專利名稱：用于抑制和改善疾病的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及醫(yī)藥和合成化學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及類胡蘿卜素類 似物的合成和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管疾病(CVD)，特別是冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，仍是美國(guó)和全世界死亡的主導(dǎo)原 因。CVD是全世界死亡率和發(fā)病率的主導(dǎo)原因。輕度至中度降低心血管風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致急性 冠脈綜合征的急診部就診和住院治療減少，可以產(chǎn)生明顯的臨床和公共衛(wèi)生益處。對(duì)抗氧化劑的廣泛研究已表明它們是初級(jí)和二級(jí)預(yù)防心血管疾病的有效治療劑。 CVD仍是美國(guó)所有種族死亡的主導(dǎo)原因；現(xiàn)在大約6千萬美國(guó)人患有某種形式的CVD。如果 可以消除CVD則在美國(guó)的預(yù)期壽命將增加差不多7年。由CVD導(dǎo)致的絕對(duì)死亡數(shù)自1996年 以來已有所降低，但是它在美國(guó)仍是單一最大死亡原因，其總年度醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)大于$3000 億(包括心臟病發(fā)作和中風(fēng))。局部缺血是特定的組織缺乏足夠的含氧血供。局部缺血是許多急性和慢性疾病狀 況的基礎(chǔ)，所述疾病包括但不限于 心肌梗塞，或MI 不穩(wěn)定性心絞痛 穩(wěn)定性心絞痛 經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)后的突然重閉 血栓形成性中風(fēng)(中風(fēng)總數(shù)的85% ) 栓塞性血管閉塞 外周血管機(jī)能不全 器官移植 深靜脈血栓形成，或DVT 留置導(dǎo)管閉塞局部缺血也可能成為選擇性操作中的一個(gè)問題，例如預(yù)定的器官移植；預(yù)定的 冠狀動(dòng)脈分流移植手術(shù)(CABG)；和預(yù)定的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)。這些情況 中的每一種的共同之處是再灌注損傷現(xiàn)象在將含氧血流重新引入到先前局部缺血的區(qū)域 時(shí)產(chǎn)生活性氧種類(ROS)，隨后發(fā)生反常額外的組織損害。特別地，在急性心肌梗塞(AMI) 和急性血栓形成性中風(fēng)中使用溶栓療法_以及用PTCA進(jìn)行外科血管再形成_通常伴有局 部缺血心肌和/或腦的再灌注。臨床結(jié)果隨著在急性血栓形成后實(shí)現(xiàn)早期開放而改善，但 并非不用付出代價(jià)(即“再灌注損傷”)。目前的治療允許再灌注藥理學(xué)活性劑，包括重組組織型纖溶酶原活化物(r-TPA)、阿尼普酶(APSAC)、鏈激酶和尿激酶。近來的研究已表明早期外科再灌注帶來AMI之后的最佳臨床結(jié)果。但是，外科再灌注僅在15-20%的美國(guó)醫(yī)療中心可獲得，而在全世界則更少。 因此，藥理學(xué)再灌注對(duì)可預(yù)見的未來而言可能仍是臨床上適當(dāng)?shù)暮椭匾摹Ｈ芩ㄖ委熢诖蠹s20%的梗塞動(dòng)脈的再灌注中是不成功的。在成功地進(jìn)行再灌注 的動(dòng)脈中，大約15%突然重閉(24小時(shí)之內(nèi))。系統(tǒng)炎癥的衡量指標(biāo)(例如C-反應(yīng)蛋白或 CRP的血清水平)與這些患者的臨床重閉十分相關(guān)。心肌搶救作用似乎在急性斑塊破裂和 血栓形成之后的2-6小時(shí)“治療窗”內(nèi)最大。在急性血栓形成性或血栓栓塞性中風(fēng)中，這種 治療窗甚至更窄，通常小于血栓形成后3小時(shí)。在局部缺血性中風(fēng)3小時(shí)內(nèi)施用重組組織 型纖溶酶原活化物顯著地改善臨床結(jié)果，但增加出血的風(fēng)險(xiǎn)。在局部缺血期間，許多細(xì)胞經(jīng)歷與缺氧有關(guān)的生物化學(xué)和病理學(xué)變化，但保持潛 在活力。因此這些潛在存活的細(xì)胞是再灌注期中的“戰(zhàn)場(chǎng)”。局部缺血引起受影響的組織發(fā) 生變化，并可能最終導(dǎo)致處于危險(xiǎn)的心肌的收縮帶和/或凝固壞死。局部缺血心肌的病理 變化包括但不限于·自由基和ROS產(chǎn)生 · ATP喪失和缺陷ATP再合成 磷酸肌酸喪失 細(xì)胞外鉀喪失 心肌產(chǎn)生主動(dòng)張力的能力喪失 細(xì)胞腫脹 酸中毒 離子穩(wěn)態(tài)喪失 結(jié)構(gòu)破壞·電不穩(wěn)定和心律失常發(fā)生 脂膜過氧化物 谷胱甘肽和其它內(nèi)源性/外源性抗氧化劑消耗(包括維生素C和E和類胡蘿卜 素)對(duì)尚未不可逆地達(dá)到壞死閾的局部缺血心肌的援救是再灌注損傷中干預(yù)的焦點(diǎn)。間隙連接是一種在大部分動(dòng)物細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特類型的細(xì)胞間連接。它們形 成使相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)互相連接的水性通道，并使小(小于大約1千道爾頓)細(xì)胞質(zhì)組分 的直接細(xì)胞間交換成為可能。通過對(duì)接由各個(gè)相鄰細(xì)胞提供的兩個(gè)半通道(“連接子”)跨 越其間的胞外空間創(chuàng)建間隙連接。每個(gè)半通道是6個(gè)連接蛋白分子的低聚物。連接蛋白43是所發(fā)現(xiàn)的第二種連接蛋白基團(tuán)，它編碼在確立的細(xì)胞系和組織中 最廣泛表達(dá)的連接蛋白中的一種。由連接蛋白43形成的間隙連接涉及發(fā)育、心臟功能和生 長(zhǎng)調(diào)控。CVD的一個(gè)共同的表現(xiàn)是心律失常。一般認(rèn)為心律失常是心臟電活動(dòng)的紊亂，其表 現(xiàn)為心率或心律異常。心律失?；颊呖赡芙?jīng)歷從心悸至昏暈("暈厥")的廣泛癥狀。心血管系統(tǒng)中的主要連接蛋白為連接蛋白43。認(rèn)為在血管壁細(xì)胞，特別是內(nèi)皮細(xì) 胞之中細(xì)胞反應(yīng)的間隙連接協(xié)調(diào)對(duì)于血管舒縮張力的局部調(diào)節(jié)和循環(huán)穩(wěn)態(tài)的維持而言是 關(guān)鍵性的?？刂七B接蛋白43的上調(diào)還可以有助于保持心臟組織中的電穩(wěn)定性。保持心臟組織中的電穩(wěn)定性可以有益于每年數(shù)十萬患有某些類型心血管疾病[例如局部缺血性心 臟病(IHD)和心律失常]的人的健康，并可以防止處于高度心律失常風(fēng)險(xiǎn)的患者發(fā)生心源 性猝死。通常認(rèn)為癌癥的特征是不受控的、異常的細(xì)胞生長(zhǎng)。前述的連接蛋白43還與細(xì)胞生長(zhǎng)控制有關(guān)。連接蛋白43所致的生長(zhǎng)控制可能歸因于連接蛋白43與間隙連接通訊有關(guān)。 保持、恢復(fù)或增加功能性間隙連接通訊抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖。因此，上調(diào)和/或控制連接蛋 白43的可獲得性可以潛在地抑制和/或改善癌細(xì)胞的擴(kuò)散。慢性肝損傷，不管其病因如何，可以造成從急性和慢性炎癥至早期纖維化，并最終 至肝硬化和晚期肝臟疾病(ESRD)的進(jìn)行性病理范圍。初始損傷繼發(fā)的炎性事件級(jí)聯(lián)，包括 釋放細(xì)胞因子和形成活性氧種類(ROS)，活化肝星形細(xì)胞(HSC)。HSC產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分 (ECM)，包括膠原，并且在產(chǎn)生肝纖維化的過程中是關(guān)鍵。晚期肝臟疾病[表現(xiàn)為肝硬化或肝細(xì)胞癌(HCC)]是美國(guó)與疾病有關(guān)的死亡的第8 個(gè)主導(dǎo)原因。由病毒感染、酒精濫用、藥物誘導(dǎo)的毒性、鐵和銅超負(fù)荷以及許多其它因素導(dǎo) 致的肝的慢性炎癥可以引發(fā)肝纖維化。肝細(xì)胞損害的副產(chǎn)物活化枯否細(xì)胞，其然后釋放多 種細(xì)胞因子、ROS(特別包括超氧化物陰離子)和其它旁分泌和自分泌因子，進(jìn)而作用于肝 星形細(xì)胞(HSC)。目前認(rèn)為纖維發(fā)生級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵細(xì)胞是HsC-負(fù)責(zé)產(chǎn)生ECM的細(xì)胞類型。 體外證據(jù)表明，ROS可以誘導(dǎo)HSC細(xì)胞。在所有慢性肝臟疾病患者中觀察到氧化應(yīng)激的間 接標(biāo)記物(例如硫代巴比妥酸活性種類或TBARS)的水平升高。此外，慢性肝臟疾病患者的 谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、類胡蘿卜素和α-生育酚(維生素E)的 水平明顯較低。提供這些內(nèi)源性和/或外源性抗氧化劑逆轉(zhuǎn)許多慢性肝臟疾病的征象，包 括病程的代用標(biāo)記和肝纖維化的直接衡量指標(biāo)。因此，它們可能是肝臟疾病治療干預(yù)的有 效藥劑。

發(fā)明內(nèi)容
在某些實(shí)施方案中，施用類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)類似物可以抑制和/或改善治療對(duì)象 疾病的發(fā)生?？梢杂妙惡}卜素的結(jié)構(gòu)類似物治療的疾病可以包括涉及產(chǎn)生活性氧種類和 /或其它自由基種類(例如單線態(tài)氧，這是一種活性氧種類但不是自由基)的任何疾病。在 某些實(shí)施方案中，水溶性類胡蘿卜素類似物可以用于治療涉及產(chǎn)生活性氧種類的疾病?；?性氧種類和其它自由基與非自由基種類對(duì)DNA、蛋白和脂質(zhì)的氧化涉及許多人類疾病。自由 基可能是以下病癥的主要原因，可使身體對(duì)其它引發(fā)疾病的因子更敏感，可抑制內(nèi)源性防 御和修復(fù)過程，和/或可促進(jìn)初期疾病的進(jìn)展。本領(lǐng)域技術(shù)人員施用類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)類 似物_包括考慮治療藥物遞送的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)_預(yù)期可抑制和/或改善所述病癥。 在第一類病癥中，主要是單一器官受影響，其證據(jù)是在疾病的病理中涉及自由基和/或非 自由基。這些實(shí)例不應(yīng)被看作是限定，其它病癥對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。頭、眼、耳、鼻和咽喉與年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)、視網(wǎng)膜脫離、高血壓性視網(wǎng) 膜疾病、葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、玻璃體炎、眼出血、退化性視網(wǎng)膜損傷、白內(nèi)障生成和白內(nèi)障、 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、美尼爾病、藥物誘導(dǎo)的耳毒性(包括氨基糖苷和速尿毒性)、感染性和 特發(fā)性耳炎、中耳炎、感染性和過敏性鼻竇炎、頭頸部癌癥；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)老年性癡呆(包括阿爾茨海默癡呆)、尼曼-皮克病、神經(jīng)毒素反應(yīng)、高壓氧效應(yīng)、帕金森氏病、腦和脊髓外傷、高血壓性腦血管損傷、中風(fēng)(血栓 栓塞性、血栓形成性和出血性)、感染性腦炎和腦膜炎、變應(yīng)性腦脊髓炎和其它脫髓鞘疾病、 肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、共濟(jì)失調(diào)_毛細(xì)血管擴(kuò) 張綜合征、鋁、鐵和其它重金屬超負(fù)荷、原發(fā)性腦癌/惡性腫瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤； 心血管動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、外周血管疾病、心肌梗塞、慢性穩(wěn)定性心絞痛、 不穩(wěn)定性心絞痛、特發(fā)性手術(shù)損傷(CABG、PTCA期間)、炎性心臟疾病[由C-反應(yīng)蛋白(CRP) 和髓過氧化物酶(MPO)衡量并受其影響]、低密度脂蛋白氧化(Ox-LDL)、心肌病、心律失常 (局部缺血性和心肌梗塞后誘導(dǎo)的)、充血性心衰(CHF)、藥物毒性(包括亞德里亞霉素和阿 霉素)、克山病(硒缺乏)、錐蟲病、酒精性心肌病、靜脈停滯和損傷(包括深靜脈血栓形成 或DVT)、血栓性靜脈炎；肺哮喘、反應(yīng)性氣道疾病、慢性阻塞性肺病(C0PD或肺氣腫)、氧過多、高壓氧效 應(yīng)、香煙煙霧吸入效應(yīng)、環(huán)境氧化劑污染物效應(yīng)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、支氣管肺發(fā) 育不良、礦物塵肺、阿霉素毒性、博來霉素毒性、百草枯和其它殺蟲劑毒性、化學(xué)性肺炎、特 發(fā)性肺間質(zhì)纖維化、感染性肺炎(包括真菌)、結(jié)節(jié)病、石棉沉著病、肺癌(小細(xì)胞和大細(xì) 胞)、炭疽感染、炭疽毒素接觸；腎高血壓性腎病、終末期腎病、糖尿病性腎病、感染性腎小球腎炎、腎病綜合征、 變應(yīng)性腎小球腎炎、I-IV型超敏反應(yīng)、腎同種移植排斥、腎炎性抗腎小球基底膜疾病、重金 屬腎毒性、藥物誘導(dǎo)的(包括氨基糖苷、速尿和非留體抗炎藥)腎毒性、橫紋肌溶解、腎癌；肝四氯化碳肝損傷、內(nèi)毒素和脂多糖肝損傷、慢性病毒感染(包括肝炎感染)、感 染性肝炎(非病毒性病因)、血色素沉著、肝豆?fàn)詈俗冃圆?、?duì)乙酰氨基酚過量、充血性心衰 伴肝充血、肝硬化(包括酒精性、病毒性和特發(fā)性病因)、肝細(xì)胞癌、肝轉(zhuǎn)移瘤；胃腸炎性腸病(包括克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和腸易激綜合征)、結(jié)腸癌、息肉 病、感染性憩室炎、中毒性巨結(jié)腸、胃炎(包括幽門螺桿菌感染)、胃癌、食管炎(包括巴瑞特 氏食道癥)、胃食管反流疾病(GERD)、惠普爾病、膽石病、胰腺炎、血β-脂蛋白缺乏癥、感染 性胃腸炎、痢疾、非甾體抗炎藥誘導(dǎo)的毒性；造血/血液Pb (鉛)中毒、藥物誘導(dǎo)的骨髓抑制、原卟啉光氧化、淋巴瘤、白血病、 卟啉癥、寄生蟲感染(包括瘧疾)、鐮狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血、蠶豆病、惡性貧血、范康尼 氏貧血、感染后貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫缺陷綜合征(AIDS)；泌尿生殖感染性前列腺炎、前列腺癌、良性前列腺肥大(BPH)、尿道炎、睪丸炎、 睪丸扭轉(zhuǎn)、子宮頸炎、宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、陰道炎、陰道痙攣；肌肉骨骼骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌腱炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良、退化性椎間盤疾病、 退化性關(guān)節(jié)疾病、運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨胳肌損傷、腕管綜合征、格林_巴利綜合征、佩吉特骨病、強(qiáng) 直性脊椎炎、異位骨形成；和體被日照射損傷(包括曬斑)、熱損傷、化學(xué)和接觸性皮膚炎(包括漆樹屬皮 炎)、牛皮癬、布盧姆氏綜合征、粘膜白斑病(特別是口)、感染性皮炎、卡波濟(jì)氏肉瘤。第二類是多器官病癥，其病理已在某些方面令人信服地與自由基和非自由基損傷 相關(guān)聯(lián)衰老(包括與年齡相關(guān)的免疫缺陷和過早衰老疾病)、癌癥、心血管疾病、腦血管疾 病、輻射損傷、酒精介導(dǎo)的損害(包括韋_科綜合征)、局部缺血_再灌注損害、炎性和自身 免疫疾病、藥物毒性、淀粉樣疾病、超負(fù)荷綜合征(鐵、銅等)、多系統(tǒng)器官衰竭和內(nèi)毒素血癥/膿毒病。 可以用類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物治療的疾病可以包括但不限于心血管炎癥、丙型肝 炎感染、癌(肝細(xì)胞癌和前列腺)、黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)、阿爾茨海默氏病，和/ 或骨關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，給治療對(duì)象施用水溶性類胡蘿卜素類似物可以抑制和/ 或改善治療對(duì)象再灌注損傷的發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，可以給治療對(duì)象單獨(dú)或與其它類 胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物組合來施用水溶性和其它類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物。可以通過給治療對(duì) 象施用治療量的水溶性和/或其它類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物來抑制或改善正在經(jīng)歷或已經(jīng) 歷或傾向于經(jīng)歷心肌梗塞、中風(fēng)、外周血管疾病、靜脈或動(dòng)脈閉塞、器官移植、冠狀動(dòng)脈分流 移植手術(shù)、經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和心血管驟停和/或死亡的人類治療對(duì)象發(fā)生再 灌注損傷?！八苄浴鳖惡}卜素結(jié)構(gòu)類似物是可以在水溶液中單獨(dú)或與賦形劑一起配制的 那些類似物。水溶性類胡蘿卜素類似物可以包括形成分子自裝配體的那些化合物和合成衍 生物，它可能更恰當(dāng)?shù)乇环Q為“水可分散性”類胡蘿卜素類似物。水溶性和“水可分散性”類 胡蘿卜素類似物可能在本發(fā)明某些方面是優(yōu)選實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，給治療對(duì)象施用水溶性類胡蘿卜素類似物可以抑制和/或改 善與心律失常有關(guān)的某些類型的心血管疾病。在某些實(shí)施方案中，可以給治療對(duì)象單獨(dú)或 與其它類胡蘿卜素類似物組合來施用水溶性類胡蘿卜素類似物。類胡蘿卜素類似物可能有 助于保持心臟組織的電穩(wěn)定性。對(duì)心臟組織電穩(wěn)定性保持的幫助可以抑制和/或改善某些 類型的心血管疾病，特別包括可歸因于致命性心律失常的心源性猝死。在一個(gè)實(shí)施方案中，給治療對(duì)象施用水溶性類胡蘿卜素類似物可以抑制和/或改 善治療對(duì)象肝臟疾病的發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，可以給治療對(duì)象單獨(dú)或與其它類胡蘿卜 素類似物組合來施用水溶性類胡蘿卜素類似物。所述肝臟疾病可以是慢性肝臟疾病，例如 丙型肝炎感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，給治療對(duì)象施用水溶性類胡蘿卜素類似物可以抑制和/或改 善初始、轉(zhuǎn)化和/或癌細(xì)胞的增殖和繁殖。在某些實(shí)施方案中，可以給治療對(duì)象單獨(dú)或與其 它類胡蘿卜素類似物組合來施用水溶性類胡蘿卜素類似物。類胡蘿卜素類似物可以抑制致 癌物引發(fā)細(xì)胞的增殖速率。類胡蘿卜素類似物可以增加連接蛋白43表達(dá)。連接蛋白43表 達(dá)的增加可以增加、保持或恢復(fù)間隙連接細(xì)胞間通訊，從而抑制致癌物引發(fā)細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)施方案還可涉及給該治療對(duì)象施用包含類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的組合的藥物 組合物。一種可注射的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物-蝦青素的組合物可特別用于本文所述的治 療方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將可注射的蝦青素結(jié)構(gòu)類似物與另一種蝦青素結(jié)構(gòu)類似物 和/或其它類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物一起給藥，或者與其它促進(jìn)期望目的的抗氧化劑和/或 賦形劑一起配制給藥。在某些實(shí)施方案中，一種或多種蝦青素結(jié)構(gòu)類似物是水溶性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含類胡蘿卜素的化合物可以具有通式結(jié)構(gòu)(I) 各個(gè)R3可以獨(dú)立地為氫或甲基。R1和R2可以獨(dú)立地為H、具有一個(gè)或多個(gè)取代基 的無環(huán)烯烴或包含一個(gè)或多個(gè)取代基的環(huán)。在某些實(shí)施方案中，取代基可以至少部分親水。 這些類胡蘿卜素衍生物可以用于藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括通式結(jié)構(gòu)(I)的類 胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的藥物組合物可以用于治療再灌注損傷。 本文所用的術(shù)語“二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物”、〃 dAST"、“ Cardax"、“ Ca rdax "、“ rac"和“蝦青素二琥珀酸酯衍生物(ADD) ”代表二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生 物用于不同立體異構(gòu)體和水性配方的不同命名法，并代表目前優(yōu)選但是例舉性的用于預(yù)期 使用這種類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的實(shí)施方案。二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生物(astaCOOH) 是用于閃光光解研究以直接與非酯化的“外消旋”(即立體異構(gòu)體的混合物)蝦青素進(jìn)行比 較的質(zhì)子化形式的衍生物?！癈ardax-C"是二鈉鹽二琥珀酸酯二維生素C衍生物(衍生物 XXIII)，用于超氧化物陰離子清除實(shí)驗(yàn)，通過電子順磁共振(EPR)成像來測(cè)定。附圖的簡(jiǎn)要說明參照以下與附圖結(jié)合對(duì)目前優(yōu)選但只不過是例示性的本發(fā)明的實(shí)施方案所作的 詳細(xì)說明將更為完全地理解以上的簡(jiǎn)要說明和本發(fā)明方法和裝置的進(jìn)一步的目標(biāo)、特征和 優(yōu)點(diǎn)。

圖1為在自然界中發(fā)現(xiàn)的幾種“母體”類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)的圖示；圖2描述用電子順磁共振(EPR)成像監(jiān)測(cè)的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物對(duì)活 性氧種類超氧化物陰離子的作用；圖3描述用電子順磁共振(EPR)成像監(jiān)測(cè)的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/游 離維生素C溶液對(duì)活性氧種類超氧化物陰離子的作用；圖4描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物靜脈內(nèi)制劑(Cardax )預(yù)處理的雄性 Sprague-Dawley大鼠中梗塞大小相對(duì)減小的圖示；圖5描述為當(dāng)前研究合成的內(nèi)消旋蝦青素(3R，3’ S-或3S，3’ R- 二羥基-β，β -胡 蘿卜素_4，4' - 二酮；dAST)的全反式(全-E) 二鈉鹽二琥珀酸酯衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(顯 示為全-E 二陰離子bolamphiphile)；圖6描述25°C下在乙醇中的dAST的紫外-可見吸收光譜(室長(zhǎng)度1cm，c = 1.05X10_5M)。摩爾吸收系數(shù)示于括號(hào)內(nèi)。吸收光譜的第二衍生曲線表示近UV區(qū)的峰的確 切位置和隱藏的主要譜帶的振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu)；圖 7 描述 Ringer 緩沖液(pH 7. 4，室長(zhǎng)度 1cm，c = 1. 85 X IO^5M, t = 37°C )中的 dAST的吸收光譜。顯示了摩爾吸收系數(shù)；圖8描述通過以低L/P比率用在Ringer緩沖液(pH 7. 4)中的dAST滴定人血清 白蛋白(HSA)而獲得的誘導(dǎo)的⑶和UV/Vis光譜。HSA的濃度為1.6X 10_4M，而加入配體 為等份試樣的DMSO儲(chǔ)備溶液(室長(zhǎng)度1cm，t = 37°C )。顯示了在不同L/P值下測(cè)定的曲 線。插圖在溶液中總內(nèi)消旋類胡蘿卜素濃度的基礎(chǔ)上計(jì)算的誘導(dǎo)的CD和吸收譜帶的摩爾 圓二色性吸收系數(shù)(Δ ε，以M-1CnT1為單位)和摩爾吸收系數(shù)(ε，以M—knT1為單位)；圖9描述通過用以上L/P比率為1的在Ringer緩沖液(pH 7. 4)中的dAST滴定 HSA而獲得的誘導(dǎo)的⑶和UV/Vis光譜。HSA的濃度為2. 3X 10_4M，而加入的配體為等份試 樣的DMSO儲(chǔ)備溶液(室長(zhǎng)度lcm, t = 370C )。顯示了 L/P值為1. 2,2. 0,2. 9,4. 1,5. 7和 7. 4時(shí)測(cè)定的曲線。CD強(qiáng)度隨配體濃度平行地增加；
圖10描述通過用以上L/P比率為1的在0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中的dAST滴 定HSA而獲得的誘導(dǎo)的⑶和UV/Vis光譜。HSA的濃度為2. 2X 10_4M，而加入的配體為等份 試樣的DMSO儲(chǔ)備溶液(室長(zhǎng)度lcm, t = 370C )。顯示了 L/P值為1.2,2.0,2.9,4. 1、5· 7、 9. 0,10. 6和13. 1時(shí)測(cè)定的曲線。⑶強(qiáng)度隨配體濃度平行地增加； 圖11描述關(guān)于兩種內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子的右手性排列的例示，對(duì)于它們激子 相互作用在CD光譜中產(chǎn)生長(zhǎng)波正和短波負(fù)卡滕效應(yīng)?；疑肿游挥诩埰矫娴暮竺?；圖12描述(上圖)在37°C下在0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中測(cè)定的dAST導(dǎo) 致的HAS的熒光猝滅。HSA和配體的最初和最終濃度分別在4. 2X10_6M-4.0X10_6M和 1.3X IO-6M-L 4X ICT5M之間變化。在曲線上標(biāo)注L/P比率。(下圖)單獨(dú)的DMSO對(duì)HSA 固有熒光的影響。實(shí)驗(yàn)條件如正文；圖13描述脂肪酸-游離HSA的X-射線晶體結(jié)構(gòu)。顯示了 HSA的亞結(jié)構(gòu)域和兩個(gè) 主要藥物結(jié)合位點(diǎn)。虛線表示域間裂隙的空間尺寸，而星號(hào)表示Trp214的位置。dAST分子 的3和3'手性碳原子之間的原子間距離為28 A；圖14描述二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物(圖注中 的"rac")誘導(dǎo)鼠胚胎成纖維細(xì)胞(10T1/2)中的功能性間隙連接通訊。如正文所述將融 合培養(yǎng)物處理4天，然后測(cè)定轉(zhuǎn)移熒光染料熒光黃的能力。箭頭表示注射熒光黃的細(xì)胞；圖15A描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的混合物處理的細(xì) 胞中的連接蛋白43蛋白表達(dá)，通過定量Western印跡分析來評(píng)價(jià)。認(rèn)為上面的條帶代表 裝配為間隙連接的磷酸化形式的蛋白；下面的條帶代表未裝配的蛋白(Saez，1998)。泳 道1 1 2乙醇(Et0H)/H20(僅僅溶劑的陰性對(duì)照)；泳道2 :TTNPB，一種合成的類維生 素A，在丙酮中，濃度10_8M(陽性對(duì)照)；泳道3 乙酸視黃酯，在丙酮中，濃度10_5M(陽性對(duì) 照)；泳道4:二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物(“rac")，濃 度10_5M，在1 2Et0H/H20配方中遞送；泳道5 :3R，3' R 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物， 濃度10_5M，在1 2Et0H/H20配方中遞送；泳道6 :3S，3' S 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生 物，濃度10_5M，在1 2Et0H/H20配方中遞送；和泳道7:內(nèi)消旋二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍 生物，濃度IO-5M,在1 2Et0H/H20配方中遞送；圖15B描述用考馬斯藍(lán)染色的免疫印跡，表明所有條帶的相同蛋白載量。這證明 免疫標(biāo)記的差別不是人為地由裝載和/或轉(zhuǎn)移至膜上的總蛋白的變異性導(dǎo)致的；圖15C描述與陽性對(duì)照和僅用溶劑處理的對(duì)照相比二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍 生物對(duì)連接蛋白43蛋白表達(dá)的相對(duì)誘導(dǎo)水平的數(shù)字分析。泳道如圖15A。將折疊誘導(dǎo)相對(duì) 于1 2Et0H/H20處理的陰性對(duì)照中對(duì)照水平的Cx43表達(dá)進(jìn)行歸一化，將其設(shè)定為任意單 位=1.0 ；圖15D描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物處理 的鼠胚胎成纖維細(xì)胞(10T1/2)中Cx43蛋白表達(dá)的劑量_反應(yīng)曲線，它由定量Western印跡 分析法來評(píng)價(jià)。上面的條帶認(rèn)為代表裝配為間隙連接的磷酸化形式的蛋白；下面的條帶代 表未裝配的蛋白。泳道1 1 2Et0H/H20(僅溶劑的陰性對(duì)照)。泳道2:TTNPB，在丙酮中， 濃度IO-8M(陽性對(duì)照)。泳道3 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(“rac")，濃度10_5M， 在1 2的Et0H/H20配方中遞送。泳道4:二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(“rac")， 濃度5X 10_6M，在1 2的Et0H/H20配方中遞送。泳道5 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物("rac")，濃度 10_6M，在 1 2Et0H/H20 配方中遞送; 圖15E描述與陽性對(duì)照和僅用溶劑處理的對(duì)照相比二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍 生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物對(duì)連接蛋白43蛋白表達(dá)的相對(duì)誘導(dǎo)水平的數(shù)字分析。泳 道如圖15D。將折疊誘導(dǎo)相對(duì)于1 2Et0H/H20處理的對(duì)照中對(duì)照水平的Cx43表達(dá)進(jìn)行歸 一化，將其設(shè)定為任意單位=1. 0 ；圖16描述二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物增加Cx43 免疫反應(yīng)性連接斑塊的裝配。如上述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng) 計(jì)混合物將10T1/2細(xì)胞融合培養(yǎng)物處理4天(1)濃度10_5M，在1 2Et0H/H20中；(2)用 1 2Et0H/H20作為僅溶劑的陰性對(duì)照；或(3)11^^，濃度10_%，在四氫呋喃(THF)溶劑中， 作為陽性對(duì)照。如正文所述用Cx43抗體將細(xì)胞免疫染色。A組二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素 衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物，濃度10_5M，在1 2Et0H/H20中；C組1 2Et0H/H20, 作為溶劑對(duì)照；E組TTNPB，濃度為10、，在四氫呋喃(THF)溶劑中，作為陽性對(duì)照。B、D和 F組分別對(duì)A、C和E組進(jìn)行數(shù)字分析，表明固定設(shè)置的閾值以上的像素是熒光強(qiáng)度陽性。 黃色箭頭免疫反應(yīng)性連接斑塊；紅色箭頭細(xì)胞核位置。注意到用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青 素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物處理的培養(yǎng)物中連接免疫反應(yīng)性斑塊的數(shù)量和強(qiáng)度 比僅用溶劑處理的對(duì)照組大。C和D組所示的連接斑塊代表對(duì)照組中罕見的斑塊；這些培 養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞為Cx43染色陰性；圖17描述為目前研究合成的蝦青素的二鈉二琥珀酸二酯的4種立體異構(gòu)體(顯 示為全-E幾何異構(gòu)體)；將立體異構(gòu)體的混合物或單獨(dú)的立體異構(gòu)體用于分別的應(yīng)用(見 圖注)；圖18描述由DEPMPO自旋阱檢測(cè)的在純水性配方中的蝦青素的二鈉二琥珀酸酯 衍生物對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)的平均抑制百分率?；旌衔?立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物 [1:2: 1比率的3S，3' S，內(nèi)消旋(3R，3' S和3' R，3S)，3R，3' R]。將水性配方中的 各衍生物相對(duì)于不加入化合物時(shí)檢測(cè)的對(duì)照Era信號(hào)(根據(jù)慣例設(shè)為0%抑制)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) 化。注意到水中3S，3' S制劑缺乏對(duì)超氧化物的抑制作用。在每種情況下，水性配方的效 力小于在EtOH中的相應(yīng)配方(圖19)；圖19描述由DEPMPO自旋阱檢測(cè)的在乙醇配方中的蝦青素的二鈉二琥珀酸酯 衍生物對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)的平均抑制百分率。混合物=立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物 [1:2: 1比率的3S，3' S，內(nèi)消旋(3R，3' S和3' R，3S)，3R，3' R]?；旌衔?、內(nèi)消旋和 3R,3' R儲(chǔ)備溶液為1 2乙醇/水(3373%EtOH) ;3S，3' S儲(chǔ)備溶液為1 1乙醇/水 (50%Et0H)。在分離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn)中最終的EtOH濃度分別為0.3%和0.5%。將在 乙醇配方中的各衍生物相對(duì)于不加入化合物時(shí)檢測(cè)的對(duì)照Era信號(hào)(根據(jù)慣例設(shè)為0%抑 制)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；圖20描述由DEPMPO自旋阱檢測(cè)的蝦青素的二鈉二琥珀酸酯衍生物的立體異構(gòu)體 的混合物對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)的平均抑制百分率(在1 2Et0H/水配方中測(cè)試；在分 離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn)中最終EtOH濃度0.3%)。隨著衍生物的濃度增加，抑制作用以非 線性、依賴于劑量的方式增加。在3mM下，觀察到對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)接近完全的抑制 (95.0% 抑制)；圖21描述由DEPMPO自旋阱檢測(cè)的鹽酸鹽二賴氨酸蝦青素衍生物對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)的平均抑制百分率。此衍生物高度水溶(> 50mg/ml)，且在此測(cè)定中優(yōu)異的自由基 猝滅能力不需要助溶劑。將此衍生物的超氧化物陰離子抑制作用與圖20關(guān)于在純水性配 方中形成超分子裝配體的衍生物所示的抑制作用進(jìn)行比較； 圖22描述黑小鼠單劑經(jīng)口管飼之后非酯化的游離蝦青素的血漿濃度對(duì)時(shí)間的標(biāo) 準(zhǔn)圖。在血漿中僅檢測(cè)到非酯化的游離蝦青素，證明類胡蘿卜素類似物在哺乳動(dòng)物腸中完 全脫酯化，如先前所述；圖23描述黑小鼠單劑經(jīng)口管飼之后非酯化的游離蝦青素的肝濃度對(duì)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn) 圖。在肝中僅檢測(cè)到非酯化的游離蝦青素，也證明(參見關(guān)于血漿的圖22)類胡蘿卜素類 似物在哺乳動(dòng)物腸中完全脫酯化，如先前所述。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，非酯化的游離蝦青素的肝水 平大于血漿中觀察到的水平，這是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，表明游離類胡蘿卜素在此研究所用的新 乳劑載體中的實(shí)體器官遞送得到大大改善；圖24描述通過經(jīng)口管飼500mg/kg的二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物對(duì)脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響(通過血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或ALT升高來測(cè)定)。各組測(cè) 試3只動(dòng)物。對(duì)照動(dòng)物接受單獨(dú)的鹽水(假處理的對(duì)照；圖的左側(cè)部分)或不含二鈉二琥 珀酸酯蝦青素衍生物的乳劑(載體對(duì)照)。假處理的動(dòng)物接受新衍生物表現(xiàn)出對(duì)ALT的背 景水平無影響；接受含500mg/kg的新衍生物的口服乳劑的小鼠表現(xiàn)出ALT誘導(dǎo)水平降低， 表明在LPS損害之后抗肝壞死的保護(hù)作用；圖25描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物靜脈內(nèi)配方(Cardax )預(yù)處理的雄 性Sprague-Dawley大鼠中梗塞大小相對(duì)減小的圖示?？煽吹絼┝亢凸Ｈ笮p小之間的 線性關(guān)系。梗塞大小減小水平接近對(duì)局部缺血預(yù)處理觀察到的結(jié)果；圖26描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物靜脈內(nèi)配方(Cardax )預(yù)處理的雄 性Sprague-Dawley大鼠中梗塞大小的相對(duì)減小的圖示；圖27描述使用閃光光解得到的二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生物(astaCOOH)的瞬間 吸收vs.延遲。實(shí)驗(yàn)在乙腈(MeCN)中使用Iiitronaftalin(NN)作為光敏劑來進(jìn)行。所得 的光譜證明二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生物表現(xiàn)與作為自由基猝滅劑的非酯化的游離外消 旋蝦青素相同(形成類胡蘿卜素自由基陽離子)，鑒定該衍生物為在口服和靜脈遞送之后 在體內(nèi)產(chǎn)生非酯化的游離蝦青素的活性“軟藥物”；圖28描述使用閃光光解得到的參照化合物非酯化的游離外消旋蝦青素(asta)] 的瞬間吸收vs.延遲。實(shí)驗(yàn)在乙腈(MeCN)中使用Iiitronaftalin(NN)作為光敏劑來進(jìn)行。 所得的光譜幾乎可疊加在二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生物(astaCOOH)所得的光譜上，表明 兩種化合物具有相同的自由基_陽離子形成性能；圖29描述用抗連接蛋白43抗體進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠Western印跡的圖示；圖30描述用抗連接蛋白43抗體，然后在Biorad成像儀上進(jìn)行HRP化學(xué)發(fā)光而得 到的Western印跡定量光密度圖像的圖示；圖31描述在服藥后96小時(shí)由陽性對(duì)照(TTNPB，有效的合成類維生素A)和受試化 合物(二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物，在四種水和/或乙醇(EtOH)/水配方中H20-10-5、 H2O-10-6、H2O-10-7和Et0H/H20-10-5)相對(duì)于無菌水對(duì)照(H2O)對(duì)連接蛋白43表達(dá)的相對(duì) 折疊誘導(dǎo)的圖；圖32描述在給黑小鼠經(jīng)口管飼在乳劑載體中的500mg/kg 二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(ADD) 11天之后血漿和肝中非酯化的游離蝦青素的平均水平圖。所達(dá)到的血漿和肝 中的峰值和谷值水平都> 200nM，其被認(rèn)為在體內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激和肝損傷有保護(hù)作用。在第 11次服藥后6小時(shí)肝中所得的峰值水平為必需的保護(hù)水平的近9倍(1760nM)； 圖33描述由DEPMPO自旋阱檢測(cè)的二鈉鹽二琥珀酸酯二維生素C衍生物[衍生物 (XXIII)]對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)的平均抑制百分率。當(dāng)衍生物的濃度增加時(shí)，抑制作用以 依賴于劑量的方式增加。在60 μ M下，觀察到對(duì)超氧化物陰離子信號(hào)接近完全的抑制作用。 此衍生物水溶性也十分高，并無需助溶劑將其引入試驗(yàn)中(見圖21)。該新衍生物在自由 基猝滅效率方面與以12與維生素C配制的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的配方相當(dāng) (見圖3)，表明這種衍生物的活性、“軟藥物”性能。這種共同抗氧化劑(co-antioxidant) 衍生物策略將相對(duì)自由基清除效力(如果與二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物相比)增加50 倍；圖34描述非酯化的游離蝦青素(作為立體異構(gòu)體的全反式混合物)對(duì)MCA誘導(dǎo)的 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(10T1/2)的腫瘤轉(zhuǎn)化的影響。非酯化的游離蝦青素在口服和靜脈內(nèi) 施用新類胡蘿卜素衍生物之后在體內(nèi)快速產(chǎn)生，并在血液和實(shí)體器官中檢測(cè)到高濃度(見 圖22和23)。非酯化的游離青蝦素表現(xiàn)出腫瘤轉(zhuǎn)化降低水平(100% )超過類似濃度的在 本測(cè)定中測(cè)試的任何其它類胡蘿卜素，證明此化合物對(duì)癌癥化學(xué)預(yù)防應(yīng)用的效用增加；圖35描述蝦青素處理的平皿與對(duì)照平皿的比較(見關(guān)于圖34的描述)；圖36描述蝦青素(作為立體異構(gòu)體混合物)與前面測(cè)試的類胡蘿卜素在此實(shí)驗(yàn) 室用此試驗(yàn)所進(jìn)行的比較(見關(guān)于圖34的描述)；圖37描述用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物靜脈內(nèi)配方(Cardax )預(yù)處理的雄 性新西蘭兔中梗塞大小的相對(duì)減小的圖示。當(dāng)與在嚙齒動(dòng)物中以相同劑量和相同預(yù)處理方 案觀察到的梗塞大小減小進(jìn)行比較時(shí)，在兔模型中觀察到梗塞大小的減小增加38% ；和圖38描述用二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物靜脈內(nèi)配方(Cardax )預(yù)處理的雄性 新西蘭兔中血漿C-反應(yīng)蛋白(CRP)的循環(huán)水平的相對(duì)減小的圖示。通過皮下注射巴豆 油來刺激發(fā)生急性期反應(yīng)的對(duì)照兔(單獨(dú)鹽水注射)表現(xiàn)出相對(duì)于基線(在再灌注時(shí)所取 的靜脈樣品)循環(huán)CRP水平平均增加23.5%。相比之下，Cardax 處理的動(dòng)物(50mg/kg) 表現(xiàn)出相對(duì)于基線循環(huán)CRP水平平均降低(-15. 7% )，表明Cardax 的有效抗炎作用。詳述“母體”類胡蘿卜素可以總體上指用作類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物合成的起始骨架的 天然化合物。類胡蘿卜素衍生物可以衍生自天然存在的類胡蘿卜素。例如，天然存在的類 胡蘿卜素可以包括番茄紅素、番茄紫素、番茄黃素、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì) 和/或角黃素。類胡蘿卜素是一組主要由植物、酵母和微藻類產(chǎn)生的天然色素。目前相關(guān)化合物 家族的數(shù)量超過600種已有描述的成員，不包括Z和E異構(gòu)體。在人血清或組織中已發(fā)現(xiàn)50 種。人和其它動(dòng)物不能從頭合成類胡蘿卜素，必須從其飲食中獲得它們。所有的類胡蘿卜 素具有共同的化學(xué)特征，例如聚類異戊二烯結(jié)構(gòu)、形成發(fā)色團(tuán)的長(zhǎng)多烯鏈和中央雙鍵周圍 接近對(duì)稱。兩個(gè)C2tl香葉草基香葉草基二磷酸酯分子的尾至尾連接產(chǎn)生母體C4tl碳骨架。不 含氧化官能團(tuán)的類胡蘿卜素稱為“胡蘿卜素”，反映它們的烴屬性；氧化胡蘿卜素已知為“葉 黃素”。在分子的一端或兩端的環(huán)化產(chǎn)生7個(gè)確定的末端基團(tuán)(代表性結(jié)構(gòu)如圖1所示)。
證實(shí)的自然界中類胡蘿卜素的功能包括集光、光保護(hù)以及分別在顯微生物、哺乳 動(dòng)物和鳥類中的保護(hù)性和與性有關(guān)的著色。較近的觀察是類胡蘿卜素抗人與年齡有關(guān)的疾 病的保護(hù)作用，作為細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)的一部分。這種作用由各類胡蘿卜素的生理 化學(xué)性能和它們?cè)谏矬w內(nèi)的功能之間的緊密關(guān)系所賦予。分子中心部分的交替雙鍵和單 鍵的長(zhǎng)系統(tǒng)(在多烯鏈全長(zhǎng)上使H-軌道電子離域)賦予類胡蘿卜素獨(dú)特的分子形狀、化 學(xué)反應(yīng)性和光吸收性能。此外，環(huán)繞C = C雙鍵的異構(gòu)產(chǎn)生可以分離為單獨(dú)化合物(已知 為z("順式")和E("反式")或幾何異構(gòu)體)的明顯不同的分子結(jié)構(gòu)。在大于600種 所述的類胡蘿卜素中，在自然界中有時(shí)見到甚至更多數(shù)目的理論上可能的單Z和多Z異構(gòu) 體。Z雙鍵的存在在鄰近的氫原子和/或甲基之間制造更大的空間位阻，因此Z異構(gòu)體與對(duì) 應(yīng)的全-E形式相比通常熱力學(xué)穩(wěn)定性較小，而化學(xué)反應(yīng)性更大。全-E構(gòu)型是延伸的、線性 和剛性分子。相比之下，Z異構(gòu)體不是簡(jiǎn)單的線性分子(所謂的“彎曲鏈”異構(gòu)體)。多烯 鏈中任何Z的存在產(chǎn)生彎曲鏈分子。Z-異構(gòu)體結(jié)晶或聚集的趨勢(shì)比全-E小得多，而Z異構(gòu) 體比其全-E對(duì)應(yīng)物更容易在體內(nèi)溶解、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。這對(duì)于哺乳動(dòng)物的腸內(nèi)(例如口服) 和腸胃外(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下)服藥而言具有重要意義。 具有手性中心的類胡蘿卜素可以作為R(rectus)或S(sinister)構(gòu)型存在。例 如，蝦青素(在3和3'碳具有2個(gè)手性中心)可以作為4種可能的立體異構(gòu)體存在3S， 3' S ；3R,3' S和3S，3' R(內(nèi)消旋形式)；或3R，3' R。各個(gè)立體異構(gòu)體的相對(duì)比例可能 隨天然來源而變。例如，雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)微藻粉為99% 3S，3' S 蝦青素，并且可能是占優(yōu)勢(shì)的人進(jìn)化蝦青素來源。磷蝦(3R，3' R)和酵母來源與微藻來源 相比產(chǎn)生不同的立體異構(gòu)體組合物。合成蝦青素，由大制造商如Hoffmarm-LaRoche AG、 Buckton Scott(USA)或BASF AG生產(chǎn)，以非酯化的游離蝦青素的1 2 1立體異構(gòu)體混 合物[3S，3' S;3R,3' S，3' R，3S (內(nèi)消旋)；3R，3‘ R]的確定的幾何異構(gòu)體混合物提供。 來自鮭科魚的天然來源蝦青素主要是單一立體異構(gòu)體(3S，3' S)，但包含幾何異構(gòu)體的混 合物。來自天然來源雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的蝦青素可以包含近50% Z 異構(gòu)體。如上述，Z構(gòu)象改變可能在類胡蘿卜素分子的兩部分之間產(chǎn)生更高的位阻，使它穩(wěn) 定性降低，反應(yīng)性增大，并在低氧張力下對(duì)反應(yīng)性更敏感。在這種情況下，相對(duì)于全-E形 式，Z形式⑴可能首先降解；(2)可能更好地抑制活性氧種類如超氧化物陰離子攻擊細(xì) 胞；和(3)可能優(yōu)先減緩自由基形成?？傊琙形式可能最初在熱力學(xué)上有利以保護(hù)細(xì)胞和 細(xì)胞膜的親脂部分免受破壞。但是，重要的是注意到全-E形式的蝦青素，與胡蘿卜素 不同的是，以其在β-紫羅酮環(huán)上二羥基-和二酮取代的形式，保持顯著的口服生物利用度 和抗氧化能力，并已證明其在大部分研究中具有超過胡蘿卜素的增大的效力。還推斷 全-E形式的蝦青素在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞具有最大的膜穩(wěn)定作用。因此，可能在天然和合成的立體 異構(gòu)體的混合物中全-E形式的蝦青素在抗氧化機(jī)理中也非常重要，并可能是最適于特定 藥物制劑的形式。類胡蘿卜素，特別是蝦青素的抗氧化機(jī)理，包括單線態(tài)氧猝滅、直接自由基清除和 脂質(zhì)過氧化鏈斷裂。類胡蘿卜素的多烯鏈吸收單線態(tài)氧的激發(fā)能，通過沿鏈發(fā)生離域而有 效地穩(wěn)定能量轉(zhuǎn)移，并將能量作為熱消散至局部環(huán)境。從三重線態(tài)葉綠素(在植物中)或 其它卟啉和原卟啉(在哺乳動(dòng)物中)至類胡蘿卜素的能量轉(zhuǎn)移比到氧以形成高度反應(yīng)性和 破壞性單線態(tài)氧(1O2)的可供選擇的能量轉(zhuǎn)移更容易發(fā)生。類胡蘿卜素還可以接受來自單線態(tài)氧的可能在原位形成的激發(fā)能，并再次將能量作為熱消散至局部環(huán)境。這種單線態(tài)氧 猝滅能力在心臟局部缺血、黃斑變性、P卜啉癥和單線態(tài)氧的產(chǎn)生具有破壞作用的其它病癥 中具有重要的意義。在物理猝滅機(jī)理中，類胡蘿卜素分子可以再生(最常見)或喪失。類 胡蘿卜素還是優(yōu)異的鏈斷裂抗氧化劑，這是一種在抑制脂質(zhì)過氧化中重要的機(jī)理。蝦青素 可以給不穩(wěn)定的多不飽和脂肪酸(PUFA)自由基貢獻(xiàn)氫(H)，阻止鏈反應(yīng)。過氧自由基還可 以通過加到類胡蘿卜素的多烯鏈而成為脂質(zhì)過氧化物鏈終止的直接原因。適宜劑量的蝦青 素已顯示出可完全抑制脂質(zhì)體系統(tǒng)中的過氧自由基鏈反應(yīng)。蝦青素與維生素E共享這種單 線態(tài)氧猝滅和直接自由基清除的雙重抗氧化防御系統(tǒng)，并在大部分情況(特別在體內(nèi)低氧 張力下)下優(yōu)于維生素E作為自由基清除劑和單線態(tài)氧物理猝滅劑。類胡蘿卜素，特別是蝦青素，是有效的直接自由基清除劑和單線態(tài)氧猝滅劑，具有 用于抑制或改善再灌注損傷的治療劑的所有期望的性質(zhì)。合成具有“軟藥物”性能(即衍生 形式的活性)，具有與前體部分連接的生理學(xué)相關(guān)的可裂解鍵的新類胡蘿卜素衍生物可以 在血漿和實(shí)體器官中產(chǎn)生顯著水平的游離類胡蘿卜素。在非酯化的游離蝦青素的情況下， 這是一個(gè)特別有用的實(shí)施方案(以下非酯化的游離蝦青素特有的特征) 天然形式脂溶；可以改造以變得更具水溶性 分子量為597道爾頓[大小< 60道爾頓(Da)，容易穿過血腦屏障或BBB] 類胡蘿卜素特征性的長(zhǎng)多烯鏈，在單線態(tài)氧猝滅和脂質(zhì)過氧化鏈斷裂中有效 對(duì)哺乳動(dòng)物無維生素A原活性(消除人維生素A過多和類維生素A毒性的顧
慮)ο作為有效的單線態(tài)氧猝滅劑和直接自由基清除劑(特別是超氧化物陰離子)的抗 氧化劑的給藥應(yīng)該通過影響纖維發(fā)生途徑早期肝星形細(xì)胞的活化來限制肝纖維化和進(jìn)展 成肝硬化。因此，通過施用有效的抗氧化劑來降低ROS水平可能在防止HSC和枯否細(xì)胞活 化方面是關(guān)鍵。這種保護(hù)性抗氧化作用似乎擴(kuò)展至潛在治療性抗氧化劑的范圍，包括水溶 性(例如維生素C、谷胱甘肽、白藜蘆醇)和親脂性(例如維生素Ε、β -胡蘿卜素、蝦青素) 活性劑。因此，水溶性和親脂性活性劑合成組合的共同抗氧化劑衍生物策略是特別有用的 實(shí)施方案。一般將維生素E看作參照抗氧化劑。與維生素E相比，類胡蘿卜素更有效地猝滅 在均勻的有機(jī)溶劑和脂質(zhì)體系統(tǒng)中的單線態(tài)氧。它們?cè)谥|(zhì)體系統(tǒng)中也是更好的鏈斷裂抗 氧化劑。已證實(shí)它們?cè)隗w內(nèi)的功效和效力增加。它們?cè)诘脱鯊埩偷蜐舛认绿貏e有效，這 使它們成為局部缺血是組織損傷和病理的重要部分的疾病狀況中特別有效的藥劑。這些類 胡蘿卜素在口服之后還具有對(duì)肝的天然向性。因此，類胡蘿卜素的治療給藥應(yīng)該在限制纖 維變性方面提供比維生素E更大的益處。與使用某些類胡蘿卜素和類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物有關(guān)的問題包括(1)在天然和 合成來源中提供的復(fù)雜的異構(gòu)體混合物，包括非類胡蘿卜素污染物，導(dǎo)致諸如FDA的機(jī)構(gòu) 所要求的安全性和效力試驗(yàn)高代價(jià)的增加；(2)對(duì)治療對(duì)象給藥后生物利用度有限；和(3) 區(qū)別誘導(dǎo)細(xì)胞色素Ρ450酶(這種酶家族表現(xiàn)出種特異性差別，在將動(dòng)物研究外推到人研究 時(shí)必須要考慮)。在一個(gè)實(shí)施方案中，母體類胡蘿卜素可以具有任何天然存在的類胡蘿卜素的結(jié) 構(gòu)?？梢杂米髂阁w化合物的天然存在的類胡蘿卜素的某些實(shí)例如圖1所示。
在某些實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素衍生物可以包括具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物 各個(gè)R3可以獨(dú)立地為氫、甲基、烷基、鏈烯基或芳族取代基。R1和R2可以獨(dú)立地為 H、具有至少一個(gè)取代基的無環(huán)烯烴或者具有通式結(jié)構(gòu)(II)的具有至少一個(gè)取代基的環(huán) 其中n可以介于4-10個(gè)碳原子之間。W為所述取代基。取代基可以至少部分親 水。親水取代基可以有助于增加類胡蘿卜素衍生物的水溶性。在某些實(shí)施方案中，類胡蘿
卜素衍生物可以至少部分水溶。所述環(huán)可以包括至少一個(gè)手性中心。所述無環(huán)烯烴可以包 括至少一個(gè)手性中心。所述環(huán)可以包括至少一個(gè)不飽和度。在某些環(huán)實(shí)施方案中，所述的 環(huán)可以是芳族的。所述環(huán)可以包括取代基。取代基可以是親水性的。在某些實(shí)施方案中， 所述環(huán)可以包括，例如(a)、(b)或(c) 在某些實(shí)施方案中，取代基可以包括，例如羧酸、氨基酸、酯、鏈烷醇、胺、磷酸酯、 琥珀酸酯、氨基乙酸酯、醚、葡糖苷、糖或羧酸鹽。在某些實(shí)施方案中，各個(gè)取代基-W可以獨(dú)立地包括-XR。各個(gè)X可以獨(dú)立地包括 0、N或S。在某些實(shí)施方案中，各個(gè)取代基-W可以獨(dú)立地包含氨基酸、酯、氨基甲酸酯、酰胺、 碳酸酯、醇、磷酸酯或磺酸酯。在某些取代基實(shí)施方案中，取代基可以包括，例如(d)-(pp)
,或其中各個(gè)R例如獨(dú)立地為-烷基-NR1/、-芳族-NR1/、-烷基_C02_、-芳族_C02_、-氨 基酸-NH3+、-磷酸化氨基酸-NH3+、聚乙二醇、右旋糖酐、H、烷基或芳基。在某些實(shí)施方案中， 取代基可以包括(d)-(pp)的任何組合。在某些實(shí)施方案中，帶負(fù)電的取代基可以包括堿金 屬，一種金屬或不同堿金屬的組合(在有超過一個(gè)帶負(fù)電的取代基的實(shí)施方案中)，作為抗 衡離子。堿金屬可以包括但不限于鈉、鉀和/或鋰。雖然以上的結(jié)構(gòu)和隨后的結(jié)構(gòu)描述E構(gòu)型的烯烴，但這不應(yīng)被看作是限定。本文 所討論的化合物可以包括烯烴為z構(gòu)型的實(shí)施方案或者包括在相同的分子內(nèi)Z和E構(gòu)型組 合的烯烴。本文所述的化合物可以在Z和E構(gòu)型之間天然轉(zhuǎn)化，和/或在兩種構(gòu)型之間平
衡存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(III)的類胡蘿卜素衍生物 各個(gè)Y可以獨(dú)立地為0或H2。各個(gè)R可以獨(dú)立地為OR1或R1。各個(gè)R1可以獨(dú)立地為-烷基-NR23+、-芳族-NR23+、-烷基_C02_、-芳族_C02_、-氨 基酸-NH3+、-磷酸化氨基酸-NH3+、聚乙二醇、右旋糖酐、H、烷基、肽、聚賴氨酸或芳基。此外， 各個(gè)R2可以獨(dú)立地為H、烷基或芳基。所述類胡蘿卜素衍生物可以包括至少一個(gè)手性中心。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，其中Y為H2，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(IV) 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，其中Y為0，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(V) 在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(VI)的類胡蘿卜素衍生物 各個(gè)Y可以獨(dú)立地為0或H2。各個(gè)R可以獨(dú)立地為H、烷基或芳基。所述類胡蘿 卜素衍生物可以包括至少一個(gè)手性中心。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，Y可以為H2，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(VII) 在Y為0的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(VIII) 在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(IX)的類胡蘿卜素衍生物
立地為
各個(gè)Y可以獨(dú)立地為0或H2。各個(gè)R’可以為CH2。n可以為1-9。各個(gè)X可以獨(dú)各個(gè)R可以獨(dú)立地為-烷基-NRY、-芳族-NRY、-烷基_C02_、-芳族_C02_、-氨 基酸-NH3+、-磷酸化氨基酸-NH3+、聚乙二醇、右旋糖酐、H、烷基或芳基。各個(gè)R1可以獨(dú)立地 為H、烷基或芳基。所述類胡蘿卜素衍生物可以包括至少一個(gè)手性中心。在Y為H2的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(X) 在Y為0的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(XI) 在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(XII)的類胡蘿卜素衍生物， 各個(gè)Y可以獨(dú)立地為0或吐。所述類胡蘿卜素衍生物可以包括至少一個(gè)手性中心。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，Y可以為H2，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(XIII) 在Y為0的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素衍生物具有結(jié)構(gòu)(XIV) 在某些實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(XV)的二琥珀酸酯類胡蘿卜素衍 生物 在某些實(shí)施方案中，化合物可以包括具有結(jié)構(gòu)(XVI)的二鈉鹽二琥珀酸酯類胡蘿 卜素衍生物 在某些實(shí)施方案中，化合物可以包括具有與類胡蘿卜素偶聯(lián)的共同抗氧化劑 (co-antioxidant)，特別是一個(gè)或多個(gè)維生素C類似物(即L抗壞血酸)的類胡蘿卜素衍生 物。某些實(shí)施方案可以包括與類胡蘿卜素偶聯(lián)的維生素C的羧酸和/或羧酸酯衍生物(例如結(jié)構(gòu)(XVII))。
(XVII).Carbohydr. Res. 1978，60，251-258 公開如 EQN. 5 所述抗壞血酸 C-6 位的氧化 某些實(shí)施方案可以包括與類胡蘿卜素偶聯(lián)的維生素C和/或維生素C類似物。維 生素C可以通過醚鍵與類胡蘿卜素偶聯(lián)(例如結(jié)構(gòu) 某些實(shí)施方案可以包括與類胡蘿卜素偶聯(lián)的維生素C 二琥珀酸酯類似物(例如結(jié) 構(gòu)(XIX)。 某些實(shí)施方案可以包括類胡蘿卜素和/或類胡蘿卜素衍生物與共同抗氧化劑，特 別是維生素C和/或維生素C類似物組合的溶液或藥物制劑。藥物制劑可以包括大約2 1 比率的維生素C和類胡蘿卜素。在某些實(shí)施方案中，可以將類胡蘿卜素(例如蝦青素)與維生素C偶聯(lián)形成醚鍵。 醚鍵可以用如EQN. 1所述的Mitsunobu反應(yīng)來形成。 在某些實(shí)施方案中，維生素C可以被選擇性酯化。維生素C可以在C-3位被選擇 性酯化(例如EQN. 2)。J. Org. Chem. 2000，65，911-913公開用伯醇在未受保護(hù)的抗壞血酸 的C-3位進(jìn)行選擇性酯化。 在某些實(shí)施方案中，可以將類胡蘿卜素與維生素C偶聯(lián)?？梢栽贑-6，C-5 二醇位 置將維生素C偶聯(lián)到類胡蘿卜素，如EQNS. 3和4所述，形成縮醛。 在某些實(shí)施方案中，可以用二羥乙酸接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如 維生素C)，如EQN. 6所述。Tetrahedron 1989，22，6987-6998公開類似的縮醛形成 在某些實(shí)施方案中，可以用二羥乙酸接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如 維生素C)，如EQN. 7所述。J. Med. Chem. 1988，31，1363-1368公開二羥乙酸氯化物。 在某些實(shí)施方案中，可以用磷酸酯接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如維 生素C)，如EQN. 8所述。Carbohydr. Res. 1988，176，73-78公開L-抗壞血酸6-磷酸酯。 在某些實(shí)施方案中，可以用磷酸酯接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如維 生素C)，如EQN. 9所述。Carbohydr. Res. 1979，68，313-319公開維生素C的6-溴代衍生物。 Carbohydr. Res. 1988，176,73-78公開維生素C的6-溴代衍生物與磷酸酯的反應(yīng)。 在某些實(shí)施方案中，可以用磷酸酯接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如 維生素 C)，如 EQN. 10 所述。J.Med Chem. 2001，44，1749-1757 和 J. Med Chem. 2001，44，
3710-3720公開烯丙基氯衍生物和它與親核試劑，包括磷酸酯在弱堿性條件下的反應(yīng)。 在某些實(shí)施方案中，可以用磷酸酯接頭將類胡蘿卜素偶聯(lián)到水溶性部分(例如維 生素C)，如EQN. 11所述?？梢杂貌荚谖词鼙Ｗo(hù)的抗壞血酸的C-3位進(jìn)行選擇性酯化而將 維生素C偶聯(lián)到類胡蘿卜素。 在某些實(shí)施方案中，化合物可以包括含有偶聯(lián)到類胡蘿卜素上的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸(例如賴氨酸)和/或氨基酸類似物(例如賴氨酸鹽酸鹽)的類胡蘿卜素衍生物[例如結(jié)構(gòu)(XX)]。
(XX).在某些實(shí)施方案中，類胡蘿卜素衍生物可以包括
W201] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素衍生物可以由天然存在的類胡蘿卜素合成。 所述類胡蘿卜素可以包括圖1中所述的結(jié)構(gòu)2A-2E。在某些實(shí)施方案中，類胡蘿卜素衍生物可以由包含一個(gè)或多個(gè)醇取代基的天然存在的類胡蘿卜素合成。在其它實(shí)施方案中，所述 類胡蘿卜素衍生物可以由包含一個(gè)或多個(gè)醇取代基的天然存在的類胡蘿卜素的衍生物合 成。所述合成可以產(chǎn)生單一立體異構(gòu)體。所述合成可以產(chǎn)生類胡蘿卜素衍生物的單一幾何 異構(gòu)體。所述合成/合成流程可以包括在母體類胡蘿卜素上進(jìn)行的任何在先純化或分離步 驟。實(shí)例可以包括但不限于3S，3' S全-E類胡蘿卜素衍生物，其中母體類胡蘿卜素為蝦青 素。合成流程可以包括對(duì)類胡蘿卜素和/或取代基前體的不同官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，然后脫保 護(hù)?？梢杂脡A將醇脫質(zhì)子?？梢允姑撡|(zhì)子的醇與具有好的離去基團(tuán)的取代基前體反應(yīng)。所 述的堿可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何非親核堿，例如二甲基氨基吡啶。脫質(zhì)子的醇 可以用作親核試劑與取代基前體反應(yīng)置換離去基團(tuán)。離去基團(tuán)可以包括但不限于Cl、Br、 甲苯磺?；?、對(duì)溴苯磺酰基、甲磺?；蛉谆酋；?。這些僅是可以使用的離去基團(tuán)的幾 個(gè)實(shí)例，還有更多是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且顯而易見的。在某些實(shí)施方案中，取決于所用 的離去基團(tuán)，可能甚至不必將醇脫質(zhì)子。在其它實(shí)例中，離去基團(tuán)可以是內(nèi)在的，并可以隨 后包括在類胡蘿卜素衍生物最終的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)非限制性的實(shí)例可以包括酐或應(yīng)變環(huán)醚。 例如，可以使脫質(zhì)子的醇與琥珀酸酐反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步將蝦青素的二琥 珀酸酯轉(zhuǎn)化成二鈉鹽。制備所述的某些特定實(shí)施方案的合成流程的實(shí)例在實(shí)施例部分作了 描述。以下所述的實(shí)例是關(guān)于制備類胡蘿卜素衍生物的合成流程的一個(gè)一般性非限制性實(shí) 例。
局部缺血-再灌注(I/R)損傷病理生理特征再灌注局部缺血心肌導(dǎo)致處于危險(xiǎn)的組織發(fā)生明顯的細(xì)胞和局部改變，從而使由局部缺血侵害產(chǎn)生的損傷惡化。具體而言，再灌注后發(fā)生血管和微血管損傷、內(nèi)皮機(jī)能障礙、細(xì)胞壞死加速和粒細(xì)胞活化。血管和微血管損傷由補(bǔ)體活化，循環(huán)和局部C-反應(yīng)蛋白與暴露的細(xì)胞上的Clq和 磷酸膽堿相互作用形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)，然后發(fā)生細(xì)胞死亡和內(nèi)皮通透性增加，受影響 的內(nèi)皮和活化的白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物陰離子(02_)，微栓子、細(xì)胞因子釋放(特別是IL-6)， 血小板活化伴隨IIbIIIa受體活化，然后釋放ADP和5-羥色胺而導(dǎo)致。然后發(fā)生內(nèi)皮機(jī)能 障礙，隨后由機(jī)能障礙的內(nèi)皮產(chǎn)生超氧化物陰離子，進(jìn)一步破壞受影響的內(nèi)皮，形成正反饋 循環(huán)。已表明局部缺血_再灌注導(dǎo)致脈管系統(tǒng)的早期和嚴(yán)重?fù)p傷，從而進(jìn)一步危害肌細(xì)胞 存活。粒細(xì)胞活化也在再灌注期間發(fā)生。這種細(xì)胞系的活化和脫粒導(dǎo)致釋放髓過氧化物 酶(MPO)、彈性蛋白酶、蛋白酶和氧衍生的自由基和非自由基種類(最重要的是在“呼吸爆 發(fā)”之后的超氧化物陰離子、次氯酸鹽、單線態(tài)氧和過氧化氫)。氧衍生的自由基和非自由 基(例如單線態(tài)氧)種類涉及許多與局部缺血和再灌注有關(guān)的損害，且已清楚地表明脂質(zhì) 過氧化是再灌注的后果，如由硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARS)、丙二醛(MDA)或共軛二烯形 成來測(cè)定。冠狀血管內(nèi)皮和心肌本身局部缺血損傷創(chuàng)建有利于產(chǎn)生能夠損害組織的自由基 和其它非自由基氧衍生種類的條件，其在此總稱為活性氧種類("R0S")。人的基于內(nèi)皮 的黃嘌呤脫氫酶-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)是超氧化物陰離子((V)的一個(gè)來源。人心肌缺乏這 種酶系統(tǒng)。在健康組織中，90%的酶作為脫氫酶(D)形式存在；它在局部缺血組織中轉(zhuǎn)化成 氧化酶(0)形式。(0)-形式，使用分子氧為電子受體，在冠脈內(nèi)皮中產(chǎn)生超氧化物陰離子 02_。從而可獲得超氧化物陰離子以在局部環(huán)境中制造其它組織損害。超氧化物陰離子本 身不是生物系統(tǒng)中最具反應(yīng)性或破壞性的自由基種類。但是，它是某些壽命較短和較長(zhǎng)的、 更具破壞性的自由基和/或ROS如羥基基團(tuán)、過氧化氫、單線態(tài)氧和過氧自由基的來源。因 此，可以認(rèn)為它是I/R損傷中的“關(guān)鍵”基團(tuán)。以下顯示了形成這些重要氧化劑的超氧化物 自由基的生物反應(yīng)(1)超氧化物陰離子可以接受單一電子(“一價(jià)還原”)，產(chǎn)生過氧化物(02_2)。 然后過氧化物偶聯(lián)2個(gè)質(zhì)子形成過氧化氫(H2O2)。H2O2容易通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，且不能 容易地從細(xì)胞質(zhì)中排除，其中它可以與細(xì)胞組分反應(yīng)或活化中心炎性級(jí)聯(lián)如核因子 kappa-B (NF-kappa-B)，所述級(jí)聯(lián)也涉及I/R損傷中的其它炎性損害。(2)超氧化物陰離子一般自身發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫和氧(“歧化”)。超氧化物歧 化可以是自發(fā)的或由酶超氧化物歧化酶(SOD)催化，它是一種導(dǎo)致形成氧化SOD的反應(yīng)2CV+2H+ — H202+302(3)超氧化物陰離子可以用作還原劑，并給金屬陽離子提供單一電子(“一價(jià)還 原”)。例如，在以下的兩步法中，高鐵(Fe3+)被還原，然后用作催化劑以將過氧化氫(H2O2) 轉(zhuǎn)化成羥基自由基(H0 )。 O2^Fe3+ — 302+Fe2+ (步驟 1)然后，還原的金屬陽離子亞鐵(Fe2+)催化斷裂過氧化氫的氧-氧鍵。這產(chǎn)生一個(gè) 羥基自由基(HO )和一個(gè)氫氧化物離子(H0_)。所述反應(yīng)已知為Fenton反應(yīng)，其在再灌注 損傷中特別重要，其中鐵和/或銅區(qū)室化喪失(一般通過紅細(xì)胞RBC溶血)Fe2++H202 — Fe3++H0· +HCT (步驟 2)
羥基自由基容易穿過細(xì)胞膜。羥基自由基損害是“擴(kuò)散速率限制的”，也就是說，損 害可能施加的3維距離與基團(tuán)的擴(kuò)散速率有關(guān)。羥基自由基是一種特別具有毒性的R0S。 羥基自由基可以加到有機(jī)底物(由以下反應(yīng)中的R表示)，并形成本身為自由基的羥基化加 合物。在局部缺血-再灌注損傷的情況下，內(nèi)皮和肌細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸(PUFAs) 對(duì)羥基自由基損害特別敏感HO' +R — HOR-(羥基化加合物) 以上形成的加合物還可以在金屬陽離子或分子氧存在下氧化。這形成氧化的穩(wěn)定 產(chǎn)物。在第一種情況下，額外的電子轉(zhuǎn)移至金屬離子，而在第二種情況下轉(zhuǎn)移至氧(形成超 氧化物)。兩種加合物自由基還可以彼此反應(yīng)形成氧化的、穩(wěn)定的和交聯(lián)的產(chǎn)物和水。這是 膜蛋白氧化中的一個(gè)重要過程H0R.+H0R. — R_R+2H20此外，羥基自由基可以通過從這些分子中抽取電子而氧化有機(jī)底物HO'+R ^ R-+OF氧化底物(R )為自由基。這些自由基可以在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中與其它分子反應(yīng)。類胡蘿卜素是特別有效的脂質(zhì)-過氧化鏈斷裂劑。在一種情況下，與基態(tài)氧的反 應(yīng)產(chǎn)生過氧化自由基(ROO )R-+3O2 ^ ROO-過氧化自由基非常具有活性。它們可與其它有機(jī)底物在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中反應(yīng)R00.+RH — R00H+R.鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在PUFAs和其它敏感性膜脂質(zhì)的氧化損害中是常見的。氧消耗率的測(cè)定是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的開始和進(jìn)行的一個(gè)指示。重要的是注意到在脂質(zhì)體 模型系統(tǒng)中，適宜劑量的非酯化的游離蝦青素能夠完全抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和伴隨的氧消耗。(4)超氧化物陰離子可以與羥基自由基(HO )反應(yīng)形成單線態(tài)氧(1O2*)。單線態(tài) 氧不是一種自由基，但在心臟生物系統(tǒng)中具有高度活性和破壞性。單線態(tài)氧涉及膜結(jié)合蛋 白如5'-核苷酸酶的破壞，所述酶在維持和恢復(fù)血管擴(kuò)張化合物如腺苷的局部濃度中具 有重要性(表現(xiàn)對(duì)人梗塞大小的減小有效)(V+H0. — 1O2*+!^(5)超氧化物陰離子還可以與自由基氧化氮(NO )反應(yīng)，產(chǎn)生過氧亞硝酸(00N0_)。 過氧亞硝酸是生物系統(tǒng)中具有高度活性和破壞性的分子。(V+N0. — OONCT 多形核白細(xì)胞(PMNS)，特別是嗜中性白細(xì)胞，和活化的巨噬細(xì)胞是氧衍生的自由 基和非自由基種類的豐富來源。位于吞噬細(xì)胞細(xì)胞膜中的NADPH氧化酶系統(tǒng)是刺激后自由 基的重要來源。PMNs和活化的巨噬細(xì)胞快速地消耗“呼吸爆發(fā)”中的氧，并將其轉(zhuǎn)化成超氧 化物陰離子，然后轉(zhuǎn)化成過氧化氫(H2O2),以及大量的單線態(tài)氧。PMNs還是次氯酸鹽-另一 種破壞性活性氧種類的來源。雖然在感染中在吞噬細(xì)胞活性中重要，但在局部缺血和再灌 注期間的局部環(huán)境中，這些ROS攻擊局部區(qū)域中的正常和受損的宿主細(xì)胞而發(fā)生進(jìn)一步的 細(xì)胞損傷。嗜中性白細(xì)胞是延長(zhǎng)心肌局部缺血之后再灌注期間的氧自由基的一個(gè)主要來源， 特別是在實(shí)驗(yàn)性梗塞的動(dòng)物模型中。許多先前的研究已證實(shí)在局部缺血-再灌注期間形成氧自由基，但很少指出這種自由基在體內(nèi)的來源或已檢查了延長(zhǎng)的心肌局部缺血中的自由 基產(chǎn)生。嗜中性白細(xì)胞在先前局部缺血的組織中大量募集，并被認(rèn)為通過局部釋放多種介 質(zhì)，主要是氧自由基來誘導(dǎo)損傷。先前，活化的嗜中性白細(xì)胞對(duì)再灌注損傷和潛在心肌搶救 的貢獻(xiàn)仍不清楚。已提出一種方法用于檢測(cè)自由基，特別是超氧化物陰離子，這種方法不干 擾自由基產(chǎn)生的血源機(jī)理。
開胸和閉胸的狗經(jīng)歷主動(dòng)脈和冠脈竇導(dǎo)管插入(Duilio等人，2001)。不注入化學(xué) 物質(zhì)。取而代之，將血液抽至預(yù)填充自旋阱的注射器，并用電子順磁共振(EPR)光譜法分 析。在冠脈閉塞90分鐘后，氧自由基的經(jīng)心濃度在再流動(dòng)后10分鐘升高數(shù)倍，并保持至 少1小時(shí)明顯升高。自由基大部分來源于嗜中性白細(xì)胞，特別是超氧化物陰離子。這些自 由基在施用以下物質(zhì)后表現(xiàn)出明顯降低(1)嗜中性白細(xì)胞NADPH-氧化酶抑制劑和(2)抗 嗜中性白細(xì)胞CD18-粘附分子的單克隆抗體(R15.7)。設(shè)計(jì)第一種干預(yù)用于減少嗜中性白 細(xì)胞呼吸爆發(fā)，而第二種用于減少嗜中性白細(xì)胞募集至再灌注損傷部位。通過單克隆抗體 R15. 7導(dǎo)致的自由基產(chǎn)生減少還與明顯較小的梗塞大小有關(guān)，并與伴隨的無再流動(dòng)區(qū)域減 少有關(guān)。第一次證明，活化的嗜中性白細(xì)胞是延時(shí)局部缺血后體內(nèi)再灌注心臟中氧化劑的 主要來源，這種現(xiàn)象是長(zhǎng)久存在的，且抗嗜中性白細(xì)胞干預(yù)可以有效地防止再灌注期間氧 自由基經(jīng)心濃度的增加。在這些實(shí)驗(yàn)性梗塞的動(dòng)物模型中，在冠脈閉塞之前預(yù)先存在的病 理的缺乏可能過分強(qiáng)調(diào)嗜中性白細(xì)胞募集和活化對(duì)I/R損傷的促進(jìn)作用；但實(shí)際上在人動(dòng) 脈粥樣硬化的情況下，已駐留在“危險(xiǎn)區(qū)域”的活化的巨噬細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞也可大 大促進(jìn)I/R損傷。局部缺血導(dǎo)致受影響區(qū)域細(xì)胞中ATP耗盡。在通常“泄漏”大約5%健康組織中加 工的電子的線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈水平下，當(dāng)呼吸鏈大量減少時(shí)有利于進(jìn)一步泄漏部分還原的 氧種類(特別是O2-)。這主要在局部缺血期間發(fā)生。局部細(xì)胞環(huán)境中的凈效應(yīng)是從抗氧化 至促氧化的氧化還原狀態(tài)平衡的傾斜，同時(shí)其吸收附加的自由基危害而不造成進(jìn)一步細(xì)胞 損害的能力減小。預(yù)防局部缺血_再灌注損傷用于先前動(dòng)物和/或人試驗(yàn)的藥理學(xué)活性劑在動(dòng)物模型或有限的人試驗(yàn)中評(píng)價(jià)了以下化合物作為急性心肌梗塞(AMI)期間 減少局部缺血_再灌注損傷和/或心肌搶救的治療劑。大部分是生物抗氧化劑。 超氧化物歧化酶(和衍生物或模擬物) 過氧化氫酶 谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶 黃嘌呤氧化酶抑制劑 維生素B、C、E (和衍生物) 鈣拮抗劑· ACE 抑制劑 巰基硫醇化合物(特別是N-乙酰半胱氨酸) 鐵螯合劑(甲磺酸去鐵胺) 抗炎劑(例如布洛芬) 磷酸肌酸· N-2-巰基丙酰甘氨酸(MPG)
普羅布考(和衍生物) 褪黑激素 輔酶 Q-IOSingh和印度合作者的開創(chuàng)性研究之前證明急性心肌梗塞人患者的內(nèi)源性抗氧化劑耗盡，而補(bǔ)充抗氧化劑混合物和/或輔酶QlO ( 一種有效的親脂性抗氧化劑)單一療法 在AMI后30天有效實(shí)現(xiàn)心肌搶救和改善傳統(tǒng)上硬的臨床終點(diǎn)(例如總心源性死亡和非致 命再梗塞)。AMISTAD試驗(yàn)證明腺苷在三個(gè)分別的患者組中作為心肌搶救試劑的有用性。 RheothRx (—種流變?cè)噭?也有效地作為人試驗(yàn)中的搶救劑，但腎毒性繼發(fā)后被棄用。最 近，Medicure，Inc.在與 Duke ClinicalResearch Institute 合作的小型 II 期初步研究中 證明維生素B衍生物可用于心肌搶救。因此，現(xiàn)在更好地理解在先前對(duì)I/R損傷的回顧中 認(rèn)識(shí)到的“翻譯”問題(從實(shí)驗(yàn)性梗塞的動(dòng)物模型中的效力至人臨床效力)。但是，商業(yè)上 的機(jī)會(huì)窗口仍然存在，因?yàn)樯形从兴巹┍惶貏e批準(zhǔn)用作人用搶救試劑。心肌局部缺血_再灌注損傷治療的時(shí)間選擇如以上討論，早期再灌注急性心肌梗塞(主要采用藥理學(xué)或手術(shù)再灌注)終止由 于局部缺血導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，但矛盾地導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷-最可能通過氧化機(jī)理。Horwitz 等人(1999)在57只狗中確定了機(jī)會(huì)窗口，在此期間抗氧化劑必須以治療濃度存在以防止 在局部缺血90分鐘和隨后再灌注48小時(shí)期間發(fā)生再灌注損傷。在該試驗(yàn)中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì) 分析關(guān)注鑒定引起梗塞大小差別的組成員成分，并揭示治療持續(xù)時(shí)間是主要的決定因素。 如果在再灌注第1個(gè)小時(shí)內(nèi)的任何時(shí)間開始，則大于或等于3小時(shí)的輸注明顯減小梗塞大 小。Duilio等人(2001)在犬模型中通過證明反映過氧化自由基鏈反應(yīng)的氧消耗在再灌注 后10分鐘開始以及自由基活性在再灌注的至少第1小時(shí)保持升高來進(jìn)一步澄清這個(gè)問題。 Singh等人(1996)先前在人患者中證明，在MI后平均13小時(shí)起始抗氧化劑治療，并持續(xù) 28天，則心肌搶救以及改善硬的臨床終點(diǎn)(非致命再梗塞，死亡)是可能的。因此，具有長(zhǎng) 半衰期的血漿抗氧化劑可能特別適于這種情況，因?yàn)樗鼈兛梢砸载?fù)荷劑量給藥，并在整個(gè) 關(guān)鍵的AMI后早期(0-24小時(shí))在血漿中衰變?？诜惡}卜素的血漿半衰期范圍從葉黃 素(“氧化的”類胡蘿卜素包括蝦青素、辣椒黃素、葉黃素和玉米黃質(zhì))的大約21小時(shí)至胡 蘿卜素(“烴”類胡蘿卜素如番茄紅素)的222小時(shí)。在Horwitz等人(1999)的試驗(yàn)中超 氧化物歧化酶及其模擬物在人研究中的血漿抗氧化劑半衰期(7分鐘)與關(guān)于葉黃素的近 21小時(shí)和關(guān)于胡蘿卜素的近9天的半衰期的明顯差別突出了在人AMI中類胡蘿卜素的藥代 動(dòng)力學(xué)優(yōu)點(diǎn)和對(duì)抗I/R損傷的潛在的心臟保護(hù)作用。抗氧化劑在再灌注損傷中的關(guān)鍵評(píng)價(jià)人研究在Singh等人(1994)進(jìn)行的研究中，與對(duì)照患者相比表現(xiàn)AMI的患者的維生素A、 C、E和β-胡蘿卜素平均水平明顯降低。AMI患者的脂質(zhì)過氧化物明顯升高。AMI和低維 生素血漿水平之間的負(fù)關(guān)系在調(diào)節(jié)這些患者的吸煙和糖尿病之后仍然明顯。類似地，Levy 等人(1998)研究了 38名AMI患者，他們與年齡相匹配的健康對(duì)照對(duì)象相比表現(xiàn)出維生素 A、E和胡蘿卜素水平明顯降低。在血栓溶解之后，治療患者血清中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 明顯升高。溶栓治療還導(dǎo)致血漿維生素E水平明顯降低。這些描述的研究表明在呈現(xiàn)AMI 時(shí)經(jīng)歷急性冠脈事件的患者的抗氧化劑維生素血清水平可能降低。在急性情況下用抗氧化 劑化合物進(jìn)行藥理學(xué)干預(yù)可能會(huì)糾正抗氧化劑維生素缺乏和全身抗氧化狀態(tài)。
在初級(jí)和/或二級(jí)預(yù)防CVD的情況下用抗氧化劑進(jìn)行前瞻性人干預(yù)試驗(yàn)同樣有 限，但大多數(shù)是成功的。4/5目前的人研究強(qiáng)烈支持維生素E在減少心臟病風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥率 方面的有效性。對(duì)患有明顯腎病的患者進(jìn)行的抗氧化劑對(duì)晚期腎病中的心血管疾病的二級(jí) 預(yù)防研究揭示，給予800IU/天的天然來源維生素E的患者的非致命性MI降低70%。類似 地，如本文所提到的，許多藥劑現(xiàn)已成功地用于人的心肌搶救應(yīng)用。在急性情況下靜脈內(nèi)遞送低分子量化合物以抑制或改善I/R損傷需要評(píng)價(jià)它的 免疫原性。對(duì)快速輸注化合物的輸血類型和其它不良反應(yīng)的發(fā)生率應(yīng)該最小化。分子量 < IOOODa的化合物，例如阿司匹林、孕酮和蝦青素可能不具有免疫原性，除非與載體復(fù)合。 當(dāng)分子量增加到1000-6000Da時(shí)，例如胰島素和ACTH，化合物可能是或可能不是免疫原性 的。當(dāng)分子量增加至> 6000Da時(shí)，化合物可能是免疫原性的。此外，脂質(zhì)很少具有免疫原 性，同樣除非與載體復(fù)合。蝦青素，作為一種葉黃素類胡蘿卜素，其天然形式具有高度脂溶 性。它的尺寸也小(597Da)。因此，可注射的蝦青素結(jié)構(gòu)類似物在恰當(dāng)?shù)呐浞街械拿庖咴?可能性低，是用于目前治療適應(yīng)癥的特別理想的化合物。預(yù)防心律失常用于先前的動(dòng)物試驗(yàn)的藥理學(xué)活性劑Gutstein等人(2001)進(jìn)行的研究評(píng)價(jià)基因修飾的小鼠，其不能在心肌中表達(dá)連 接蛋白43[Cx43條件敲除(CKO)小鼠]。Gutstein等人發(fā)現(xiàn)盡管Cx43 CKO小鼠具有正常 心臟結(jié)構(gòu)和收縮性能，但它們一致地發(fā)生心源性猝死，顯然是由于自發(fā)的致命性室性心動(dòng) 過速。這些數(shù)據(jù)支持間隙連接通道特別是連接蛋白43在保持心臟電穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用。 能夠由類胡蘿卜素誘導(dǎo)的連接蛋白43是在人組織中最廣泛表達(dá)的連接蛋白。因此，類胡蘿 卜素和類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物可以用于治療心律失常。預(yù)防癌癥用于先前動(dòng)物試驗(yàn)的藥理學(xué)活性劑已主要在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)類胡蘿卜素在預(yù)防和治療癌癥方面的可能治療價(jià)值。先 前，類胡蘿卜素的抗氧化性能是涉及類胡蘿卜素及其在癌癥預(yù)防中的應(yīng)用的研究的焦點(diǎn)。 Bertram等人(1991)進(jìn)行的研究指出雖然類胡蘿卜素是抗氧化劑，但這種特定的性能似乎 不是導(dǎo)致它們作為癌癥化學(xué)預(yù)防劑的活性的主要因素。而是發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的活性與它們 上調(diào)間隙連接通訊的能力十分相關(guān)。已推定間隙連接充當(dāng)由生長(zhǎng)受抑制的正常細(xì)胞產(chǎn)生的 抗增殖信號(hào)的傳送管道。能夠由類胡蘿卜素誘導(dǎo)的連接蛋白43是人組織中最廣泛表達(dá)的 連接蛋白。因此，上調(diào)連接蛋白43可能是類胡蘿卜素用于化學(xué)預(yù)防人和其它動(dòng)物的癌癥的 機(jī)理。而且最近Nishino等人(2003)進(jìn)行的人研究證明通過長(zhǎng)期口服給予的類胡蘿卜素 混合物(IOmg番茄紅素，α -和β -胡蘿卜素各5mg)有效地化學(xué)預(yù)防日本高危肝硬化患者 的肝細(xì)胞癌。因此更顯著地在肝內(nèi)蓄積的具有更大效力的化學(xué)預(yù)防癌癥的類胡蘿卜素(例 如蝦青素)可能是特別有用的實(shí)施方案。類胡蘿卜素用于治療局部缺血-再灌注損傷、肝 臟疾病、心律失常和癌癥的應(yīng)用本文所用的術(shù)語“抑制”和“改善”一般定義為防止和/或減輕疾病狀態(tài)的負(fù)面結(jié) 果。因此，本文所述的方法和組合物可能作為急性和慢性(預(yù)防性)形式均具有價(jià)值。本文所用的術(shù)語“局部缺血-再灌 注損傷”一般定義為歸因于對(duì)先前局部缺血的 組織(慢性或急性局部缺血)的再氧化的病理情況，它包括動(dòng)脈粥樣硬化和血栓栓塞性血 管疾病及其相關(guān)的疾病。具體而言，主要的疾病或過程包括心肌梗塞、中風(fēng)、外周血管疾病、靜脈或動(dòng)脈閉塞、器官移植、冠狀動(dòng)脈分流移植手術(shù)、經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和心血 管驟停和/或死亡包括在內(nèi)，但它們不被視為是對(duì)在其各自的病理學(xué)中涉及局部缺血組織 再灌注的其它病理過程的限制。本文所用的術(shù)語“心律失?！币话愣x為不同于心搏的正常節(jié)律任何變化，包括 竇性心律失常、早搏、心傳導(dǎo)阻滯、房顫、房撲、室性心動(dòng)過速、室顫、交替脈和陣發(fā)性心動(dòng)過 速。本文所用的術(shù)語“心律失?！币话愣x為心臟電活動(dòng)的紊亂，其表現(xiàn)為心率或心律的異 常。心律失常最通常與心血管疾病，特別是局部缺血性心臟病有關(guān)。
本文所用的術(shù)語“癌癥”一般認(rèn)為其特征是不受控的、異常的細(xì)胞生長(zhǎng)。具體而言， 癌可能指病態(tài)組織，包括致癌物引發(fā)的細(xì)胞和致癌物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物”可以一般定義為類胡蘿卜素及其生物 活性結(jié)構(gòu)類似物。典型的類似物包括表現(xiàn)同等或提高的生物有用和相關(guān)的功能，但在結(jié)構(gòu) 上不同于母體化合物的分子。母體類胡蘿卜素選自文獻(xiàn)中所述的多于600種天然存在的類胡蘿卜素和它們的 立體和幾何異構(gòu)體。這些類似物可以包括但不限于酯、醚、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸酯、磷酸 酯和醚、硫酸酯、糖苷醚，含或不含間隔(接頭)。本文所用的術(shù)語“多于一種類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的協(xié)同組合”可以一般定義為 包括一種類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物與一種或多種其它類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物或共同抗氧化 劑組合(作為衍生物或在溶液和/或制劑中)的任何組合物。本文所用的術(shù)語“治療對(duì)象”可以一般定義為所有哺乳動(dòng)物，特別是人。本文所用的術(shù)語“給藥”可以一般定義通過任何實(shí)現(xiàn)期望目標(biāo)的方法施用藥物或 非處方藥(OTC)或營(yíng)養(yǎng)組合物。例如，給藥可以包括腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、冠脈內(nèi)、直腸、肌 內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮或含服途徑?？蛇x擇或同時(shí)地，給藥可以通過口服途徑。給藥劑量取決于 接受者的年齡、健康、體重和疾病狀態(tài)，同時(shí)治療的類型(如果有的話)，治療頻率和目標(biāo)效 果的性質(zhì)。本文所述的旨在抑制局部缺血-再灌注損傷的任何技術(shù)也可以用于抑制或改善 肝臟疾病，非限制性實(shí)例為丙型肝炎感染。本文所述的涉及抑制和/或改善局部缺血_再 灌注損傷的技術(shù)也可以用于抑制和/或改善心律失常。本文所述的涉及抑制和/或改善局 部缺血_再灌注損傷的技術(shù)也可以用于抑制和/或改善癌癥?！獋€(gè)實(shí)施方案可以包括給治療對(duì)象單獨(dú)或聯(lián)合施用類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物，從而 抑制和/或改善局部缺血-再灌注損傷的發(fā)生。所述類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物可以是水溶性 和/或水可分散性衍生物。所述類胡蘿卜素衍生物可以包括實(shí)質(zhì)上增加天然存在的類胡蘿
卜素的水溶性的任何取代基。所述類胡蘿卜素衍生物可以保持和/或改善母體類胡蘿卜素的抗氧化性能。所述 類胡蘿卜素衍生物可以保持母體類胡蘿卜素的無毒性能。所述類胡蘿卜素衍生物相對(duì)于母 體類胡蘿卜素在對(duì)治療對(duì)象給藥時(shí)可以具有提高的生物利用度。所述母體類胡蘿卜素可以 天然存在。另一個(gè)實(shí)施方案可以包括給治療對(duì)象施用包含多于一種類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物 的協(xié)同組合的組合物，借此減少局部缺血_再灌注損傷的發(fā)生。所述組合物可以是類胡蘿 卜素衍生物的“外消旋的”(即潛在立體異構(gòu)形式的混合物)混合物。還包括含有與藥學(xué) 上可接受的載體(例如人血清白蛋白)組合的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)類似物與人血清白蛋白(即HSA)在溶劑中復(fù)合。 HSA可以用作藥學(xué)上可接受的載體。
在某些實(shí)施方案中，組合物可以包括1. 0克或更少的特定類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物 與1.0克或更少的一種或多種其它類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物和/或共同抗氧化劑組合的所有 組合物，其量有效實(shí)現(xiàn)期望的目的。雖然個(gè)體治療對(duì)象的需要有變化，但各個(gè)組分的有效 量的最佳范圍的確定在本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。典型地，類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物可以施用于哺 乳動(dòng)物，特別是人，參照被治療局部缺血-再灌注損傷的哺乳動(dòng)物或人的體重，口服劑量為 5-100mg/天。典型地，可以將類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物施用于哺乳動(dòng)物，特別是人，參考被治 療再灌注損傷的哺乳動(dòng)物或人的體重，腸胃外給藥劑量為5-500mg/天。在其它實(shí)施方案 中，口服或腸胃外施用大約IOOmg類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物以治療或預(yù)防局部缺血-再灌注 損傷。單位口服劑量可以包括大約0. 25mg至大約1. 0克或大約5_25mg的類胡蘿卜素結(jié) 構(gòu)類似物。單位腸胃外劑量可以包括大約25mg-l. 0克或25mg-500mg的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類 似物。單位冠脈內(nèi)劑量可以包括大約25mg-l. 0克或25mg-100mg的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似 物。單位劑量可以每天給藥一次或多次，隔天給藥，以負(fù)荷劑量或大丸藥形式給藥，或者在 腸胃外溶液中滴定至常規(guī)接受的或新的生物化學(xué)代用標(biāo)記或臨床終點(diǎn)，這些屬于本領(lǐng)域的 技能。除了將類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物作為原料化學(xué)物質(zhì)施用之外，可以將化合物作為包 含有利于可藥用的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物加工的合適的藥學(xué)上可接受的載體、防腐劑、賦 形劑和助劑的藥物制劑的一部分給藥。制劑，特別是可以口服并可以用于優(yōu)選類型的給藥 的制劑，例如片齊 、軟明膠、錠齊 、糖錠和膠囊，以及可以直腸給藥的制劑，例如栓劑，和用于 注射或口服給藥的適宜溶液，可以在如上述的提供類似生物利用度的劑量范圍內(nèi)與賦形劑 一起制備。藥物制劑可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式制備，例如通過常規(guī)混合、制粒、制糖 錠、軟明膠包囊、溶解、提取或凍干方法。因此，口服用藥物制劑可以通過將活性化合物與固 體和半固體賦形劑和適宜的防腐劑和/或共同抗氧化劑合并來獲得。任選地，可以將所得 的混合物研磨和加工。如果需要或必需的話，可以在加入適宜的助劑之后將所得的顆粒混 合物用于獲得片劑、軟明膠、錠劑、膠囊或糖錠核心。適宜的賦形劑可以是填充劑，例如糖類(例如乳糖、蔗糖或甘露糖)，糖醇(例如甘 露醇或山梨醇)，纖維素制劑和/或磷酸鈣(例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣)。此外，可以使用 粘合劑，例如淀粉糊(例如玉蜀黍或玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪 膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮)?？梢约尤氡?解劑(例如上述淀粉)和羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽(例如藻酸 鈉)。助劑首先是流動(dòng)調(diào)節(jié)劑和潤(rùn)滑劑(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽，例如硬脂酸鎂 或硬脂酸鈣，和/或聚乙二醇或PEG)。糖錠核心提供以適宜包衣，如果需要的話它耐受胃 液。軟明膠膠囊(“軟明膠”)提供適宜包衣，所述包衣一般包含明膠和/或適宜的可食用 染料。不含動(dòng)物組分和可食的明膠膠囊因?yàn)閺V泛地使用和消耗而可能特別適用于本文所述 的實(shí)施方案。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，它可以任選包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡 咯烷酮、聚乙二醇(PEG)和/或二氧化鈦、漆溶液和適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物，包括二甲亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)、丙酮、乙醇或其它適宜的溶劑和助溶劑。為了生產(chǎn)耐胃液的包衣，可以使用適宜的纖維素制劑例如乙酰纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基甲基纖維素鄰 苯二甲酸酯的溶液。可以將染料或色素加到片劑或糖錠包衣或軟明膠膠囊，例如用于識(shí)別 和為了表征活性化合物劑量的組合，或者掩飾膠囊內(nèi)容物用于臨床或其它研究?？梢钥谟玫钠渌幬镏苿┌ㄓ擅髂z制備的推入_配合膠囊和由明膠和增塑劑 如甘油或山梨醇制備的軟熱封膠囊。推入-配合膠囊可以包含顆粒形式的活性化合物，其 可以與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉和/或潤(rùn)滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選地穩(wěn)定劑 和/或防腐劑混合。在軟膠囊中，可以將活性化合物溶解或懸浮在適宜的液體，例如脂肪油 如米糠油或花生油或棕櫚油或液體石蠟中。在其它實(shí)施方案中，可以加入穩(wěn)定劑和防腐劑?？梢灾蹦c使用的可能的藥物制劑例如包括由活性化合物與栓劑基質(zhì)的組合組成 的栓劑。例如適宜的栓劑基質(zhì)為天然或合成甘油三酯或鏈烷烴。此外，還可以使用由活性 成分和基質(zhì)的組合組成的明膠直腸膠囊。可能的基質(zhì)材料例如包括液體甘油三酯、聚乙二 醇或鏈烷烴。用于腸胃外給藥的適宜的配方包括但不限于水溶性和/或水可分散性形式的活 性化合物的水溶液，例如水溶性鹽、酯、碳酸酯、磷酸酯或醚、硫酸酯、糖苷醚，以及間隔和/ 或接頭。此外，可以施用作為適宜的油注射懸浮液的活性化合物的懸浮液，特別適于肌內(nèi)注 射?？梢允褂眠m宜的親脂性溶劑，助溶劑(例如DMSO或乙醇)，或賦形劑，包括脂肪油如米 糠油或花生油和/或棕櫚油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮液可以 包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如包括羧甲基纖維素鈉、山梨醇、右旋糖酐和/或環(huán)糊精。 環(huán)糊精(例如(β_環(huán)糊精)可以具體用于增加用于腸胃外注射類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的 水溶性?？梢灾苽浒惡}卜素結(jié)構(gòu)類似物和例如卵黃磷脂酰膽堿(E-PC)的混合物的 脂質(zhì)體配方用于注射。任選地，所述懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑，例如抗氧化劑如BHT或防腐 劑如芐醇。
實(shí)施例現(xiàn)在已經(jīng)描述了本發(fā)明，參照以下實(shí)施例更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅以例 示的方式提供，而不意在限定本發(fā)明。關(guān)于本文所述化合物的合成和表征，試劑購(gòu)自商業(yè)來源并原樣使用，除非另外指 出。用于反應(yīng)和分離的溶劑是試劑級(jí)并不經(jīng)純化使用，除非另外指出。所有以下反應(yīng)在氮 (N2)氣氛下進(jìn)行，并避免直接光線?！巴庀奔榍嗨?為1 2 1比率的立體異構(gòu)體3S， 3' S、內(nèi)消旋和 3R，3' R 的混合物)購(gòu)自 Divi' s Laboratories，Ltd(Buckton Scott, India)?！巴庀比~黃素和玉米黃質(zhì)購(gòu)自Indofine Chemical Co.，Inc。用Uniplate硅膠GF 250 micron板進(jìn)行薄層色譜(TLC)。用于過程中控制(IPC)的HPLC分析用Varian Prostar Series 210 液相色譜儀進(jìn)行，該色譜儀具有 Alltech Rocket，Platinum_C18，lOOA'Sum, 7X53匪，PN 50523 ；溫度25°C ；流動(dòng)相(A =水；B = 10%二氯甲烷 / 甲醇)，40% A/60% B(起始)；8分鐘內(nèi)線性梯度至100% B;保持100% B 4分鐘，1分鐘內(nèi)線性梯度至40 % A/60% B ；流速2. 5mL/分；起始?jí)毫?050PSI ；PDA檢測(cè)器波長(zhǎng)474nm。用 Bruker Advance 300記錄匪R，并用ThermoFinnigan AQA光譜儀進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。用AgilentllOOLC/MSD VL ESI 系統(tǒng)記錄 LC/MS ；柱Zorbax Eclipse XDB-C 18Rapid Resolution (4. 6 X 75mm, 3. 5 μ m,USUT002736)；溫度25°C;起始?jí)毫?07 巴；流速1. Oml/分；流動(dòng)相(%A = 0. 025% TFA, 在 H2O 中，％ B = 0. 025% TFA，在乙腈中)方法 1 (化合物 8-21，23-27，30，31) 70% A/30% B (初始)，5分鐘內(nèi)分階梯度至50 % B，8. 30分鐘內(nèi)分階梯度至98 % B，在98 % B保持15. 20 分鐘，15. 40內(nèi)分階梯度至30% B ；方法2 (化合物28，29) :70% A/30% B (初始)，4分鐘內(nèi) 分階梯度至50% B, 7. 30分鐘內(nèi)分階梯度至90% B, 10. 30分鐘內(nèi)分階梯度至98% B，保持 在98% B 15. 20分鐘，15. 40分鐘內(nèi)分階梯度至30% B ；方法3 (化合物22) 70% A/30% B (初始)，5分鐘內(nèi)分階梯度至50 % B，8. 30分鐘內(nèi)分階梯度至98 % B，在98 % B保持25. 20 分鐘，在25. 40分鐘內(nèi)分階梯度至30% B ；PDA檢測(cè)器:470nm ；LRMS +模式，ESI。
蟲下青素(2E).HPLC 保留時(shí)間11. 629 分鐘，91. 02 % (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相 對(duì)強(qiáng)度):598(M++2H) (60), 597 (M++H) (100) ；HPLC 保留時(shí)間12. 601 分鐘，3. 67 % (AUC)； LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度):597 (M++H) (100) ；HPLC 保留時(shí)間12. 822 分鐘，5. 31 % (AUC)； LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度):597(M++H) (100)。 葉黃素(XXX).HPLC 保留時(shí)間12. 606 分鐘，100% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng) 度)568(M+) (100)。 玉米黃質(zhì)(XXXI).HPLC保留時(shí)間12. 741 分鐘，100% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì) 強(qiáng)度)568 (M+) (100)。實(shí)施例1 合成XV(蝦青素的二琥珀酸酯(琥珀酸一-(4-{18-[4-(3_羧基-丙酰 氧基)-2，6，6-三甲基-3-氧代-環(huán)己-1-烯基]-3，7，12，16-四甲基-十八烷-1,3, 5，7， 9，11，13，15，17-壬烯基}_3，5，5-三甲基-2-氧代-環(huán)己-3-烯基)酯)) 室溫下往在DCM(〃 二氯甲烷〃)(50mL)中的蝦青素2E(6. 0g，10. 05mmo 1)的溶液加入 DIPEA(〃 N，N-二異丙基乙基胺")(35.012mL，201mmo 1)、琥珀酸酐(10. 057g， 100. 5mmol)和DMAP (“ 4-( 二甲基氨基)吡啶〃 )(0. 6145g，5. 03mmol)。將反應(yīng)混合物在 室溫下攪拌48小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (60mL/10mL)終止反應(yīng)，然后 用DCM萃取。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，并濃縮得到蝦青素二琥珀酸酯(XV) (100%)。 HPLC 保留時(shí)間10. 031 分鐘，82. 57% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)798(M++2H) (52)， 797(M.+H) (100) ；HPLC 保留時(shí)間10. 595 分鐘，4. 14% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 797 (M++H) (40) ,697(100) ；HPLC保留時(shí)間10. 966 分鐘，5. 68 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì) 強(qiáng)度):797(M++H) (100) ,679(31) ；HPLC 保留時(shí)間11. 163 分鐘，7. 61 % (AUC) ；LRMS (ESI) M/Z (相對(duì)強(qiáng)度)797 (M++H) (38)，679 (100)，且無可檢測(cè)的蝦青素2E。
實(shí)施例2 合成XVI (蝦青素的二琥珀酸酯(琥珀酸一 -(4-{18-[4-(3-羧基-丙 酰氧基)_2，6，6-三甲基-3-氧代-環(huán)己-1-烯基]-3，7，12，16-四甲基-十八烷-1,3,5, 7，9，11，13，15，17-壬烯基}-3，5，5-三甲基-2-氧代-環(huán)己-3-烯基)酯)的二鈉鹽)
(XVI)將蝦青素的二琥珀酸酯(2g，2. 509mmol)和200mL乙醇在室溫和氮?dú)夥障掠?500mL圓底燒瓶中攪拌。一次性加入乙醇鈉(340mg,5. 019mmol, Acro s#A012556101)固 體，并將溶液攪拌過夜。第二天，濾出沉淀，用乙醇洗滌，然后用二氯甲烷洗滌得到一種紫 色固體，蝦青素的二琥珀酸酯的二鈉鹽，XVI[1.41g，67% ]，放置在高度真空管道中干燥。 1H-NMR(甲醇-d4) δ 6. 77-6. 28(14H, m)，5· 53 (2Η, dd, J = 12. 6,6. 8)，2· 68-2. 47 (8Η, m)， 2. 08-1. 88 (22H, m)，1. 37 (6H, s)，1. 24 (6H, s) ；13C 匪R (CDCl3) δ 196. 66，180. 80，175. 01， 163. 69，144. 12，141. 38，138. 27，136. 85，136. 12，135. 43，132. 35，129. 45，126. 22，124. 71， 72. 68,44. 09,38. 63,34. 02,32. 34,31. 19,26. 86，14. 06，13. 19，12. 91 ；質(zhì)譜 +ESI,819. 43 一鈉鹽，797. 62蝦青素的二琥珀酸酯；HPLC 7. 41分鐘(99. 84% )。實(shí)施例3 合成蝦青素的BocLys (Boc) OH酯(XXI). HPLC 柱Waters Symmetry C18 3. 5 微米 4. 6mmX 150mm ；溫度25°C ；流動(dòng)相(A =0. 025 % TFA,在 H2O 中；B = 0. 025 % TFA,在 MeCN 中)，95 % A/5 % B (起始)；線性梯度至 100% B經(jīng)歷12分鐘，保持4分鐘；線性梯度至95% Β/5% A經(jīng)歷2分鐘；線性梯度至95% A/5% B經(jīng)歷4分鐘；流速2. 5ml/分；檢測(cè)器波長(zhǎng):474歷。往在二氯甲烷(500mL)中的蝦青素 2E(11. 5g，19. 3mmol)和 BocLys(Boc)OH(20. Og, 57. 7mmol)的混合物加入 4-二 甲基氨基吡啶(DMAP) (10. 6g，86. 6mmol)和 1，3_ 二異丙基碳化二亞胺(〃 DIC" )(13.4g，86.7mm0l)。用鋁箔覆蓋圓底燒瓶，并將混合物 在室溫和氮?dú)夥障聰嚢柽^夜。16小時(shí)后，根據(jù)HPLC和TLC反應(yīng)不完全。將另外1.5當(dāng)量 的DMAP和DIC加到反應(yīng)物，2小時(shí)后根據(jù)HPLC反應(yīng)完全。然后將混合物濃縮至IOOmL,濾 出一種白色固體(1，3-二異丙基脲)。用硅膠(10%-50%庚烷序切4()對(duì)濾液進(jìn)行快速色 譜處理得到目標(biāo)產(chǎn)物，為一種暗紅色固體(XXI) (28. 2g，> 100%產(chǎn)率)。1H NMR(DMS0-d6) δ 7. 24 (2Η, t, J = 6. 3Hz)，6. 78 (2H, d, 5. OHz)，6. 57-6. 27 (14H, m)，5. 50-5. 41 (2H, m)，
3.99-3. 97 (2H, d, 6. OHz)，2. 90 (4H, m)，2. 03 (4H, m)，2. 00 (6H, s)，1. 97 (6H, s)，1. 82 (6H, s)，1. 70-1. 55 (4H, m)，1. 39-1. 33 (36H, m)，1. 24-1. 13 (8H, m)，1. 01-0. 99 (6H, m)，
0.86-0. 83 (6H, m) · HPL :21· 3 分鐘(24. 6 % AUC)) ；22. 0 分鐘(48. 1 % (AUC)) ；22. 8 分鐘 (20. 6% (AUC)). TLC(1 1 庚烷/EtOAc :Rf0. 41 ;Rf0. 5 ;Rf0. 56).通過正模式流動(dòng)注射在 Agilent 1100LC/MSDVL ESI系統(tǒng)上進(jìn)行LC/MS分析；流動(dòng)相4=在!120中的0. 025%TFA;B=在MeCN 中的 0.025% TFA，10% A/90% B (起始)；起始?jí)毫?0 巴；PDA 檢測(cè)器 470nm.+ESI，m/z = 1276. 1 (M+Na+)。實(shí)施例4 合成蝦青素的二賴氨酸酯的四鹽酸鹽(XX)。將蝦青素的DiBocLys(Boc)酯(XXI) (20. Og, 16. Ommol)和在 1，4_ 二噁烷中的 HCl (4. 00M,400mL, 1. 60mol, IOOeq)的混合物于室溫和氮?dú)夥障聰嚢?。用鋁箔蓋住圓底燒 瓶，并將反應(yīng)物攪拌1小時(shí)，此時(shí)根據(jù)HPLC反應(yīng)完全。沉淀標(biāo)題化合物，用過濾法收集，用 醚(3 X IOOmL)洗滌，并干燥(14. 7g，92%，根據(jù)HPLC為91. 6%純度)。將部分(13. 5g) 粗固體溶于500mL 1 2甲醇/ 二氯甲烷混合物，并在氮?dú)夥障聰嚢?。然后滴加乙?(168mL)，并用過濾法收集沉淀的固體得到目標(biāo)產(chǎn)物，為一種暗紅色固體(8. 60g，63. 7%產(chǎn) 率)。1HnMR(DMSO-CI6) δ 8. 65 (6Η, s) ,8. 02 (6H, s)，6. 78-6. 30 (14H，m)，5. 59-5. 51 (2H，m)，
4.08 (2H, m)，2. 77 (4H, m)，2. 09-2. 07 (4H, m)，2. 01 (6H, s)，1. 97 (6H, s)，1. 90-1. 86 (4H, m)，
1.84 (6H, s)，1. 61-1. 58 (8H, m)，1. 37 (6H, s)，1. 22 (6H, s) · HPLC -J. 8 分鐘(97. 0 % (AUC))。 用 Agilent 1100LC/MSD VL ESI 系統(tǒng)進(jìn)行 LC/MS 分析，所述系統(tǒng)具有 Zorbax Eclipse XDB-C18 Rapid Resolution4. 6 X 75mm，3· 5 微米，USUT002736 ；溫度25°C;流動(dòng)相:{% h = 0. 025% TFAj^H2O 中；％ B = 0.025% TFA，在 MeCN 中)，70% A/30% B (起始)；線性梯 度至50% B,經(jīng)歷5分鐘，線性梯度至100% B,經(jīng)歷7分鐘；流速1. OmL/分鐘；起始?jí)毫?108 巴；PDA 檢測(cè)器 470nm。質(zhì)譜 +ESI，m/z = 853. 9 (M+H+)，m/z = 875. 8 (M+NA+) ；LC 4. 5 分 鐘。實(shí)施例5 合成蝦青素二琥珀酸酯的雙-(2-0TBS抗壞血酸)6_酯(XXII) HPLC 柱Waters Symmetry C18 3. 5 微米 4. 6mmX 150mm ；溫度:25°C ；流動(dòng)相(A =0. 025% TFA，在水中；B = 0. 025% TFA，在乙腈中)，95 % A/5 % B (起始)；線性梯度至 100% B經(jīng)歷5分鐘，保持10分鐘；線性梯度至95% B經(jīng)歷2分鐘；線性梯度至95% A/5% B經(jīng)歷3分鐘；流速1. OmL/min ；檢測(cè)器波長(zhǎng)474nm。往在600mL 二氯甲烷中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (20. OOg, 25. Immol)的攪拌的溶 液加入4- 二甲基氨基吡啶(DMAP) (6. 13g，50. 2mmol) ,2-0-叔丁基二甲基甲硅烷基(OTBS) 抗壞血酸(XXVI) (21.86g，75. 3mmol)和1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸 鹽(EDCI-HCl) (12. 02g，62. 75mmol)。14 小時(shí)后用硅膠(1. Okg 硅膠，洗脫劑 0. 5% HOAc/5% MeOH/EtOAc)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行快速色譜處理。將餾分10濃縮得到暗紅色固體(6. 47g， 19. 2 %產(chǎn)率，根據(jù)HPLC為58 % AUC純度)。用硅膠(600g硅膠，洗脫劑0. 25 % HOAc/5 % MeOH/EtOAc)對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行快速色譜處理。將餾分6_10真空濃縮得到暗紅色固體(1. 50g， 4. 4%產(chǎn)率，根據(jù) HPLC 94. 8% AUC純度)。1H-WR(CDCl3) δ 11. 13 (2Η, s)，6. 78-6. 28 (14H, m) ,5. 43(2H，dd，J = 12. 2,7. 1Hz)，5. 34(2H，s)，4. 78(2H，d，J = 5. 4Hz)，4· 11-4. 07(6H，m)， 2. 69-2. 65 (8H, m)，2. 05-1. 97 (22H, m)，1· 81 (6H, s)，1. 33 (6H, s)，0. 92 (18H, s)，0. 15 (6H, s)，0· 14 (6H, s) ；HPLC 13. 4 分鐘[94. 8% (AUC)]；質(zhì)譜-ESI，m/z = 1340. 6 (Ml。實(shí)施例6 合成蝦青素二琥珀酸酯的雙抗壞血酸6-酯(XIX)。0°C下往在THF(5mL)中的蝦青素二琥珀酸酯的雙_ (2-0TBS抗壞血酸)6_酯 (XXII) (100mg,0. 075mmol)的攪拌溶液加入 HF · Et3N(121 μ L,0. 745mmol)。將反應(yīng)物于 0°C下攪拌1小時(shí)，然后溫至室溫。將反應(yīng)物攪拌2. 5小時(shí)，然后通過傾入包含5mL IPAC和 5mL水的分液漏斗來終止反應(yīng)。除去水層，并用水(2X5mL)洗滌有機(jī)層。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去有機(jī)溶劑，得到一種暗紅色固體，將其不經(jīng)純化而使用；1H-NMR(⑶Cl3) δ 11. 12 (2Η, s)， 8. 40 (2H, s)，6. 87-6. 28 (14H, m)，5. 43-5. 32 (4H, m)，4. 69 (s, 2H)，4. 09 (s,4H)，3. 99 (s, 2H)， 2. 68-2. 50(m，8H)，2. 00-1. 76(22H，m)，1. 36-1. 19(12H，m) ；HPLC 8. 9 分鐘[80.7% (AUC)]； 質(zhì)譜 +ESI，m/z = 1113. 2 (M+H.)。實(shí)施例7 合成蝦青素二琥珀酸酯的雙抗壞血酸6-酯的鈉鹽(XXIII)。室溫下往在丙酮(5mL)中的粗品蝦青素二琥珀酸酯的雙抗壞血酸6_酯(XIX) (0. 075mmol)的攪拌的溶液加入原甲酸三乙酯(62μ L，0. 373mmol)。將溶液攪拌15分鐘， 然后滴加在丙酮中的2-乙基己酸鈉的溶液(93μ ，0.019πιπιΟ1，0. 20M)。通過過濾除去所 得的沉淀。將濾液冷卻至0°C，并用附加的在丙酮中的2-乙基己酸鈉(373μ L，0. 075mmol, 0.20M)處理。將反應(yīng)物攪拌5分鐘，然后通過過濾收集固體物質(zhì)，用丙酮(5mL)洗滌，并 在高度真空下干燥得到一種暗紅色固體(27.8mg，32. 2%產(chǎn)率)HPLC 8. 9分鐘[88.2%(AUC)]，質(zhì)譜 +APCI，m/z = 1113. 3 (M+3H_2Na+)。實(shí)施例8 合成蝦青素二琥珀酸酯的二環(huán)己基甲酯(XXIV)。 HPLC 柱Alltech Rocket，Platinum_C18，1 OOA, 3AM，7 X 53mm ；溫度25°C;流動(dòng) 相(A = 0. 025% TFA 在水中；B = 0. 025% TFA，在乙腈中)，70% A/30% B (起始)；保持 40秒；線性梯度至50% B經(jīng)歷4分20秒；線性梯度至100% B經(jīng)歷1分30秒，保持4分40 秒；線性梯度至70% A/30% B，20秒；流速2. 5mL/分；檢測(cè)器波長(zhǎng)-AlArm0室溫和N2氮?dú)夥障峦?5mL圓底燒瓶中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (IOOmg， 0. 125mmol)和N，N- 二甲基甲酰胺(6. OmL)的攪拌的溶液加入碳酸銫(90. Omg, 0.275mmol)，并用鋁箔覆蓋。將反應(yīng)物攪拌15分鐘，然后加入溴甲基環(huán)己烷(52. 0 μ L，
0.375mmol)。2天后，通過加入4mL碳酸氫鈉飽和溶液終止反應(yīng)，并用50mL 二氯甲烷稀 釋。用25mL水將稀釋的溶液洗滌二次，然后用無水硫酸鈉干燥。將有機(jī)溶液過濾，并用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去溶劑。用快速色譜法(10-50% EtOAc/庚烷)純化粗殘余物，得到一種暗 紅色固體(40. 2mg，32. 5% 產(chǎn)率)=1H-WR(CDCl3) δ 7. 03-6. 17 (14H，m), 5. 54 (2H, dd, J = 12. 9,6. 7Hz)，3. 92 (4H, d, J = 6. 4Hz)，2. 82-2. 63 (8H, m)，2. 08-1. 92 (14H, m)，1. 90 (6H, s)，
1.75-1. 62 (14H, m), 1. 34-1. 20 (22H, m) ；HPLC 8. 9 分鐘[83. 9% (AUC) ] ；TLC(3 7Et0Ac/ 庚烷Rf0. 38)；質(zhì)譜 +ESI，m/z = 989. 6 (M+H+)。實(shí)施例9 合成 2-0TBS_5，6-isopropyledine 抗壞血酸(XXV) HPLC =Alltech Rocket, Platinum-C18,100A, 3 μ m, 7 X 53mm, PN50523 ；溫度25°C; 流動(dòng)相(A = 0. 025% TFA，在水中；B = 0. 025% TFA，在乙腈中)，90% A/10% B(起始)； 線性梯度至30% B經(jīng)歷3分鐘；線性梯度至90% B經(jīng)歷3分鐘，保持2分鐘；線性梯度至 90% A/10% B經(jīng)歷1分鐘，然后保持1分鐘；流速2. 5ml/分；檢測(cè)器波長(zhǎng)256nm。室溫下往在1.00L THF 中的 5，6-isopropyledine 抗壞血酸(100. 0g，463mmol) 的攪拌的溶液加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBSCl) (76. 7g，509mmol)，然后在30分鐘內(nèi)加入N，N- 二異丙基乙基胺(DIPEA) (161mL,925mmol)。將反應(yīng)物于室溫下攪拌14小時(shí)，然后真空濃縮。將混合物溶于甲基叔丁基醚(MTBE) (1.00L)，并用IM碳酸鉀(1.00L)在分 液漏斗中萃取。再用MTBE (1. 00L)萃取水層一次，并用2N HCl將水層的pH調(diào)節(jié)至pH 6。 用乙酸異丙酯(IPAC) (1.00L)萃取水層二次，并濃縮得到一種米色固體(150.4g，98%產(chǎn) 率)^h-NMR(DMSC) d6) δ 11. 3(1H，s)，4. 78(1H，d，J = 2. OHz)，4. 41-4. 36 (1Η，m)，4. 11 (1H, dd, J = 8. 4，7. 4Hz)，3. 92 (1H, dd, J = 8. 4，6. 0)，1. 24 (3H, s)，1. 23 (3H, s)，0. 92 (9H, s)，
0.14 (6H, s) ；HPLC 5. 9 分鐘[91. 6% (AUC)]；質(zhì)譜-ESI，m/z = 329. 2 (M-F)。實(shí)施例10 合成2-0TBS抗壞血酸(XXVI).室溫和氮?dú)夥障峦?. 50L 二氯甲烷中的2-0TBS-5，6-isopropyledine抗壞血 酸(XXV) (150. 4g，455mmol)的攪拌的溶液加入丙二硫醇(54. OmL，546mmol)。將溶液冷卻 至-45°C，然后以保持溫度低于_40°C的速率滴加BF3-OEt2 (58. 0mL,455mmol)。1小時(shí)后，根 據(jù)HPLC反應(yīng)完全。通過將冷反應(yīng)混合物傾入含有1. OOL IPAC和500mL飽和氯化銨溶液和 500ml水的分液漏斗來終止反應(yīng)。將有機(jī)層濃縮至一種白色固體。為了清除丙二硫醇，將 固體在二氯甲烷(250mL)中再漿化2小時(shí)，加入庚烷(1. 00L)，并攪拌1小時(shí)。將混合物真 空濃縮至500ml體積。將混合物過濾并真空干燥得到一種米色固體(112.0g，85%產(chǎn)率) 1H-NMR (DMSO d6) δ 11. 0(1H, s)，4. 89 (2H, s)，4. 78 (1H，d，J = 1. 2Hz)，3. 82-3. 80 (1H, m)， 3. 45-3. 42 (2H, m)，0. 923 (9H, s)，0. 14 (6H, s) ；HPLC 4. 9 分鐘[92. 0 % (AUC)]；質(zhì)譜-ESI， m/z = 289. 0(M-H)。實(shí)施例11 合成蝦青素的雙-二甲基磷酸酯(XXVII). HPLC =Waters Symmetry C18, 3 μ m, 4. 6 X 150mm, WAT200632，溫度25°C ；流動(dòng)相 (A =水；B = 10% DCM/MeOH)，10% A/90% B(起始)；線性梯度至100% B經(jīng)歷9分鐘；保 持100% B經(jīng)歷llmin，線性梯度至10% A/90% B經(jīng)歷1分鐘；流速1. Oml/分；檢測(cè)器波 長(zhǎng)474nm。37°C下往在二氯甲烷中的蝦青素2E(500mg，0. 84mmol)和甲基咪唑(0.50ml， 6. 27mmol)的混合物加入溴代磷酸二甲酯(2M，5. 04mL) (Ding, 2000) 0 24小時(shí)后，根據(jù)HPLC 反應(yīng)未完全，加入溴代磷酸二甲酯(2M，5.04mL)。48小時(shí)后，根據(jù)HPLC反應(yīng)未完全，并加 入溴代磷酸二甲酯(2M，5.04mL)。72小時(shí)后，根據(jù)HPLC反應(yīng)完全。用二氯甲烷(20mL)稀 釋反應(yīng)物，并用水(20mL)終止反應(yīng)。分離各層并再次用20mL 二氯甲烷萃取水層。合并有 機(jī)層，并在真空下濃縮得到 2. 69g( > 100%產(chǎn)率)。1H NMR(CDCl3) δ 6. 58-6. 14(14H，m)， 5. 05-4. 95(2H，m)，3· 91-3. 60(12H，m)，2· 11-2. 04(4H，m)，2· 04-1. 92(12H，m)，1. 85 (6H, s)，
1.26 (6H, s)，1. 15 (6H, s) · HPLC 4. 29 分鐘(86. 7 % AUC))。流動(dòng)相:A = 0. 025 % TFA,在 H2O 中；B = 0. 025% TFA，在乙腈中，10% A/90% B (起始)；PDA 檢測(cè)器 474nm. +ESI，m/z = 813. 62(M+1)。實(shí)施例12 合成蝦青素的BocProOH酯(XXVIII).
LC/MS分析在Agilent 1100LC/MSD VL ESI系統(tǒng)上進(jìn)行LC/MS分析，所述系統(tǒng)含 有Zorbax Eclipse XDB-C18 Rapid Resolution4. 6x75mm, 3. 5 μ Μ,USUT002736 ；溫度25°C; 流動(dòng)相(％ A = 0· 025 % TFA,在 H2O 中；％ B = 0. 025 % TFA,在 MeCN 中)，70 % Α/30 % B (起始)；線性梯度至50% B經(jīng)歷5分鐘，線性梯度至98% B經(jīng)歷3分鐘，在98% B下保 持17分鐘；流速:1.0ml/分；起始?jí)毫?08巴；PDA檢測(cè)器470nm，373nm，214nm. LRMS :+模 式，ESI。往在二氯甲烷(500mL)中的蝦青素2E(5. 00g，8. 38mmol)和 BocProOH(10. 8g， 50. 3mmol)的混合物加入4- 二甲基氨基吡啶(DMAP) (6. 14g，50. 3mmol)和1，3_ 二異丙基 碳化二亞胺(DIC) (7. 79mL, 50. 3mmol)。將混合物在室溫和氮?dú)夥障聰嚢柽^夜。16小時(shí)后， 根據(jù)TLC反應(yīng)完全。然后將混合物濃縮至干，并用IOOmL乙醚將粗殘余物漿化，通過硅藻 土濾墊過濾。用硅膠(Et2O)對(duì)濾液進(jìn)行快速色譜處理得到目標(biāo)產(chǎn)物，為一種暗紅色固體 (8. 56g, > 100% 產(chǎn)率)。LC 17. 5 分鐘[23. 1 % AUC)] ；18. 2 分鐘[45. 1 % (AUC) ] ；19. 4 分鐘[22. 0% (AUC) ]. TLC (3 2Et0Ac/ 己烷:Rf 0. 51 ;Rf 0. 55 ； Rf 0. 59).MS+ESI, m/z = 1013. 8(M+Na+)。實(shí)施例13 合成蝦青素的二脯氨酸酯的二鹽酸鹽(XXIX).在氮?dú)夥障聦⒁颐?130mL)和EtOH(48. 9mL, 838mmol)的混合物冷卻至_78°C。30 分鐘內(nèi)往冷卻的混合物滴加乙酰氯(82. OmL, 838mmol)。從冷卻浴中移出反應(yīng)物，并緩慢溫 至室溫。將燒瓶?jī)?nèi)容物傾入含有蝦青素的DiBocPro酯(XXVIII) (8. 31g，8. 38mmol)和攪 拌棒的單獨(dú)的圓底燒瓶。用鋁箔覆蓋燒瓶，并將反應(yīng)物在室溫和氮?dú)夥障聰嚢柽^夜。16小 時(shí)后，根據(jù)LC反應(yīng)完全。標(biāo)題化合物沉淀并用過濾法收集，用乙醚(3X100mL)洗并干燥 (6. 37g，88. O%粗產(chǎn)率，根據(jù) LC 為 75. 2%純度)· LC 8. 00 分鐘[75. 2% (AUC) ] · MS+ESI，m/ ζ = 791. 7_+)。實(shí)施例14 合成葉黃素二琥珀酸酯(XXXII). 室溫下往在DCM(2mL)中的葉黃素(XXX) (0. OlOg, 0. 018mmol)的溶液加入 DIPEA(0. 063mL,0. 360mmol)、琥珀酸酐(0. 036g,0. 360mmol)和 DMAP (0. 021g,0. 176mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (6mL/lmL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，并濃縮得到葉黃素 二琥珀酸酯(XXXII) (93. 09% )。HPLC 保留時(shí)間11. 765 分鐘，93. 09% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)769(M+) (24)，651 (100)，且無可檢測(cè)的葉黃素。實(shí)施例15 合成玉米黃質(zhì)的琥珀酸酯(XXXIII，XXXIV). 室溫下往在DCM(2mL)中的玉米黃質(zhì)(XXXI) (0. OlOg, 0. 018mmol)的溶液加入 DIPEA(0. 063ml,0. 360mmol)、琥珀酸酐(0. 036g,0. 360mmol)和 DMAP(0. 021g,0. 176mmol)。 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (6mL/lmL) 終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，并濃縮得到玉米黃質(zhì)一琥珀酸 酉旨(XXXIII) (2. 86% )。HPLC 保留時(shí)間12· 207 分鐘，2. 86% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì) 強(qiáng)度)669 (M++H) (53)，668 (M+) (100)，玉米黃質(zhì)二琥珀酸酯(XXXIV) (97. 14% )HPLC 保留 時(shí)間11. 788 分鐘，67. 42 % (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度):792(M++Na) (42)，769 (M+) (73), 651 (100) ；HPLC 保留時(shí)間13. 587 分鐘，11. 19% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 792 (M++Na) (36)，769 (M+) (38)，663 (100) ；HPLC 保留時(shí)間13. 894 分鐘，18. 53 % (AUC)； LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)769 (M+) (62)，663 (77)，651 (100)，且無可檢測(cè)的玉米黃質(zhì)實(shí)施例16 合成蝦青素的烏頭酸酯(XXXV，XXXVI)。 室溫下往在DCM/DMF ( 〃 N，N- 二甲基甲酰胺〃 )(4ml/2mL)中的蝦青素 2E (0. IOOg, 0. 168mmol)的溶液加入 DIPEA(0. 878mL，5. 04mmol)、順式烏頭酸酐(0. 2622g， 1. 68mmol)和DMAP (0. 4105g，3. 36mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用 DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl(20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī) 層濃縮得到烏頭酸一酯(XXXV) (13. 25 % ) HPLC保留時(shí)間10. 485分鐘，4. 95 % (AUC)； LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)777 (M++Na+2H) (57)，623 (100) ；HPLC 保留時(shí)間10· 722 分 鐘，8. 30% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)777 (M++Na+2H) (6)，709 (100)，烏頭酸二酯 (XXXVI) (27. 67%)HPLC保留時(shí)間:9. 478 分鐘，15. 44% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 933 (M++Na+2H) (10), 831 (100) ；HPLC 保留時(shí)間9· 730 分鐘，12. 23 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/ ζ (相對(duì)強(qiáng)度):913(M++4H) (4)，843 (100)，和蝦青素(44. 40% )。實(shí)施例17 合成蝦青素的檸檬酸酯(XXXVII，XXXVIII). 室溫下往在DCM (8mL)中的檸檬酸(0. 5149g，2. 86mmol)的懸浮液力口入 DIPEA (1. 167mL, 0. 6. 70mmol)、DIC (0. 525mL, 3. 35mmol)、DMAP (0. 4094g, 3. 35mmol)和蝦青 素(0. 200g，0. 335mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物， 用鹽水/IMHCI (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到檸檬酸 一酉旨(XXXVII) (26. 56 % )HPLC 保留時(shí)間9· 786 分鐘，17. 35% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相 對(duì)強(qiáng)度)773 (M++3H) (14)，771 (M++H) (100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 989 分鐘，9. 21 % (AUC)； LRMS (ESI) m/z(相對(duì)強(qiáng)度)773(M++3H) (50)，771 (M++H) (100)，檸檬酸二酯(XXXVIII) (7. 81 % )HPLC 保留時(shí)間8. 492 分鐘，3. 11 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 968 (M++Na) (75)，967 (100)，946 (M++H) (37) ；HPLC 保留時(shí)間8. 708 分鐘，2. 43 % (AUC)； LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度):968(M++Na) (95)，946 (M++H) (100) ；HPLC 保留時(shí)間8· 952 分鐘， 2. 27% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)946 (Μ"+Η) (19)，500 (100)，和蝦青素(21.26%)。實(shí)施例18 合成蝦青素的二甲基氨基丁酸一酯(XXXIX). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的4_( 二甲基氨基)_ 丁酸鹽酸鹽 (0. 2816g, 1. 68mmol)的懸浮液加入 DIPEA(0. 878mL，5. 04mmol)、HOBT( “1_ 羥基苯并三 唑” )-H2O (0. 3094g, 2. 02mmol)、DMAP (0. 4105g, 3. 36mmol)和蝦青素(0. 100g, 0. 168mmol)。 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20ml/3mL) 終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到4-( 二甲基氨基)丁酸一酯(XXXIX) (24. 50 % )HPLC 保留時(shí)間9. 476 分鐘，20. 32 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 732 (M++Na) (13)，729 (100) ；HPLC保留時(shí)間:9. 725 分鐘，4. 18% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì) 強(qiáng)度):732 (M++Na) (50)，729 (100)，和蝦青素(61.21%)。實(shí)施例19 合成蝦青素的谷胱甘肽一酯(L). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的還原谷胱甘肽(0. 5163g，1. 68mmol)的懸浮液加 Λ DIPEA (0. 878mL, 5. 04mmol)、HOBT-H2O (0. 3094g, 2. 02mmol)、DMAP (0. 4105g, 3. 36mmol), DIC (0. 316mL,2. 02mmol)和蝦青素 2E(0. 100g,0. 168mmol)。將反應(yīng)混合物在 室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IMHCI (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用 DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到谷胱甘肽一酯(L) (23.61% )HPLC保留時(shí)間9. 488 分鐘，16. 64% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度):886 (M+) (13)，810 (54)，766 (100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 740 分鐘，3. 57% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)886 (M+) (24)，590 (78)， 546(100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 997 分鐘，3. 40% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)886 (M+) (25)，869 (85)，507 (100)，和蝦青素(68. 17% ) 實(shí)施例20 合成蝦青素的酒石酸二酯(Li). 室溫下往在DCM/DMF (5mL/5mL)中的(L)-酒石酸(0. 4022g, 2. 68mmol)的懸 浮液加 Λ DIPEA (1. 167mL，0. 6. 70mmol)、HOBT-H2O (0. 5131g，3. 35mmol)、DMAP (0. 4094g, 3. 35mmol)和蝦青素2E(0. 200g，0. 335mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí) 用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl(20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的 有機(jī)層濃縮得到酒石酸二酯(Li) (18.44% )HPLC保留時(shí)間9. 484分鐘，14. 33% (AUC)； LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)884 (M++Na+H) (100)，815 (72)，614 (72) ；HPLC 保留時(shí)間9. 732 分鐘，4. 11 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)883 (M++Na) (100)，539 (72)，和蝦青素 (67. 11% )。實(shí)施例21 合成蝦青素二琥珀酸酯的山梨醇一酯(LII). 室溫下往在DMF(IOmL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. 200g,0. 251mmol)的溶液 加入 DIPEA(1. 312mL，7. 53mmol)、HOBT-H2O (0. 4610g，3. Olmmol)、DMAP (0. 6133g，5. 02mmol) 和⑶-山梨醇(0. 4572g，2. 51mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀 釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得 到山梨醇一酯(LII) (3. 52%)HPLC保留時(shí)間9. 172 分鐘，3. 52% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相 對(duì)強(qiáng)度):984(M++Na) (28)，503 (100)，和蝦青素二琥珀酸酯(91. 15% )0實(shí)施例22 合成蝦青素二琥珀酸酯的山梨醇二酯(LIII).
(LIII)室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. IOOg, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 656mL，3. 76mmol)、HOBT-H2O (0. 2313g, 1. 51mmol)、DMAP (0. 3067g, 2. 51mmol)、DIC(0. 236mL, 1. 51mmol)和(D)-山梨醇(0. 2286g, 1. 25mmol)。將反應(yīng)混合物 在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后 用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到山梨醇二酯(LIII) (44. 59% )HPLC保留時(shí)間8. 178 分鐘，11. 58% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1148 (M++Na) (40), 545 (100) ；HPLC保留時(shí) 間8. 298 分鐘，33. 01% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1148 (M++Na) (20)，545 (100)，并 無可檢測(cè)的蝦青素二琥珀酸酯。實(shí)施例23 合成蝦青素的嗎啉氨基甲酸酯(LIV，LV). 室溫下往在DCM/DMF (3mL/3mL)中的蝦青素 2E (0. IOOg, 0. 168mmol)的溶液力口 入 DIPEA (0. 878mL，5. 04mmol)、DMAP (0. 4105g，3. 36mmol)禾Π 4-嗎啉碳酰氯(0. 196mL, 1.68mm0l)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到4-嗎啉一氨基甲 酸酯(LIV) (33.17%)昍1^保留時(shí)間11.853 分鐘，29.01% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì) 強(qiáng)度):710(M+) (100) ；HPLC 保留時(shí)間13· 142 分鐘，1.37% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng) 度):710(M+) (100) ；HPLC 保留時(shí)間13. 383 分鐘，2. 79% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng) 度)710 (M+) (100)，4-嗎啉二氨基甲酸酯(LV) (33. 42% )HPLC保留時(shí)間12. 049分鐘， 29. 71% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)824(M++H) (54)，823 (M+) (100) ；HPLC 保留時(shí)間 13. 761 分鐘，1. 29% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)823 (M+) (100)，692 (75) ；HPLC 保留 時(shí)間14. 045 分鐘，2. 42% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)823 (M+) (100)，692 (8)，和蝦 青素(22. 10% ) ο實(shí)施例24 合成蝦青素的甘露醇一碳酸酯(LVII).
(LVII)
0 °C下往在DCM (4mL)中的蝦青素2E(0. 100g,0. 168mmol)的溶液加入 DIPEA (0. 585mL,3. 36mmol)和 1，2，2，2-四氯乙基氯甲酸酯(0. 103mL，0. 672mmol)。將反 應(yīng)混合物于0°C下攪拌2小時(shí)，在室溫下攪拌1.5小時(shí)，此時(shí)將(D)-甘露醇(0. 3060g, 1. 68mmol)、DMF(3mL)和DMAP(0. 2052g, 1. 68mmol)加到反應(yīng)物。將反應(yīng)混合物在室溫下 攪拌24小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水(20mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并 的有機(jī)層濃縮得到甘露醇一碳酸酯(LVII) (10. 19% )HPLC保留時(shí)間9. 474分鐘，10. 19% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)827(M++Na) (50)，804 (M+) (25)，725 (58)，613 (100)，和蝦 青素(53. 73% )。實(shí)施例25 合成蝦青素的(二甲基氨基)丁酸二酯(LVIII)。 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的4_( 二甲基氨基)丁酸鹽酸鹽(0. 2816g， 1. 68mmol)的懸浮液加入 DIPEA (0. 878ML，5. 04mmol)、DMAP (0. 4105g，3. 36mmol)、 HOBT-H2O (0. 3094g，2. 02mmol)、DIC (0. 316mL，2. 02mmol)和蝦青素 2E (0. 100g，0. 168mmol)。 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IMHCI (20mL/3mL) 終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到(二甲基氨基)丁酸二酯(LVIII) (77. 70 % )HPLC 保留時(shí)間-J. 850 分鐘，56. 86 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 824 (M++H) (64)，823 (M+) (100) ；HPLC 保留時(shí)間8. 443 分鐘，3. 87 % (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)823 (M+) (5)，641 (20)，520 (100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 021 分鐘，16. 97 % (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)824 (礦+H) (58)，823 (M+) (100)，且無可檢測(cè)的蝦青素。實(shí)施例26 合成蝦青素的芐基一醚(LIX). 0 °C 下往在 DCM/DMF (3mL/3mL)中的蝦青素 2E (0. IOOg, 0. 168mmol)和節(jié)基溴 (0. 400mL，3. 36mmol)的溶液加入KHMDS (“雙(三甲基甲硅烷基)酰胺鉀”)(6. 72mL ；0. 5M， 在甲苯中，3. 36mmol)。將反應(yīng)混合物于0°C下攪拌1小時(shí)，然后溫至室溫。將混合物于室溫 下攪拌24小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM 萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到芐基一醚(LIX) (15. 06% )HPLC保留時(shí)間12. 705分鐘， 15. 06% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)686 (M+) (93)，597 (100)，和蝦青素(67.96%)。實(shí)施例27 合成蝦青素的甘露醇一醚(LX). 室溫下往在DCM(15mL)中的蝦青素2E(0. 200g，0. 335mmol)的溶液加入48% HBr (IOmL)和H2O (30mL)。用DCM萃取水層，用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，并濃縮得到 蝦青素的溴化物衍生物，為一種暗紅色油。室溫下往在DCM/DMF(6mL/6mL)中的粗溴 化物的溶液加入 DIPEA (1. 58ML, 9. 09mmol)、DMAP (0. 3702g, 3. 03mmol)和(D)-甘露醇 (0. 5520g, 3. 03mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽 水/IM HCl(20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到甘露醇一 醚(LX) (4. 40% )HPLC 保留時(shí)間9. 479 分鐘，4. 40% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 783 (M++Na) (64)，710 (66)，653 (100)，和蝦青素(79. 80% ) 實(shí)施例28 合成蝦青素二琥珀酸酯的三(羥基甲基)氨基甲烷一酰胺(LXI). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. IOOg, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 653mL，3. 75mmol)、DMAP (0. 3054g，2. 50mmol)、HOBT-H2O (0. 2297g, 1. 50mmol)和三(羥基甲基)氨基甲烷(0. 1514g，1. 25mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪 拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃 取。將合并的有機(jī)層濃縮得到三(羥基甲基)氨基甲烷一酰胺(LXI) (4. 40%)HPLC保 留時(shí)間9. 521 分鐘，3. 50% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)923(M++Na) (36), 900 (M+) (80), 560 (100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 693 分鐘，0.90% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 923 (M++Na) (11)，813 (33)，500 (100)，和蝦青素二琥珀酸酯(84. 34% )。實(shí)施例29 合成蝦青素二琥珀酸酯的三(羥基甲基)氨基甲烷二酰胺(LXII). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. IOOg, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 653mL，3. 75mmol)、DMAP (0. 3054g，2. 50mmol)、HOBT-H2O (0. 2297g, 1. 50mmol)、DIC(0. 235ML, 1. 50mmol)和三(羥基甲基)氨基甲烷(0. 1514g, 1. 25mmol)。 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL) 終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到三(羥基甲基)氨基甲烷二酰胺(LXII) (66.51%)朋1^保留時(shí)間8.086 分鐘，19.34% (AUC) ；LRMS(ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 1026 (M++Na) (22)，1004 (M++H) (84)，1003 (M+) (100)，502 (83) ；HPLC 保留時(shí)間8· 715 分鐘， 47. 17% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1004(M++H) (71)，1003 (M+) (100)，986 (62)，和蝦 青素二琥珀酸酯(18.61% )。實(shí)施例30 合成蝦青素二琥珀酸酯的腺苷一酯(LXIII). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. IOOg, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 653mL，3. 75mmol)、DMAP (0. 3054g，2. 50mmol)、HOBT-H2O (0. 1914g, 1. 25mmol)和(-)-腺苷(0. 3341g，1. 25mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，此時(shí)用 DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃 縮得到腺苷一酯(LXIII) (21. 13% )HPLC 保留時(shí)間:9. 005 分鐘，2. 43% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z(相對(duì)強(qiáng)度):1047(M++H) (36)，1046 (M+) (57)，524 (100) ；HPLC 保留時(shí)間9. 178 分鐘， 10. 92 % (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1047(M++H) (80)，1046 (M+) (100)，829 (56)， 524 (94) ；HPLC 保留時(shí)間9. 930 分鐘，7. 78 % (AUC) ；LRMS (ESI)(相對(duì)強(qiáng)度)1046 (M+) (100)，524 (34)，和蝦青素二琥珀酸酯(58. 54% )0實(shí)施例31 合成蝦青素二琥珀酸酯的麥芽糖二酯(LXIV). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. 100g, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 653mL，3. 75mmol)、DMAP (0. 3054g，2. 50mmol)、HOBT-H2O (0. 2297g, 1. 50mmol)、DIC (0. 235mL, 1. 50mmol)和(D)-麥芽糖-H2O (0. 4504g, 1. 25mmol)。將反應(yīng)混 合物在室溫下攪拌36小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IM HCl (20mL/3mL)終止反 應(yīng)，然后用DCM萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到麥芽糖二酯(LXIV) (25. 22% )HPLC保留時(shí) 間7· 411 分鐘，12. 53% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1468 (M++Na) (18)，1067 (16)， 827(100) ；HPLC 保留時(shí)間-J. 506 分鐘，12. 69 % (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度) 1468 (M++Na) (52)，827 (76)，745 (100)，和蝦青素二琥珀酸酯(22. 58% ) 實(shí)施例32 合成蝦青素二琥珀酸酯的自藜蘆醇酯(LXV，LXVI). 室溫下往在DCM/DMF(3mL/3mL)中的蝦青素二琥珀酸酯(XV) (0. IOOg, 0. 125mmol) 的溶液加入 DIPEA (0. 653mL，3. 75mmol)、DMAP (0. 3054g，2. 50mmol)、HOBT-H2O (0. 2297g, 1. 50mmol)、DIC(0. 235mL, 1. 50mmol)和白藜蘆醇(0. 2853g, 1. 25mmol)。將反應(yīng)混合物在室 溫下攪拌24小時(shí)，此時(shí)用DCM稀釋反應(yīng)物，用鹽水/IMHCI (20mL/3mL)終止反應(yīng)，然后用DCM 萃取。將合并的有機(jī)層濃縮得到白藜蘆醇一酯(LXV)(1. 12%)HPLC保留時(shí)間10.039分 It, 1. 12% (AUC) ；LRMS (ESI)m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1009 (M++2H) (18)，1007 (M+) (21)，637 (100)， 白藜蘆醇二酯(LXVI) (60.72%)朋1^保留時(shí)間10.324 分鐘，15.68% (AUC) ；LRMS(ESI) m/z(相對(duì)強(qiáng)度)1217 (M+) (28)，1007 (100)，609 (69)，504 (85) ；HPLC 保留時(shí)間10.487 分 鐘，29. 26% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度)1218(M++H) (80)，1217 (M+) (100)，609 (60)； HPLC 保留時(shí)間10. 666 分鐘，15. 78% (AUC) ；LRMS (ESI) m/z (相對(duì)強(qiáng)度):1218(M++H) (84)， 1217 (M+) (100)，609 (71)，且無可檢測(cè)的蝦青素二琥珀酸酯。精確測(cè)定二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)的水溶性將總共30mg的樣品(二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物，為1 2 1比率的立體異 構(gòu)體3S，3' S、內(nèi)消旋和3R，3 ‘ R的全反式混合物)加到在15mL玻璃離心管中的2mL無 菌過濾的(o.2yMMillipore )去離子(Di)水。將管包在鋁箔中，并將混合物振蕩2 小時(shí)，然后在3500rpm下離心10分鐘。將水溶液通過0. 45微米PVDF可棄型過濾器過濾。 然后將Iml體積的濾液用DI水適宜地稀釋，并在480nM下測(cè)定溶液的濃度，采用由新鮮樣 品制備的四點(diǎn)校正曲線?？紤]稀釋后，二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物的飽和溶液的濃度為 8. 64mg/mL。抑制和/或改善疾病的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較自由基_陽離子形成能力非酯化的游離蝦青素和二酸二琥珀酸酯蝦青素， 使用閃光光解圖27和圖28描述在獲得關(guān)于非酯化的游離蝦青素和二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生 物的三重態(tài)和類胡蘿卜素陽離子自由基狀態(tài)形成的閃光光解之后的光譜分析結(jié)果。類胡蘿
卜素陽離子自由基的形成是作為抗氧化劑的新衍生物的潛在生物物理行為的衡量指標(biāo)。如 果衍生物保持非酯化的游離蝦青素的抗氧化行為，則所有先前證實(shí)的(即文獻(xiàn)先例)關(guān)于 蝦青素的治療應(yīng)用可以合理地設(shè)想用于新衍生物，包括至少單線態(tài)氧猝滅、脂質(zhì)過氧化鏈 斷裂和/或直接自由基清除。直接照射類胡蘿卜素(car)不導(dǎo)致形成類胡蘿卜素三重態(tài)fears)；需要一種光 敏劑。在此實(shí)驗(yàn)中，將Iiitronaftalin(NN)用作光敏劑。照射后，受激的光敏劑(NN*)形成 光敏劑三重態(tài)(3NN)。當(dāng)3NN遭遇類胡蘿卜素時(shí)，發(fā)生與3NN的能量和電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。通過 特征性吸收譜帶來檢測(cè)所得的相對(duì)穩(wěn)定的3car和類胡蘿卜素陽離子自由基(car+)。非極性溶劑(例如己燒)有利于3car的形成，而更具極性的溶劑(醇、水)有利于car+的形成。 光敏劑的陰離子自由基(NN__)由于低吸收系數(shù)而不通?？吹?。 A.蝦青素二琥珀酸(astaCOOH)的光譜在乙腈(MeCN)中的astaCOOH的瞬間吸收光譜，敏化劑NN.光譜中的負(fù)峰證明NN和astaCOOH的基態(tài)消耗。550nm處的正峰表明形成 astaCOOH三重態(tài)；850nm處的正峰表明形成astaCOOH陽離子自由基。3car衰變相當(dāng)迅速。 15 μ s后，一半的3car消失，50 μ s后，沒有3car剩余。car_ +在此時(shí)間范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。B.參照化合物[非酯化的游離蝦青素(asta)]的光譜.在乙腈(MeCN)中的asta的瞬間吸收光譜，敏化劑NN.asta的光譜與astaCOOH的光譜接近相同。50 μ s后，3car已消失。在此時(shí)間范圍 內(nèi)，car +是穩(wěn)定的。關(guān)于astaCOOH和asta的吸收光譜中的負(fù)和正峰可重疊。閃光光解結(jié)果簡(jiǎn)要討論在閃光光解實(shí)驗(yàn)期間二酸二琥珀酸酯蝦青素衍生物(astaCOOH)和非酯化的游離 蝦青素(asta)之間似乎存在的差別很小。AstaCOOH在閃光光解實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)類似asta。 因此，用琥珀酸將游離蝦青素酯化不改變光物理性能和陽離子自由基壽命。兩種化合物在 閃光光解實(shí)驗(yàn)期間都是光穩(wěn)定的。二琥珀酸酯蝦青素衍生物保持蝦青素的有效抗氧化潛 能，并在酯化狀態(tài)下具有活性。因此可以將它看作一種“軟”藥物(作為經(jīng)修飾的實(shí)體有活 性)，而不是前藥，用于治療應(yīng)用，賦予此衍生物有價(jià)值的雙相自由基清除活性的性能(即 水相和脂相自由基清除)。誘導(dǎo)連接蛋白43蛋白表達(dá)Rogers等人(1990)詳細(xì)描述了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)，Western印跡法、定量光密度分析 和總蛋白評(píng)價(jià)的方法，Bertram(1999)提出了修改。簡(jiǎn)言之，在4mL細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用以下 制劑處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞CH3/10T1/2細(xì)胞，培養(yǎng)基包含2%小牛血清1. TTNPB [ρ-(E)-2-(5，6，7，8-四氫 _5，5，8，8-四甲基-2-萘基)丙烯基苯甲 酸]10_8M，在丙酮中[關(guān)于連接蛋白43上調(diào)的陽性對(duì)照(4μ1在4mL中)]2. 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/H2O,濃度10_5M (40 μ L在4mL中)3. 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/H2O,濃度10_6Μ(4 μ L在4mL中)4. 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/H2O,濃度10_7M(1 10稀釋，4 μ L在4mL中)5. 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物H2O/乙醇[EtOH]配方，濃度ICT5M(40 μ L在 4mL 中)6. 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物H20/Et0H配方，濃度ICT6M (4 μ L在4mL中)7.無菌 H2O 對(duì)照(40 μ L 在 4mL 中)8.無菌 H20/Et0H 對(duì)照(20 μ L EtOH, 20 μ L H2O 在 4mL 中)9.培養(yǎng)基對(duì)照(4mL)在用受試化合物和對(duì)照溶液培養(yǎng)96小時(shí)之后收集細(xì)胞。所有培養(yǎng)基溶液的顏色相同，但在用10_5稀釋的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物進(jìn)行的兩種處理之后顏色主觀上變成橙紅色。用光顯微鏡發(fā)現(xiàn)TTNPB處理的細(xì)胞呈條紋狀，證明肌細(xì)胞分化，這是此細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中的預(yù)期結(jié)果。在收獲并沉淀細(xì)胞之后，包含兩種10_5 二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍 生物溶液的管為亮紅色；兩種10_6稀釋管為粉紅色。如先前關(guān)于其它有色類胡蘿卜素所證 實(shí)的，這是細(xì)胞攝入受試化合物的主觀證據(jù)。然后溶解細(xì)胞，使50 μ g的各種蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。然后將 凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾器。用考馬斯藍(lán)染色測(cè)定總蛋白(圖29;泳道6、7和9于凝膠轉(zhuǎn) 移后變模糊，不包括在定量比較中[圖31])。用抗連接蛋白43抗體進(jìn)行Western印跡法， 然后在Biorad成像儀上進(jìn)行HRP化學(xué)發(fā)光(圖30)。將原始凝膠剝離(stripped) —次，并 重復(fù)Western印跡兩次，然后觀察。將結(jié)果相對(duì)于顯示對(duì)照條件(無受試化合物)下連接 蛋白43蛋白的背景組成型表達(dá)的泳道8對(duì)照(Et0H/H20)進(jìn)行歸一化。由陽性對(duì)照和受試 化合物導(dǎo)致的相對(duì)連接蛋白43誘導(dǎo)的結(jié)果如圖31所示。Cx43結(jié)果簡(jiǎn)要討論.所有受試二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物制劑均誘導(dǎo)連接蛋白43表達(dá)超出在水 和乙醇/水對(duì)照中組成表達(dá)的水平(圖31)。在不存在真實(shí)處理效果(無效假設(shè)對(duì)照μ ！ =處理平均μ2)的情況下在5種分別單獨(dú)的試驗(yàn)條件下檢測(cè)出誘導(dǎo)連接蛋白43蛋白表達(dá) 的可能性為1/25或ρ = 0.03。在水中配制的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物在各試驗(yàn)條 件下均誘導(dǎo)連接蛋白43蛋白表達(dá)(從10_5至10_7Μ)。測(cè)試的最低二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青 素衍生物/水組合的降低表明誘導(dǎo)的反應(yīng)的劑量依賴性。在用在培養(yǎng)基中的最終乙醇濃度為0. 5%進(jìn)行評(píng)價(jià)的單一試驗(yàn)條件下相對(duì)誘導(dǎo)升 高。這種發(fā)現(xiàn)高度提示此配方的生物利用度增加，因?yàn)橐阎掖紲p少水溶液中二鈉鹽二琥 珀酸酯蝦青素衍生物的聚集。在水中濃度大于10_7和在乙醇/水組合中濃度為10_5的二鈉 鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的溶液似乎具有比陽性TTNPB對(duì)照更高的誘導(dǎo)水平。TTNPB是 一種高效力的類維生素Α，它在96小時(shí)時(shí)間點(diǎn)以10_8Μ有效地誘導(dǎo)連接蛋白43表達(dá)。二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞中細(xì)胞間間隙連接通訊(GJC) 的誘導(dǎo)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞的無 限增殖細(xì)胞系中的間隙連接通訊(GJC)的能力。進(jìn)行研究(1)在功能水平，通過單層培養(yǎng)物中融合細(xì)胞之間的染料轉(zhuǎn)移增加衡量細(xì)胞/細(xì) 胞通訊；(2)在分子水平，通過這些化合物誘導(dǎo)連接蛋白43(Cx43)蛋白表達(dá)的能力來測(cè) 定。Cx43是允許GJC的這些成纖維細(xì)胞中細(xì)胞間通道的結(jié)構(gòu)單元；(3)在細(xì)胞水平，由二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物增加與相鄰細(xì)胞直接接觸的 質(zhì)膜區(qū)域中的Cx43免疫反應(yīng)性斑塊的數(shù)量和大小的能力所示。(1)通訊分析。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物[作為全反式(全 E)立體異構(gòu)體、S，S'、內(nèi)消旋和R，R’1 2 1比率的統(tǒng)計(jì)混合物]增強(qiáng)小鼠胚胎成纖 維細(xì)胞C3H/10T72細(xì)胞之間的間隙連接細(xì)胞間通訊(GJC)的能力。這種能力先前與類胡蘿
卜素抑制致癌物誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化的能力高度相關(guān)(Zhang，1992)。而且，Cx43介導(dǎo)的心肌細(xì) 胞之間的連接通訊負(fù)責(zé)保持同步收縮和防止心律失常的信號(hào)的轉(zhuǎn)移(Peters，1995)。
基本如前述(Zhang，1994)通過將熒光染料熒光黃CH(Sigma，St. Louis, MO)顯微 注射至個(gè)體融合細(xì)胞來分析連接通透性。簡(jiǎn)言之，用以下試劑將C3H/10T1/2細(xì)胞的融合 培養(yǎng)物處理4天(1)溶于1 2乙醇/水(Et0H/H20)配方的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍 生物(IXl(T5M) ； (2)溶于四氫呋喃的一種合成類維生素A-TTNPB(1X10_8M)，作為陽性對(duì) 照；或(3)1 2Et0H/H20處理的細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。在相差鏡頭下鑒定各個(gè)培養(yǎng)皿中的 單一細(xì)胞，并使用裝載作為10%溶液的熒光染料熒光黃的微注射針(Eppendorf，Hamburg, Germany)進(jìn)行加壓注射。通過遙控顯微操作器來控制針，并將細(xì)胞和顯微鏡置于氣動(dòng)抗振 動(dòng)臺(tái)上。通過用導(dǎo)致熒光黃發(fā)黃色熒光的UV光簡(jiǎn)短照明來證明成功注射熒光黃。這種染 料足夠小，以通過間隙連接，并且?guī)щ姡瑥亩梢詢H進(jìn)入與注射細(xì)胞相鄰的細(xì)胞，如果它們 處于連接通訊的話。在允許連接轉(zhuǎn)移的2分鐘后，在UV照明下采取數(shù)字圖象。與注射細(xì) 胞相鄰的熒光細(xì)胞的數(shù)目之后通過使用無偏密度閾值方法和SigmaScan軟件程序(Jandel Scientific)進(jìn)行數(shù)字圖像分析來確定。將該通訊細(xì)胞的數(shù)目用作連接通訊的指標(biāo)，如前述 (Hossain,1993)。 此分析的結(jié)果表明，溶于1 2Et0H/H20配方的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物 (IXl(T5M)有效增加連接通訊的程度，超過在1 2Et0H/H20處理的對(duì)照組中所見的程度。 在22個(gè)顯微注射處理的細(xì)胞中，有15個(gè)(56% )通過間隙連接而功能性偶聯(lián)，相比之下對(duì) 照細(xì)胞僅有11分之3 (27% )。這些差別是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異的(ρ < 0. 04 ；配對(duì)的Student' s t檢驗(yàn))。代表性顯微照片如圖14所示A組用濃度為1X10_5M的在1 2Et0H/H20中的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素的立體 異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物處理；C組1 2Et0H/H20溶劑陰性對(duì)照;E組TTNPB，濃度為1 X 10_8M，在作為溶劑的四氫呋喃中，陽性對(duì)照；和B、D、F組分別數(shù)字分析顯微照片A、C、E，顯示在設(shè)置閾值以上的像素是熒光黃熒 光陽性的。由于細(xì)胞核具有最大體積，它們蓄積最多熒光黃，并表現(xiàn)最大熒光。(2)分子研究。二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的混合物和純 化的對(duì)映異構(gòu)體形式的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(S，S'、內(nèi)消旋和R，R'形 式，根據(jù)HPLC純度> 90 % )增加鼠成纖維細(xì)胞中的Cx43蛋白的表達(dá)，它由基本如所 述(Zhang，1992和1994)的免疫(Western)印跡法評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)言之，在補(bǔ)充5 %胎牛血清 (AtlantaBiologicals, Atlanta, GA)禾口 25 μ g/mL iit酸慶大霄素(Sigma, St. Louis, MO)的 含Earle鹽(Atlanta Biologicals, Atlanta, GA)的Eagle基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠胚胎成 纖維細(xì)胞C3H/10T1/2細(xì)胞，并在37°C下在5% CO2中培養(yǎng)。在100毫米(mm)平皿中接種 后第7天，用二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物將融合細(xì)胞處理4天，然后如所述地收獲細(xì) 胞并分析Cx43蛋白誘導(dǎo)。根據(jù)制造商的指示用蛋白分析試劑盒(Pierce Chemical Co., Rockford，IL)測(cè)定蛋白含量。通過Western印跡法，使用NuPage western印跡試劑盒和 儀器(Invitrogen，Carlsbad, CA)分析包含100 μ g蛋白的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并用針對(duì)對(duì)應(yīng)于 小鼠、人和大鼠Cx43的C末端域的合成多肽產(chǎn)生的兔多克隆抗體(Zymed，San Francisco, CA)檢測(cè) Cx43 蛋白。使用結(jié)合有 HRP 的抗兔二抗(Pierce Chemical Co.，Rockford, IL) 通過化學(xué)發(fā)光來觀察Cx43免疫反應(yīng)性條帶。用冷卻的CCD相機(jī)獲得數(shù)字圖像，然后進(jìn)行定 量光密度測(cè)定(Bio-Rad，Richmond，CA)。通過用考馬斯藍(lán)蛋白染料染色和數(shù)字圖像分析證明泳道的蛋白載量相同。在此實(shí)驗(yàn)中，將二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物以1 2乙醇/H2O配方、濃度為1 X IO-5M加到細(xì)胞培養(yǎng)物。立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物和純化的對(duì)映異構(gòu)體形式表現(xiàn)出與單 獨(dú)用1 2乙醇/H2O處理的細(xì)胞培養(yǎng)物相比Cx43的表達(dá)增加(圖15A和圖15B)。用二鈉 鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物處理在所有受試衍生物中引起最 高Cx43誘導(dǎo)水平。這些誘導(dǎo)水平比用包括在內(nèi)作為陽性對(duì)照的類維生素A四氫四甲基萘 基丙烯基苯甲酸(TTNPB) (Hoffman-LaRoche，Nut ley，NJ)和乙酸視黃酯(Sigma，St. Louis, MO)所見的誘導(dǎo)水平小數(shù)倍；這種相對(duì)效力差別與先前的研究一致。(3)細(xì)胞研究。二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物在處 理的鼠10T1/2細(xì)胞中在細(xì)胞/細(xì)胞接觸區(qū)域增加Cx43的裝配，與功能性間隙連接的形成 一致。在此實(shí)驗(yàn)中，通過免疫熒光染色法評(píng)價(jià)Cx43的表達(dá)和裝配成斑塊。操作基本上 如Zhang(1992)所述。簡(jiǎn)言之，C3H/10T1/2細(xì)胞的融合培養(yǎng)物在Permanox塑料4室玻片 (Nalge Nunc International, Naperville, IL)上生長(zhǎng)，并用以下試劑處理 4 天(1)溶于 1 2Et0H/H20配方的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物)；(2) 在四氫呋喃中的濃度為IX 10_8M的類維生素A TTNPB，作為陽性對(duì)照；或(3)1 2Et0H/H20, 作為溶劑對(duì)照。用-20°C甲醇將細(xì)胞固定過夜，用緩沖液洗滌，用在PBS中的牛血清白 蛋白(Sigma, St, Louis, M0)封閉，如在以上(2)那樣用兔多克隆抗Cx43抗體(Zymed, San Francisco, CA)培養(yǎng)，并用結(jié)合 Alexa568 的抗兔二抗(MoIecuIarProbes, Eugene, OR)檢 測(cè)。用568nm光照射玻片，并在600nm波長(zhǎng)下使用Zeiss Axioscope光學(xué)顯微鏡和Roper Scientific冷卻的CCD相機(jī)獲得圖像。用TTNPB類維生素A對(duì)照和濃度為1 X 10_5M的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的 立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物處理的玻片表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性Cx43在與相鄰細(xì)胞直接接觸的細(xì) 胞膜區(qū)域裝配成為斑塊。這種裝配與間隙連接的斑塊的位置和形成一致，已知所述斑塊是 通過連接而關(guān)連的細(xì)胞群中多個(gè)單獨(dú)間隙連接聚集形成的(Perkins，1997)。在用作為對(duì) 照的溶劑處理的培養(yǎng)物中，這種免疫反應(yīng)斑塊是不常見的，并且比在用二鈉鹽二琥珀酸酯 蝦青素衍生物的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物或作為陽性對(duì)照的TTNPB處理的細(xì)胞中檢測(cè)到 的斑塊要小。這些斑塊的頻率及其大小與在第1部分和圖14所述的熒光黃染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 所檢測(cè)到的間隙連接通透性的功能差異(TTNPB >二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素的立體異構(gòu)體 的統(tǒng)計(jì)混合物>溶劑對(duì)照)一致，并與在第2部分和圖15所述的免疫印跡實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的 Cx43誘導(dǎo)程度一致。代表性顯微照片如圖16所示。鼠成纖維細(xì)胞中非酯化的游離蝦青素對(duì)致癌物誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化的抑制在口服酯化的蝦青素之后在哺乳動(dòng)物腸中產(chǎn)生非酯化的游離蝦青素。僅游離蝦青 素在哺乳動(dòng)物血漿和實(shí)體器官中發(fā)現(xiàn)。這在單一和多劑量口服藥代動(dòng)力學(xué)研究中再次得到 證明；結(jié)果如本文所述。血清白蛋白的固有酯酶活性以及血清和實(shí)體器官中混棲酯酶的作 用在腸胃外施用二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)之后快速地產(chǎn)生非酯化的游離蝦青素。
閃光光解實(shí)驗(yàn)也證明二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物和非酯化的游離蝦青素 在類胡蘿卜素陽離子自由基形成方面具有相同的抗氧化行為。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)非酯化的游離蝦青素(二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)的體內(nèi)最終裂解產(chǎn)物，作為 1:2: 1比率的立體異構(gòu)體3S，3S'、內(nèi)消旋和3R，3' R的全反式混合物測(cè)試)在已故的 CharlesHeidelberger的實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)的C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng)模型(Reznikoff，1973)中 抑制腫瘤轉(zhuǎn)化的能力。這種細(xì)胞培養(yǎng)體系顯示出有效地模擬在全動(dòng)物腫瘤形成中的引發(fā)和 轉(zhuǎn)化事件(Bertram，1985)。在這些細(xì)胞中，致癌性多環(huán)烴3-甲基膽蒽(MCA)處理在少部 分處理的細(xì)胞中產(chǎn)生引發(fā)事件，在5周之后導(dǎo)致這些細(xì)胞發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為存在轉(zhuǎn)化 的病灶。將這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞注射至同系小鼠導(dǎo)致在注射部位形成肉瘤，表明轉(zhuǎn)化的致癌性 質(zhì)(Reznikoff，1973)。此試驗(yàn)被改造為適于檢測(cè)癌癥預(yù)防劑(Bertram，1989)，而癌癥預(yù)防 性類維生素A和類胡蘿卜素已證明可抑制此體系中的轉(zhuǎn)化(Bertram，1991 ；Pung, 1988 ；和 Merriman,1979)。此實(shí)驗(yàn)根據(jù)先前確立的方案(Bertram，1991和Pung，1988)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將源自 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的IOT 1/2細(xì)胞以IO3細(xì)胞/60mm平皿的密度接種在補(bǔ)充4%胎牛血 青(Atlanta Biologicals, Atlanta, GA)禾口 25 μ g/mL lit酸慶大霄素(Sigma, St. Louis,MO) 的 Eagle 基本培養(yǎng)基(BME) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA)中。24 小時(shí)后用在丙酮 中的5. 0 μ g/mL MCA(Sigma, St. Louis, MO)或作為對(duì)照的0. 5%丙酮(最終濃度)處理細(xì) 胞。在MCA處理后24小時(shí)更換培養(yǎng)基。7天后用在THF中的蝦青素或在丙酮中的乙酸視 黃醇酯處理細(xì)胞，并每7天進(jìn)行再處理，持續(xù)4周。用適宜的溶劑對(duì)照處理其它平皿。在實(shí) 驗(yàn)開始5周后，用甲醇固定細(xì)胞，并用10%吉姆沙染色劑(Sigma，St. Louis，M0)染色，并給 II 型和 III 型病灶評(píng)分(Reznikoff, 1973)。此分析的結(jié)果表明與用MCA和作為溶劑對(duì)照的THF處理的細(xì)胞相比用蝦青素處理 4周導(dǎo)致MCA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化病灶數(shù)量發(fā)生濃度依賴性減小(如圖34所述)。圖34描述非酯 化的、游離蝦青素(作為立體異構(gòu)體的全反式混合物)對(duì)MCA誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化的作用。圖 代表總共68份用3 X 10_6M、1 X 10_6M和3 X 10_7M的蝦青素處理的培養(yǎng)物，它們分別在0.3%、 0. 和0. 03%的THF載體中遞送。對(duì)照如下總共16平皿沒有接受致癌物，并用0. 05% 乙醇溶劑處理；對(duì)照沒有表現(xiàn)任何轉(zhuǎn)化事件。總共20個(gè)平皿用MCA和THF溶劑處理， 產(chǎn)生0. 92病灶/平皿的轉(zhuǎn)化率。與用MCA-處理的對(duì)照的各種處理的平均病灶/平皿比較 來計(jì)算蝦青素處理的平皿的轉(zhuǎn)化降低百分率(％降低)。用配對(duì)的Student’ s t檢驗(yàn)進(jìn)行 推理性統(tǒng)計(jì)，分別得到計(jì)算的P值為0. 00004,0. 00001、和0. 00006。認(rèn)為P < 0. 05是顯著 的。用3X10_6M蝦青素處理導(dǎo)致完全抑制轉(zhuǎn)化的表型(圖35)。圖35描述蝦青素處理的 平皿與對(duì)照平皿的比較。代表性平皿用以下試劑處理A，無MCA，溶劑對(duì)照；B，MCA 5. 0 μ g/ mL，1 % THF作為溶劑對(duì)照；C，MCA,在THF中的3 X 10、蝦青素(作為立體異構(gòu)體的全反式 混合物)。值得注意的是這種抑制水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過先前關(guān)于使用相同方案(Bertram，1991)測(cè) 試的所有其它類胡蘿卜素報(bào)道的水平。比較目前的數(shù)據(jù)與先前在受試濃度下腫瘤轉(zhuǎn)化降低 百分率所報(bào)道的數(shù)據(jù)表明，蝦青素是比胡蘿卜素或角黃素有效得多的轉(zhuǎn)化抑制劑(圖 36)。圖36描述蝦青素(作為立體異構(gòu)體的混合物)與先前測(cè)試的類胡蘿卜素 進(jìn)行的比 較。編輯數(shù)據(jù)，將用蝦青素處理的培養(yǎng)物中MCA-誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化病灶/平皿的降低百分率 與先前Bertram實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的在用β -胡蘿卜素和角黃素(Bertram，1991)采用相同的方 案處理之后的數(shù)據(jù)得出的病灶/平皿的降低百分率進(jìn)行比較。在此報(bào)道關(guān)于胡蘿卜素 和角黃素在先前試驗(yàn)的最高濃度(IXlO-5M)下的降低百分率；對(duì)蝦青素沒有采用這種更高濃度，因?yàn)槲r青素在較低濃度下測(cè)定的活性較大。這些研究表明合成衍生物的裂解的蝦青 素部分在口服和腸胃外給藥之后是高度有效的癌癥化學(xué)預(yù)防劑的潛能。結(jié)合本文還報(bào)道的 肝蓄積藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(在單一和多劑量策略之后)，此化合物的應(yīng)用構(gòu)成特別有用的實(shí) 施方案。抑制活性氧種類 在實(shí)驗(yàn)中，以Percoll梯度從人志愿者全血中分離嗜中性白細(xì)胞。然后將分離的 嗜中性白細(xì)胞重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中，并用佛波醇酯作最大刺激以誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)和產(chǎn)生 超氧化物陰離子。往活化的人嗜中性白細(xì)胞的溶液中加入不同濃度的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦 青素衍生物，然后測(cè)定超氧化物信號(hào)[如用電子順磁共振(EPR)成像測(cè)定]。二鈉鹽二琥 珀酸酯蝦青素衍生物(作為立體異構(gòu)體的混合物)以依賴于劑量的方式減少測(cè)定的超氧化 物陰離子信號(hào)(圖2)；在3mM濃度下實(shí)現(xiàn)近乎完全抑制超氧化物陰離子信號(hào)。圖2表明在 對(duì)照組中活化之后強(qiáng)烈的超氧化物信號(hào)，以及用100μΜ-3πιΜ的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素 衍生物滴定的結(jié)果。在ΙΟΟμΜ下測(cè)試的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物清除28%的總信 號(hào)。在3mM下，幾乎沒有超氧化物信號(hào)剩余。這些結(jié)果表明對(duì)上述的其它抗嗜中性白細(xì)胞 干預(yù)所證實(shí)的在局部缺血-再灌注損傷中的心臟保護(hù)作用也可以用本文所述的新類胡蘿
卜素衍生物實(shí)現(xiàn)。除了減少在局部缺血_再灌注損傷中重要的超氧化物陰離子信號(hào)之外， 用所述的新類胡蘿卜素衍生物還可能實(shí)現(xiàn)心肌搶救，因?yàn)槌趸镪庪x子在心肌局部缺血 延長(zhǎng)期間在組織損傷和死亡中起主要作用。圖3描述二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/維生素C溶液對(duì)活性氧種類(超氧 化物陰離子)的作用，這是用Era成像監(jiān)測(cè)的。溶液分別包括大約2比大約1的維生素C 和二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物的混合物。二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/維生素 C溶液以依賴于劑量的方式降低測(cè)定的超氧化物陰離子信號(hào)(圖3)；在0. 02 μ M濃度實(shí)現(xiàn) 完全抑制超氧化物陰離子信號(hào)。圖3證明在對(duì)照組中活化之后的強(qiáng)超氧化物信號(hào)，以及用 0. 01 μ Μ-0. 02 μ M的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物/維生素C溶液滴定的結(jié)果。在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，再次以Percoll梯度從第二人志愿者的全血中分離嗜中性白細(xì) 胞。然后將分離的嗜中性白細(xì)胞重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中，并用佛波醇酯作最大刺激以誘 導(dǎo)呼吸爆發(fā)和產(chǎn)生超氧化物陰離子。往活化的人嗜中性白細(xì)胞的溶液加入4種濃度的鹽酸 鹽二賴氨酸酯蝦青素衍生物(XX)，然后測(cè)定超氧化物信號(hào)(用Era成像測(cè)定)。鹽酸鹽二 賴氨酸酯蝦青素衍生物也以依賴于劑量的方式減少測(cè)定的超氧化物陰離子信號(hào)(圖21)， 從在1 μ M下減少大約5%至在3mM下減少98%。再次在3mM濃度下實(shí)現(xiàn)接近完全地抑制 超氧化物陰離子信號(hào)。這種新的類胡蘿卜素衍生物在低濃度(ΙμΜ)下表現(xiàn)出清除效力，以 及增加濃度的該衍生物在此體外試驗(yàn)中接近完全地消除超氧化物陰離子信號(hào)的能力。這種新衍生物在體外作為水性清除劑的活性再次表明新衍生物(二鈉二琥珀酸 酯蝦青素，鹽酸鹽二賴氨酸蝦青素)在體內(nèi)將充當(dāng)軟藥物(即作為完整、未裂解的新衍生物 有活性)而不是前藥(不具有活性，直至裂解成游離蝦青素)。此衍生物(XX)的水溶性大 于50mg/mL，表明本發(fā)明方法可用于增加母體類胡蘿卜素(在此情況下為蝦青素)的水溶 性，從接近零的固有水溶性增加至高mg/mL范圍。二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物導(dǎo)致的直接超氧化物陰離子清除通過電子順磁共 振成像法表明的各立體異構(gòu)體相對(duì)于立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物的相對(duì)效力
材料非酯化的全E蝦青素[立體異構(gòu)體3S，3' S、內(nèi)消旋(3S，3' R和3' S，3R)和3R， 3' R的1 2 1統(tǒng)計(jì)混合物]購(gòu)自Buckton Scott (India)，并如提供的那樣使用(HPLC 表明>95%純度)。將蝦青素溶于 HPLC 級(jí)二甲亞砜(DMS0 ；Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) 以9種配方分別單獨(dú)測(cè)試蝦青素的二鈉二琥珀酸酯衍生物立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物(關(guān) 于蝦青素，上述，全 2 1混合物；在所有的表和圖中標(biāo)記為“混合物”)；3S，3' S 和3R，3 ‘ R (光學(xué)異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體)；和內(nèi)消旋(3S，3 ‘ R和3 ‘ S，3R的混合物；對(duì)映 異構(gòu)體對(duì)的非對(duì)映異構(gòu)體)。所有二琥珀酸酯衍生物合成純度根據(jù)HPLC >90%。首先在 來自IOmM儲(chǔ)備溶液的在純水溶液(去離子水)中適宜的最終濃度下測(cè)試二琥珀酸酯衍生 物。然后由在乙醇的1 2混合物中以IOmM制備的儲(chǔ)備溶液(儲(chǔ)備溶液中EtOH的最終濃 度3373% ；分離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn)中的最終濃度0.3% ；HPLC級(jí)乙醇，Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)測(cè)試4種二琥珀酸酯衍生物中的每一種。還由50% EtOH濃度的儲(chǔ)備溶液 (在分離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn)中的最終濃度0.5% )測(cè)試3S，3' S衍生物。二琥珀酸酯 衍生物的乙醇配方表現(xiàn)出完全解聚在純水溶液中形成的超分子裝配體，提供衍生物的單 體溶液，然后立即引入試驗(yàn)。還進(jìn)行單獨(dú)乙醇的陰性對(duì)照(在分離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn) 中為0.3%和0.5%最終EtOH濃度)和超氧化物歧化酶模擬陽性對(duì)照(ΙΟμΜ最終濃度；
Me taphore Pharmaceuticals, Inc. ，St. Louis, MO)。合成類胡蘿卜素衍生物[琥珀酸一-(4-{18-[4-(3-羧基-丙酰氧基)-2，6，6_三 甲基-3-氧代-環(huán)己-1-烯基]-3，7，12，16-四甲基-十八烷-1，3，5，7，9，11，13，15，17-壬 烯基} -3，5，5-三甲基-2-氧代-環(huán)己-3-烯基)酯；圖17]及其立體異構(gòu)形式，蝦青素的 二鈉二琥珀酸酯衍生物，全反式(全-E)形式。所述衍生物為在3和3'碳位置具有2個(gè)手 性中心的對(duì)稱手性分子，包含4種立體異構(gòu)體3R，3' R和3S ,3' S(光學(xué)異構(gòu)體或?qū)τ?異構(gòu)體)，以及非對(duì)映異構(gòu)體內(nèi)消旋形式(3R，3' S和3' R，3S)。由商業(yè)來源的蝦青素合 成的立體異構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物包含1 2 1比率的3R，3' R、內(nèi)消旋(3R，3' S和3' R， 3S)和3S，3' S立體異構(gòu)形式。所有單獨(dú)的立體異構(gòu)體和統(tǒng)計(jì)混合物根據(jù)HPLC合成純度> 90%,允許直接比較這些形式作為直接自由基清除劑的個(gè)體效力。用于此研究的全-E形式 立體異構(gòu)體是線性、剛性分子(bolaamphiphiles)，因?yàn)樵陂g隔物的多烯鏈中缺乏順式(或 Z)構(gòu)型。蝦青素的二鈉二琥珀酸二酯相對(duì)于母體化合物蝦青素表現(xiàn)出水“分散性”增大。 各立體異構(gòu)體和統(tǒng)計(jì)混合物的水分散性都大于8mg/mL(大約IOmM)，使它們可被引入不含 助溶劑的緩沖水性試驗(yàn)體系。對(duì)于在本研究中測(cè)試的衍生物也觀察到母體類胡蘿卜素如 蟲下青素(Salares,1977)以及新類胡蘿卜素衍生物(例如辣椒紅衍生物)(Zsila，2001和 Bikadi, 2002)在水溶液中形成超分子裝配體的趨勢(shì)。超分子自我裝配導(dǎo)致水溶液中相當(dāng)大的聚集體，并阻止聚集分子與自由基種類的 最大直接相互作用。因此，在純水性配方和含有助溶劑乙醇的配方中比較新蝦青素衍生物 的直接清除表現(xiàn)。在儲(chǔ)備溶液中，1 2濃度的EtOH/水表現(xiàn)出完全解聚統(tǒng)計(jì)混合物、內(nèi)消 旋和3R，3' R衍生物；需要50%乙醇儲(chǔ)備溶液來完全解聚3S，3' S異構(gòu)體。還相對(duì) 于陰 性(即乙醇載體)和陽性[超氧化物歧化酶(SOD)模擬物，游離外消旋蝦青素，在DMSO中] 對(duì)照測(cè)定化合物的清除能力。
白細(xì)胞純化和制備 通過Percoll密度梯度離心從新鮮取樣的單一志愿者的靜脈血(S. F. L.)中分離 人多形核白細(xì)胞(PMNs)，產(chǎn)生PMN純度為> 95%。將各IOmL全血與0. 8mL 0. IM EDTA和25mL鹽水混合。將稀釋的血液鋪于1. 080g/ mL特定密度的9mL Percoll上。在400X g和20°C下離心20分鐘后，移出血漿、單核細(xì)胞和 Percoll層。通過加入18mL冰冷的水30秒，然后加入2mL 10XPIPES緩沖液(25mM PIPES, IlOmM NaCl和5mM KCl，用NaOH滴定至pH 7.4)溶解紅細(xì)胞。在4°C下將細(xì)胞沉淀，傾析上 清液，并重復(fù)此過程。在第二次低滲溶解之后，用PAG緩沖液(PIPES緩沖液，包含0.003% 人血清白蛋白和0. 葡萄糖)洗滌細(xì)胞兩次。然后，通過在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行光學(xué)顯微 鏡檢查來計(jì)數(shù)PMN。然后將最終的沉淀懸浮在PAG-CM緩沖液(PAG緩沖液，含有ImM CaCl2 禾口 ImM MgCl2)中。EPR 測(cè)定所有EI3R測(cè)定使用在X-譜帶以TM11Jg操作的Bruker ER 300 EI3R光譜計(jì)進(jìn)行。 微波頻率用Model 575微波計(jì)數(shù)器(EIP Microwave, Inc.，San Jose, CA)測(cè)定。為測(cè)定佛 波醇 _ 酉旨(PMA)刺激的 PMN 產(chǎn)生 0、，用 IOmM 的 DEPMP0(0xis，Portland, OR)進(jìn)行 EPR 自 旋-捕集研究。用PMA(lng/mL)刺激1 X IO6PMNs,并將其裝填至毛細(xì)管以進(jìn)行EI5R測(cè)定。為 測(cè)定在DMSO中的非酯化的游離“外消旋”蝦青素和在9種配方之每種中的二鈉鹽二琥珀酸 酯衍生物的自由基清除能力，將PMN與化合物預(yù)溫育5分鐘，然后如前述進(jìn)行PMA刺激。用 于自旋-捕集實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)置如下調(diào)節(jié)幅度，0. 32G ；時(shí)間常數(shù)，0. 16s ；掃描時(shí)間，60s ；調(diào) 節(jié)頻率，IOOkHz ；微波功率，20毫瓦；和微波頻率，9. 76GHz。將樣品置于石英EI3R扁平室中， 并記錄光譜。如報(bào)道那樣鑒定光譜中的組成信號(hào)并進(jìn)行定量(Lee，2000)。統(tǒng)計(jì)分析用NCSS統(tǒng)計(jì)軟件包(NCSS 2001和PASS 2002，Kaysville，UT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所 有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)在α =0. 05下進(jìn)行。EPR結(jié)果簡(jiǎn)述在研究開始時(shí)將由Metaphore，Inc.生產(chǎn)的有效SOD模擬物用作陽性對(duì)照。如 在Zweier實(shí)驗(yàn)室反復(fù)觀察到的，在僅僅水載體中的10 μ M劑量近乎完全消除超氧化物陰 離子信號(hào)，如用DEPMPO檢測(cè)(97%抑制；表1)。還評(píng)價(jià)了單獨(dú)乙醇的陰性對(duì)照(最終濃度 0.3%),因?yàn)橐掖荚谶@些體系中表現(xiàn)出較小清除活性；在此濃度下看到5. 7%抑制作用。在 表1的描述數(shù)據(jù)中，沒有從包含乙醇的配方中扣除該抑制量，因?yàn)樵诖搜芯恐性u(píng)價(jià)給藥載 體本身(在EtOH中的二鈉二琥珀酸酯衍生物)在直接清除中的效用。評(píng)價(jià)在DMSO中的非 酯化的游離蝦青素(100μΜ)作為與此研究中合成的新衍生物進(jìn)行直接比較的參照標(biāo)準(zhǔn)； 蝦青素/DMSO載體的平均抑制作用為28% (表1)。圖18顯示最終濃度為100 μ M的在水中的4種立體異構(gòu)體(混合物和3種單獨(dú)的 立體異構(gòu)體)中每一種的相對(duì)清除能力。除了 3R，3' R對(duì)映異構(gòu)體(28.7%抑制)，所有其 它新衍生物配方表現(xiàn)出相對(duì)于蝦青素/DMSO配方降低的清除能力(范圍-2. 0%至19. 3% 抑制；表1)?？梢钥闯?，3S，3' S配方?jīng)]有表現(xiàn)出任何平均清除活性。但是，當(dāng)在乙醇配方 中引入到分離的嗜中性白細(xì)胞試驗(yàn)體系中時(shí)，在每種情況下清除活性增大超過在水中配制 的相同衍生物(圖19 ；范圍38.0%-42.5% )。重要的是注意到3S，3' S衍生物在50%EtOH中配制以進(jìn)行這種比較。觀察到在乙醇配方中的新衍生物清除能力增加超過在DMSO 中的蝦青素的趨勢(shì)，但在扣除乙醇載體(在試驗(yàn)中的最終濃度為0. 3%)的平均清除能力之 后，該趨勢(shì)不明顯(NS)。此外，在乙醇中的4種受試的新衍生物制劑之間沒有觀察到平均清 除能力的顯著差異(圖19)。圖20表明增加濃度的在乙醇配方中的二鈉二琥珀酸酯蝦青素的立體異構(gòu)體的混 合物對(duì)超氧化物信號(hào)抑制的滴定結(jié)果。當(dāng)濃度從100 μ M增至3mM時(shí)，觀察到對(duì)超氧化物信 號(hào)接近完全的抑制作用(在3mM劑量下為95.0%抑制；表1和圖18)。劑量-反應(yīng)曲線是 非線性的。對(duì)抑制百分率和測(cè)試劑量進(jìn)行調(diào)整，二鈉二琥珀酸酯衍生物比在本研究中用作 陽性對(duì)照的SOD模擬物的效力低1至2個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。表1描述在本研究中測(cè)試的蝦 青素的二鈉二琥珀酸酯衍生物的不同配方的描述統(tǒng)計(jì)。各個(gè)配方評(píng)價(jià)的樣本大小為3或更 大，除了在50 % EtOH儲(chǔ)備溶液中的3S，3 ‘ S (N = 2)，和在研究開始時(shí)評(píng)價(jià)的SOD模擬物 (陽性對(duì)照，N = 1)。表 1 EPR結(jié)果簡(jiǎn)述蝦青素是一種有效的親脂性抗氧化劑，它通常在富含脂質(zhì)的細(xì)胞膜、脂蛋白和其 它組織中發(fā)揮其抗氧化性能(Britton，1995)。作為水分散性活性劑效用增大的蝦青素的衍 生物具有直接清除由在呼吸爆發(fā)刺激之后分離的人嗜中性白細(xì)胞產(chǎn)生的水相超氧化物陰離子的能力。新衍生物的純水性配方在直接清除能力方面的效力小于乙醇配方。在某些溶劑 (例如水)中水溶性類胡蘿卜素衍生物的超分子裝配可以解釋它們?cè)谶@些溶劑中效力的缺 乏。所述聚集是螺旋狀、“card-pack”類型，在純水性溶液中形成大小超過240nm的聚集物。 增加緩沖液的離子強(qiáng)度可以增加這些聚集體的大小和穩(wěn)定性。這些聚集體的自由基清除能 力與相同化合物的單體溶液相比減小；實(shí)際上，對(duì)于溶于水的3S，3' S立體異構(gòu)體沒有見 到清除能力(表1，圖18)。必須小心地制備用于體外和體內(nèi)試驗(yàn)的配方，因?yàn)槌肿友b配 限制可與自由基種類相互作用的分子的數(shù)量。聚集體的大小也必須考慮，已經(jīng)描述了包含 多至IO6個(gè)分子和尺寸達(dá)到300nm或更大的聚集體(Bakadi，2002)。
滴定二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物劑量至3mM(作為在1 2Et0H/水中的立體異 構(gòu)體的混合物)表現(xiàn)出接近完全抑制超氧化物陰離子信號(hào)(95%抑制)，如用DEPMPO自旋 胼測(cè)定(圖20)。劑量-反應(yīng)曲線是非線性的，要求增加劑量以接近完全抑制自由基信號(hào) (圖20)。在最低測(cè)試濃度(100 μ M)下抑制近40%的信號(hào)。此劑量下二鈉二琥珀酸酯蝦青 素衍生物的效力可以直接與用作本研究中的陽性對(duì)照的超氧化物歧化酶(SOD)模擬物(在 ΙΟμΜ為97%抑制)進(jìn)行比較。這些結(jié)果表明，作為水相自由基清除劑，二鈉二琥珀酸酯 蝦青素衍生物比SOD模擬物的效力小1至2個(gè)數(shù)量級(jí)。但是，在體內(nèi)這些衍生物衰變成游 離蝦青素，其在富含脂質(zhì)的細(xì)胞膜[包括線粒體膜和核膜(Goto，2001)]中變得具有活性， 因而提供雙重保護(hù)作用(水相和脂相自由基清除)，這是用水溶性蛋白和酶模擬物不能實(shí) 現(xiàn)的。非酯化的游離蝦青素(當(dāng)以0.02%食物wt/wt作為飲食補(bǔ)充物提供時(shí))具有抗ROS 介導(dǎo)的對(duì)骨骼肌和心肌的艱苦運(yùn)動(dòng)損害的心臟保護(hù)作用(Aoi等人2003)。因此，這種特征 (即雙相自由基清除)應(yīng)該使此類化合物可額外地用作自由基和活性氧種類預(yù)防是重要的 適應(yīng)癥中的臨床治療劑(Cross，1987)。此研究第一次證明由EI5R光譜學(xué)檢測(cè)到的一類新的類胡蘿卜素衍生物對(duì)超氧化 物陰離子的直接清除。發(fā)現(xiàn)所述化合物在純水溶液中形成超分子裝配體。相對(duì)于相同化合 物的單體溶液，超分子裝配體的形成可能限制它們的清除效力。在所述新化合物的4種潛 在的立體異構(gòu)體中沒有看到清除能力的顯著差異。劑量-范圍研究表明衍生物的濃度可以 增加至接近完全抑制誘導(dǎo)的超氧化物陰離子信號(hào)。作為潛在的體內(nèi)治療劑，這類化合物可 以用作水相和脂相清除劑，從而可以廣泛地用于有效的自由基清除劑對(duì)其具有經(jīng)證實(shí)的效 力的急性和慢性疾病。二鈉二琥珀酸酯二維生素C蝦青素衍生物導(dǎo)致的直接超氧化物陰離 子清除在電子順磁共振(EPR)成像實(shí)驗(yàn)中，以Percoll梯度從人志愿者全血中分離 嗜中性白細(xì)胞。然后將分離的嗜中性白細(xì)胞重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中，并用佛波醇酯 作最大刺激以誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)和產(chǎn)生超氧化物陰離子。往活化的人嗜中性白細(xì)胞的溶液 加入不同濃度的二鈉二琥珀酸酯二維生素C蝦青素衍生物(XXIII)(半系統(tǒng)命名琥珀酸 4- [ 18- (4- {3- [2- (3，4- 二羥基-5-氧代-2，5- 二氫呋喃_2_基)-2-羥基-乙氧基羰基]-丙 酰氧基}-2，6，6-三甲基-2-氧代-環(huán)己-1-烯基)-3，7，12，16-四甲基-十八烷-1，3，5，7， 9，11，13，15，17-壬烯基]-3，5，5-三甲基-2-氧代-環(huán)己-3-烯基酯2-(3，4-二羥基-5-氧 代-2，5- 二氫呋喃-2-基)-2-羥基-乙基酯)，然后測(cè)定超氧化物信號(hào)(如用EI5R成像測(cè) 定)。二鈉二琥珀酸酯二維生素C蝦青素衍生物(XXIII)以依賴于劑量的方式減少測(cè)定的超氧化物陰離子信號(hào)(圖33)；在60 μ M濃度下實(shí)現(xiàn)完全抑制超氧化物陰離子信號(hào)。這代 表效力比同樣合成用于本系列實(shí)驗(yàn)的二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)增加50倍。測(cè) 試的衍生物的純度為88% (通過HPLC曲線下面積或AUC確定)。該新的類胡蘿卜素衍生 物_通過對(duì)各維生素C的6-ΟΗ位置進(jìn)行酯化而設(shè)計(jì)成“軟藥物”-保持單 獨(dú)維生素C分子 的抗氧化功能。衍生物(XXIII)的效力接近1 2摩爾比的二鈉二琥珀酸酯蝦青素(XVI) 和游離維生素C的配方的效力(其以20 μ Μ/40 μ M二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)/游 離維生素C配方完全抑制超氧化物陰離子信號(hào))。每摩爾的衍生物在體內(nèi)產(chǎn)生2摩爾游離 維生素C和1摩爾非酯化的游離蝦青素的衍生物(XXIII)特別優(yōu)選用于某些臨床適應(yīng)癥。 衍生物(XXIII)還可能在這些臨床情況下表現(xiàn)效力增加其中水相清除(通過完整母體衍 生物以及游離維生素C)和脂相清除(通過非酯化的游離蝦青素)對(duì)于可歸因于ROS和其 它自由基種類損傷的病理情況的減少是重要的。雄性Sprague-Dawley大鼠中的梗塞大小減小圖4、圖25和圖26描述雄性Sprague-Dawley大鼠中梗塞大小的減小。用在 水溶液中的二鈉鹽二琥珀酸酯蝦青素衍生物(作為立體異構(gòu)體的混合物)預(yù)處理雄性 Sprague-Dawley大鼠，然后進(jìn)行閉塞并誘導(dǎo)心肌梗塞。用100mg/kg仲丁硫巴比妥麻醉雄 性Sprague-Dawley大鼠(175-200克s)，進(jìn)行器械操作，并暴露心臟。環(huán)繞左冠狀動(dòng)脈周圍 放置縫線，并進(jìn)行30分鐘的總冠狀動(dòng)脈閉塞，然后進(jìn)行2小時(shí)再灌注，此時(shí)從動(dòng)物上切離心 臟測(cè)定梗塞大小。用緩沖液洗滌心臟，并用保持在37°C下的在pH 7. 40的磷酸鹽緩沖液中 的三苯基四唑翁氯化物(TTC)染色溶液培養(yǎng)。梗塞大小(IS)表示為占危險(xiǎn)面積的％ (IS/ AAR, % )0在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)系統(tǒng)血壓、心率、血?dú)夂腕w溫，并將體溫和血?dú)鈬?yán)格控制 在正常生理水平。通過為期4天每天尾靜脈注射I. V.給藥25、50或75mg/kg的二鈉鹽二 琥珀酸酯蝦青素衍生物或無菌鹽水載體，然后進(jìn)行梗塞實(shí)驗(yàn)和測(cè)定梗塞大小。搶救結(jié)果簡(jiǎn)述.梗塞大小減小和相應(yīng)的心肌搶救隨劑量呈線性和明顯地增加(P = 0. 001**)。在 最大受試劑量75mg/kg下，平均心肌搶救為56%，它接近用局部缺血預(yù)處理策略可獲得的 搶救率。在測(cè)試更高劑量前對(duì)在此大鼠中進(jìn)行單一劑量I. V.注射有體積限制；但是非酯化 的游離血漿水平的蝦青素和IS/AAR%之間的顯著的線性相關(guān)性(P < 0. 001** ；r2 = 0. 67) 表明在大約120-125mg/kg的劑量下可實(shí)現(xiàn)100%搶救。這第一次證明新類胡蘿卜素衍生物 的心臟保護(hù)作用。口服二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)、增加的生物利用度和增加的靶 組織分布血漿藥代動(dòng)力學(xué)在雄性C57BL/6小鼠上測(cè)定二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物的單一劑量口服藥代 動(dòng)力學(xué)參數(shù)(包括0_、1_、4肌((|_72)1和清除率)。以在先前研究中顯示出可有效預(yù)防 Sprague-Dawley大鼠中CCl4給藥之后繼發(fā)的損傷(在這些研究中為100mg/kg體重)的單 一最大劑量(500mg/kg)給動(dòng)物口服衍生物。在以下時(shí)間點(diǎn)，從每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少3只動(dòng)物獲 得用于HPLC分析血漿和肝中游離蝦青素水平的樣品 時(shí)間0 [在受試化合物給藥之前即時(shí)進(jìn)行]、攝入后2、4、6、8、12、16、24、48和72小 時(shí)·
以其它間隔(10、14和36小時(shí)；表2和3)取N <3的附加的樣品。在此研究中當(dāng) 類胡蘿卜素酯在哺乳動(dòng)物腸中完全裂解成游離類胡蘿卜素，其被動(dòng)移動(dòng)通過腸細(xì)胞時(shí)測(cè)定 非酯化的游離蝦青素水平。實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)述血漿藥代動(dòng)力學(xué) 將雄性C57BL/6小鼠，大約25g，關(guān)養(yǎng)在籠中(3只小鼠/籠)，并自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)小 鼠食物(Purina Mouse Chow, Ralston Purina, St. Louis)和水，持續(xù)至少5天，然后開始實(shí) 驗(yàn)。將二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物與以下組分混合以制備適于經(jīng)口管飼的乳液 無菌過濾(0. 2 微米 M illipore ) /K ； 橄欖油(Bertolli USA, Inc.，Secaucus, NJ)； 大豆卵磷脂，IV-S 型(Sigma-Aldrich Co.，St. Louis, MO ；目錄號(hào) P3644)。二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物在純水性配方中表現(xiàn)出大約8. 64mg/mL的水溶性。 在上述乳液中，溶解度增至大約50mg/mL，允許在這些動(dòng)物中通過管飼法服藥多達(dá)500mg/ kg。這種在給藥載體中溶解度顯著增加6倍大大利于這些小鼠的管飼法研究。用于制備乳液的方法如下(1)將 80mg 大豆卵磷脂(Sigma catalog P3644)加到 5. OmL 水。在 15mL 離心管 中間歇地渦旋混合大約30分鐘直至懸浮液均一；(2)室溫下加入2. 5mL橄欖油并渦旋混合。這產(chǎn)生均一、稠厚、渾濁的黃色懸浮液。 這種乳液物質(zhì)可以在室溫或4°C冰箱中儲(chǔ)存。如果儲(chǔ)存的話，在第3步(以下)加入二鈉二 琥珀酸酯衍生物之前即刻渦旋混合；(3)將50mg/mL的二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物直接加到乳液。此濃度下該化合 物容易地進(jìn)入均一懸浮液。渦旋混合然后立即進(jìn)行管飼以確保均一懸浮液；和(4)所述物質(zhì)具有堵塞小鼠管飼針的可能性。在每2次管飼之后沖洗管飼針。通過經(jīng)口管飼法以500mg/kg體重單一劑量施用乳液。在實(shí)驗(yàn)之前的晚上從所有 籠中撤出食物。在施用乳液后1小時(shí)，對(duì)所有動(dòng)物恢復(fù)食物和水。用于全血和組織取樣、樣品提取和HPLC分析的方法已作了詳述(Osterlie， 2000)。簡(jiǎn)言之，將全血收集在包含EDTA的Va CU t a i ne r ‘管中，然后通過在4°C ,1500 Xg 下離心20分鐘來制備血漿。隨后將血漿樣品等分試樣化，并在液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)運(yùn) 并進(jìn)行HPLC分析。組織蓄積還在與血漿樣品相同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定肝中的游離蝦青素濃度。處死后從藥代動(dòng)力學(xué) 研究的各只動(dòng)物中取出肝臟，并在液氮中快速冷凍。如所述(Jewell，1999)制備用于HPLC 分析的肝組織。因此，在與血漿分析相同的時(shí)間點(diǎn)同時(shí)檢查游離蝦青素的肝蓄積。實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)述游離蝦青素的肝蓄積在液氮中快速冷凍來自各只動(dòng)物的至多300mg肝。用氯仿/甲醇/水的混合物， 根據(jù)Jewell的方法(1999)進(jìn)行組織勻漿和提取。然后如以上關(guān)于血漿樣品所述通過HPLC 法評(píng)價(jià)肝中非酯化的游離蝦青素蓄積。藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果簡(jiǎn)述在適宜的取樣間隔時(shí)間的游離蝦青素的血漿和肝水平的總結(jié)表如表2和3所示。 血漿和肝非酯化的游離蝦青素曲線下面積vs.時(shí)間(AUC' s)也包括在表2和3中。這些結(jié)果表明，對(duì)于各取樣間隔，肝中游離蝦青素水平相同或大于在血漿中的水平。這一改善的 組織特異性遞送至肝在文獻(xiàn)中是沒有先例的；實(shí)際上游離蝦青素的肝水平通常低于在給藥 后相同時(shí)間點(diǎn)血漿中的相應(yīng)水平(Kurihara，2002)。因此，在上述乳液中的二鈉二琥珀酸酯 蝦青素衍生物是用于在口服之后遞送治療濃度的游離類胡蘿卜素至感興趣組織的優(yōu)異載 體。表2 非酯化的游離蝦青素的血漿水平 表3 非酯化的游離蝦青素的肝水平 當(dāng)在口服載體或食物中提供類胡蘿卜素如蝦青素時(shí)通常需要進(jìn)行預(yù)處理(15天 至6周)以在肝損傷研究中實(shí)現(xiàn)有效水平(Kang，2001 ；Kim, 1997 ；Aoi等人1993)。在此情 況下，用單一劑量實(shí)現(xiàn)治療水平(200nm或以上)。0. 9mg/L的Cmax (表4)在嚙齒動(dòng)物中也是空前的，這些動(dòng)物僅吸收小百分比的口服 劑量的類胡蘿卜素。游離類胡蘿卜素的這些血漿和肝水平是在僅僅服用在乳液載體中的單 一劑量化合物之后就獲得的，這一點(diǎn)是有意義的。在人中，Osterlie等人(2000)已描述在 單一劑量IOOmg(大約1. lmg/kg 口服劑量)在橄欖油載體中的非酯化的游離蝦青素之后的 Cmax血漿水平為1. 3mg/L。當(dāng)在脂肪載體中提供時(shí)人通常吸收40-50% 口服劑量的類胡蘿卜 素，相比之下嚙齒動(dòng)物只有少數(shù)幾個(gè)百分點(diǎn)。因此，本研究證明，用為嚙齒動(dòng)物研制的乳液 載體達(dá)到了人中Cmax的近70%，從而大大增加此衍生物用于肝保護(hù)研究的有用性。表4:pK 參數(shù) *最大濃度**最大濃度的時(shí)間***曲線下面積腸胃外施用CardaXTM( 二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物)之后兔中實(shí)驗(yàn)性梗塞大小 和C-反應(yīng)蛋白的循環(huán)水平的降低用Barrett等人(2002)等人的方法并進(jìn)行細(xì)微修改來研究腸胃外施用二鈉二琥 珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)對(duì)兔中誘導(dǎo)的梗塞大小減小和誘導(dǎo)的循環(huán)C-反應(yīng)蛋白(CRP) 水平的影響。本研究的目的在于調(diào)查二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(XVI)減輕炎癥的能 力，這是在兔心臟中在實(shí)驗(yàn)性心肌局部缺血/再灌注損傷情境下通過CRP測(cè)定的。已提出 常用作急性炎性(“急性期”)反應(yīng)的標(biāo)志的CRP可能實(shí)際上具有通過活化補(bǔ)體級(jí)聯(lián)而介導(dǎo) 的促炎效果。伴隨氧自由基(ROS)形成增加的心肌局部缺血/再灌注損傷已表現(xiàn)出可活化 補(bǔ)體系統(tǒng)。在該體系中已證明(1)繼發(fā)于遠(yuǎn)端炎性病損的血漿CRP的內(nèi)源性增加與繼發(fā)于 區(qū)域局部缺血和再灌注的心肌組織損傷的增加有關(guān)；(2)這種損傷的增加(表現(xiàn)為梗塞大 小增加)是由補(bǔ)體活性介導(dǎo)的；和(3)CRP是一種“效應(yīng)物，而不僅是系統(tǒng)性炎癥的間接度 量。因此，循環(huán)CRP水平降低，和先前用Cardax 在嚙齒動(dòng)物中所見的梗塞大小減小一起， 形成急性冠脈綜合征情境中的有力抗炎治療療法。簡(jiǎn)言之，將雄性新西蘭白兔(2.25_2.5kg)用于此研究。通過皮下注射4個(gè) 等分試樣(各0. 5mL)在玉米油中的巴豆油來誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)，所述注射開 始于用Cardax 進(jìn)行預(yù)處理的第二天。每天施用一次在水或等體積的無菌鹽水中的 Cardax (50mg/kg IV，通過耳靜脈注射)，持續(xù)4天，然后在第5天完成實(shí)驗(yàn)性梗塞形成。如 前述(Barret等人2002)，使用基于ELISA的方法，用抗兔CRP抗體得到循環(huán)CRP水平增加 的時(shí)間進(jìn)程。在實(shí)驗(yàn)的最后一天(第5天在最后一次藥物灌輸之后大約24小時(shí))，使用 甲苯噻嗪(3mg/kg)和氯胺酮(35mg/kg)的混合物，然后肌內(nèi)使用戊巴比妥(90mg/kg)麻醉 兔。需要時(shí)再施用戊巴比妥以保持麻醉。在氣管切開術(shù)之后，用室內(nèi)空氣給兔子通氣，并通 過左開胸術(shù)暴露心臟。然后將心臟支承在心包支架中，并將3-0絲結(jié)扎線放置在冠狀動(dòng)脈 左前降支周圍。通過往對(duì)結(jié)扎線加牽引力而將動(dòng)脈閉塞30分鐘，然后再灌注180分鐘。在 完成此方案之前刻即獲得靜脈血樣以測(cè)定血漿CRP。在該方案的再灌注期完成時(shí)，取出心臟，并在Langendorff灌注儀器上通過主動(dòng)脈插入導(dǎo)管。然后用改良的Krebs-Henseleit緩沖液再灌注心臟10-15分鐘(20_25mL/分)。在此段時(shí)間結(jié)束時(shí)，用80mL0. 4% 2，3，5-三苯基四唑翁氯化物(TTC)在37°C下灌注 心臟以確定危險(xiǎn)區(qū)域(AAR)。然后在與外科制備/實(shí)驗(yàn)梗塞形成期間相同的區(qū)域結(jié)扎冠狀 動(dòng)脈左回旋支。此時(shí)，停止灌注泵，并通過與主動(dòng)脈套管連接的側(cè)口將3. OmL Evan藍(lán)染料 緩慢注射入心臟。使所述溶液分布至整個(gè)心臟大約30秒。然后與垂直軸成直角將心臟切 成六個(gè)橫向部分。棄去右心室、心尖和心房組織。由紫色/藍(lán)色劃界的組織代表由非梗塞 相關(guān)的冠狀動(dòng)脈分布灌注的區(qū)域。將各個(gè)橫切部分的兩個(gè)表面印至干凈的乙酸酯片上，對(duì) 其進(jìn)行掃描，然后數(shù)字化以計(jì)算梗塞面積?？偽ｋU(xiǎn)面積表示為左心室的百分?jǐn)?shù)。然后將梗 塞大小表示為占危險(xiǎn)面積的百分?jǐn)?shù)。 對(duì)照動(dòng)物和Cardax 處理的動(dòng)物的平均梗塞大小如圖37所示。對(duì)照動(dòng)物和 Cardax 處理的動(dòng)物的循環(huán)CRP水平(表示為基線水間和再灌注時(shí)誘導(dǎo)的水平之間的平 均差異)如圖38所示。在Cardax 處理的兔子中看到梗塞大小減小約55. 4% ；兩組的局 部缺血危險(xiǎn)區(qū)域類似。類似地，對(duì)照中超出基線的循環(huán)CRP水平的平均增加(+23.5% )在 Cardax 處理的動(dòng)物中完全消除，至低于在基線觀察到的平均水平(_15.7%)。由于CRP既 是急性冠脈綜合征中的效應(yīng)物_在這種急性期反應(yīng)物水平升高的情況下導(dǎo)致梗塞大小增 加-又是初級(jí)與二級(jí)預(yù)防心臟患者中心血管風(fēng)險(xiǎn)的強(qiáng)烈獨(dú)立性預(yù)測(cè)物-這種循環(huán)蛋白水平 的降低形成強(qiáng)有力的治療療法?？诜c二琥珀酸酯蝦青素降低小鼠中脂多糖(LPS)導(dǎo)致的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)升高以下研究評(píng)價(jià)口服二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物在LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型 中的肝保護(hù)作用的效用。實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)述用LPS和半乳糖胺處理三月齡的雄性ICR小鼠以誘導(dǎo)肝損傷(Leist，1995)。首先 對(duì)小鼠經(jīng)口管飼橄欖油/水/卵磷脂乳液(10mL/kg或?qū)τ?0克小鼠而言0. 3mL)或包含 二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(50mg/mL)的相同乳液，最終二鈉二琥珀酸酯蝦青素劑量為 500mg/kg。2小時(shí)后對(duì)小鼠腹膜內(nèi)(IP)注射鹽水(10mL/kg)或大腸桿菌LPS (3mg/kg，Sigma 目錄號(hào)L-3755)和D-半乳糖胺(700mg/kg)的溶液。IP注射后5小時(shí)用二氧化碳(CO2)窒 息法處死動(dòng)物，然后收集血漿用于ALT測(cè)定。LPS誘導(dǎo)的損傷結(jié)果的簡(jiǎn)述.這些初步結(jié)果證明二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物對(duì)鹽水注射(肝損傷假處理對(duì) 照)動(dòng)物的血漿ALT沒有作用。在僅用乳液(不含衍生物)管飼的對(duì)照動(dòng)物中，ALT增加大 于3倍。在接受含500mg/kg 二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物的乳液的動(dòng)物中，ALT升高大大 減小(N = 3只動(dòng)物/組)，證明化合物降低作為這些動(dòng)物中肝細(xì)胞壞死的血清標(biāo)志的ALT 的效力。由于LPS誘導(dǎo)的肝損傷是由ROS(包括自由基氧化氮NO.)介導(dǎo)的，且在LPS侵害 后發(fā)生顯著的系統(tǒng)炎癥(非酯化的游離蝦青素對(duì)此有保護(hù)作用(Ohgami等人2003))，該新 衍生物用于在其中這種炎癥得到促進(jìn)的臨床適應(yīng)癥的效用代表一個(gè)特別有用的實(shí)施方案。黑小鼠多劑量口服之后游離蝦青素在血漿和肝中的蓄積在該藥代動(dòng)力學(xué)研究中，用本文所述的方法，給黑小鼠經(jīng)口管飼在乳液載體中的 十一(11)個(gè)單獨(dú)日口服劑量的二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生物(500mg/kg)，并在可能的Cmax和Tmax(6小時(shí))在3只動(dòng)物中測(cè)定游離蝦青素在血漿和肝中的蓄積?？赡艿腃max和Tmax(6 小時(shí))是由前面單一劑量口服藥代動(dòng)力學(xué)研究中的血漿和肝樣品推導(dǎo)出來的。評(píng)價(jià)在單一 乳液劑量之后非酯化的游離蝦青素在血漿和肝中的蓄積。所有受試動(dòng)物的平均血漿濃度為 381nM。所有受試動(dòng)物的平均肝濃度為1735nM。在單一劑量研究中，平均起來，在血漿和肝 中均獲得保護(hù)水平(對(duì)非酯化的游離蝦青素設(shè)在抗氧化ED5tl為200nM)；所獲得的平均肝濃 度差不多為保護(hù)水平的9倍。在多劑量研究中，峰和谷水平均取(給藥之后6小時(shí)在可能的Cmax取峰水平；在 Cfflax后6小時(shí)或給藥后12小時(shí)獲得谷水平)。在峰和谷血漿中的平均峰水平分別為485nM 和231nM ；在峰和谷肝的平均峰水平分別為1760nM和519nM。同樣，在各種情況下獲得保護(hù) 水平，并保持至多劑量給藥后11天；在肝的情況下，獲得差不多為保護(hù)水平9倍的水平。同 樣，在多次給藥后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝中的蓄積大于血漿中觀察到的蓄積，表明這種給藥載體 用于靶向至該實(shí)體器官的效用增加(圖32)。由此數(shù)據(jù)組還明顯看出長(zhǎng)期施用二鈉二琥珀 酸酯蝦青素衍生物將在肝保護(hù)方面有效。黑小鼠單一劑量口服之后游離蝦青素在心肌(心臟)和腦中的蓄積通過口服管飼法將在乳液載體中的單一最大劑量的二鈉二琥珀酸酯蝦青素衍生 物(500mg/kg)施用于黑小鼠，并在4只動(dòng)物中在可能的Cmax和Tmax(6小時(shí))測(cè)定非酯化的游 離蝦青素的蓄積，Cmax和Tmax根據(jù)前面研究中的血漿和肝樣品來推導(dǎo)。在單一劑量后非酯 化的游離蝦青素在心臟中的蓄積是優(yōu)異的(4只動(dòng)物的平均值+/-SEM = 693. 25+/"272ηΜ), 并與非酯化的游離蝦青素在肝中的蓄積結(jié)果平行。同樣，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，心臟中的蓄積大于 血漿中觀察到的蓄積，表明這種給藥載體用于靶向至實(shí)體器官的效用增加。非酯化的游離 蝦青素在CNS (腦)中的蓄積較不明顯(4只動(dòng)物的平均值+/-SEM = 3. 6+/-1. 7nM)，表明穿 透血-腦屏障(BBB)是可能的，但長(zhǎng)期、多劑量給藥可能是獲得對(duì)于CNS應(yīng)用(阿爾茨海默 氏病、中風(fēng)等)的保護(hù)水平所必需的。內(nèi)消旋蝦青素的二鈉鹽二琥珀酸酯衍生物與人血清 白蛋白(HSA)的相互作用大部分胡蘿卜素類胡蘿卜素和絕大部分葉黃素的差水溶性限制了它們作為水相 單線態(tài)氧猝滅劑和自由基清除劑的應(yīng)用。已將增加類胡蘿卜素的表觀溶解度和/或分散性 的化學(xué)修飾應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究。但是，母體類胡蘿卜素和新衍生物在水溶液中形 成超分子裝配體的趨勢(shì)使得先綜合全面評(píng)價(jià)這種行為然后才轉(zhuǎn)向這些化合物的效力的體 外和體內(nèi)試驗(yàn)有正當(dāng)理由。圖5描述類胡蘿卜素衍生物，全反式(全-E)形式的合成內(nèi)消旋蝦青素(3R， 3’ S-二羥基-β，β-胡蘿卜素_4，4' - 二酮)的二鈉鹽二琥珀酸酯衍生物(dAST)。用 于產(chǎn)生新衍生物的對(duì)稱C4tl-葉黃素在3和3'位具有兩個(gè)手性中心。在水溶液中，C4tl-葉 黃素不表現(xiàn)出旋光活性，因?yàn)檫@些立體中心具有相反的絕對(duì)構(gòu)型，并且在內(nèi)部彼此補(bǔ)償。具 有羧酸官能團(tuán)的天然類胡蘿卜素分子優(yōu)先與人血清白蛋白(HSA)-血液中最豐富的蛋白結(jié) 合。由于白蛋白結(jié)合強(qiáng)烈影響給定化合物的潛在體內(nèi)生物化學(xué)活性，因而將圓二色性(CD)、 紫外-可見(UV/Vis)和熒光光譜用于表征這種新類胡蘿卜素衍生物與不含脂肪酸的HSA 的相互作用。研究該對(duì)稱類胡蘿卜類的蛋白結(jié)合和聚集特性，其通過將含有羧酸末端基團(tuán) 的部分直接酯化而連接，形成剛性、長(zhǎng)鏈、高度不飽和二陰離子bolamphiphile。證明在 不存 在蛋白的緩沖溶液中，內(nèi)消旋類胡蘿卜素形成不表現(xiàn)CD卡滕效應(yīng)(CE)的緊密包裝的H型card-pack聚集體。但是在低配體/蛋白(L/P)摩爾比下，內(nèi)消旋類胡蘿卜素立即并優(yōu)先以 單體方式與HSA締合，表明允許在水溶液中發(fā)生超分子裝配的二級(jí)化學(xué)相互作用(范德華 力，氫鍵鍵合)在生物相關(guān)環(huán)境中被克服。超過1 1配體/蛋白摩爾比，內(nèi)消旋類胡蘿卜 素分子再次開始聚集；在這些比率下觀察到的聚集是手性的，產(chǎn)生表現(xiàn)出強(qiáng)烈激子型CD活 性的超分子結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)述由結(jié)晶蝦青素[3R，3'R，3R，3' S，3S，3' S (25 50 25)]，一種商購(gòu)的立體異 構(gòu)體的統(tǒng)計(jì)混合物(Buckton Scott, India)合成新的衍生物dAST。通過高壓液相色譜法 (HPLC)分離蝦青素立體異構(gòu)體，導(dǎo)致合成用于本研究中測(cè)試的純化的內(nèi)消旋二鈉鹽二琥珀 酸酯衍生物。所用的內(nèi)消旋立體異構(gòu)體的全反式(全-E)形式由于在間隔物的多烯鏈中 缺乏順式(或Z)構(gòu)型因而是一種線性、剛性分子(圖5)。成功地合成了根據(jù)HPLC純度> 99 %的合成內(nèi)消旋蝦青素的二鈉鹽二琥珀酸酯衍生物。材料基本上不含脂肪酸的人血清白蛋白(catalog No.A-1887，lot No. 14H9319)購(gòu)自 Sigma，并如提供地使用。使用雙蒸水和光譜級(jí)二甲亞砜(DMSO，Scharlau Chemie S. A.， Barcelona, Spain)和乙醇(Chemolab，Budapest，Hungary)。所有其它化學(xué)物質(zhì)為分析級(jí)。制備dAST的儲(chǔ)備溶液在將內(nèi)消旋類胡蘿卜素溶于DMSO之后，將ΙΟΟμ 1 DMSO溶液加到在光程長(zhǎng)度為 Icm的矩形比色杯中的2mL乙醇中。在260-650nm下記錄吸收光譜。由在λ_下的光吸收 值計(jì)算濃度(ε 478 = 116, 570M-W1)。制備HSA溶液對(duì)于光譜樣品制備，將HSA溶于ρΗ 7. 4 Ringer或0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖液。計(jì) 算白蛋白濃度，E1%lc;m = 5. 31，使用實(shí)驗(yàn)得到的279nm下的吸光度數(shù)據(jù)。HSA的分子量定義 為 66500Da。圓二色性和UV/Vis吸收光譜用Jasco J-715分光偏振計(jì)，在25士0. 2和37士0. 2°C下，在光程長(zhǎng)度為Icm的矩 形比色杯中記錄⑶和UV光譜。通過配備磁力攪拌的Peltier恒溫器提供溫度控制。以
1.Onm帶寬和0. 5nm分辨率且掃描速率為IOOnm/分，使所有的光譜聚集三次。誘導(dǎo)的⑶定 義為dAST-HSA混合物的⑶減去相同波長(zhǎng)下單獨(dú)HSA的⑶，并表示為毫度的橢圓率(mdeg)。37°C下用在pH 7. 4 Ringer和0. IM磷酸鹽緩沖液中的dAST對(duì)HSA進(jìn)行CD/UV/ Vis滴定將RinRer 緩沖液，L/P 倌為 0. 007-0. 10 2mL 1.6X10_4M HSA 溶液置于光程 長(zhǎng)度為Icm的比色杯中，并以10 μ L等分試樣用自動(dòng)移液管加入少量配體儲(chǔ)備溶液(c =
2.2 X 1(Γ4)。將 Rjnger 緩沖液，L/P 倌為 0. 82-13. 13 2ml 的 2. 3 X ICT6M HSA 溶液置于光 程長(zhǎng)度為Icm的比色杯中，并用自動(dòng)移液管加入μ L體積的配體儲(chǔ)備溶液(c = 3. 9X 10_4)。 將磷酸鹽緩沖液，L/P倌為0. 82-13. 10 2mL 2. 2X10_6M HSA溶液置于光程長(zhǎng)度為Icm的 比色杯中，并用自動(dòng)移液管加入μ L體積的配體儲(chǔ)備溶液(c = 3. 6 X ΙΟ"4)。測(cè)定dAST存在下HAS的固有熒光在Icm矩形室中在0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中制備2mL的4. 2X10_6M HSA溶液。連續(xù)地將1. 3 ΧΙΟ-4和3. 3 X IO-4M內(nèi)消旋類胡蘿卜素DMSO溶液以μ L體積加入在Jasco J-715分光偏振計(jì)的樣品室內(nèi)的比色杯中。在240和360nm之間以0. 5nm波長(zhǎng)增量激發(fā)所得 的樣品溶液。用安裝在光源右角的Hamamatsu H5784-型光電倍增檢測(cè)器收集在各個(gè)波長(zhǎng)下 的總熒光強(qiáng)度。在樣品溶液中，HSA和dAST的最初和最終濃度分別為4. 2 X 10_6M_4. O X 10_6M 和1.3X IO^7M-L 4X IO^5M0內(nèi)消旋類胡蘿卜素/HSA摩爾比在0. 03和3. 53之間變化。在 熒光測(cè)定期間，最終的DMSO濃度不超過5V/V%。還進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中測(cè)定將20、50和 100 μ L DMSO加到溶液期間HSA的熒光。UV/Vis和CD光譜結(jié)果簡(jiǎn)述在乙醇和水性緩沖液中的dAST的UV/Vis和CD光譜特性由于其延伸的π系統(tǒng)，dAST在可見光譜中表現(xiàn)出強(qiáng)烈光吸收(圖6)。主要的 鐘形吸收譜帶集中在481. 5nm處是由于允許的最低能量電子偶極，沿多烯鏈長(zhǎng)軸極化的 π — π*躍遷。室溫下，對(duì)于包含一個(gè)或多個(gè)共軛羰基的類胡蘿卜素，缺乏細(xì)微結(jié)構(gòu)是典 型的。但是，振動(dòng)次能帶實(shí)際存在于該曲線下，如由光譜的次級(jí)衍生揭示(圖6)。此外，在 近UV區(qū)存在進(jìn)一步的躍遷。根據(jù)在多烯模型上進(jìn)行的理論計(jì)算，在300nm附近的適當(dāng)強(qiáng)度 的譜帶的電子躍遷矩(μ)平行于dAST分子的長(zhǎng)軸極化。同時(shí)，371nm處的譜帶μ取向沿 著共軛體系的雙重C2對(duì)稱軸。羰基的弱η — η*躍遷由于其它譜帶而變得模糊。如預(yù)期 的，內(nèi)消旋類胡蘿卜素化合物在乙醇中不顯示任何CD譜帶，因?yàn)閮蓚€(gè)相反的手性中心(3R 3' S)的作用彼此取消(數(shù)據(jù)未顯示)。在Ringer緩沖液中，dAST主要吸收譜帶改變，表現(xiàn)大的藍(lán)色位移(2541. 6cm"1)和 頻寬縮窄(圖7)。這些光譜變化表明形成所謂的“card-pack”聚集體，其中的分子通過來 自水性環(huán)境的排阻和H鍵合相互作用而緊密結(jié)合在一起(在數(shù)埃范圍內(nèi))。結(jié)果是，多烯 鏈的激態(tài)波功能在分子間發(fā)生離域，允許在相鄰分子之間發(fā)生激子共振相互作用。這種相 互作用導(dǎo)致UV/Vis光譜中的高能量激子峰。由于在龐大的末端基團(tuán)中出現(xiàn)不利的空間相 互作用，不允許多烯鏈的平行排列；單獨(dú)分子的長(zhǎng)軸取而代之封閉確定的分子間覆蓋角度。 在這些情況下，由手性單體構(gòu)建的類胡蘿卜素聚集體還由于由不對(duì)稱中心決定的手性分子 間排列而表現(xiàn)出誘導(dǎo)的卡滕效應(yīng)(CE)。相比之下，內(nèi)消旋類胡蘿卜素化合物在聚集狀態(tài)下 在溶液中不表現(xiàn)旋光活性(數(shù)據(jù)未顯示)，原因是缺乏凈分子偏手性。在低配體/蛋白摩爾比的人血清白蛋白存在下dAST的光學(xué)特性在往在pH 7.4 Ringer緩沖液中制備的HSA溶液中加入dAST時(shí)，兩個(gè)明確的、相反 符號(hào)的誘導(dǎo)的⑶譜帶出現(xiàn)在300和450nm之間，且零交叉點(diǎn)在367nm(圖8)。附圖插入顯 示誘導(dǎo)的卡滕效應(yīng)的強(qiáng)度和在不同L/P比率下的主要吸收譜帶(Δ ε和ε值相對(duì)于總內(nèi) 消旋類胡蘿卜素濃度計(jì)算)。CEs的大小隨配體濃度增加而增加，但是它們的形狀和波長(zhǎng)位 置保持不變。如上述，在450nm以下存在兩個(gè)躍遷，其可能負(fù)責(zé)觀察到的旋光活性。300nm 附近的吸收譜帶具有躍遷對(duì)稱B，而對(duì)應(yīng)的電和磁躍遷矩與沿多烯鏈的雙重對(duì)稱軸垂直。將 372. 5nm處的譜帶的電和磁躍遷矩與C2軸平行極化，它的躍遷對(duì)稱為A?？珊侠淼赝茢嘣诘?白結(jié)合時(shí)，這些譜帶由于多烯鏈周圍微環(huán)境的改變而位移至更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。已很好地證明類 胡蘿卜素的CD光譜(發(fā)色團(tuán)部分屬于C2點(diǎn)基團(tuán))符合C2-規(guī)則如果總共軛體系獲得右手 手性(即鍵6-7和6' -T周圍的雙面夾角是負(fù)的)，則對(duì)稱A的躍遷導(dǎo)致負(fù)CE，而對(duì)稱B 的躍遷導(dǎo)致正CE(圖8)。因此，內(nèi)消旋類胡蘿卜素以這樣的方式與HSA結(jié)合蛋白環(huán)境固定良好確定的手性構(gòu)象的末端環(huán)，從而導(dǎo)致觀察到負(fù)和正誘導(dǎo)的CD譜帶。手性3和3'中心的絕對(duì)構(gòu)型不決定分子的手性光學(xué)特性；相反，白蛋白分子的不 對(duì)稱蛋白環(huán)境(通過非共價(jià)化學(xué)相互作用)決定觀察到的活性。與上述在水溶液中的聚集 行為相比，dAST分子在這些L/P比率的HSA溶液中不聚集，這通過鐘形和輕微紅色位移的 可見吸收譜帶的保持來證明(圖8)。這樣UV/Vis吸收和CD光譜均表明內(nèi)消旋類胡蘿卜素 分子與HSA的結(jié)合以單體形式發(fā)生。超過1 1L/P比率的HSA存在下dAST的光學(xué)特性將增加量的dAST加到用pH 7. 4 Ringer或0. 1M pH 7. 4磷酸鹽緩沖液制備的HSA 溶液以實(shí)現(xiàn)L/P比率高于1。CD和UV/Vis吸收光譜在加入配體期間均表現(xiàn)出顯著變化(圖 9和圖10)。除了藍(lán)色位移的可見吸收譜帶以外，一個(gè)新的正-負(fù)⑶譜帶對(duì)分別出現(xiàn)在480 和420nm附近。這些CE' s不表現(xiàn)出振動(dòng)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，且它們的振幅隨配體濃度的增加而 增長(zhǎng)。但是，在Ringer和磷酸鹽緩沖液中獲得的光譜之間存在某些顯著的差別a)在Ringer緩沖液中主要吸收譜帶遷移至較低的波長(zhǎng)(434. 5nm)。磷酸鹽緩沖 液中的相應(yīng)值為451. 5nm。b) Ringer (441. 6cm"1)中來自最大吸收譜帶的CEs的零交叉點(diǎn)的偏差比磷酸鹽緩 沖液(148. 4cm"1)大 3 倍。c)L/P值為8以上，Ringer溶液中的⑶譜帶的強(qiáng)度不再增加。相比之下，⑶譜帶 的振幅繼續(xù)隨磷酸鹽緩沖液中L/P比率增加而增加，甚至在L/P值為13的時(shí)候。d)在相同的L/P比率下，在磷酸鹽緩沖液中測(cè)定更強(qiáng)烈的⑶譜帶(圖9和圖10)。這些相反符號(hào)的⑶譜帶僅在超過1 1L/P比率時(shí)出現(xiàn)的事實(shí)強(qiáng)烈地表明它們?cè)?自相鄰內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子之間的手性分子間相互作用。當(dāng)兩個(gè)電子躍遷偶極矩能量類 似，在空間上彼此靠近，并形成手性排列時(shí)，它們的相互作用表現(xiàn)為手性激子偶合CD光譜 表明bisignate couplet，與對(duì)應(yīng)的吸收譜帶的光譜位置相匹配，所述吸收譜帶的信號(hào)由兩 個(gè)偶極之間的扭曲的絕對(duì)意義確定。根據(jù)激子手性規(guī)則，正扭曲對(duì)應(yīng)于正長(zhǎng)波長(zhǎng)CE和較短 波長(zhǎng)處的負(fù)CE，反之亦然。在我們的情況下，躍遷偶極矩的方向是已知的；它沿多烯鏈的長(zhǎng) 軸極化。因此，相鄰內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子以使它們的長(zhǎng)軸形成正(順時(shí)針)分子間覆蓋 角度的方式排列。圖11所示的兩個(gè)共軛鏈的手性排列滿足前者條件；在這些情況下，長(zhǎng)波 長(zhǎng)正和短波長(zhǎng)負(fù)譜帶將出現(xiàn)在⑶光譜中。但是，吸收譜帶的光譜學(xué)表現(xiàn)有助于區(qū)別這些空 間排列。由于在a和b的情況下相鄰內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子的躍遷偶極矩之間存在不利的 庫侖相互作用(圖11)，吸收最大值位移至較高的能量；如果c形式存在，則吸收譜帶變寬 且它的最大值位移至較低的能量。因此，dAST分子形成右手手性排列，其中內(nèi)消旋類胡蘿 卜素單體的長(zhǎng)軸形成正銳角(圖11，a和b)。提出有關(guān)配體分子的手性排序起源的以下設(shè)想。白蛋白似乎是誘導(dǎo)光學(xué)活性所必 需的，首先有興趣的是推斷在HSA上存在能夠容納兩個(gè)內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子的大的結(jié)合 位點(diǎn)。在低L/P值下白蛋白將僅結(jié)合單一配體；在較高L/P濃度下，將復(fù)合第二內(nèi)消旋類胡 蘿卜素單體。但是如上述，CEs的大小在相當(dāng)高的L/P值下持續(xù)增加(圖10)，在這種情況 下單一結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)已被飽和。這個(gè)問題的一個(gè)解決方案推斷HSA是一種不對(duì)稱模板，在其 上開始手性自裝配。最早的一些內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子以右手性排列方式與HSA結(jié)合，而 隨后的內(nèi)消旋類胡蘿卜素單體建立在此手性結(jié)構(gòu)之上。在此設(shè)想中，HSA提供第一基本步
74驟，手性引發(fā)(“手性接種")；此后自裝配自動(dòng)地繼續(xù)。但是非常重要是的注意到，在沒 有其手性末端基團(tuán)的情況下，僅少數(shù)dAST分子在HSA的結(jié)合位點(diǎn)處保持右手性排列。3和 3'手性中心在允許聚集體在HSA分子上形成手性自裝配體方面起決定作用。在不存在蛋 白的情況下，內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子由于缺乏手性區(qū)別而形成右手和左手性裝配體的程度 相等。如上述，在磷酸鹽緩沖液和Ringer溶液中測(cè)定的⑶曲線之間的光譜差異表明鹽 濃度對(duì)聚集體穩(wěn)定性的影響(圖9和圖10)。Ringer緩沖液的克分滲透壓濃度和離子強(qiáng)度 高于磷酸鹽緩沖液。琥珀酸部分在PH 7. 4下在兩種緩沖液中都發(fā)生離子化，在聚集體內(nèi)部 和聚集體之間均形成靜電排斥。帶正電的鹽離子能夠減少這種排斥，因而有助于在存在這 些陽離子的情況下增加聚集體的穩(wěn)定性和大小。在用超過1 1L/P比率的dAST滴定HSA 期間，同時(shí)形成手性和非手性聚集體；但是僅手性聚集體與HSA締合，而非手性聚集體則沒 有。在Ringer緩沖溶液中獲得的CD光譜(圖9)表明非手性聚集體由于鹽離子的掩蔽效 果而在這種較高克分滲透壓濃度緩沖液中得以更好穩(wěn)定。加入的配體分子優(yōu)先與存在的聚 集體締合，從而導(dǎo)致CD譜帶的振幅達(dá)到平臺(tái)，并變得恒定，與磷酸鹽緩沖液形成對(duì)照。加入dAST后HSA的熒光猝滅位于亞結(jié)構(gòu)域IIA深處的單一色氨酸殘基(Trp214)在很大程度上負(fù)責(zé)HSA的固 有熒光。HSA的熒光發(fā)射譜與內(nèi)消旋類胡蘿卜素的吸收光譜重疊。因此，在將在DMSO中的 dAST增量加入到HSA的溶液之后獲得熒光光譜學(xué)測(cè)定。結(jié)果清楚地表明內(nèi)消旋-類胡蘿卜 素分子能夠有效地猝滅HSA的固有熒光(圖12)。用于制備dAST的儲(chǔ)備溶液的DMSO對(duì)固 有HAS熒光的影響可以忽略(圖12)。在0.7的L/P比率下，基線熒光強(qiáng)度減小50%。所 觀察到的現(xiàn)象表明內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子結(jié)合在Trp214的附近，其在HSA的兩個(gè)主要結(jié)合 腔中的一個(gè)中形成壁的一部分(位點(diǎn)I，亞結(jié)構(gòu)域IIA;圖13)。但是，位點(diǎn)I和位點(diǎn)11(亞 結(jié)構(gòu)域IIIA)-都為疏水脂肪酸結(jié)合通道-都不能夠容納長(zhǎng)的、剛性dAST分子(圖13)?；?于結(jié)構(gòu)類似性，第二種可能性是dAST與HSA的其它長(zhǎng)鏈(C18、C20)脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合， 所述位點(diǎn)已用高分辨率χ-射線結(jié)晶學(xué)進(jìn)行充分地表征。在不具有龐大的末端基團(tuán)的較短 開放鏈類胡蘿卜素的情況下，這種可能性是可能的。但是，內(nèi)消旋類胡蘿卜素衍生物本身的 多烯鏈測(cè)量為28A (在3和3'手性碳原子之間)。盡管它們的構(gòu)象可動(dòng)性，琥珀酸部分需 要額外的空間，將分子的有效長(zhǎng)度增加至48A。仔細(xì)地檢查HSA的晶體結(jié)構(gòu)表明，結(jié)構(gòu)域I 和III之間的長(zhǎng)、窄裂隙可能適于結(jié)合內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子(圖13)。域間裂隙是寬的， 且它的窄端靠近色氨酸(Trp214 ；*在圖13上)殘基，這為在內(nèi)消旋類胡蘿卜素分子與HSA 的域間裂隙結(jié)合時(shí)觀察到的熒光猝滅提供結(jié)構(gòu)解釋。而且，可以推斷，附加的dAST分子與 域間裂隙中的單一一個(gè)分子的締合誘導(dǎo)HSA顯著的構(gòu)象變化，導(dǎo)致中央裂縫變寬。這可能 是熒光猝滅不停止于L/P = 1比率，而隨CEs增加繼續(xù)強(qiáng)化的原因(圖13)。討論UV/Vis和CD光譜學(xué)結(jié)果作為從水性環(huán)境被排斥和分子間氫鍵鍵 合的結(jié)果，合成的非手性內(nèi)消旋蝦青素的 二鈉鹽二琥珀酸酯衍生物在水性緩沖液中形成無旋光活性的card-pack類型的聚集體，這 通過相對(duì)于在乙醇溶液中觀察到的譜帶來說主要可見吸收譜帶的大藍(lán)色位移來表明。在存 在過量的不含脂肪酸的HSA的情況下，內(nèi)消旋類胡蘿卜素似乎優(yōu)先以單體方式與HSA締合。 這些結(jié)果表明，允許在水溶液中發(fā)生超分子裝配的弱范德華力和氫鍵鍵合在生物相關(guān)環(huán)境中將被迅速克服。在體內(nèi)人血中的白蛋白濃度為大約0. 6mM，表明在多至500mg的劑量下，內(nèi)消旋類胡蘿卜素(分子量841Da)將以單體方式與白蛋白締合(排除與循環(huán)血細(xì)胞和脂 蛋白的額外的潛在非特異性結(jié)合，這會(huì)增加潛在非聚集劑量)。結(jié)合的內(nèi)消旋類胡蘿卜素分 子表現(xiàn)出誘導(dǎo)的CD譜帶，這種譜帶用共軛體系的右手性螺旋構(gòu)象充分解釋。在增加濃度的 dAST存在下HSA的分級(jí)熒光猝滅強(qiáng)化了這樣的觀點(diǎn)類胡蘿卜素-白蛋白復(fù)合體的形成負(fù) 責(zé)這種猝滅，并表明結(jié)合的配體和HSA的色氨酸214殘基之間的空間鄰近?；诠庾V數(shù)據(jù)、dAST分子的分子長(zhǎng)度和充分表征的HSA的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點(diǎn)暫 定地指定于位于結(jié)構(gòu)域I和III之間的域間裂隙。在高于1 1L/P比率的內(nèi)消旋類胡蘿卜素和HSA的⑶光譜中似乎存在正-負(fù)譜 帶對(duì)。這種發(fā)現(xiàn)歸因于以右手性裝配排列的內(nèi)消旋類胡蘿卜素多烯鏈之間的分子間手性激 子偶合。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明HSA用作一種手性模板，在該模板上自裝配開始，然后繼續(xù)，受內(nèi)消 旋類胡蘿卜素分子的末端基團(tuán)的手性來支配。在PH 7. 4磷酸鹽緩沖液和Ringer溶液中得 到的bisignate CD光譜之間的差異表明，自裝配受溶液的克分滲透壓濃度和離子強(qiáng)度影 響。隨著克分滲透壓濃度增加，聚集體的穩(wěn)定性提高，推測(cè)起來是由于鹽陽離子對(duì)帶負(fù)電的 琥珀酸羧酸官能團(tuán)的靜電屏蔽。本發(fā)明的不同方面的進(jìn)一步修改和可替代選擇的實(shí)施方案考慮本說明書對(duì)本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，應(yīng)將本說明書理解為僅是例示性的，其目的是教導(dǎo)本 領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的一般方式。應(yīng)該理解，應(yīng)將本文所示和所述的本發(fā)明的形式理 解為目前優(yōu)選的實(shí)施方案?？梢蕴娲疚睦竞兔枋龅脑睾筒牧?，部分和過程可以顛倒， 且本發(fā)明的某些特征可以獨(dú)立地利用，所有這些對(duì)已從本發(fā)明的描述中獲益的本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的?？梢栽诓槐畴x以下權(quán)利要求所述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下 改變本文所述的要素。
權(quán)利要求
具有以下結(jié)構(gòu)的化合物其中各個(gè)Y獨(dú)立地為O或H2；各個(gè)R為R1；各個(gè)R1獨(dú)立地為-烷基-NR23+、-烷基-NR22、-氨基酸-NH3+或-氨基酸-NH2；并且各個(gè)R2獨(dú)立地為H、烷基或芳基。FSA00000093394300011.tif
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R為-氨基酸-NH3+。
3.權(quán)禾Ij要求1的化合物，其中R為-CH(NH2)CH2CH2CH2CH2NH2 或-CH (NH3) +CH2CH2CH2CH2NH3+ο
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R為-烷基-NR23+。
5.權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)
6.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)中所述的化合物。
7.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)中所述的化合物在制備用于治療局部缺血-再灌注損傷的藥 物中的用途。
8.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)中所述的化合物在制備用于治療癌細(xì)胞和癌前細(xì)胞的藥物中 的用途。
9.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)中所述的化合物在制備用于治療肝臟疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制和改善疾病的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明還涉及該類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物的組合物和用途。本發(fā)明的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)類似物可用于抑制和/或改善與活性氧種類，活性氮種類，自由基和/或非自由基有關(guān)的疾病的發(fā)生，例如抑制和/或改善局部缺血-再灌注損傷、抑制和/或改善肝臟疾病以及抑制和/或改善癌癥。
文檔編號(hào)C07D233/60GK101845009SQ20101016571
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2003年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者D·G·沃塔馬爾, G·納多爾斯基, H·杰克遜, L·M·?？怂? S·F·洛克伍德, S·奧馬利 申請(qǐng)人:卡達(dá)克斯藥物公司