q295N、Q295P、Q295R、Q295S、Q295T、Q295V、Q295W、Q295Y、Y296A、Y296D、Y296E、Y296G、Y296H、Y296I、Y296K、Y296L、Y296M、Y296N、Y296Q、Y296R、Y296S、Y296T、Y296V、N297D、N297E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、N297R、N297S、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、S298N、S298Q,S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324L、S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328E、L328F、L328G、L328H、L328I、L328K、L328M、L328N、L328P、L328Q、L328R、L328S、L328T、L328V、L328W、L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H、和S337N，其中Fc區(qū)殘
基的編號為Kabat中的EU索引。這組變體有時(shí)稱為本發(fā)明的“單一變體組(the single variant set)，，。本發(fā)明的另一方面是提供與親本Fc多肽例如Fc區(qū)SEQ ID N0:X相比具有至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9和10個(gè)或更多氨基酸替代的Fc變體(和包含這些變體的蛋白質(zhì))。在 有些實(shí)施方案中，1、2、3和4個(gè)替代特別有用。本發(fā)明的又一方面是提供與親本Fc多肽例如SEQ ID NO :X的Fc區(qū)相比展示改變 的Fc配體結(jié)合且由在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼人Fc多肽的基因雜交的核酸編碼的Fc變體(和 包含這些變體的蛋白質(zhì))。高嚴(yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域已知的；參見例如美國專利6，875，846，在 此引入作為參考，特別是對于高嚴(yán)謹(jǐn)條件。編碼人Fc多肽的基因通常為更大基因的片段， 且也是本領(lǐng)域已知的，以及由于遺傳密碼的簡并性而將編碼天然發(fā)生的Fc多肽的基因，即 便其本身不是天然發(fā)生的。本發(fā)明的另一方面是提供展示改變的ADCC活性，特別是增強(qiáng)的ADCC活性的變體 Fc多肽。在有些方面，這些變體包含位置239的氨基酸替代，任選位置239和332的氨基酸 替代，且任選可以包含上述單一變體組中概括的任何其它替代，以構(gòu)建包含多重替代的變 體。本發(fā)明的又一目的是提供本文已經(jīng)表征的Fc變體，其中所述Fc變體選自下組 D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、 P227G、P227K、P227Y、P228F、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230A/E233D、P230A/E233D/ I332E、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、 P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、 E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234I/L235D、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、 L234W、L234Y、L235A、L235D、L235D/S239D/A330Y/I332E、L235D/S239D/N297D/I332E、 L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、 L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、 G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、 G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、 G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、 P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239D/A330L/I332E、
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N297D/I332E/T299F、N297D/I332E/T299H、N297D/I332E/ T299I、N297D/I332E/T299L、N297D/I332E/T299V, N297D/I332E/Y296D、N297D/I332E/ Y296E、N297D/I332E/Y296H、N297D/I332E/Y296N、N297D/I332E/Y296Q、N297D/I332E/ Y296T、N297E/I332E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、 N297R、N297S、N297S/I332E、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298A/I332E、S298A/K326E、 S298A/K326E/K334L、S298A/K334L、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、 S298N、S298Q、S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、 T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、 Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、 S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、 E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、 K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、 K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324I/A327D、S324L、 S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、 N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、 N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、 A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328D/ I332E、L328E、L328E/I332E、L328F、L328G、L328H、L328H/I332E、L328I、L328I/I332E、 L328I/I332E、L328K、L328M、L328M/I332E、L328N、L328N/I332E、L328P、L328Q, L328Q/ I332E、L328Q/I332E、L328R、L328S、L328T、L328T/I332E、L328V、L328V/I332E、L328W、 L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、 P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、 A330L/I332E、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、A330Y/ I332E、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、 P331Y、 I332A、 I332D、 I332E、 I332E/G281D、 I332E/H268D、 I332E/H268E、 I332E/S239D/ S298A、 I332E/S239N/S298A、 I332E/V264I/S298A、 I332E/V284E、 I332F、 I332H、 I332K、 I332L、 I332M、 I332N、 I332P、 I332Q、 I332R、 I332S、 I332T、 I332V、 I332W、 I332Y、 E333F、 E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334P、K334T、T335D、 T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、 T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H、和 S337N，其中 Fc 區(qū)殘基的編號為 Kabat 中的 EU索引。本發(fā)明的又一目的是提供以更高親和力結(jié)合一種或多種Fc Y R的Fc變體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體具有比親本Fc多肽高1倍以上的對Fc y R的親和力。在一個(gè) 備選的實(shí)施方案中，所述Fc變體具有比親本Fc多肽高5倍以上的對Fc Y R的親和力。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體具有比親本Fc多肽高約5倍與300倍之間的對Fc YR 的親和力。本發(fā)明的又一目的是提供具有大于1 1的FcyRIIIa倍數(shù)FcyRIIb倍數(shù)比的 Fc變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體具有大于11 1的FcyRIIIa倍數(shù)Fc Y Rllb 倍數(shù)比。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體具有11 1與86 1之間的FcyRIIIa 倍數(shù)FcyRIIb倍數(shù)比。本發(fā)明的又一目的是提供在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)更有效的介導(dǎo)效應(yīng)器功能的Fc變 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體介導(dǎo)ADCC，其大于由親本Fc多肽介導(dǎo)的ADCC。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體介導(dǎo)ADCC，其比由親本Fc多肽介導(dǎo)的ADCC大5倍以上。 在大部分優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fc變體介導(dǎo)ADCC，其比由親本Fc多肽介導(dǎo)的ADCC大5 倍與1000倍之間。本發(fā)明的又一目的是提供以更弱親和力結(jié)合一種或多種Fc Y R的Fc變體。本發(fā)明的又一目的是提供在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)以更低效率介導(dǎo)ADCC的Fc變體。本發(fā)明的又一目的是提供與無糖基化形式的親本Fc多肽相比具有改善的功能和 /或溶解特性的Fc變體。本文改善的功能性包括但不限于對Fc配體的結(jié)合親和力。本文 改善的溶解特性包括但不限于穩(wěn)定性和溶解度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc變體以糖基化 形式親本Fc多肽的約0. 5倍內(nèi)的親和力結(jié)合Fc y R。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，所述無糖 基化Fc變體以與糖基化親本Fc多肽可比的親和力結(jié)合FcyR。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中， 所述Fc變體以高于糖基化形式親本Fc多肽的親和力結(jié)合Fc y R。本發(fā)明還提供了改造優(yōu)化的Fc變體的方法。本發(fā)明的又一目的是提供用于獲得 優(yōu)化的Fc變體的試驗(yàn)性生產(chǎn)和篩選方法。本發(fā)明提供了編碼本文描述的Fc變體的分離核酸。本發(fā)明提供了包含所述核酸 的載體，任選的是所述核酸與控制序列可操作連接。本發(fā)明提供了包含所述載體的宿主細(xì) 胞，以及用于生產(chǎn)和任選回收Fc變體的方法。本發(fā)明提供了新的Fc多肽，包括抗體、Fc融合物、分離的Fc、和Fc片段，其包含本 文公開的Fc變體。所述新的Fc多肽可用于治療性產(chǎn)品。本發(fā)明提供了包含F(xiàn)c多肽和生理學(xué)或制藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的組合物，所 述Fc多肽包含本文描述的Fc變體。本發(fā)明設(shè)想了 Fc多肽的治療和診斷用途，所述Fc多肽包含本文公開的Fc變體。本發(fā)明還涉及如下方面1.包含人Fc多肽(SEQ ID N0:1)的Fc變體的蛋白質(zhì)，其中所述變體與人Fc多 肽相比展示對Fc配體改變的結(jié)合，其中所述變體具有如下通式，它包含Vb (221) -Vb (222) -Vb (223) -Vb (224) -Vb (225) -Fx (226) -Vb (227) -Vb (228) -Fx (22 9) -Vb (230) -Vb (231) -Vb (232) -Vb (233) -Vb (234) -Vb (235) -Vb (236) -Vb (237) -Vb (238) -Vb (239) -Vb (240) -Vb (241) -Fx (242) -Vb (243) -Vb (244) -Vb (245) -Vb (246) -Vb (247) -Fx (248) -Vb (249) -Fx (250-254) -Vb (255) -Fx (256-257) -Vb (258) -Fx (259) -Vb (260) -Fx (261) -Vb (2 62) -Vb (263) -Vb (264) -Vb (265) -Vb (266) -Vb (267) -Vb (268) -Vb (269) -Vb (270) -Vb (271) -V b (272) -Vb (273) -Vb (274) -Vb (275) -Vb (276) -Fx (277) -Vb (278) -Fx (279) -Vb (280) -Vb (281 )-Vb (282) -Vb (283) -Vb (284) -Vb (285) -Vb (286) -Fx (287) -Vb (288) -Fx (289) -Vb (290) -Vb ( 291) -Vb (292) -Vb (293) -Vb (294) -Vb (295) -Vb (296) -Vb (297) -Vb (298) -Vb (299) -Vb (300)-Vb (301) -Vb (302) -Vb (303) -Vb (304) -Vb (305) -Fx (306-312) -Vb (313) -Fx (314-316) -Vb (31 7) -Vb (318) -Fx (319) -Vb (320) -Fx (321) -Vb (322) -Vb (323) -Vb (324) -Vb (325) -Vb (326) -Vb (327) -Vb (328) -Vb (329) -Vb (330) -Vb (331) -Vb (332) -Vb (333) -Vb (334) -Vb (335) -Vb (336) -Vb (337)；其中Vb(221)選自 D、K和 Y ;Vb (222)選自 K、E 和 Y ;Vb(223)選自 T、E 和 K ;Vb (224)選自 H、E 和 Y ;Vb(225)選自 T、E、K 和 W ;Fx (226)為 C ；Vb(227)選自 P、E、G、K、Y ;
￥b(272)選自E、D、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W、Y
Vb(273)選自V、I ；
Vb(274)選自K、D、E、F、G、H、L、M、N、P、R、T、V、ff>Y；
Vb(275)選自F、L、W ；
Vb (276)選自N、D、E、F、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、ff>Y；
Fx (277)為w
Vb (278)選自Y、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、s、T、V、ff
Fx (279)為V
Vb (280)選自D、G、K、L、P、W ;
Vb(281)選自G、D、E、K、N、P、Q、Y ;
Vb (282)選自V、E、G、K、P、Y ;
Vb (283)選自E、G、H、K、L、P、R、Y ;
Vb(284)選自V、D、E、L、N、Q、T、Y ;
Vb (285)選自H、D、E、K、Q、W、Y ;
Vb (286)選自N、E、G、P、Y ;
Fx (287)選自A；
Vb (288)選自K、D、E、Y ;
Fx (289)為T
Vb (290)選自K、D、H、L、N、W ;
Vb(291)選自P、D、E、G、H、I、Q、T ;
Vb (292)選自R、D、E、T、Y ;
Vb (293)選自E、F、G、H、I、L、M、N、P、R、S、T、V、ff>Y
Vb(294)選自E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、ff>Y
Vb (295)選自Q、D、E、F、G、H、I、M、N、P、R、S、T、V、ff>Y
Vb (296)選自Y、A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、s、T、V
Vb (297)選自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、s、T、V、ff>
Vb (298)選自S、D、E、F、H、I、K、M、N、Q、R、T、ff>Y
Vb (299)選自T、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、
Vb (3
Vb(3
Vb (302)選自V、I ；
Vb (303)選自V、D、E、Y ;
Vb(304)選自S、D、H、L、N、T ；
Vb (305)選自V、E、T、Y ;
Fx(306-312)為-(L-T-V-L-H-Q-D)-；
Vb(313)選自ff>F ；
Fx (314-316)為-(L-N-G)-；
Vb(317)選自K、E、Q ;
Vb(318)選自E、H、L、Q、R、Y ；0126]Fx (319)為Y 0127]Vb (320)選自K、D、F、G、H、I、L、N、P、S、T、V、ff>Y0128]Fx (321)為c 0129]Vb(322)選自K、D、F、G、H、I、P、S、T、V、ff>Y0130]Vb(323)選自V、I0131]Vb(324)選自S、D、F、G、H、I、L、M、P、R、T、V、ff>Y0132]Vb(325)選自N、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、s、T、V、W、Y0133]Vb (326)選自K、I、L、P、T0134]Vb(327)選自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、ff>Y0135]Vb (328)選自L、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、s、T、V、W、Y0136]Vb (329)選自P、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、ff>Y ；0137]Vb (330)選自A、E、F、G、H、I、L、M、N、P、R、S、T、V、ff>Y0138]Vb(331)選自P、D、F、H、I、L、M、Q、R、T、V、ff>Y0139]Vb(332)選自I、A、D、E、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、s、T、V、ff>Y ；0140]Vb(333)選自E、F、H、I、L、M、N、P、T、Y0141]Vb(334)選自K、F、I、L、P、T0142]Vb(335)選自T、D、F、G、H、I、L、M、N、P、R、S、V、ff>Y0143]Vb (336)選自I、E、K、Y0144]Vb(337)選自S、E、H、N ；且其中所述變體與SEQ ID N0:1相比包含一至四個(gè)氨基酸替代。2.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中所述替代選自下組G236S、G236A、S239D、S239E、S239N、 S239Q、S239T、K246H、T260H、K246Y、D249Y、R255Y、E258Y、V264I、S267E、H268D、H268E、 E272Y、E272I、E272H、K274E、G281D、E283L、E283H、S304T、S324G、S324I、K326T、A327D、 A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、E333Y、K334T、和 K334F，其中編號依照 EU索引。3.項(xiàng)2的蛋白質(zhì)，其中所述Fc變體選自下組S239D/I332E、S239D/G236A、S239D/
G236S、S239D/々2641、S239D//H268D、S239D/'H268E、S239D//S298A,S239D/'K326E、S239D/A330L、S239D/,A330Y、S239D//A330I、I332E/ 264I、I332E/ZH268D、I332E/'H268E、I332E/S298A、I332E/,K326E、I332E/,A330L、I332E/'A330Y、I332E/'A330I、I332E/'G236A、I332E/G236S、I332D/12641、I332D/ZH268D、I332D/'H268E、I332D/'S298A、I332D/'K326E、I332D/A330L、I332D/'A330Y、I332D/13301、I332D/,G236A、I332D,/G236S、S239D,/K246H/'I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/'S267E/I332E、S239D/'H268D/'I332E、S239D//H268E/'I332E、S239D/S298A/I332E、S239D/'S324G/I332E、S239D/'S324I/'I332E、S2 39D,/K326T/'I332E、S239D/'K326E/'I332E、S239D//K326D/I332E、S239D/'A327D/1332E、S239D,/A330L/'I332E、S239D/'A330Y/'I332E、S239D/13301/I332E、S239D/'K334T/1332E、S239D,/K246H/'T260H/I332E、S239D,/K246H/'H268D/1332E、S239D,/K246H/'H268E/1332E、S239D,/H268D//S324G/I332E、S239D,/H268E//S324G/1332E、S239D,/H268D/'K326T/1332E、S239D,/H268E/'K326T/I332E、S239D,/H268D/'A330L/1332E、S239D,/H268E/'A330L,,I332E、S239D,/H268D/'A330Y/I332E、S239D,/H268E/'A330Y/1332E、S239D,/S298A//S267E/1332E、S239D,/S298A/'H268D/I332E、 S239D/S298A/H268E/I332E、 S239D/S298A/S324G/I332E、 S239D/S298A/S324I/ I332E、 S239D/S298A/K326T/I332E、 S239D/S298A/K326E/I332E、 S239D/S298A/A327D/ I332E、 S239D/S298A/A330L/I332E、 S239D/S298A/A330Y/I332E, S239D/K326T/A330Y/ I332E、S239D/K326E/A330Y/I332E、S239D/K326T/A330L/I332E、和 S239D/K326E/A330L/ I332E，其中編號依照EU索引。4.項(xiàng)2的蛋白質(zhì)，額外包含選自下組的替代S298A、K326E、K326D、K326A、E333A、 和K334A，其中編號依照EU索引。5.包含人Fc多肽(SEQ ID N0:1)的Fc變體的蛋白質(zhì)，所述Fc變體在所述親本 Fc多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中相對于一種或多種其它Fc配體來說，所述變 體蛋白質(zhì)選擇性增強(qiáng)與一種或多種Fc配體的結(jié)合，且其中所述Fc變體在選自下組的位點(diǎn) 包含替代:234、235、236、267、268、292、293、295、300、324、327、328、330、和 335，其中編號 依照EU索引。6.根據(jù)項(xiàng)5的蛋白質(zhì)，其中相對于Fc y RII來說，所述Fc變體增強(qiáng)與一種或多種 FcyRII的結(jié)合。7.根據(jù)項(xiàng)6的蛋白質(zhì)，其中所述Fc變體包含替代G236S或G236A。8.根據(jù)項(xiàng)5的蛋白質(zhì)，其中相對于FcyRIIb來說，所述Fc變體增強(qiáng)與FcyRIIa 或Fc yRIIc的結(jié)合。9.根據(jù)項(xiàng)8的蛋白質(zhì)，其中所述Fc變體包含替代取代G236S或G236A。10.包含親本Fc多肽的Fc變體的蛋白質(zhì)，所述Fc變體在所述親本Fc多肽的Fc區(qū) 包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述變體蛋白質(zhì)減弱與一種或多種Fc配體的結(jié)合，且其中 所述Fc變體在選自下組的位置包含替代232、234、235、236、237、239、264、265、267、269、 270、299、325、328、329、和330，其中編號依照EU索引標(biāo)引。11.根據(jù)項(xiàng)10的蛋白質(zhì)，其中所述Fc變體在位置299或328包含替代，其中編號 依照EU索引。12.包含SEQ ID NO :5的蛋白質(zhì)，其中所述變體與人Fc多肽相比展示對Fc配體 改變的結(jié)合。附圖簡述圖1.抗體結(jié)構(gòu)與功能。顯示了全長人IgGl抗體的模型，它是使用來自pdb登錄 號 1CE1 (James et al.，1999，J Mol Biol 289 :293_301)的人源化 Fab 結(jié)構(gòu)和來自 pdb 登 錄號 1DN2 (DeLano et al.，2000，Science 287:1279-1283)的人 IgGlFc 結(jié)構(gòu)建模的。沒有 顯示連接Fab和Fc區(qū)的柔性鉸鏈。IgGl是異二聚體的同二聚體，由兩條輕鏈和兩個(gè)重鏈組 成。標(biāo)示了構(gòu)成所述抗體的Ig結(jié)構(gòu)域，包括輕鏈的八和Q，以及重鏈的VH、C伽馬1 (C Y 1)、 C伽馬2(Cy2)、和C伽馬3(CY3)。標(biāo)示了 Fc區(qū)。標(biāo)示了相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，包括可 變區(qū)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及Fc區(qū)中Fc y R、FcRn、Clq及蛋白質(zhì)A和G的結(jié)合位點(diǎn)。圖2. Fc/Fc y RHIb復(fù)合物結(jié)構(gòu)1IIS。Fc顯示為灰色條帶圖樣，而Fc Y RHIb顯 示為黑色條帶。N297碳水化合物顯示為黑色棒狀。圖3a-3b.人IgG免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4的氨基酸序列的比對。圖 3a提供了 CHI (C y 1)和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的序列，而圖3b提供了 CH2 (C y 2)和CH3 (C y 3)結(jié)構(gòu)域 的序列。根據(jù)IgGl序列的EU索引為位置編號，而IgGl與其它免疫球蛋白IgG2、IgG3、和IgG4之間的差異以灰色顯示。在許多位置存在多態(tài)性(Kim et al.，2001，J. Mol. Evol. 54 1-9)，因此在所呈現(xiàn)的序列和現(xiàn)有技術(shù)中的序列之間可能存在微小差異。標(biāo)示了 Fc區(qū)可能 的起點(diǎn)，本文定義為EU位置226或230。圖4.在本發(fā)明的Fc變體中進(jìn)行氨基酸修飾的殘基，定位到Fc/FcyRIIIb復(fù)合物 結(jié)構(gòu)1IIS上。Fc顯示為灰色條帶圖樣，而FcyRIIIb顯示為黑色條帶。試驗(yàn)文庫殘基顯示 為黑色，N297碳水化合物顯示為灰色。圖5. 293T細(xì)胞中alemtuzumab的Fc變體和野生型(WT)蛋白質(zhì)的表達(dá)。包含 alemtuzumab重鏈基因(WT或變體)的質(zhì)粒與包含alemtuzumab輕鏈基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染后5天收獲培養(yǎng)基。對于每個(gè)轉(zhuǎn)染的樣品，將10ul培養(yǎng)基上樣到SDS-PAGE凝膠上 用于Western分析。用于Western的探針為綴合有過氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson Immuno-Research, catalog#109-035_088)。WT 野生型 alemtuzumab ；1-10 alemtuzumab 變體。H和L分別指抗體重鏈和輕鏈。圖6.用蛋白質(zhì)A層析純化alemtuzumab。在293T細(xì)胞中表達(dá)WTalemtuzumab蛋 白質(zhì)，并在轉(zhuǎn)染后5天收獲培養(yǎng)基。用PBS 1 1稀釋所述培養(yǎng)基，并用蛋白質(zhì)A(PierCe， Catalog#20334)純化。0 純化前的原始樣品；FT 流出液(flow through) ；E 洗脫液；C 濃縮的最終樣品。左圖顯示了簡單藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠，而右圖顯示了用綴合有過氧化 物酶的山羊抗人IgG標(biāo)記的western印跡。圖7.脫糖基化抗體的生產(chǎn)。在293T細(xì)胞中表達(dá)alemtuzumab的野生型和變體， 并用蛋白質(zhì)A層析純化。將抗體與肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37° °C保溫24小時(shí)。對 于每種抗體，平行操作模擬處理樣品(-PNGase F)。WT 野生型alemtuzumab ;#15、#16、 #17、#18、#22 分別為 alemtuzumab 變體 F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/ V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、和 I332E。PNGaseF 處理樣 品較之模擬處理樣品的遷移更快代表重鏈脫糖基化。圖8.由293T細(xì)胞表達(dá)的alemtuzumab結(jié)合其抗原。在IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌 BL21 (DE3)中表達(dá)與GST融合的抗原性⑶52肽。未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的樣品均在SDS-PAGE凝膠 上跑電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。為進(jìn)行western分析，將來自Sotec (a_⑶52，Sotec)(終濃度 2. 5ng/ul)的 alemtuzumab 或經(jīng)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)基(Campath, Xencor) (alemtuzumab 終濃度大約0. 1-0. 2ng/ul)用作一抗，而將綴合有過氧化物酶的山羊抗人IgG用作二抗。M 染色前標(biāo)記 ’U :GST-CD52的未誘導(dǎo)樣品；I :GST-CD52的誘導(dǎo)樣品。圖9.人V158Fc YRIIIa胞外區(qū)的表達(dá)和純化。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶標(biāo)簽的 Fc y RHIa, 3天后收獲含有分泌的Fc yRIIIa的培養(yǎng)基并用親和層析純化。1 培養(yǎng)基；2 流出液；3 洗滌液；4-8 系列洗脫液。顯示了簡單藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠和western 二者 結(jié)果。為進(jìn)行western印跡，用抗GST抗體探查膜。圖10.通過AlphaScreen 測定法測定的從試驗(yàn)文庫挑選的alemtuzumab Fc 變體與人V158Fc yRIIIa的結(jié)合，描述于實(shí)施例2。在存在競爭物抗體(Fc變體或WT alemtuzumab)時(shí)，通過發(fā)光信號降低觀測到特征性抑制曲線。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)單獨(dú) 用作陰性對照。對于每條特定曲線，將結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為最大和最小發(fā)光信號，其分別由低 和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。曲線呈現(xiàn)了采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)對單一位點(diǎn)競爭模 型(one site competition model)的擬合。這些擬合為每種抗體提供了 IC50，對于WT和S239D，以點(diǎn)線顯示。圖 11a 和 lib.顯示挑選的 alemtuzumab(圖 11a)和 trastuzumab (圖 llb)Fc 變 體與人Vall58Fc yRIIIa結(jié)合的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖12 顯示挑選的alemtuzumab Fc變體與人Fc Y Rllb結(jié)合的AlphaScreen測 試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位 點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖 13.顯示挑選的 alemtuzumab Fc 變體與人 R131Fc y Rlla 結(jié)合的 AlphaScreen 測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一 位點(diǎn)競爭模型的擬合。圖14.測量挑選的alemtuzumab Fc變體與人FcRn結(jié)合的AlphaScreen測試，描 述于實(shí)施例2。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù) 據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖15.測量挑選的alemtuzumab Fc變體與細(xì)菌蛋白質(zhì)A結(jié)合的AlphaScreen測 試，描述于實(shí)施例2。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所 述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖 16a_16b.比較挑選的 alemtuzumab Fc 變體與人 V158Fc Y Rllla (圖 16a)和人 FcyRIIb (圖16b)結(jié)合的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為 上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖17a_17b.測量trastuzumab的背景中挑選的Fc變體與人V158Fc Y Rllla(圖 17a和17b)和人Fc YRIIb (圖17c)結(jié)合的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié) 合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰 性對照。圖18.測量rituximab的背景中挑選的Fc變體與人V158FcyRIIIa結(jié)合的 AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所 述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖19.測量cetuximab的背景中挑選的Fc變體與人V158FcyRIIIa結(jié)合的 AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所 述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖 20a_20b.顯示挑選的 alemtuzumab Fc 變體與人 Fc Y Rllla 的 V158 (圖 20a) 和F158(圖20b)同種異型結(jié)合的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖21a_21d.圖21a和21b顯示了來自挑選的alemtuzumab Fc變體與 V158Fc yRIIIa (圖 21a)和 F 158Fc y Rllla (圖 21b)的結(jié)合，SPR Kd 與 AlphaScreen IC50 之間的相關(guān)性。圖21c和21d顯示了對于挑選的alemtuzumab Fc變體與V158Fc y Rllla(圖 21c)和F158Fc yRIIIa (圖21d)的結(jié)合，較之WT的STO和AlphaScreen倍數(shù)提高之間的相 關(guān)性。結(jié)合數(shù)據(jù)列于表3。數(shù)據(jù)中的線代表數(shù)據(jù)的線性擬合，r2值指示這些擬合的顯著性。圖22a和22b.顯示挑選的alemtuzumab Fc變體與人V158Fc Y Rllla結(jié)合的 AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖23a_23b. alemtuzumab的背景中挑選的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試。使 用DoHH-2淋巴瘤靶細(xì)胞和50倍過量的人PBMC，利用基于DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒 性測定法(Perkin Elmer, MA)測量ADCC，描述于實(shí)施例3。圖23a的條形圖顯示了指定 alemtuzumab抗體于lOng/ml時(shí)的原始熒光數(shù)據(jù)。PBMC條指示不存在抗體時(shí)細(xì)胞毒性的基 礎(chǔ)水平。圖23b顯示了對于指定的alemtuzumab抗體，ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對于每 一條特定曲線，標(biāo)準(zhǔn)化至最小和最大熒光信號，其分別由低和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。 曲線呈現(xiàn)了采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖24a_24c. trastuzumab的背景中挑選的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試。使用
BT474和Sk-Br-3乳癌靶細(xì)胞和50倍過量的人PBMC，利用基于DELFIA EuTDA的細(xì)胞 毒性測定法測量ADCC，描述于實(shí)施例3。圖24a的條形圖顯示了指定trastuzumab抗體于 lng/ml時(shí)的原始熒光數(shù)據(jù)。PBMC條指示不存在抗體時(shí)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)水平。圖24b和24c 顯示了對于指定的trastuzumab抗體，ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對于每一條特定曲線， 標(biāo)準(zhǔn)化至最小和最大熒光信號，其分別由低和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。曲線呈現(xiàn)了采 用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖25a-25C.rituXimab的背景中挑選的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試。使用 WIL2-S淋巴瘤靶細(xì)胞和50倍過量的人PBMC，利用基于DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測定 法測量ADCC，描述于實(shí)施例3。圖25a的條形圖顯示了指定的rituximab抗體于lng/ml時(shí) 的原始熒光數(shù)據(jù)。PBMC條指示不存在抗體時(shí)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)水平。圖25b和25c顯示了對 于指定的rituximab抗體，ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對于每一條特定曲線，標(biāo)準(zhǔn)化至最 小和最大熒光信號，其分別由低和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。曲線呈現(xiàn)了采用非線性回 歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖26a_26b.顯示效力和功效增強(qiáng)的挑選的trastuzumab (圖26a)和 rituximab (圖26b) Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試。兩項(xiàng)測試均使用純合F158/F 158Fc y RHIa PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞且25倍過量于靶細(xì)胞，靶細(xì)胞對于trastuzumab測試為 Sk-Br-3細(xì)胞而對于rituximab測試為WIL2-S細(xì)胞。數(shù)據(jù)依據(jù)所述測試的絕對最小裂解和 所述測試的絕對最大裂解標(biāo)準(zhǔn)化，所述絕對最小裂解由僅存在PBMC (無抗體)時(shí)靶細(xì)胞的 熒光信號提供，所述絕對最大裂解由存在Triton X1000時(shí)靶細(xì)胞的熒光信號提供，描述于 實(shí)施例3。圖 27.顯示挑選的 alemtuzumab Fc 變體與人 V158Fc Y Rllla 結(jié)合的 AlphaScreen 測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一 位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖28. ADCC。與WT trastuzumab相比，挑選的Fc變體trastuzumab抗體基于細(xì)胞 的ADCC測試。使用純化的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為效應(yīng)細(xì)胞，而使用Sk-Br-3乳癌 細(xì)胞作為靶細(xì)胞。通過使用細(xì)胞毒性檢測試劑盒(LDH，Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN)測量LDH活性來監(jiān)測裂解。樣品運(yùn)行三份以提供誤差評估(n = 3，+/_S. D.)。該圖顯示了不同抗體濃度時(shí)ADCC的劑量依賴，對于所述測試，標(biāo)準(zhǔn)化為最小和最大裂 解水平。曲線呈現(xiàn)了采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖29a_29b.針對表達(dá)不同水平Her2/neu靶抗原的不同細(xì)胞系，挑選的trastuzumab Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試。ADCC測定法如實(shí)施例5所述進(jìn)行，利用表達(dá)放 大至低水平Her2/neu受體的不同細(xì)胞系，包括Sk_Br_3 (lxlO6個(gè)拷貝)、SkOV3 ( lxlO5)、 0VCAR3 ( lxlO4)、和MCF-7 ( 3xl03個(gè)拷貝)。圖29a提供了顯示每種細(xì)胞系Her2表達(dá) 水平的western印跡；將等量細(xì)胞溶解產(chǎn)物上樣到SDS-PAGE凝膠上，并用trastuzumab檢 測Her2。以25倍過量于靶細(xì)胞使用同種異型為純合F158/F158Fc y Rllla的人PBMC。圖 29b的條形圖提供了 WT和Fc變體針對指定細(xì)胞系的ADCC數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化為由最小裂解(僅 PBMC)和最大裂解(Triton X1000)提供的最小和最大熒光信號。圖30. trastuzumab的背景中挑選的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試，其中使用天 然殺傷(NK)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，并測量LDH釋放以監(jiān)測細(xì)胞裂解。同種異型為雜合F158/ F158Fc yRIIIa的NK細(xì)胞4倍過量于Sk_Br_3乳癌靶細(xì)胞，并使用LDH細(xì)胞毒性檢測試劑 盒按照廠商的方案(Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)測量細(xì)胞毒性水平。該 圖顯示了對于指定的trastuzumab抗體，ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對于每一條特定曲 線，標(biāo)準(zhǔn)化至最小和最大熒光信號，其分別由低和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。曲線呈現(xiàn)了 采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖31.挑選的變體基于細(xì)胞的ADCP測試。采用與流式細(xì)胞術(shù)偶聯(lián)的共標(biāo)記策略， 如實(shí)施例7所述進(jìn)行ADCP測定法。使用分化的巨噬細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，而使用Sk-Br-3細(xì) 胞作為靶細(xì)胞。吞噬百分比指共標(biāo)記細(xì)胞(巨噬細(xì)胞+Sk-Br-3)相對于群體中Sk-Br-3總 數(shù)(吞噬的+未吞噬的)的數(shù)目。圖32a_32c.挑選的Fc變體介導(dǎo)補(bǔ)體結(jié)合與活化的能力。圖32a顯示了測量挑選 的alemtuzumab Fc變體結(jié)合Clq的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。圖32b和31c顯示了 基于細(xì)胞的測試，它測量挑選的rituximab Fc變體介導(dǎo)⑶C的能力。使用Alamar Blue實(shí) 施CDC測定法，以監(jiān)測人血清補(bǔ)體(Quidel，San Diego, CA)對經(jīng)過Fc變體和WT rituximab 調(diào)理的WIL2-S淋巴瘤細(xì)胞的裂解。對于指定的rituximab抗體，顯示了補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解對 抗體濃度的劑量依賴，對于每一條特定曲線，標(biāo)準(zhǔn)化至最小和最大熒光信號，其分別由低和 高抗體濃度時(shí)的基線所提供。曲線呈現(xiàn)了采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模 型的擬合。圖33a_33c.獼猴(macaque)中由Fc變體增強(qiáng)的B細(xì)胞損耗，描述于實(shí)施例9。 圖33a顯示了用抗CD20WT和S239D/I332E rituximab抗體處理期間，食蟹猴(Macaca Fascicularis)體內(nèi)殘余的B細(xì)胞百分比，利用標(biāo)志物CD20+和CD40+測得。圖33b顯示了 處理期間猴子體內(nèi)殘余的天然殺傷(NK)細(xì)胞百分比，利用標(biāo)志物⑶3-/⑶16+和⑶3-/⑶8+ 測得。圖33c顯示了 CD20+B細(xì)胞水平對S239D/I332E rituximab處理的劑量反應(yīng)。數(shù)據(jù) 以3只猴子/樣品的平均值提供。圖 34a 和 34b.測量挑選的 alemtuzumab (圖 34a)和 trastuzumab (圖 34b) Fc 變 體與小鼠FcyRIII結(jié)合的AlphaScreen測試，描述于實(shí)施例10。對于每種特定抗體，所述 結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作 陰性對照。圖35. trastuzumab背景中挑選的Fc變體基于細(xì)胞的ADCC測試，其中使用小鼠 PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞。利用基于DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測定法測量ADCC，其中使用Sk-Br-3乳癌靶細(xì)胞和8倍過量的小鼠PBMC。該條形圖顯示了指定trastuzumab抗體于 10ng/ml時(shí)的原始熒光數(shù)據(jù)。PBMC條指示不存在抗體時(shí)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)水平，而TX指示存 在Triton X1000時(shí)的完全細(xì)胞裂解。圖36。測量在293T和CH0細(xì)胞中表達(dá)的挑選的trastuzumab Fc變體結(jié)合人 V158FcyRIIIa的AlphaScreen測試，描述于實(shí)施例11。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對 照。圖37a_37b. Fc變體與改造糖型的協(xié)同作用。圖37a呈現(xiàn)了 AlphaScreen測試， 顯示 293T、CH0、和 Lec-13CH0 細(xì)胞中表達(dá)的 WT 和 Fc 變體(V209、S239/I332E/A330L) trastuzumab對V158Fc y Rllla結(jié)合。對于每種抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而 曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖37b呈現(xiàn)了基于 細(xì)胞的 ADCC 測試，顯示 239T、CH0、和 Lec_13CH0 表達(dá)的 WT 和 V209trastuzumab 介導(dǎo) ADCC 的能力。用Sk-Br-3乳癌靶細(xì)胞，利用前述基于DELFIA EuTDA的細(xì)胞毒性測定法測量 ADCC。所述數(shù)據(jù)顯示了對于指定trastuzumab抗體，ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對于每 一條特定曲線，標(biāo)準(zhǔn)化至最小和最大熒光信號，其分別由低和高抗體濃度時(shí)的基線所提供。 曲線呈現(xiàn)了采用非線性回歸時(shí)所述數(shù)據(jù)與S形劑量-反應(yīng)模型的擬合。圖38.顯示無糖基化alemtuzumab Fc變體與人V158Fc Y Rllla結(jié)合的 AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所 述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。PBS用作陰性對照。圖39.比較挑選的糖基化(實(shí)心符號，實(shí)線)和脫糖基化(空心符號，點(diǎn)線) alemtuzumab Fc變體結(jié)合人V158Fc y RHIa的AlphaScreen測試。對于每種特定抗體，所 述結(jié)合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為上下基線，而曲線呈現(xiàn)了所述數(shù)據(jù)與單一位點(diǎn)競爭模型的擬合。圖40a-40c.顯示改善的抗CD20抗體的序列。rituximab的輕鏈和重鏈序列分別 列于圖40a和圖40b，由US 5，736，137的翻譯序列3獲得。圖40b中的相關(guān)位置以粗體顯 示，包括 S239、V240、V264I、H268、E272、K274、N297、S298、K326、A330、和 1332。圖 40c 顯 示了改善的抗CD20抗體重鏈序列，可變位置以粗體表示并指定為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、 X8、X9、Z1JPZ2。序列下面的表提供了這些位置可能的替代。改善的抗⑶20抗體序列至 少包含一個(gè)選自乂132、乂33435363738、和乂9可能替代的非訂氨基酸。這些改善的 抗⑶20抗體序列還可包含替代Z1和/或Z2。這些位置按照Kabat中的EU索引編號，因此 與所述序列中的先后順序不對應(yīng)。圖41描繪了構(gòu)建并經(jīng)實(shí)驗(yàn)測試的一組Fc變體。圖42描繪了 SEQ ID NO 5 ；特定的Xaa殘基如表10所示。發(fā)明詳述為了更完全的理解本發(fā)明，下文列出了一些定義。這些定義意味著涵蓋語法等同 物。本文所用“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中 表達(dá)Fc y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞的裂解。本文所用“A2￡E”或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá) FcyR的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞的吞噬。
本文“氨基酸修飾”指多肽序列中的氨基酸替代、插入、和/或刪除。本文優(yōu)選的 氨基酸修飾是替代。本文“或“替代”指用另一種氨基酸置換親本多肽序列中 特定位置的一種氨基酸。例如，替代I332E指位置332的異亮氨酸替換為谷氨酸的變體多 肽，此處指Fc變體。在有些實(shí)施方案中，不需要確定WT類別。例如，替代332E指位置332 突變?yōu)楣劝彼岬淖凅w多肽。本文“ ■”指由一種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)，其中所述多肽基本上由整個(gè)或部 分公認(rèn)的免疫球蛋白基因編碼。所述公認(rèn)的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括卡帕(K)、 拉姆達(dá)(λ)、和重鏈遺傳基因座，其共同包含無數(shù)的可變區(qū)基因，以及恒定區(qū)基因謬(μ)、 德爾塔(S)、伽馬(Y)、西格馬(σ)、和阿爾法(α )，其分別編碼IgM、IgD、IgGUgEjPIgA 同種型。本文抗體意圖包括全長抗體和抗體片段，并且可以指來自任何生物體的天然抗體、 改造抗體、或用于試驗(yàn)、治療、或下文進(jìn)一步定義的其它目的的重組生產(chǎn)的抗體。術(shù)語“抗 體”包括本領(lǐng)域已知的抗體片段，諸如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv, scFv、或抗體的其它抗原 結(jié)合子序列，或是通過修飾完整抗體而生成的或是利用重組DNA技術(shù)從頭合成的。特別優(yōu) 選包括本文描述的Fc變體的全長抗體。術(shù)語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體?？贵w可以 是拮抗劑、激動(dòng)劑、中和性的、抑制性的、或刺激性的。本發(fā)明的抗體可以是非人的、嵌合的、 人源化的、或完全是人的，如下文更詳細(xì)描述的。“抗體”的定義明確包括無糖基化的抗體。本文所用“無糖某化杭體”指缺乏附著 于Fc區(qū)位置297的碳水化合物的抗體，其中編號依照Kabat的EU系統(tǒng)。所述無糖基化抗 體可以是脫糖基化抗體，即已經(jīng)例如化學(xué)或酶學(xué)去除了 Fc碳水化合物的抗體?；蛘?，所述 無糖基化抗體可以是非糖基化或未糖基化抗體，即表達(dá)時(shí)就沒有Fc碳水化合物的抗體，例 如通過突變編碼糖基化樣式的一個(gè)或多個(gè)殘基或者通過在不將碳水化合物附著于蛋白質(zhì) 的生物體例如細(xì)菌中表達(dá)?！翱贵w”的定義明確包括包含F(xiàn)c變體部分的全長抗體。本文“全長抗體”指構(gòu)成 天然生物學(xué)形式抗體的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。例如，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物包括人和小鼠 中，IgG類的全長抗體為四聚體，由兩對相同的兩條免疫球蛋白鏈組成，每一對具有一條輕 鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域\和Q，每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 VH>Cyl (ChI)、C γ 2 (Ch2)、和C γ 3 (CH3)。在有些哺乳動(dòng)物中，例如在駱駝和美洲駝(llama) 中，IgG抗體可以僅由兩條重鏈組成，每條重鏈包含附著于Fc區(qū)的可變區(qū)。本文所用“IsT’ 指屬于基本上由公認(rèn)的免疫球蛋白伽馬基因編碼的抗體類別的多肽。在人類中，此類別包 含 IgGU IgG2、IgG3、和 IgG4。在小鼠中，此類另包含 IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3。本文所用“氨基酸”和“氨基酸種類(identity) ”指20種天然發(fā)生的氨基酸之一， 或者可能存在于特定的確定位置的任何非天然類似物。本文“蛋白質(zhì)”指至少兩個(gè)共價(jià)附 著的氨基酸，包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和肽。蛋白質(zhì)可以由天然發(fā)生的氨基酸和肽鍵組成， 或者由合成的肽模擬物結(jié)構(gòu)即“類似物”諸如類肽(P印toid)組成(參見Simon et al., 1992，Proc Natl Acad Sci USA89 (20) :9367，引入作為參考)，特別是當(dāng)要為患者施用LC 肽時(shí)。因此本文所用“氨基酸”、或“肽殘基”指天然發(fā)生的和合成的兩種氨基酸。例如，為 了本發(fā)明目的，認(rèn)為高苯丙氨酸(homophenylalanine)、瓜氨酸(citrulline)和正亮氨酸 (norleucine)是氨基酸?！鞍被帷边€包括亞氨基酸殘基，諸如脯氨酸和羥脯氨酸。側(cè)鏈可 以為(R)或(S)構(gòu)型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸為(S)或L-構(gòu)型。如果使用非天然發(fā)生的側(cè)鏈，則可以使用例如非氨基酸替代物以防止或阻滯體內(nèi)降解。本文所用“效應(yīng)器功能”指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體相互作用引起的生化事 件。效應(yīng)器功能包括但不限于ADCC、ADCP、和⑶C。本文所用“效應(yīng)細(xì)胞”指表汰一種或多 種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)器功能的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括但不限于單核細(xì) 胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒 淋巴細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、和Y YT細(xì)胞，并且可以來自任何生物體，包 括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。本文“文庫”指一組任何形式的Fc變體，包括但不限 于純化或非純化形式的一系列核酸或氨基酸序列、可變位置的一系列核酸或氨基酸替代、 包含編碼文庫序列的核酸的物理文庫、或包含F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)的物理文庫。本文所用“匹”或“g”指包含抗體恒定區(qū)但不排除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域的多肽。因此，F(xiàn)c指IgA、IgDjP IgG的最后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，IgE和 IgM的最后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域的柔性鉸鏈N-末端。對于IgA和 IgM, Fc可以包括J鏈。對于IgG，如圖1所示，F(xiàn)c包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域C伽馬2和C伽 馬3 (C γ 2禾口 C γ 3)以及C伽馬I(CyI)和C伽馬2 (C γ 2)之間的鉸鏈。盡管Fc區(qū)的邊界 可以變化，但人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為包含殘基C226或Ρ230至其羧基末端，其中所述 編號依照Kabat的EU索引。Fc可以指單獨(dú)的該區(qū)域，或者指Fc多肽背景中的該區(qū)域，如下 所述。本文所用“E^li”指包含整個(gè)或部分Fc區(qū)的多肽。Fc多肽包括抗體、Fc融合物、 分離的Fe、和Fc片段。本文所用“Fe融合物”指其中一種或多種多肽或小分子與Fc區(qū)可操作連接的蛋白 質(zhì)或其衍生物。本文Fc融合物與現(xiàn)有技術(shù)中使用的術(shù)語“免疫粘附素”、“Ig融合物”、“Ig 嵌合物”、和“受體球蛋白”(有時(shí)帶破折號)同義(Chamowet al.，1996，Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi et al. , 1997, Curr OpinImmunol 9 :195_200，弓|入) 。 Fc 融合物將免疫球蛋白的Fc區(qū)與融合伴侶組合起來，所述融合伴侶通?？梢詾槿魏蔚鞍踪|(zhì) 或小分子。Fc融合物的非Fc部分即融合伴侶的作用可以是介導(dǎo)靶物結(jié)合，因此其在功能上 類似于抗體的可變區(qū)。本文所用“Fe伽馬受體”或“Ε^χΕ”指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)的蛋白質(zhì)家族的任 何成員，其基本上由Fc γ R基因編碼。在人類中，該家族包括但不限于Fc y RI (⑶64)，包 括同種型 Fc γ RIa、Fc y Rib、和 Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，包括同種型 Fc γ RIIa(包括同 種異型 H131 禾口 R131)、Fc γ RIIb (包括 Fc γ RIIb-I 禾口 Fc y RIIb—2)、禾口 Fc γ RIIc ；以及 Fc yRIII(CD16)，包括同種型Fc ￥1 111&(包括同種異型￥158和卩158)和Fc γ RIIIb (包括 同種異型Fc y RIIIb-NAl和Fc y RIIIb_NA2)，以及任何未發(fā)現(xiàn)的人Fc γ R或Fc γ R同種型 或同種異型。Fc γ R可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠Fc YR 包括但不限于 Fc y RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、Fc γ RIII (CD16)、禾口 Fc γ RIII-2 (CD16-2)、 以及任何未發(fā)現(xiàn)的小鼠Fc γ R或Fc γ R同種型或同種異型。本文所用“Fe配體”或“效應(yīng)器配體”指來自任何生物體的結(jié)合抗體Fc區(qū)以形成 Fc/Fc配體復(fù)合物的分子，優(yōu)選多肽。Fc配體與Fc的結(jié)合優(yōu)選引發(fā)一種或多種效應(yīng)器功 能。Fc配體包括但不限于Fc受體，F(xiàn)cy R、Fca R、Fc ε R、FcRn、Clq、C3、甘露聚糖結(jié)合凝集 素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白質(zhì)A、鏈球菌蛋白質(zhì)G、和病毒Fc y R0 Fc配體還包括Fc受 體同系物(FcRH)，其為與 Fc γ R 同源的 Fc 受體家族(Davis et al. ,2002, ImmunologicalReviewsl90 123-136，引入作為參考)。Fc配體可以包括結(jié)合Fc的未發(fā)現(xiàn)的分子。本文所用“Μ”指屬于基本上由公認(rèn)的免疫球蛋白伽馬基因編碼的抗體類別的多 肽。在人類中，此類別包含IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在小鼠中，此類別包含IgGl、IgG2a、 IgG2b、IgG3。本文“免疫球蛋白(Ig) ”指由基本上由免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多 肽組成的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括但不限于抗體。免疫球蛋白可以具有許多結(jié)構(gòu)形式，包 括但不限于全長抗體、抗體片段、和各個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本文“免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu) M”指免疫球蛋白的區(qū)域，其作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確認(rèn)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)實(shí)體存在。 Ig結(jié)構(gòu)域典型的具有特征性三明治折疊拓?fù)鋵W(xué)。IgG類抗體中已知的Ig結(jié)構(gòu)域?yàn)閂H、 Cy 1、C γ 2、C γ 3、VL、禾口 CL。本文所用“親本多肽”或“前體多肽”(包括Fc親本或前體)指隨后遭到修飾以 生成變體的多肽。所述親本多肽可以是天然發(fā)生的多肽，或者是天然發(fā)生的多肽的變體或 改造型式。親本多肽可以指多肽本身、包含所述親本多肽的組合物、或者編碼它的氨基酸序 列。相應(yīng)的是，本t所用“親本Fc多妝”指講行修飾以牛成奪體的Fc多肽，本文所用“M im"指進(jìn)行修飾以生成變體抗體的抗體。如上文所概括的，F(xiàn)c分子的某些位置可以改變。本文所用“_”指蛋白質(zhì)序列中 的定位。位置可以連續(xù)編號，或者依照已確定的格式，例如Kabat中的EU索引。例如，位置 297指人抗體IgGl中的位置。相應(yīng)位置通常通過與其它親本序列比對來確定，如上文所概 括的。本文所用“_”指蛋白質(zhì)中的位置及其相關(guān)的氨基酸種類。例如，天冬酰胺 297 (也稱為Asn297，還稱為N297)為人抗體IgGl中的殘基。本文所用“imM”指由給定抗體可變區(qū)特異性結(jié)合的分子。靶抗原可以是蛋白 質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、或其它化學(xué)合成物。本文所用“靶細(xì)胞”指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。本文所用“可變區(qū)”指包含一種或多種Ig結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域，所述一種或 多種Ig結(jié)構(gòu)域基本上分別由構(gòu)成卡帕、拉姆達(dá)、和重鏈免疫球蛋白遺傳基因座的任何Vk、 νλ、和/或￥11基因編碼。本文所用“變體多肽”指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本多肽序列的多肽 序列。該親本多肽可以是天然發(fā)生的或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修飾型式。 變體多肽可以指多肽本身、包含所述多肽的組合物、或者編碼它的氨基酸序列。優(yōu)選的是， 與親本多肽相比，所述變體多肽具有至少一個(gè)氨基酸修飾，例如與親本相比約一個(gè)至約十 個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選約一個(gè)至約五個(gè)氨基酸修飾。本文變體多肽序列優(yōu)選與親本多肽序列 擁有至少約80%的同源性，最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%的同源性。相 應(yīng)的是，本文所用“Fe變體”指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本Fc序列的Fc序列。 Fc變體可以僅包含F(xiàn)c區(qū)，或者可以在抗體、Fc融合物、分離的Fe、Fc片段、或基本上由Fc 編碼的其它多肽的背景中存在。Fc變體可以指Fc多肽本身、包含F(xiàn)c變體多肽的組合物、或 者編碼它的氨基酸序列。本發(fā)明的Fc變體依照構(gòu)成它們的氨基酸修飾定義。這樣，例如Ι332Ε為相對于親 本Fc多肽具有替代Ι332Ε的Fc變體。同樣，S239D/A330L/I332E (也稱為239D/330L/332E) 定義相對于親本Fc多肽具有替代S239D、A330L、和Ι332Ε (239D、330L、和332E)的Fc變體。注意其中提供替代的順序是任意的，也就是說，例如S239D/A330L/I332E為與S239D/ I332E/A330L等等相同的Fc變體。對于本發(fā)明中討論的所有位置，編號均依照EU索引或 EU編號方案(Kabat et al. , 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，引入作為參考)。EU索引或Kabat中的EU索引指EU抗體的編號(Edelman et al. , 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63 :78_85，引入作為參考)。本發(fā)明致力于可用于多種背景的優(yōu)化的Fc變體。如上文所概括的，當(dāng)前的抗體療法面臨許多問題。本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)抗體抗腫瘤效力的有前景的手段，它通過增強(qiáng) 其介導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)器功能諸如ADCC、ADCP、和⑶C的能力而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明顯示，具有為結(jié) 合某些Fc γ R而優(yōu)化的Fc區(qū)的抗體可以更好的介導(dǎo)效應(yīng)器功能，并由此更有效的破壞患者 的癌細(xì)胞?；罨c抑制受體之間的平衡是重要的考慮事項(xiàng)，最理想的效應(yīng)器功能可能由這 樣的Fc引發(fā)，所述Fc對活化受體例如FcyRI.Fcy Rlla/c、和FcyRIIIa具有增強(qiáng)的親和 力，但對抑制性受體Fc y RIIb具有減弱的親和力。另外，由于Fc γ R能介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞 的抗原攝取和加工，因而增強(qiáng)的Fc/Fc y R親和力也能提高抗體治療劑引發(fā)適應(yīng)性免疫反 應(yīng)的能力。例如，本申請中公開的幾種突變，包括S298A、E333A、和K334A，顯示對活化受體 Fc YRIIIa的結(jié)合增強(qiáng)并且對抑制性受體Fc y RIIb的結(jié)合減弱。可以組合這些突變以獲得 顯示累加的結(jié)合改善的雙重和三重突變變體。一種具體的變體是S298A/E333A/K334A三重 突變體，其對F158Fc γ RIIIa的結(jié)合增強(qiáng)大約1. 7倍，對Fc YRIIb的結(jié)合降低5倍，且ADCC 增強(qiáng)2. 1倍。雖然需要更強(qiáng)的效應(yīng)器功能，但是對于有些抗體治療劑，可能需要減弱或消除的 效應(yīng)器功能。對于其作用機(jī)理牽涉阻斷或拮抗但不殺死攜帶靶抗原的細(xì)胞的治療性抗體來 說，通常就是這樣的。在這些情況中，不希望損耗靶細(xì)胞，并且可能認(rèn)為是副作用。例如，抗 CD4抗體阻斷T細(xì)胞上CD4受體的能力使它們成為有效的抗炎藥，但其募集Fc γ R受體的 能力也指導(dǎo)針對靶細(xì)胞的免疫攻擊，導(dǎo)致T細(xì)胞損耗(Reddy et al. ,2000, J Immunol 164 1925-1933，引入作為參考)。對于放射性標(biāo)記的抗體，稱為放射性綴合物，和綴合有毒素的 抗體，稱為免疫毒素來說，效應(yīng)器功能也可能是問題。這些藥物可用于破壞癌細(xì)胞，但經(jīng)由 Fc與Fc γ R相互作用的免疫細(xì)胞募集將健康的免疫細(xì)胞引導(dǎo)到所述致命有效負(fù)載(輻射 或毒素)附近，導(dǎo)致正常淋巴組織與靶向的癌細(xì)胞一起損耗(Hutchins et al. , 1995,Proc Natl Acad Sci US A 92 11980-11984 ；White et al.，2001，Annu Rev Med 52 125-145， 引入作為參考)。可能能夠通過利用募集補(bǔ)體或效應(yīng)細(xì)胞能力較弱的IgG同種型例如IgG2 和IgG4來規(guī)避該問題。一種替代辦法是開發(fā)減弱或消除結(jié)合的Fc變體(Alegre et al., 1994,Transplantation 57:1537-1543 ；Hutchins et al. ,1995,Proc Natl Acad Sci U S A 92 11980-11984 ；Armour et al.,1999, Eur J Immunol29 2613-2624 ；Reddy et al.， 2000,J Immunol 164 1925-1933 ；Xu et al.，2000，Cell Immunol 200 16-26 ；Shields et al.，2001，JBiol Chem 276 :6591_6604)(US6, 194,551 ；US 5，885，573 ；PCT WO 99/58572)， 均引入作為參考。減小或消除效應(yīng)器功能的一個(gè)重要考慮事項(xiàng)是其它重要的抗體特性不受 干擾。應(yīng)當(dāng)改造Fc變體，不僅消除對Fc γ R和/或Clq的結(jié)合，還要保持抗體穩(wěn)定性、溶解 度、和結(jié)構(gòu)完整性，以及與其它重要Fc配體諸如FcRn和蛋白質(zhì)A和G相互作用的能力。此外，本發(fā)明利用能增強(qiáng)Fc/Fc γ R親和力和效應(yīng)器功能的改造糖型。具有有利溶解特性和介導(dǎo)效應(yīng)器功能能力的無糖基化Fc將意義重大的使上述替代性生產(chǎn)方法成為可 能。通過克服無糖基化Fc的結(jié)構(gòu)和功能缺點(diǎn)，可以在細(xì)菌以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物中生產(chǎn)抗 體，其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)減弱，且具有可用于其中需要細(xì)胞毒性的臨床應(yīng)用諸如癌癥的效應(yīng)器 功能。本發(fā)明描述了蛋白質(zhì)工程方法用于開發(fā)具有效應(yīng)器功能的穩(wěn)定的可溶性Fc變體的 應(yīng)用。目前，本領(lǐng)域還不存在這樣的Fc變體。本發(fā)明的Fc變體本發(fā)明的Fc變體可用于許多Fc多肽。包含本發(fā)明Fc變體的Fc多肽本文稱為“主 發(fā)明的Fc多妝”。本發(fā)明的Fc多肽包括在更大多肽的背景中包含本發(fā)明Fc變體的多肽， 諸如抗體或Fc融合物。即本發(fā)明的Fc多肽包括包含本發(fā)明Fc變體的抗體和Fc融合物。 本文所用“本發(fā)明的抗體”指包含本發(fā)明Fc變體的抗體。本文所用“本發(fā)明的Fc融合物” 指包含本發(fā)明Fc變體的Fc融合物。本發(fā)明的Fc多肽還包括包含很少或不包含F(xiàn)c區(qū)之外 其他多肽序列的多肽，稱為分離的Fe。本文所用“本發(fā)明的分離的Fc，，指句,含本發(fā)明的Fc 變體，并且包含很少或不包含F(xiàn)c區(qū)之外其他多肽序列的Fc多肽。本發(fā)明的Fc多肽還包括 Fc區(qū)的片段。本文所用“本發(fā)明的Fc片段”指包含本發(fā)明Fc變體的Fc片段。如下所述， 任何前述本發(fā)明Fc多肽可以融合一種或多種融合伴侶或綴合伴侶以提供所需功能特性。不論親本Fc多肽背景如何，都可以在其中構(gòu)建Fc變體。也就是說，親本Fc多肽 的唯一標(biāo)準(zhǔn)是它包含F(xiàn)c區(qū)。本文描述的親本Fc多肽可以衍生自廣泛的來源，并且可以基 本上由來自任何生物體的一種或多種Fc基因編碼，包括但不限于人，嚙齒類包括但不限于 小鼠和大鼠，兔類諸如兔(rabbit)和野兔(hare)，駱駝科(camelidae)諸如駱駝、美洲駝、 和單峰駝，以及非人靈長類包括但不限于原猴類(Prosimian)、闊鼻猴亞目(Platyrrhini) (新世界猴)、猴型總科(Cercopithecoidea)(舊世界猴)、和人型總科(Hominoidea)包括 長臂猿、較小的和巨大的猿，最優(yōu)選人。本發(fā)明的親本Fc多肽可以是基本上由屬于任何抗 體類別的免疫球蛋白基因編碼，所述類別包括但不限于屬于IgG(包括人亞類IgGl、IgG2、 IgG3、或IgG4)、IgA (包括人亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、或IgM抗體類別的序列。最優(yōu) 選的是，本發(fā)明的親本Fc多肽包含屬于人IgG抗體類別的序列。例如，親本Fc多肽可以是 親本抗體，例如人IgGl抗體、人IgA抗體、或小鼠IgG2a或IgG2b抗體。所述親本抗體可以 是非人的、嵌合的、人源化的、或完全人的，正如下文所詳述的。親本Fc多肽可以通過某些 方式進(jìn)行修飾或改造，例如親本抗體可以進(jìn)行親和力成熟，或者可以具有改造糖型，都如下 面所更完整描述的。或者，親本Fc多肽可以是Fc融合物，例如其中融合伴侶靶向細(xì)胞表面 受體的Fc融合物?；蛘?，親本Fc多肽可以是分離的Fc區(qū)，包含很少或不包含F(xiàn)c區(qū)以外的 其他多肽序列。親本Fc多肽可以是天然存在的Fc區(qū)，或者可以是現(xiàn)有的Fc多肽改造后變 體。重要的是親本Fc多肽包含F(xiàn)c區(qū)，該區(qū)可然后突變以生成Fc變體。本發(fā)明的Fc變體可以是抗體,在本文中稱為“本發(fā)明的抗體”。本發(fā)明的抗體可以 包含基本上由屬于任何抗體類別的免疫球蛋白基因編碼的免疫球蛋白序列，所述類別包括 但不限于IgG (包括人亞類IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA (包括人亞類IgAl和IgA2)、IgD、 IgE、或IgM抗體類別。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體包含屬于人IgG抗體類別的序列。本發(fā)明 的抗體可以是非人的、嵌合的、人源化的、或完全人的。正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)的， 抗體的這些不同類型反映了 “人性(humarmess) ”的程度或在人體內(nèi)的潛在免疫原性水平。 關(guān)于這些概念的描述，參見Clark et al.，2000及其引用的參考文獻(xiàn)(Clark，2000，ImmunolToday 21 :397-402，引入作為參考)。嵌合抗體包含非人抗體的可變區(qū)，例如小鼠或大鼠 起源的Vh和\結(jié)構(gòu)域，與人抗體的恒定區(qū)可操作連接(見例如美國專利4，816，567，引入 作為參考)。所述非人可變區(qū)可以是衍生自上述任何生物體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選嚙齒類 或靈長類。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含猴可變區(qū)，例如Newman et al.，1992， Biotechnology 10 1455-1460 ；US 5，658，570 ；和 US 5，750，105 中所述，引入作為參考。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可變區(qū)衍生自非人來源，但它的免疫原性已經(jīng)通過蛋白質(zhì)工程而 降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化的(Tsurushita & Vasquez，2004， Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells,533—545, Elsevier Science (USA)，引入作為參考)。本文所用“人源化”抗體指抗體包含人框架區(qū) (FR)和非人(通常為小鼠或大鼠)抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。提供CDR的非人抗 體稱為“供體”，提供框架的人免疫球蛋白稱為“受體”。人源化主要依賴將供體CDR移植到 受體(人和Vh框架上(Winter US 5，225，539，引入作為參考)。這種策略稱為“CDR移 植”。常常需要將選擇的受體框架殘基“回復(fù)突變(backmutation)”成相應(yīng)的受體殘基以恢 復(fù)在最初的移植構(gòu)建物中喪失的親和力(US 5，530，101 ；US 5，585，089 ；US 5，693，761 ；US 5, 693, 762 ；US 6, 180, 370 ；US 5, 859, 205 ；US 5, 821, 337 ；US6, 054, 297 ；US 6,407,213， 引入作為參考)。本領(lǐng)域知道用于人源化的許多其它方法(Tsurushita & Vasquez，2004， Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells,533—545, Elsevier Science(USA)，引入作為參考)，并且任何這樣的方法可以在本發(fā)明中用于修 飾Fc變體以降低免疫原性。最理想的是，人源化抗體還將包含至少部分免疫球蛋白恒定 區(qū)，典型的為人免疫球蛋白的，因此將典型的包含人Fc區(qū)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中， 使用 2004 年 12 月 3 日提交的，題為 “Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof，，(生成宿主串內(nèi)容增力口的變 體蛋白質(zhì)及其組合物的方法)的USSN11/004，590中描述的方法來降低本發(fā)明Fc變體的免 疫原性，引入作為參考。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以是完全人的，即抗體 的序列完全或基本上是人的。本領(lǐng)域知道用于生成完全人的抗體的許多方法，包括利用轉(zhuǎn) 基因小鼠(Bruggemann et al. , 1997, Curr Opin Biotechnol 8 :455_458，引入作為參考) 或人抗體庫結(jié)合篩選方法(Griffiths et al.，1998，Curr Opin Biotechnol 9:102-108， 引入作為參考)。 本發(fā)明的Fc變體可以是Fc融合物，在本文中稱為“本發(fā)明的Fc融合物”。本發(fā) 明的Fc融合物包含與一種或多種融合伴侶可操作連接的Fc多肽。融合伴侶的作用典型 的為但不總是介導(dǎo)Fc融合物與靶抗原的結(jié)合(Chamow et al.，1996，Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi et al. , 1997, Curr Opin Immunol 9 195-200，引入作為參考)。例 如，已批準(zhǔn)的藥物alefac印t (作為AMEVIVE 銷售)是由與人IgGlFc區(qū)連接的人白 細(xì)胞功能抗原_3 (LFA-3)的胞外CD2結(jié)合部分組成的免疫抑制性Fc融合物。已批準(zhǔn)的藥 物etanerc印t (作為ENBREL 銷售)是包含與人IgGlFc連接的人腫瘤壞死因子受體 (TNFR)的胞外配體結(jié)合部分的Fc融合物。實(shí)際上任何蛋白質(zhì)、多肽、肽、或小分子都可以連 接Fc以生成Fc融合物。融合伴侶包括但不限于受體和胞外受體結(jié)構(gòu)域、粘著分子、配體、 酶、細(xì)胞因子、趨化因子、或有些其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。融合伴侶還可以作為化學(xué)引 誘物發(fā)揮作用。未發(fā)現(xiàn)的配體或受體可以充當(dāng)本發(fā)明Fc變體的融合伴侶。小分子可以充當(dāng)融合伴侶，并且可以包括將Fc融合物引導(dǎo)至治療靶的任何治療劑。這樣的靶物可以是任何 分子，優(yōu)選與疾病有牽連的胞外受體。作為許多已批準(zhǔn)小分子藥物的靶物的兩個(gè)表面受體 家族是G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和離子通道，包括K+、Na+、Ca+通道。當(dāng)前全世界銷售的所 有藥物幾乎70%靶向GPCR。因此本發(fā)明的Fc變體可以與靶向例如一種或多種GABA受體、 嘌呤能受體、腎上腺素能受體、組胺能受體、阿片樣物質(zhì)受體、趨化因子受體、谷氨酸受體、 煙堿性受體、5HT(血清素)受體、和雌激素受體的小分子融合。融合伴侶可以是靶向治療上 有用的靶物的蛋白質(zhì)的小分子模擬物?？梢猿洚?dāng)Fc融合伴侶的具體藥物的具體范例可以 在 L. S.Goodman et al. , Eds. ,Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw-Hill,New York，ed. 9，1996，引入作為參考)中找到。融合伴侶不僅 包括結(jié)合現(xiàn)有藥物的已知靶物的小分子和蛋白質(zhì)，而且包括尚未作為藥物靶物存在的孤兒 受體?；蚪M和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的完成正在證明是藥物發(fā)現(xiàn)的推動(dòng)力，并且這些計(jì)劃發(fā)現(xiàn)了 一批孤兒受體。證明這些新的分子是藥物靶物并開發(fā)靶向它們的蛋白質(zhì)和小分子治療劑有 著巨大潛力。設(shè)想這樣的蛋白質(zhì)和小分子治療劑作為采用本發(fā)明Fc變體的Fc融合伴侶。 本發(fā)明的Fc融合物可以包含基本上由屬于任何抗體類別的免疫球蛋白基因編碼的免疫球 蛋白序列，所述類別包括但不限于IgG(包括人亞類IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA(包括 人亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、或IgM抗體類別。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的Fc融合物包含屬 于人IgG抗體類別的序列。下文定義和描述的各種接頭，可以用于共價(jià)連接Fc與融合伴侶 以生成Fc融合物。本發(fā)明的Fc變體可用于分離的Fe，即包含很少或不包含F(xiàn)c區(qū)域以外其它多肽序 列且包含本發(fā)明Fc變體的Fc多肽。本發(fā)明的分離的Fc指這樣的分子，其中該分子的期望 功能，例如期望的治療性功能僅位于Fc區(qū)中。因而本發(fā)明的分離的Fc的治療性靶物很可 能牽涉一種或多種Fc配體。包含F(xiàn)c變體的分離的Fc可能不需要另外的共價(jià)多肽序列來 實(shí)現(xiàn)其預(yù)期結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單獨(dú)的Fc包含90-100%的Fc區(qū)，帶有很 少或沒有“額外的”序列。因而，例如，本發(fā)明的分離的Fc可以包含殘基C226或P230至人 IgGl的羧基末端，其中編號依照Kabat中的EU索引。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的 Fc可以不含F(xiàn)c區(qū)以外的額外序列。然而，還設(shè)想分離的Fc還可以不含另外的多肽序列。 例如，分離的Fc可以在包含F(xiàn)c變體Fc區(qū)以外還包含其它多肽序列標(biāo)簽從而能夠表達(dá)、純 化等等。本發(fā)明的Fc變體可用于Fc區(qū)片段，即包含F(xiàn)c片段的Fc多肽，所述Fc片段包含 本發(fā)明的Fc變體。顯然，本發(fā)明的Fc片段的一個(gè)必要條件是它包含F(xiàn)c變體進(jìn)行氨基酸修 飾的位置。本發(fā)明的Fc片段可以包含F(xiàn)c區(qū)的1-90%，優(yōu)選10-90%，最優(yōu)選30-90%。因 此例如，本發(fā)明的Fc片段可以包含F(xiàn)c變體IgGlC γ 2結(jié)構(gòu)域、Fc變體IgGlC γ 2結(jié)構(gòu)域和 絞鏈區(qū)、Fc變體IgGlC γ 3功能區(qū)、等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc片段另外包含融 合伴侶，使其有效成為Fc片段融合物。就像分離的Fc，F(xiàn)c片段可以包含或不含額外的多肽 序列。本發(fā)明的Fc變體可以基本上由來自任何生物體的基因編碼，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包 括但不限于人，嚙齒類包括但不限于小鼠和大鼠、兔類包括但不限兔(rabbit)和野兔 (hare)，駱駝科包括但不限于駱駝、美洲駝、和單峰駝，以及非人靈長類包括但不限于原猴 類、闊鼻猴亞目(新世界猴)、猴型總科(舊世界猴)、和人型總科包括長臂猿、較小的和巨大的猿。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體基本上是人的。本發(fā)明的Fc變體 可以是基本上由屬于任何抗體類別的免疫球蛋白基因編碼。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的Fc變體包含屬于IgG抗體類別的序列，包括人亞類IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在 一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體包含屬于IgA(包括人亞類IgAl和IgA2)、IgD、 IgE、IgG、或IgM抗體類別的序列。本發(fā)明的Fc變體可以包含多于一條蛋白質(zhì)鏈。也就是 說，本發(fā)明可用于這樣的Fc變體，它是單體或寡聚體，包括同型或異型寡聚體。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽基于人IgG序列，因此使用人IgG序列 作為“基本”序列，其它序列與起進(jìn)行比較，包括但不限于來自其它生物體的序列例如嚙齒 類和靈長類序列，以及來自其他免疫球蛋白類別諸如IgA、IgE、IgG、IgD、IgM等等的序列。 設(shè)想盡管本發(fā)明的Fc變體在一個(gè)親本Fc變體的背景中進(jìn)行改造，該變體可以在另一個(gè)、第 二親本Fc變體的背景中進(jìn)行改造或“轉(zhuǎn)移”到其中。這是通過確定第一和第二 Fc變體之 間的“等同”或“對應(yīng)”殘基和替代來完成的，這通常基于兩種Fc變體序列之間的序列或結(jié) 構(gòu)同源性。為了建立同源性，將本文中概括的第一 Fc變體的氨基酸序列與第二 Fc變體的 序列直接進(jìn)行比較。在比對序列后，使用本領(lǐng)域已知的一種或多種同源比對程序(例如使 用物種之間的保守殘基)，容許必需的插入和刪除來維持比對(即避免保守殘基通過任意 的刪除和插入而消除)，確定與第一 Fc變體一級序列中的特定氨基酸等同的殘基。保守殘 基的比對應(yīng)優(yōu)選保留100%這樣的殘基。然而，大于75%或低至50%的保守殘基的比對也 足以確定等同的殘基了。對于結(jié)構(gòu)已經(jīng)測定的Fc變體，還可以通過在三級結(jié)構(gòu)水平上確定 第一和第二 Fc變體之間的結(jié)構(gòu)同源性來確定等同的堿基。在這種情況中，等同的殘基定義 為那些親本或前體的特定氨基酸殘基的兩個(gè)或更多主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對N，CA對CA， C對C和0對0)在比對后在0. 13nm內(nèi)，優(yōu)選在0. Inm內(nèi)。比對是在最佳模型已經(jīng)確定方 向和位置以給出蛋白質(zhì)的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大交疊之后實(shí)現(xiàn)的。無論等同或 對應(yīng)的殘基是如何確定的，并且不管其中構(gòu)建Fc變體的親本Fc變體的種類，想要傳達(dá)的是 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的Fc變體可以改造到與所述Fc變體具有顯著序列或結(jié)構(gòu)同源性的任何第二親 本Fc變體中。因此，例如，如果通過使用上文所述方法或用于確定等同殘基的其它方法生 成了其中親本抗體是人IgGl的變體抗體，那么可以在人IgG2親本抗體、人IgA親本抗體、 小鼠IgG2a或IgG2b親本抗體等等中改造所述變體抗體。再則，如上所述，親本Fc變體的 背景不影響將本發(fā)明的Fc變體轉(zhuǎn)移到其它親本Fc變體中的能力。例如，可以將在靶向一 種表位的人IgGl抗體中改造的變體抗體轉(zhuǎn)移到靶向不同表位的人IgG2抗體中，轉(zhuǎn)移到包 含靶向仍然不同表位的人IgGlFc區(qū)的Fc融合物中，諸如此類。本發(fā)明的Fc變體可用于廣泛的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體是治療 性、診斷性或研究性試劑，優(yōu)選治療性的。或者，本發(fā)明的Fc變體可用于農(nóng)業(yè)或工業(yè)用途。 本發(fā)明的抗體可用于抗體組合物，它是單克隆的或多克隆的。本發(fā)明的Fc變體可以是激動(dòng) 劑、拮抗劑、中和性的、抑制性的或刺激性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體 用于殺死攜帶靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體 用于阻斷、拮抗或激動(dòng)(agonize)靶抗原。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體用 于阻斷、拮抗或激動(dòng)靶抗原并殺死攜帶靶抗原的靶細(xì)胞。靶物事實(shí)上任何抗原可以作為本發(fā)明的Fc變體的靶物，包括但不限于屬于下列靶物的蛋白質(zhì)、亞基、結(jié)構(gòu)域、基序、和/或表位17-IA、4-lBB、4Dc、6-酮_PGFla、8_異_PGF2a、 8-氧合-dG、Al腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活素(activin)、激活素A、激活素AB、激 活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活 素 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2, ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、 ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、α -V/ β -1 拮抗劑、 ANG、Ang、APAF-l、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗-Id、ASPARTIC、心房尿鈉 肽(atrial natriuretic factor)、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴 細(xì)胞刺激物(BlyS)、BACE, BACE-UBad, BAFF, BAFF-R、Bag-I、BAK、Bax、BCA-U BCAM, Bel、 BCMA, BDNF, b_ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC, BL-CAM、BLK, BMP、BMP-2、BMP_2a、BMP-3 成 骨蛋白、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-U BMP-7 (0P-1)、BMP-8 (BMP_8a，0P-2)、BMPR、 BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-II (BRK-3)、BMP、b_NGF、BOK,鈴 蟾肽、骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、補(bǔ)體因子3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、 CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌關(guān)聯(lián)抗原、組織蛋白酶Α、組織蛋白酶B、 組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白 酶0、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCLU CCLlU CCL12、CCL13、CCL 14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、 CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、 CCR、CCRl、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、 CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla, CDllb, CDllc, CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、 CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋 白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、 CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、 CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)毒 素、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、CKb8_l、CLC, CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-I、COX、C-Ret, CRG-2、CT-I、CTACK, CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、 CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCR、CXCRU CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細(xì)胞角蛋白腫 瘤關(guān)聯(lián)抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、腐爛加速因子、des (1-3) -IGF-I (腦 IGF-1)、Dhh、地 高辛(digoxin)、DNAM-U DNA 酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD, EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、 EGF, EGFR(ErbB-I)、EMA, EMMPRIN、ΕΝΑ、內(nèi)皮縮血管肽受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性 粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)l、EpCAM、肝配蛋白(印hrin)B2/EphB4、ΕΡ0、ERCC, E-選擇蛋 白、ET-1、因子Ila、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcRl、 FEN-l、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、 Flt-4、促卵泡激素、Fractalkine, FZDl、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、 FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14、 CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12、CDMP-3)、GDF-8 (肌抑素(myostatin))、 GDF-9、GDF-15 (MIC-I)、GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-U GFR-α 1、GFR-α 2、GFR-α 3、GITR、胰 高血糖素、Glut 4、糖蛋白 IIb/IIIa(GP Ilb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生長激素 釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF, HCC, HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、H印Bgpl20、類肝素酶(h印aranase)、Her2、Her2/ neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV) gB 糖蛋白、HSV gD 糖蛋 白、HGFA、高分子量黑素瘤關(guān)聯(lián)抗原(HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gp 120V3 環(huán)、HLA、 HLA-DR、HMl. 24、HMFG PEM、HMG, Hrk、人心臟肌球蛋白、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、人生長激素 (HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-U ICAM-3、ICE、I COS, IFNg、Ig、IgA 受體、IgE、IGF、 IGF 結(jié)合蛋白、IGF-1R、IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL、IL-U IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、 IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、 干擾素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣生長因 子1、整聯(lián)蛋白α 2、整聯(lián)蛋白α 3、整聯(lián)蛋白α 4、整聯(lián)蛋白α4/β1、整聯(lián)蛋白α4/β7、整 聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白α5/β1、整聯(lián)蛋白α5/β3、整聯(lián)蛋白α6、整聯(lián)蛋白β 1、整聯(lián) 蛋白β 2、干擾素γ、IP-10、I_TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放 酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶Li、激肽釋放酶L2、激肽 釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、層粘連蛋白5、LAMP、LAP、 LAP (TGF-I)、潛伏的 TGF-I、潛伏的 TGF-1 bpl、LBP、LDGF, LECT2、Lefty、路易斯(Lewis)-Y 抗原、Lewis-Y 相關(guān)抗原、LFA-U LFA-3、Lfo, LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇 蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性劑(lung surfactant)、黃體生成素、淋巴毒素 β 受體、Mac-U MAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF, MDC, Mer、金屬 蛋白酶、MGDF 受體、MGMT, MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-I-α、MK、MMACU MMP, MMP-U MMP-10、MMP-11、MMP—12、MMP—13、MMP—14、MMP—15、MMP—2、MMP—24、MMP—3、MMP—7、MMP—8、 MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、穆勒氏(Muellerian)抑制性物質(zhì)、Mug、 MuSK, NAIP, NAP、NCAD, N-鈣粘著蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、中性溶酶(Mprilysin)、神經(jīng) 營養(yǎng)蛋白 _3，-4，或-6、Neurturin、神經(jīng)元生長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS, Npn, NRG-3、NT、ΝΤΝ、OB、OGGU OPG, 0ΡΝ、0SM、0X40L、0X40R、ρ150、ρ95、PADPr、甲狀旁腺素、 PARC、PARP, PBR、PBSF, PCAD, P-鈣粘著蛋白、PCNA、PDGF, PDGF, PDK-U PECAM、PEM、PF4、 PGE, PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、PlGF, PLP、PP14、胰島素原、松弛 素原、蛋白 C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、 RANKL、RANTES、RANTES、松弛肽A鏈、松弛肽B鏈、腎素、呼吸道合胞體病毒(RSV) F,RSV Fgp、 Ret、類風(fēng)濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清清蛋白、sFRP-3、 Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI,SMAC,SMDF,SM0H、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-11,TACE, TACI, TAG-72(腫瘤關(guān)聯(lián)糖蛋白-72)、TARC, TCA-3、T-細(xì)胞受體(例如T-細(xì)胞受體α / β )、TdT、TECK, ΤΕΜ1、ΤΕΜ5、ΤΕΜ7、ΤΕΜ8、TERT、睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、 TGF- β、TGF- β 泛特異性的、TGF- β RI (ALK-5)、TGF- β RII、TGF- β RIIb、TGF- β RIII、 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、TGF- β 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲狀腺素、Ti e、TIMP、 TIQ、組 只因子、TMEFF2、Tmpo, TMPRSS2、TNF, TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL RlApo-2、DR4)、TNFRSFIOB(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、 TRICK-B)、TNFRSF IOC (TRAIL R3DcRl、LIT、TRID)、TNFRSFIOD (TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、 TNFRSF11A(RANK ODF R,TRANCE R)、TNFRSFIlB(0PG 0CIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、 TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA, LIGHT R、TR2)、 TNFRSF 16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSFIA(TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、 p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4 (0X40ACT35、 TXGP1R)、TNFRSF5 (CD40p50)、TNFRSF6 (Fas Apo_l、APTl、CD95)、TNFRSF6B (DcR3M68、 TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、I LA)、TNFRSF21 (DR6)、 TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo_3、LARD、 TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSFl 1 (TRANCE/RANK 配體 ODF、 OPG 配體)、TNFSF12(I￥EAK Apo_3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS、TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TLIA/ VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSF1A (TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、 TNFSFlB(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGP1)、 TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-I 配體、APTl 配 體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD137 配體)、 TP-I、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRANCE、轉(zhuǎn)運(yùn)受體、TRF、Trk、TROP-2、 TSG、TSLP、腫瘤關(guān)聯(lián)抗原CA 125、表達(dá)Lewis Y相關(guān)碳水化合物的腫瘤關(guān)聯(lián)抗原、TWEAK、 TXB2、Ung、uPAR、uPAR-l、尿激酶、VCAM、VCAM-l、VECAD、VE-鈣粘著蛋白、VE-鈣粘著蛋白-2、 VEFGR-I (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA, VLA-1、VLA-4、 VNR 整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德(von ffillebrands)因子、WIF-I、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、 WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、 WNT1OB、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生長因子的受 體。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，上述靶物名單不僅指具體的蛋白質(zhì)和生物分子，而 且還指包含它們的生化途徑。例如，提到將CTLA-4作為靶抗原暗示構(gòu)成T細(xì)胞共刺激途徑 的配體和受體，包括CTLA-4、B7-l、B7-2、⑶28，以及結(jié)合這些蛋白質(zhì)的任何其它未發(fā)現(xiàn)的配 體或受體也是靶物。因此本文所用靶物不僅指具體的生物分子，而且還指與所述靶物和所 述靶物所屬生化途徑的成員相互作用的一組蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員還將領(lǐng)會(huì)，任何 上述靶抗原、結(jié)合它們的配體或受體、或它們相應(yīng)生化途徑的其他成員可以與本發(fā)明的Fc 變體可操作連接以生成Fc融合物。因此，例如靶向EGFR的Fc融合物可以通過可操作連接 Fc變體與EGF、TGF-i3、或任何其它已發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的配體來構(gòu)建。因此，本 發(fā)明的Fc變體可以與EGFR可操作連接以生成結(jié)合EGF、TGF-i3、或任何其它已發(fā)現(xiàn)的或未 發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的配體的Fc融合物。因而實(shí)際上不論是配體、受體、或有些其它蛋白質(zhì)或 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，任何多肽，包括但不限于上述靶物和構(gòu)成它們相應(yīng)生化途徑的蛋白質(zhì)，都可 以與本發(fā)明的Fc變體可操作連接以開發(fā)Fc融合物。選擇正確的靶抗原用于抗體療法是一個(gè)復(fù)雜的過程并且涵蓋許多變量。對于抗癌 治療而言，希望采用其表達(dá)限制于癌細(xì)胞的靶物。已證明尤其服從抗體療法的有些靶物是 具有信號功能的那些。其它治療性抗體通過抑制受體與其關(guān)聯(lián)配體間的結(jié)合來阻斷受體的 信號而發(fā)揮其作用。治療性抗體的另一種作用機(jī)制是引起受體下調(diào)。盡管許多在治療上有 效的抗體部分通過經(jīng)由它們的靶抗原發(fā)信號而起作用，但情況不總是這樣。例如，有些靶物 類別諸如細(xì)胞表面糖型不產(chǎn)生任何生物學(xué)信號。然而，改變的糖型常常與疾病狀態(tài)諸如癌 癥有關(guān)。另一種重要的靶物類型是作為正常功能或響應(yīng)抗體結(jié)合而內(nèi)在化的那些。在靶物是可溶性的而非細(xì)胞表面結(jié)合的情況中，效應(yīng)器功能的募集不會(huì)導(dǎo)致任何細(xì)胞死亡。已證明尤其服從抗體療法的有些靶物是具有信號功能的那些。例如，Herf/neu抗 原的抗體交聯(lián)可產(chǎn)生導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡的凋亡信號。在有些情況中，諸如CD30抗原，與游離 抗體的這種集聚可能不足以引起體外凋亡。對于體外試驗(yàn)，充分的集聚可以通過交聯(lián)抗體 或通過將其以高密度固定在表面諸如微量滴定板的孔上來介導(dǎo)。然而，在體內(nèi)這種效果可 能是通過抗體與Fc配體，例如鄰近細(xì)胞上表達(dá)的Fc γ R的結(jié)合來介導(dǎo)的。因此更緊的結(jié)合 Fc配體的抗體Fc變體可能更有效的集聚發(fā)信號的靶物并導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)的增強(qiáng)。這樣的機(jī) 制可以通過實(shí)驗(yàn)來測試，其通過添加具有或沒有對表達(dá)期望的發(fā)信號靶物的細(xì)胞結(jié)合增強(qiáng) 的Fc配體的抗體，和/或添加Fc受體和能夠集聚Fc受體的相應(yīng)抗體來進(jìn)行。用于集聚Fc 受體的備選方式包括固定在珠上，和在非效應(yīng)器細(xì)胞系中過表達(dá)。在允許凋亡發(fā)生之后，測 量靶物表達(dá)細(xì)胞的相對凋亡將能夠定量測定效果。通過其與靶物相互作用而引起細(xì)胞死亡的抗體可以具有另外的益處。由這些垂死 細(xì)胞釋放的信號吸引巨噬細(xì)胞及免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞。然后這些細(xì)胞能以抗體介導(dǎo)的方式 攝取死亡的或垂死的細(xì)胞。已經(jīng)證明這導(dǎo)致抗原的交叉呈遞和針對靶細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答 的潛力。關(guān)于抗原靶物Her2和⑶20，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了響應(yīng)抗體療發(fā)的這樣的自身抗體。為此 使Fc變體具有改變的受體特異性以特異性刺激交叉呈遞和免疫應(yīng)答而非不希望得到的耐 受誘導(dǎo)結(jié)果可能是有利的。其它治療性抗體通過抑制受體與其關(guān)聯(lián)配體之間的相互作用，最終阻斷該受體的 信號來發(fā)揮其效果。此類抗體用于治療許多疾病狀態(tài)。在這種情況中，利用不募集任何宿 主免疫功能的抗體可能是有利的。此類抗體的次要效果可能是實(shí)際上經(jīng)由受體集聚而誘導(dǎo) 自身發(fā)信號。在這種情況中，期望的阻斷信號的治療效果將被抗體介導(dǎo)的信號消除。如上 所述，這種集聚可以通過抗體與含F(xiàn)c受體的細(xì)胞的相互作用而增強(qiáng)。在這種情況中，使用 較不緊密或根本不結(jié)合Fc受體的Fc變體將是更可取的。此類抗體不會(huì)介導(dǎo)信號，因此它 的作用機(jī)理將限于阻斷受體/配體相互作用。對此最適合的信號受體將可能是只會(huì)由一抗 二聚化但基本上不集聚的單體受體。多聚體受體可能由一抗顯著集聚，而且可能不要求通 過Fc受體結(jié)合的另外集聚。治療性抗體的另一種潛在作用機(jī)理是受體下調(diào)。例如，胰島素樣生長因子受體可 能就是這種情況。細(xì)胞生長依靠經(jīng)由受體的連續(xù)信號，而在其缺乏時(shí)細(xì)胞停止生長。針對 該受體的抗體的一種效果是下調(diào)其表達(dá)并因此消除信號。細(xì)胞從細(xì)胞毒性療法恢復(fù)需要刺 激這種受體。這種受體的下調(diào)阻止這些細(xì)胞恢復(fù)并使細(xì)胞毒性療法基本上更有效。對于這 是主要作用機(jī)制的抗體而言，降低Fc受體結(jié)合可能阻止因?qū)c受體的非靶物結(jié)合而對抗 體的扣留。盡管許多在治療上有效的抗體部分通過經(jīng)由它們的靶抗原發(fā)信號起作用，但情況 不總是這樣。例如，有些靶物類別，諸如細(xì)胞表面糖型不產(chǎn)生任何生物學(xué)信號。然而，改變 的糖型常常與疾病狀態(tài)諸如癌癥有關(guān)。在其它情況中，抗體與相同靶抗原的不同表位的相 互作用可能賦予不同的信號效應(yīng)。在此類很少或沒有通過抗體或Fc融合物結(jié)合靶抗原而 引發(fā)信號的情況中，本發(fā)明的Fc多肽可用于為在其它情況中沒有效果的分子提供新的功 效機(jī)制。已經(jīng)用于生成對此類無信號靶物的治療性抗體的一種方法是將抗體與胞毒劑諸如放射性同位素、毒素、或加工底物以便在腫瘤附近產(chǎn)生胞毒劑的酶偶聯(lián)。作為細(xì)胞毒性模 塊的替換物，本發(fā)明的Fc變體可提供增加的免疫功能的募集，它們固有的對宿主毒性較低 同時(shí)仍有效破壞目標(biāo)癌細(xì)胞。此類Fc變體可以是例如在募集NK細(xì)胞或在活化吞噬作用或 起動(dòng)CDC方面更有效?；蛘?，如果使用胞毒劑，使用提供減少或改變的Fc配體結(jié)合的Fc變 體也許是有利的。這可能降低或消除試劑對表達(dá)Fc受體的免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用，從而 降低對患者的毒性。此外，F(xiàn)c配體結(jié)合的降低可能有助于將對毒性試劑或酶產(chǎn)生的免疫反 應(yīng)降至最低。如上所述，細(xì)胞死亡可導(dǎo)致宿主免疫細(xì)胞的募集；在這種情況中，如果除了細(xì) 胞毒性模塊之外，治療性抗體具有增強(qiáng)的Fc受體結(jié)合親和力或改變的受體特異性，那么抗 體介導(dǎo)的交叉呈遞可以隨免疫反應(yīng)而非免疫耐受而增加。另一種重要的靶物類型是作為它們生物學(xué)功能的正常部分或者響應(yīng)抗體結(jié)合而 內(nèi)在化的那些靶物。對于此類靶物，已經(jīng)在偶聯(lián)胞毒劑諸如RNA酶、蓖麻毒素和加利車霉素 方面付出許多努力，它們只能在內(nèi)在化之后發(fā)揮它們的效果。對于此類試劑，F(xiàn)c配體結(jié)合 可能由于Fc配體對治療劑的非生產(chǎn)性扣留而降低功效。在這種情況中，使用提供降低的Fc 配體親和力的Fc變體也許是有益的。反之，在其結(jié)合呈現(xiàn)于細(xì)胞上的靶抗原之前與Fc配 體預(yù)關(guān)聯(lián)的抗體可用于抑制靶物的內(nèi)在化。在這種情況中，提高Fc配體親和力可能有助于 改善預(yù)關(guān)聯(lián)及因此效應(yīng)細(xì)胞和宿主免疫應(yīng)答的募集。在靶物是可溶性的而非細(xì)胞表面結(jié)合的情況中，效應(yīng)器功能的募集不會(huì)直接導(dǎo)致 細(xì)胞死亡。然而，在刺激對靶物的宿主抗體的生成中可能是有用處的。對有些疾病狀態(tài)，成 功的治療可能需要施用治療性抗體達(dá)極長的一段時(shí)間。此類療法可能是極為昂貴的或麻煩 的。在這些情況中，宿主免疫應(yīng)答的刺激和抗體的產(chǎn)生可能導(dǎo)致治療功效的改善。這作為 疫苗療法的佐劑可能是適用的。介導(dǎo)此類效應(yīng)的抗體Fc變體可能具有提高的對Fc配體的 親和力或改變的Fc配體特異性。批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)、或開發(fā)的許多抗體和Fc融合物可受益于本發(fā)明的Fc變 體。這㈣抗體和Fc融合物在本文中稱為“臨床產(chǎn)品和備詵物”。因此在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，本發(fā)明的Fc多肽可用于一系列臨床產(chǎn)品和備選物。例如，許多靶向CD20的抗 體可受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如，本發(fā)明的Fc多肽可用于這樣的抗體，該抗體基本 上類似于 rituximab ( Rituxan , IDEC/Genentech/Roche)(見例如 US 5，736，137)，批 準(zhǔn)用于治療非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤的嵌合抗⑶20抗體；HuMax-⑶20，當(dāng)前正在由 Genmab 開發(fā)的抗 CD20，US 5, 500, 362 中描述的抗 CD20 抗體，AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc. ), HumaLYM(Intracel)，禾口 PR070769 (PCT/ US2003/040426,題目為 “Immunoglobulin Variants and Uses Thereof ”(免疫球蛋 白變體與其應(yīng)用))。許多靶向表皮生長因子受體家族成員，包括EGFR(ErbB-I)、Her2/ neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)的抗體可受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如， 本發(fā)明的Fc多肽可用于這樣的抗體，該抗體基本上類似于trastuzumab ( Herceptin , Genentech)(見例如US 5，677，171)，批準(zhǔn)用于治療乳癌的人源化抗Her2/neu抗體； pertuzumab (rhuMab_2C4，Omnitarg )，當(dāng)前正在由 Genentech 開發(fā)；US 4，753，894 中描 述的抗 Her2 抗體；cetuximab ( Erbitux , Imclone) (US 4，943，533 ；PCT WO 96/40210)， 在臨床試驗(yàn)中用于多種癌癥的嵌合抗EGFR抗體；ABX-EGF(US 6，235，883)，當(dāng)前正在 由 Abgenix-Immunex-Amgen 開發(fā)；HuMax-EGFr (USSN 10/172，317)，當(dāng)前正在由 Genmab開發(fā)；425、EMD55900、EMD62000、和 EMD72000 (MerckKGaA) (US 5，558，864 ；Murthy et al. ,1987, Arch Biochem Biophys.252 (2) 549-60 ;Rodeck et al. , 1987, J Cell Biochem.35(4) 315-20 ；Kettleborough et al. ,1991, Protein Eng.4(7) 773-83)； ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045 ；Modjtahedi et al. ,1993, J. Cell Biophys. 22(1-3) 129-46 ；Modjtahedi et al. , 1993, Br J Cancer. 67(2) 247-53 ；Modjtahediet al,1996, Br J Cancer,73(2) 228-35 ；Mo djtahedi et al, 2003， Int J Cancer,105(2) :273_80) ；TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada 禾口 Centro de Immunologia Molecular, Cuba) (US 5,891,996 ；US 6, 506, 883 ；Mateo et al,1997, Immunotechnology,3 (1) :71_81) ；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(JungbIuth et al. ,2003, Proc Natl Acad SciUSA. 100(2) 639-44) ；KSB-102(KS Biomedix) ；MRl-I(IVAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；及 SClOO (Scancell) (PCT W001/88138)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā) 明的Fc多肽可用于alemtuzumab ( Campath ，Mi 11 enium)，當(dāng)前批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞 慢性淋巴細(xì)胞白血病的人源化單克隆抗體。本發(fā)明的Fc多肽可用于基本上類似于其它 臨床產(chǎn)品和備選物的多種抗體或Fc融合物，所述其它臨床產(chǎn)品和備選物包括但不限于 muromonab_CD3 (Orthoclone OKT3 )，由 OrthoBiotech/Johnson & Johnson 開發(fā)的抗 CD3 抗體，ibritumomab tiuxetan (Zevalin )，由 MEC/Schering AG 開發(fā)的抗 CD20 抗體， gemtuzumabozogamicin (Mylotarg ),由 Celltech/Wyeth 開發(fā)的抗 CD33(p67 蛋白)抗 體，alefac印t (Amevive ),由 Biogen 開發(fā)的抗 LFA_3Fc 融合物，abciximab (ReoPro )， fi Centocor/Lilly Jf U, basiliximab (Simulect ), ^ Novartis Jf U, palivizumab(Synagis ),由 MedImmune 開發(fā)，infliximab (Remicade ),由 Centocor 開 發(fā)的抗 TNF α 抗體，adalimumab (Humira ),由 Abbott 開發(fā)的抗 TNF α 抗體，Humicade ， 由 Celltech 開發(fā)的抗 TNFa 抗體，etanerc印t (Enbrel ),由 Immunex/Amgen 開發(fā)的抗 TNF α Fc融合物，ABX-CBL，由Abgenix正在開發(fā)的抗CD147抗體，ABX-IL8，由Abgenix正在 開發(fā)的抗IL8抗體，ABX-MAl,由Abgenix正在開發(fā)的抗MUC 18抗體，Pemtumomab (Rl549， 90Y-muHMFGl)，由 Antisoma 開發(fā)的抗 MUCl 抗體，Therex (R1550)，正在由 Antisoma 開發(fā)的 抗 MUCl 抗體，AngioMab (AS 1405)，正在由 Antisoma 開發(fā)，HuBC-I，正在由 Antisoma 開發(fā)， Thioplatin (AS 1407)，正在由 Antisoma 開發(fā)，Antegren (natalizumab)，正在由 Biogen 開發(fā)的抗α -4-β -1 (VLA-4)和α _4_β _7抗體，VLA-lmAb，正在由Biogen開發(fā)的抗VLA-1 整聯(lián)蛋白抗體，LTBR mAb，正在由Biogen開發(fā)的抗淋巴毒素β受體(LTBR)抗體，CAT-152， 正在由 Cambridge Antibody Technology 開發(fā)的抗 TGF-β 2 抗體,J695,正在由 Cambridge Antibody Technology 和 Abbott 開發(fā)的抗 IL-12 抗體，CAT-192，正在由 Cambridge Antibody Technology 和 Genzyme 開發(fā)的抗 TGF3 1 抗體，CAT-213，正在由 Cambridge Antibody Technology開發(fā)的抗嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1抗體，LymphoStat-B ,正在由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences Inc.開發(fā)的抗 Blys 抗體， TRAIL-RlmAb,正在由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences, Inc. 開發(fā)的抗 TRAIL-R 1 抗體，Avastin (bevacizumab, rhuMAb-VEGF)，正在由 Genentech 開 發(fā)的抗VEGF抗體，抗HER受體家族抗體，正在由Genentech開發(fā)，抗組織因子(ATF)，正在由Genentech開發(fā)的抗組織因子抗體，Xolair (Omalizumab)，正在由Genentech開發(fā)的抗IgE 抗體，Raptiva (Efalizumab)，正在由 Genentech 和 Xoma 開發(fā)的抗 CDl Ia 抗體，MLN-02 抗體 (從前的 LDP-02)，正在由 Genentech 和 Millenium Pharmaceuticals 開發(fā)，HuMax CD4,正 在由Genmab開發(fā)的抗CD4抗體，HuMax_IL15，正在由Genmab和Amgen開發(fā)的抗IL15抗體， HuMax-Inflam,正在由 Genmab 禾口 Medarex 開發(fā)，HuMax-Cancer,正在由 Genmab 禾口 Medarex 以及Oxford GcoSciences開發(fā)的抗類肝素酶I抗體，HuMax-Lymphoma，正在由Genmab和 Amgen 開發(fā)，HuMax-TAC，正在由 Genmab 開發(fā)，IDEC-131，正在由 IDEC Pharmaceuticals 開 發(fā)的抗 CD40L 抗體，IDEC-151 (Clenoliximab)，正在由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD4 抗體，IDEC-114，正在由 IDECPharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD80 抗體，IDEC-152，正在 由IDECPharmaceuticals開發(fā)的抗⑶23抗體，抗巨噬細(xì)胞遷移因子(MIF)抗體，正在由 IDEC Pharmaceuticals開發(fā)，BEC2，正在由Imclone開發(fā)的抗獨(dú)特型抗體，IMC-1C11，正在 由Imclone開發(fā)的抗KDR抗體，DClOl，正在由Imclone開發(fā)的抗flk_l抗體，抗VE鈣粘著 蛋白抗體，正在由Imclone開發(fā)的，CEA-Cide (Iabetuzumab)，正在由Immunomedics開發(fā) 的抗癌胚抗原(CEA)抗體，LymphoCide (Epratuzumab)，正在由Immunomedics開發(fā)的抗 CD22 抗體,AFP-Cide,正在由 Immunomedics 開發(fā),MyelomaCide,正在由 Immunomedics 開發(fā)， LkoCide,正在由 Immunomedics 開發(fā)，ProstaCide,正在由 Immunomedics 開發(fā)，MDX-010,正 在由Medarex開發(fā)的抗CTLA4抗體，MDX-060，正在由Medarex開發(fā)的抗CD30抗體，MDX-070， 正在由 Medarex 開發(fā)，MDX-018，正在由 Medarex 開發(fā)，OsidenT(IDM-I)，正在由 Medarex 與 Immuno-Designed Molecules 開發(fā)的抗 Her2 抗體，HuMax -CD4,正在由 Medarex 與 Genmab 開發(fā)的抗CD4抗體，HuMax-ILl5,正在由Medarex與Genmab開發(fā)的抗IL15抗體，CNTO 148，正在由 Medarex 與 Centocor/J&J 開發(fā)的抗 TNFa 抗體，CNT01275,正在由 Centocor/ J&J開發(fā)的抗細(xì)胞因子抗體，MORlOl和M0R102，正在由MorphoSys開發(fā)的抗細(xì)胞間粘附分 子-1 (ICAM-I)(⑶54)抗體，M0R201，正在由MorphoSys開發(fā)的抗成纖維細(xì)胞生長因子受體 3 (FGFR-3)抗體，Nuvion (visilizumab)，正在由 Protein Design Labs 開發(fā)的抗 CD3 抗 體，HuZAF ，正在由Protein Design Labs開發(fā)的抗γ干擾素抗體，抗α5β1整聯(lián)蛋白，正 在由 Protein Design Labs 開發(fā)，抗 IL-12，正在由 Protein Design Labs 開發(fā)，ING-1，正 在由Xoma開發(fā)的抗Ep-CAM抗體，和MLNO1，正在由Xoma開發(fā)的抗β 2整聯(lián)蛋白抗體，所有 參考文獻(xiàn)引入作為參考。Fc多肽用于上述抗體和Fc融合物臨床產(chǎn)品和備選物的應(yīng)用并不意味著限于其精 確組成。本發(fā)明的Fc多肽可以摻入上述臨床備選物和產(chǎn)品，或摻入基本上與它們類似的抗 體和Fc融合物。本發(fā)明的Fc多肽可以摻入上述臨床備選物和產(chǎn)品人源化的、親和力成熟 的、改造的、或以有些其它方式修飾的型式。此外，不必使用上述臨床產(chǎn)品和備選物的整個(gè) 多肽來構(gòu)建包容本發(fā)明Fc多肽的新抗體或Fc融合物；例如，可以只使用臨床產(chǎn)品或備選抗 體的可變區(qū)、基本上類似的可變區(qū)、或可變區(qū)人源化的、親和力成熟的、改造的、或以有些其 它方式修飾的型式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽可用于與上述臨床產(chǎn)品和備選 物之一結(jié)合相同表位、抗原、配體、或受體的抗體或Fc融合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽可用于治療自身免疫、炎癥、或移植適應(yīng)癥。 與此類疾病相關(guān)的靶抗原及臨床產(chǎn)品和備選物包括但不限于抗α 4β 7整聯(lián)蛋白抗體諸 如LDP-02，抗β 2整聯(lián)蛋白抗體諸如LDP-01，抗補(bǔ)體(C5)抗體諸如5G1. 1，抗CD2抗體諸如 BTI-322、MEDI-507,抗 CD3 抗體諸如 0KT3、SMART 抗 CD3，抗 CD4 抗體諸如 IDEC-151、 MDX-CD4、0KT4A，抗CDl Ia抗體，抗CD14抗體諸如IC14，抗CD18抗體，抗CD23抗體諸如IDEC 152，抗 CD25 抗體諸如 Zenapax，抗 CD40L 抗體諸如 5c8、Antova、IDEC-131，抗 CD64 抗體諸 如MDX-33，抗CD80抗體諸如IDEC-114，抗CD 147抗體諸如ABX-CBL，抗E-選擇蛋白抗體諸 如 CDP850，抗 gpIIb/IIIa 抗體諸如 ReoPro/Abcixima，抗 ICAM-3 抗體諸如 ICM3，抗 ICE 抗 體諸如VX-740，抗FcRl抗體諸如MDX-33，抗IgE抗體諸如rhuMab_E25，抗IL-4抗體諸如 SB-240683，抗 IL-5 抗體諸如 SB_240563、SCH55700，抗 IL-8 抗體諸如 ABX-IL8，抗干擾素 γ 抗體，抗 TNF (TNF、TNF α ,TNFa,TNF-阿爾法)抗體諸如 CDP571、CDP870、D2E7、Infliximab、 MAK-195F,和抗 VLA-4 抗體諸如 Antegren。本發(fā)明的Fc變體可用于TNF抑制劑分子以提供增強(qiáng)的特性。已經(jīng)證明，與 Fc YRIIIa關(guān)聯(lián)的效應(yīng)器功能可以負(fù)面的影響用于治療具有高親和力多態(tài)性(本文別 處討論的158F:V)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或銀屑病關(guān)節(jié)炎患者的某些TNF抑制劑分子的效 力，反之亦然(Z. Tutuncu et al. , 2004, "FcRPolymorphisms and Treatment Outcomes in Patients with Inflammatory Arthritis Treated with TNF Blocking Agents，，， 于2004年10月18日在San Antonio，TX召開的2004ACR會(huì)議上口頭報(bào)告；摘要公開于 Arthritis&Rheumatism, 2004年9月，引入作為參考)。通常，對于自身免疫狀況諸如類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎或銀屑病關(guān)節(jié)炎，將TNF抑制劑與相對于親本提供降低的對一種或多種Fc γ R 結(jié)合的Fc變體組合起來提高療法的效力。理想的是，減低或甚至消除對一種或多種Fc γ R 例如Fc YRIIIa的結(jié)合，與TNF抑制劑分子一起將產(chǎn)生最佳的結(jié)果。有用的TNF抑制劑分子包括在哺乳動(dòng)物中抑制TNF- α作用的任何分子。適宜的例 子包括 Fc 融合物Enbrel (etanerc印t)及抗體Humira (adalimumab)和Remicade (infliximab)。使用本發(fā)明的Fc變體進(jìn)行改造以降低Fc結(jié)合的單克隆抗體(諸如 Remicade和Humira)可能轉(zhuǎn)變成更有功效。在開發(fā)這些藥物中并未考慮Humira、Remicade、 和Enbrel的效應(yīng)器功能，更不用說效應(yīng)器功能的調(diào)節(jié)了。對比當(dāng)前的商業(yè)化產(chǎn)品，通過在 作用于自身免疫狀況的抗體或Fc融合物的背景中使用降低對一種或多種Fc γ R結(jié)合的本 發(fā)明的Fc變體，可以提高功效。有用的TNF抑制劑分子優(yōu)選包括優(yōu)勢負(fù)面TNF(Dominant Negative TNF)分子(如2000年3月2日提交的USSN 09/798, 789中定義的；2001年10 月15日提交的09/981，289 ；2002年9月30日提交的10/262，630 ；及2004年10月12日 提交的10/963，994，都引入作為參考)。優(yōu)勢負(fù)面TNF分子(DN-TNF)不具有內(nèi)在的效應(yīng)器 活性，并且起“挽救”跨膜TNF(tmTNF)的作用(即如果殺死含有tmTNF的細(xì)胞對于類風(fēng)濕 性或銀屑病關(guān)節(jié)炎的疾病結(jié)果具有負(fù)面影響的話)。優(yōu)選與降低或消除Fc γ R對受體結(jié)合 的Fc變體關(guān)聯(lián)的DN-TNF分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽發(fā)揮治療功能，完全或部分通過ADCC活性 來實(shí)現(xiàn)。與此類應(yīng)用相關(guān)的靶抗原及臨床產(chǎn)品和備選物可包括但不限于抗CD20抗體諸 如 Bexocar、Rituxan 、Zevalin 和 PR070769，抗 CD33 抗體諸如 Smart M195，抗 CD22 抗體諸如Lymphocide ，抗CD30抗體諸如AC-10和SGN-30，抗EGFR抗體諸如ABX-EGF、 Cetuximab, IMC-C225、Merck Mab 425，抗 EpCAM 抗體諸如 Crucell 氏抗 EpCAM,抗 HER2 抗 體諸如Here印tin和MDX-210，以及抗CEA抗體諸如cantumab和Pentacea。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽發(fā)揮治療功能，完全或部分通過CDC活性來實(shí)現(xiàn)。與此類應(yīng)用相關(guān)的靶抗原及臨床產(chǎn)品和備選物可包括但不限于抗CEA抗體諸如 cantumab 和 Pentacea，抗 CD20 抗體諸如 Bexocar、Rituxan 、Zevalin 和 PR070769,抗 EpCAM抗體諸如Crucell氏抗EpCAM和Edrecolomab，以及抗CD52抗體諸如Campath (alemtuzumab)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽針對在血液學(xué)譜系中表達(dá)的抗原。與此類 應(yīng)用相關(guān)的靶抗原及臨床產(chǎn)品和備選物可包括但不限于抗CD33抗體諸如Smart M195， 抗CD40L抗體諸如Antova 、IDEC-131，抗CD44抗體諸如Blvatuzumab，抗CD52抗體諸如 Campath (alemtuzumab)，抗 CD80 抗體諸如 IDEC-114，抗 CTLA-4 抗體諸如 MDX-101, 抗 CD20 抗體諸如 Bexocar、Rituxan 、Zevalin 和 PR070769，抗 CD22 抗體諸如 Lymphocide ，抗 CD23 抗體諸如 IDEC-152，抗 CD25 抗體諸如Zenapax (daclizumab)，以 及抗 MHC (HLA-DR)抗體諸如 apol izumab。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽針對實(shí)體瘤中表達(dá)的抗原。與此類應(yīng)用相 關(guān)的靶抗原及臨床產(chǎn)品和備選物可包括但不限于抗EpCAM抗體諸如Crucell氏抗EpCAM 和 Edrecolomab，抗 CEA 抗體諸如 cantumab 和 Pentacea，抗 EGFR 抗體諸如 ABX-EGF、 Cetuximab, IMC-C225、Merck Mab425，抗 Muc 1 抗體諸如 BravaRex、TriAb，抗 Her2 抗體諸 如Herceptin 、MDX-210，抗⑶-2神經(jīng)節(jié)苷脂抗體諸如3F8和TriGem，抗⑶-3神經(jīng)節(jié)苷酯 抗體諸如mitumomab，抗PSMA抗體諸如MDX-070，抗CA125抗體諸如oregovomab，抗TAG-72 抗體諸如MDX-220，以及抗MUC-I抗體諸如cantuzumab。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明Fc變體的靶物自身是一種或多種Fc配體。本 發(fā)明的Fc多肽可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的活性，以及在某些情況中以更受控制的、特異的和高 效的方式模仿IVIg療法的效果。IVIg是有效的高劑量靜脈內(nèi)投遞免疫球蛋白。通常，已將 IVIg用于下調(diào)自身免疫狀況。已有假設(shè)，IVIg的治療性作用機(jī)制牽涉高頻率的Fc受體連 ^ (J. Bayry et al. ,2003,Transfusion Clinique et Biologique 10 165-169 ；Binstadt et al.，2003，JAllergy Clin. Immunol，697-704)。事實(shí)上，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP) 的動(dòng)物模型顯示了分離的Fc是IVIg的活性部分(Samuelsson et al，2001，Pediatric Research 50(5)，551)。為了在治療中使用，從數(shù)千名供體收集免疫球蛋白，其具有與從人 類收集非重組生物治療劑相關(guān)的所有伴隨問題。當(dāng)IVIg作為重組蛋白生產(chǎn)而非從供體收 集時(shí)，本發(fā)明的Fc變體應(yīng)充當(dāng)IVIg的所有角色。IVIg的免疫調(diào)節(jié)效果可能依賴于與一種或多種Fc配體的生產(chǎn)性相互作用，該配 體包括但不限于Fc y R、補(bǔ)體蛋白和FcRn。在有些實(shí)施方案中，具有對Fc y RIIb增強(qiáng)的 親和力的本發(fā)明Fc變體可用于促進(jìn)抗炎活性(Samuelsson et al.，2001，Science 291 484-486)和 / 或降低自身免疫性(Hogarth，2002，Current Opinion in Immunology, 14 798-802)。在其它實(shí)施方案中，具有對一種或多種Fc Y R增強(qiáng)的親和力的本發(fā)明Fc多肽可 通過其自身或結(jié)合另外的修飾用于降低自身免疫性(Hogarth，2002，Current Opinion in Immunology, 14 =798-802)。在備選的實(shí)施方案中，具有對Fc Y RIIIa增強(qiáng)的親和力但細(xì)胞 內(nèi)法信號能力降低的本發(fā)明Fc變體可用于通過競爭性干擾Fc y RIIIa結(jié)合而降低免疫系 統(tǒng)活化。Fc變體的背景顯著影響期望的特異性。例如，提供對一種或多種活化Fc γ R結(jié)合 增強(qiáng)的Fc變體在抗體、Fc融合物、分離的Fe、或Fc片段的背景中通過擔(dān)當(dāng)Fc γ R拮抗劑可 提供最佳免疫調(diào)節(jié)效果(van Mirre et al.，2004，J. Immunol. 173 :332_339)。然而，兩種或多種Fc變體的融合或綴合可提供不同效果，而且對于這樣的Fc多肽，利用提供對抑制性 受體增強(qiáng)的親和力的Fc變體可能是最佳的。本發(fā)明的Fc變體可用作免疫調(diào)節(jié)治療劑。結(jié)合或阻斷免疫系統(tǒng)細(xì)胞上的Fc受體 可用來影響免疫學(xué)狀況中的免疫應(yīng)答，該免疫狀況包括但不限于特發(fā)性血小板減少性紫癜 (ITP)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等。通過使用本發(fā)明親和力增強(qiáng)的Fc變體，典型的IVIg應(yīng) 用中需要的劑量可以減少而同時(shí)獲得基本上類似的治療效果。Fc變體可提供對Fc γ R增強(qiáng) 的結(jié)合，包括但不限于Fc y RIIa,Fc y RIIb,Fc y RIIIa、Fc y Rlllb、和/或Fc γ RI。具體而 言，對Fc YRIIb的結(jié)合增強(qiáng)將根據(jù)需要提高該受體的表達(dá)或抑制活性，并改善功效。或者， 阻斷對活化受體諸如Fc γ RIIIb或Fc γ RI的結(jié)合可改善功效。另外，調(diào)節(jié)Fc變體對FcRn 和/或還有補(bǔ)體的親和力也可帶來益處。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供對抑制性受體Fc γ RIIb增強(qiáng)的結(jié)合的Fc變體提供對 IVIg治療方法的增強(qiáng)。具體而言，可以使用以比親本Fc多肽更大親和力結(jié)合Fc γ RIIb受體 的本發(fā)明Fc變體。這樣的Fc變體將因此發(fā)揮Fc y RIIb拮抗劑的功能，并將預(yù)計(jì)增強(qiáng)IVIg 作為自身免疫病治療劑及還有作為B細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑的有益效果。另外，這樣的Fc y RIIb 增強(qiáng)型Fc變體還可以進(jìn)一步修飾以具有對其它受體相同或有限的結(jié)合。在另外的實(shí)施方 案中，具有增強(qiáng)的Fc YRIIb親和力的Fc變體可以與降低或消除對其它受體結(jié)合的突變結(jié) 合起來，從而在治療性使用中進(jìn)一步潛在的將副作用最小化。本發(fā)明Fc變體的此類免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用還可用于腫瘤學(xué)適應(yīng)癥的治療，尤其是抗體 療法牽涉抗體依賴性細(xì)胞毒性機(jī)制的那些。例如，增強(qiáng)對Fc y RIIb親和力的Fc變體可用 于拮抗該抑制性受體，例如通過對Fc/Fc y RIIb結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合但不會(huì)觸發(fā)，或降低細(xì)胞 信號，潛在增強(qiáng)基于抗體的抗癌療法的效果。這樣的Fc變體，行使Fc γ RIIb拮抗劑的功能， 可阻斷Fc YRIIb的抑制特性，或如同在IVIg的情況中一樣降低其抑制功能。Fc γ RIIb拮 抗劑可用作與任何其它療法，包括但不限于抗體相結(jié)合的輔助療法(co-therapy)，在ADCC 相關(guān)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上起作用。這種類型的Fc y RIIb拮抗型Fc變體優(yōu)選是分離的Fc或 Fc片段，盡管在備選的實(shí)施方案中可以使用抗體和Fc融合物。優(yōu)化的特性本發(fā)明提供了為許多治療性相關(guān)特性優(yōu)化的Fc變體。Fc變體相對于親本Fc多肽 包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述氨基酸修飾提供一種或多種優(yōu)化的特性。本發(fā)明的 Fc變體由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與親本Fc多肽在氨基酸序列上有所不同。因此，本發(fā)明 的Fc變體與親本相比具有至少一個(gè)氨基酸修飾?；蛘?，本發(fā)明的Fc變體與親本相比可具 有多于一個(gè)氨基酸修飾，例如與親本相比約1個(gè)到50個(gè)的氨基酸修飾，優(yōu)選約1個(gè)到10個(gè) 氨基酸修飾，最優(yōu)選約1個(gè)到約5個(gè)氨基酸修飾。因此，F(xiàn)c變體的序列與親本Fc多肽的序 列基本上是同源的。例如，本文中的變異的Fc變體序列將具有與親本Fc變體序列約80% 的同源性，優(yōu)選至少約90%的同源性，最優(yōu)選至少約95%的同源性。本發(fā)明的Fc變體可以為多種特性優(yōu)化。經(jīng)改造或預(yù)測而展示一種或多種優(yōu)化 特性的Fc變體在本文中稱為“優(yōu)化的Fc變體”。可以優(yōu)化的特性包括但不限于對Fc γ R 增強(qiáng)或減弱的親和力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體經(jīng)優(yōu)化而具有對人活 化 Fc γ R 增強(qiáng)的親和力，優(yōu)選 Fc γ RI、FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIA 和 Fc y RIIIb, 最優(yōu)選FcYRIIIa。在一個(gè)備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體經(jīng)優(yōu)化而具有對人抑制性受體Fc YRIIb減弱的親和力。這些優(yōu)選的實(shí)施方案預(yù)期在人中提供具有增強(qiáng)的治療特性的 Fc多肽，例如增強(qiáng)的效應(yīng)器功能和更大的抗癌效力。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的 Fc變體經(jīng)優(yōu)化而具有對人Fc γ R減弱或消除的親和力，包括但不限于Fc γ RI、Fc γ RIIa, Fc y RIIb, Fc y RIIc, Fc y RIIIA和Fc γ Rlllb。這些實(shí)施方案預(yù)期在人中提供具有增強(qiáng)的 治療特性的Fc多肽，例如減弱的效應(yīng)器功能和減弱的毒性。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的 Fc變體提高對一種或多種Fc γ R增強(qiáng)的親和力，而對一種或多種其它Fc γ R減弱的親和力。 例如，本發(fā)明的Fc變體可具有對Fc YRIIIa增強(qiáng)的親和力，而對Fc y RIIb減弱的親和力。 或者，本發(fā)明的Fc變體可具有對Fc y RIIa和Fc y RI增強(qiáng)的結(jié)合，而對Fc y RIIb減弱的結(jié) 合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc變體可具有對Fc y RIIb增強(qiáng)的親和力，而對一種或 多種活化Fc γ R減弱的親和力。優(yōu)選的實(shí)施方案包括對Fc結(jié)合人Fc γ R的優(yōu)化，然而在備選的實(shí)施方案中本發(fā)明 的Fc變體具有對來自非人生物體的Fc γ R增強(qiáng)或減弱的親和力，包括但不限于嚙齒類和非 人靈長類。為結(jié)合非人Fc YR優(yōu)化的Fc變體可用于實(shí)驗(yàn)。例如，小鼠模型可用于多種疾病， 從而能夠?qū)o定的藥物備選物測試諸如功效、毒性和藥動(dòng)學(xué)等特性。正如本領(lǐng)域所知道的， 可以將癌細(xì)胞移植或注射到小鼠中以模擬人類的癌癥，這一過程稱為異種移植。測試包含 為一種或多種小鼠Fc γ R優(yōu)化的Fc變體的蛋白質(zhì)可提供關(guān)于這種蛋白質(zhì)的功效、其作用機(jī) 制等等的有用信息。本發(fā)明的Fc變體還可為無糖基化形式的增強(qiáng)的功能性和/或溶解特 性而優(yōu)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的無糖基化Fc變體以比親本Fc變體的無糖 基化形式更大的親和力結(jié)合Fc配體。所述Fc配體包括但不限于Fc y R、Clq、FcRn、及蛋白 質(zhì)A和G，而且可來自任何來源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔或猴，優(yōu)選人。在一個(gè)備選 的優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體經(jīng)優(yōu)化比親本Fc變體的無糖基化形式更穩(wěn)定和/或更易溶解。本發(fā)明的Fc變體可包含調(diào)節(jié)與Fc γ R以外Fc配體的相互作用的修飾，包括但不 限于補(bǔ)體蛋白、FcRn和Fc受體同系物(FcRH)。FcRH包括但不限于FcRHl、FcRH2、FcRH3、 FcRH4、FcRH5 禾口 FcRH6(Davis et al. ，2002，Immunol. Reviews 190 :123—136)。優(yōu)選的是，本發(fā)明Fc變體的Fc配體特異性將決定其治療效用。用于治療目的的 給定Fc變體的效用將取決于靶抗原的表位或形式以及所治療的疾病或適應(yīng)癥。對于有些 靶物和適應(yīng)癥來說，增強(qiáng)的Fc γ R介導(dǎo)的效應(yīng)器功能可能是優(yōu)選的。這可能對于抗癌Fc變 體而言是特別有利的。因此，可使用這樣的Fc變體，該Fc變體包含提供對活化Fc γ R增強(qiáng) 的親和力和/或?qū)σ种菩訤c γ R減弱的親和力的Fc變體。對于有些靶物和適應(yīng)癥而言，利 用對不同活化Fc γ R提供不同選擇性的Fc變體可能是更為有利的；例如，在有些情況中，可 能希望對Fc y RIIa和Fc y RIIIa增強(qiáng)的結(jié)合，而非Fc y RI，然而在其它情況中，可能優(yōu)選只 對Fc y RIIa增強(qiáng)的結(jié)合。對某些靶物和適應(yīng)癥而言，可能優(yōu)選利用增強(qiáng)Fc γ R介導(dǎo)的和補(bǔ) 體介導(dǎo)的兩種效應(yīng)器功能的Fc變體，而對于其它情況，利用增強(qiáng)Fc γ R介導(dǎo)的或補(bǔ)體介導(dǎo) 的任一效應(yīng)器功能的Fc變體可能是有利的。對某些靶物或癌癥適應(yīng)癥而言，減弱或消除一 種或多種效應(yīng)器功能可能是有利的，例如通過敲除與Clq、一種或多種Fcy R、FcRru或一種 或多種其它Fc配體的結(jié)合。對其它靶物和適應(yīng)癥而言，可能優(yōu)選利用對抑制性Fc y RIIb 提供增強(qiáng)的結(jié)合，但對活化Fc γ R提供WT水平、減弱的、或消除的結(jié)合的Fc變體。這可能 是特別有用的，例如當(dāng)Fc變體的目標(biāo)是以某種方式抑制炎癥或自身免疫病，或調(diào)節(jié)免疫系 統(tǒng)。
顯然，決定給定Fc變體治療給定疾病的最有利選擇性的一項(xiàng)重要參數(shù)是Fc變體的背景，也就是所使用的是什么類型的Fc變體。因此，給定Fc變體的Fc配體選擇性或特 異性將提供不同特性，取決于它是否包含具有偶聯(lián)的融合或綴合伴侶的抗體、Fc融合物、 或Fc變體。例如，如果包含毒素、放射性核苷酸或其它綴合物的Fc變體具有對一種或多 種Fc配體減弱或消除的結(jié)合，那么所述毒素、放射性核苷酸或其它綴合物對正常細(xì)胞的毒 性可能會(huì)變小。作為另一個(gè)例子，為了抑制炎癥或自身免疫病，可能優(yōu)選利用對活化Fc γ R 具有增強(qiáng)的親和力的Fc變體，諸如結(jié)合這些Fc γ R以及防止它們活化。相反，包含具有 增強(qiáng)的Fc y RIIb親和力的兩個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)域的Fc變體可能在免疫細(xì)胞表面上共招致 (co-engage)受體，從而抑制這些細(xì)胞的增殖。而在有些情況中，F(xiàn)c變體可在一種細(xì)胞類 型上招致其靶抗原而在與靶抗原分開的細(xì)胞上招致Fc γ R，在其它情況中，在與靶抗原相同 的細(xì)胞的表面上招致Fc γ R可能是有利的。例如，如果抗體靶向細(xì)胞上的抗原，該細(xì)胞還 表達(dá)一種或多種Fc y R，那么利用增強(qiáng)或減弱對該細(xì)胞表面上Fc γ R的結(jié)合的Fc變體可能 是有利的。這是有可能的，例如當(dāng)Fc變體作為抗癌藥使用，而且同一細(xì)胞表面上靶抗原和 FcyR的共招致促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致生長抑制、凋亡或其它抗增殖效果的信號事件時(shí)。或者，當(dāng) Fc變體在以某種方式用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)時(shí)，抗原和Fc γ R在同一細(xì)胞上的共招致可能是有 利的，其中靶抗原和Fc γ R的共招致提供了一些增殖性的或抗增殖的效果。同樣，包含兩個(gè) 或多個(gè)Fc區(qū)域的Fc變體可能從調(diào)節(jié)Fc γ R選擇性或特異性從而在同一細(xì)胞表面上共招致 FcyR的Fc變體獲益?？烧{(diào)節(jié)本發(fā)明Fc變體的Fc配體特異性以創(chuàng)建可能適于特定靶抗原、適應(yīng)癥、或患 者群的不同效應(yīng)器功能譜。表1描述了受體結(jié)合譜的幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，包括對各種受體 的結(jié)合的改進(jìn)、降低或無影響，其中此類改變在某些背景中可能是有益的。此表中的受體結(jié) 合譜可通過增加或減少指定受體的程度而改變。另外，指定的結(jié)合變化可以在對其它受體 諸如Clq或FcRn的另外結(jié)合變化的背景中，例如通過與消除對Clq的結(jié)合以關(guān)閉補(bǔ)體活化 結(jié)合起來，或通過與增強(qiáng)對Clq的結(jié)合以增加補(bǔ)體活化結(jié)合起來。具有其它受體結(jié)合譜的 其它實(shí)施方案是可能的，列出的受體結(jié)合譜是例示性的。表權(quán)利要求
包含親本Fc多肽的Fc變體的蛋白質(zhì)，所述Fc變體在Fc區(qū)中包含選自如下的氨基酸取代267D、267E、328Y、328R、236A、236S、236D、236R和268F，其中編號依照EU索引。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)化的Fc變體、其生產(chǎn)方法、包含優(yōu)化的Fc變體的Fc多肽、以及使用優(yōu)化的Fc變體的方法。
文檔編號C07K16/00GK101987870SQ20101027014
公開日2011年3月23日 申請日期2005年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者黨偉, 奧米德·瓦法, 格雷戈里·A·拉扎爾, 約翰·R·德斯賈萊斯, 羅伯特·海斯, 謝爾·B·卡基 申請人:贊科股份有限公司