專利名稱：新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及皂苷類化合物分離、制備和應(yīng)用，具體涉及兩個(gè)新 的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷、制備方法及其在抗腫瘤藥物和治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)阿爾廷類(9，19-cycl0artane)化合物為羊毛留烷型四環(huán)三萜類化合物。近 幾十年來，發(fā)現(xiàn)了大量的環(huán)阿爾廷苷類。已分離得到的環(huán)阿爾廷類化合物主要來自植 物界，如豆科的紫云英屬(Astragalus)、毛莨科的升麻屬(Cimicifugeae)和唐松草屬 (Thalictrum)、鐵角蕨科的過山蕨屬(Comptosorus)等。環(huán)阿爾廷類化合物是中藥升麻和黃芪的主要成分。近年來的研究表明其有多方面 的藥理活性。文獻(xiàn)報(bào)道Astragalus oleifolius具有止汗、利尿的作用，并對(duì)腎炎、糖尿病、 白血病、子宮癌有療效；Astragalus spinous在埃及的民間用來治療高血壓、白血病和子宮 癌；Mussaenda pubescens具有抗咽炎、急性腸胃炎、痢疾和引產(chǎn)的作用；有學(xué)者利用現(xiàn)代 藥理手段證明了 Curculigo orchiodes禾口 Astragalus verrucosus的提取物分別具有免疫 增強(qiáng)作用和免疫調(diào)節(jié)作用；從Amberboa ramosa分離的環(huán)阿爾廷具有細(xì)胞毒活性；而有人 認(rèn)為Astragalus的各種植物都具有細(xì)胞毒活性?？傊壳皥?bào)道主要集中在富含環(huán)阿爾廷 單萜的植物總提取物活性研究上，而對(duì)單體化合物的研究較少，限制了這類成分在新藥研 發(fā)中的應(yīng)用。分離新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷，并充分的研究這類天然產(chǎn)物的藥理活性，也是本 領(lǐng)域技術(shù)人員正在努力的方向。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)鐵角蕨科過山蕨屬植物富含環(huán)阿爾 廷型三萜皂苷，綜合利用多種分離和鑒定手段從過山蕨中分離制備、鑒定了新的環(huán)阿爾廷 三萜皂苷類化合物并檢測(cè)其抗腫瘤活性和醛糖還原酶抑制活性，在現(xiàn)有技術(shù)中還未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了兩個(gè)新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了兩個(gè)新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷，具有如下結(jié)構(gòu)
4 本發(fā)明提供了新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，通過以下三種方法中任意一 種制備得到，方法一(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，減 壓回收提取液至醇濃度低于5%，離心后取上清液；(2)上清液經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，得到 30% -90%醇洗脫部位；(3)步驟(2)所得醇洗物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙 醇一些有機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到新環(huán)阿爾廷型三萜皂苷1和2 ；方法二(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，減 壓回收提取液至醇濃度低于5%，提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，收集得到 乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，得到 30% -90%醇洗脫流分；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一 些有機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫，得化合物2 ；(4)上述步驟(2)醇洗脫物，經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到化合物1 ；方法三(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，減 壓回收提取液至醇濃度低于5%，提取液用乙酸乙酯萃取，回收溶劑，收集得到乙酸乙酯萃 取物和剩余水層；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水層經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度 洗脫，得到30% -90%醇洗脫流分；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫，得化合物2 ；(4)上述步驟(2)醇洗脫物，經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到化合物1。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，所述方法一和方法二中的步 驟(2)的醇為乙醇，其梯度洗脫濃度為30% -90%。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，所述方法一中的步驟(3)為 醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為9 1 6 4的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙 醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常規(guī) 有機(jī)溶劑，混合比例8 2 6 4的流分含有目標(biāo)化合物。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，所述方法二和方法三中的步 驟(3)為乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為1 12 3 7的氯仿或二氯 甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙 酸乙酯一些常規(guī)有機(jī)溶劑，混合比例9 1 8 2的流分中得到化合物2。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，所述方法一中的步驟(4)為 步驟(3)洗脫流分經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水， 從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 5 1、乙腈/水混合溶劑比例為1 10 5 1、甲 醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 10 5 5 2的流分中得到化合物1和2。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，所述方法二和方法三中的步 驟(4)為步驟(2)中所得醇洗脫物經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/水、乙腈/水或 甲醇/乙腈/7jC，從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 5 1、乙腈/水混合溶劑比例為 1 10 5 1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 10 5 5 2的流分中得到 化合物1。本發(fā)明提供的新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷化合物1和2有抗腫瘤和醛糖還原酶抑制 活性，可用于抗腫瘤和治療糖尿病藥物的開發(fā)和應(yīng)用。


圖1為實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)流程圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例1(1)干燥過山蕨全草10kg經(jīng)70%乙醇回流提取三次，每次2小時(shí)，減壓回收提取 液至醇濃度低于3%，離心后取上清液；(2)上清液經(jīng)HPD100大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和30 %乙醇、60 %乙醇和 90%乙醇梯度洗脫；(3)步驟(2)所得60%乙醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿甲醇10 1， 8 1,6 1,4 1,2 1 梯度洗脫；(4)上述步驟(3)中所得氯仿甲醇4 1流分經(jīng)半制備HPLC色譜分離，以70% 甲醇/水為流動(dòng)相洗脫，得到新化合物1 ；氯仿甲醇8 1流分經(jīng)半制備HPLC色譜分離，以80%甲醇/水為流動(dòng)相洗脫，得到新化合物2。實(shí)施例2 (1)干燥過山蕨地上部分以75%乙醇為溶劑，經(jīng)閃式提取技術(shù)提取，減壓回收提 取液至醇濃度低于5%，提取液分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑， 收集得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物經(jīng)D101非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和70%乙醇、 90%乙醇梯度洗脫；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿丙酮8 1，6 1,4 1， 3 2梯度洗脫，氯仿丙酮6 1流分得化合物2;(4)上述步驟(2) 70%醇洗脫物，經(jīng)制備型HPLC色譜分離，以40%乙腈/水為流動(dòng) 相洗脫，得到化合物1。實(shí)施例3:(1)新鮮過山蕨全草經(jīng)90%乙醇冷浸提取，低溫減壓回收提取液至醇濃度低于 5%，提取液分別用環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑，收集得到環(huán)己烷萃取物、氯仿萃 取物、乙酸乙酯萃取物；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水層經(jīng)AB-8非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水、 20%乙醇、60%乙醇和90%乙醇梯度洗脫；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以乙酸乙酯甲醇20 1,15 1， 10 1,8 1,4 1梯度洗脫，10 1洗脫部分得化合物2;(4)上述步驟(2)60%醇洗脫物，經(jīng)半制備型HPLC色譜分離，以65%甲醇/水洗 脫，得到化合物1。實(shí)施例4化合物1和2的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞的培養(yǎng)HL-60細(xì)胞株，Dul45細(xì)胞株，Colon205細(xì)胞株的培養(yǎng)條件均為RMPI 1640培養(yǎng)液， 10%胎牛血清，MCF-7細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為低糖DMEM培養(yǎng)液10%胎牛血清，HepG2細(xì)胞株 的培養(yǎng)條件為高糖DMEM培養(yǎng)液10%胎牛血清，A549細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為RMPI 1640培養(yǎng) 液，10%小牛血清。以上細(xì)胞株均培養(yǎng)于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中。2.藥物的配制將所測(cè)定的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷(1和2)配成濃度為50mmol/L的母液，儲(chǔ)存 于-20 °C。細(xì)胞株使用無血清的RMPI 1640培養(yǎng)液將藥物的母液稀釋成lOOOumol/L， 500umol/L, 100umol/L, 10umol/L,每孔加入 10uL,使得藥物的終濃度為 100umol/L, 50umol/L,10umol/L,lumol/L。3. MTT 實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞密度至1. 0 1. 5X 105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中每孔100ul，培養(yǎng)24h后 加入上述各濃度藥物，每孔10ul。每濃度為6個(gè)復(fù)孔。孵育72h后，每孔加入lOuLMTT，在 培養(yǎng)箱中孵育4h后，進(jìn)行檢測(cè)。將上清液吸出，加入lOOulDMSO，振蕩均勻后，于酶標(biāo)儀上 492nm處測(cè)得0D值。
細(xì)胞成活率％=給藥組0D值的平均值/空白乳組0D值的平均值X 100%4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS(13. 0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用i士S表示。5.每種藥物針對(duì)三種細(xì)胞的篩選要重復(fù)三次。表1化合物1和2的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)施例5化合物1和2醛糖還原酶抑制活性測(cè)試采用醛糖還原酶抑制劑(ARI)篩選模型，對(duì)化合物1和2進(jìn)行了醛糖還原酶抑制 活性測(cè)試。(1)實(shí)驗(yàn)材料醛糖還原酶從大鼠眼睛晶狀體中獲得。180mM Na_K 磷酸鹽緩沖液；DMS0 ；0. 5N HC1 ； 10mM DL-glyceraldehyde ；0. 3mM
NADPH ；1. OM Li2S04。(2)檢量限制作A 180mM Na-K 磷酸鹽緩沖液24501B 1. OM Li2S047001C lOmM DL-glyceraldehyde700LD稀釋后的醛糖還原酶1400LE DMSO350LF 0. 5N HC12100LG 0. 3mM NADPH700LA-G液混合，分注于12支試管，600L/支，兩支平行一組。每支分別加不同濃度的 NADP 501 ；再分別加入5001含有6N NaOH的10mM imidazole溶液；60°C加熱20min，放至 室溫，分別注入96孔平板，進(jìn)行熒光測(cè)定。(3)實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示A 180mM Na-K 磷酸鹽緩沖液2251B 1. 0M Li2S04501C lOmM DL-glyceraldehyde (樣品組平行 2) 50LH20 (空白組)50LD 稀釋后的醛糖還原酶100LE 樣品(樣品組和空白組各)251實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2表2化合物1和2的醛糖還原酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷，其特征在于，其具有如下結(jié)構(gòu)。FSA00000101682600011.tif
2.如權(quán)利要求1所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，減壓回 收提取液至醇濃度低于5%，離心后取上清液；(2)上清液經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，得到30%-90%醇 洗脫部位；(3)步驟(2)所得醇洗物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一 些有機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫；(4)上述步驟⑶中所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/7K，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到新環(huán)阿爾廷型三萜皂苷1和2。
3.如權(quán)利要求1所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，減壓回 收提取液至醇濃度低于5%，乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，收集得到乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，得到 30% -90%醇洗脫流分；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有 機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫，得化合物2 ；(4)上述步驟(2)醇洗脫物，經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到化合物1。
4.如權(quán)利要求1所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于(1)過山蕨經(jīng)閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，減壓 回收提取液至醇濃度低于5%，提取液分別用石油醚或環(huán)己烷、氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯 萃取，回收溶劑，收集得到石油醚或環(huán)己烷萃取物、氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取 物；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水層經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，得到30%-90%醇洗脫流分；(3)乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有 機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫，得化合物2 ；(4)上述步驟(2)醇洗脫物，經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/7K，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相洗脫，得到化合物1。
5.按照權(quán)利要求2或3所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述 步驟(2)的醇為乙醇，其梯度洗脫濃度為30% -90%。
6.按照權(quán)利要求2所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(3)為醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為9 1 6 4的氯仿或二氯甲烷/甲醇 或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯，混合 比例82 64的流分含有目標(biāo)化合物。
7.按照權(quán)利要求3或4所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述 步驟(3)為乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜法分離，洗脫溶劑為1 12 3 7的氯仿或二 氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/ 乙酸乙酯，混合比例9 1 8 2的流分中得到化合物2。
8.按照權(quán)利要求2所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(4)為步驟(3)洗脫流分經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/ 水，從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 5 1、乙腈/水混合溶劑比例為1 10 5 1、 甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 10 5 5 2的流分中得到化合物1和2。
9.按照權(quán)利要求3或4所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述 步驟(4)為步驟(2)中所得醇洗脫物經(jīng)高效液相色譜分離，流動(dòng)相為甲醇/水、乙腈/水 或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1 5 5 1、乙腈/水混合溶劑比例為 1 10 5 1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1 1 10 5 5 2的流分中得到 化合物1。
10.權(quán)利要求1所述新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷化合物1和2在制備抗腫瘤和醛糖還原 酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及兩個(gè)新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷制備方法及其應(yīng)用；兩個(gè)新的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷，具有如下結(jié)構(gòu)該兩個(gè)環(huán)阿爾廷型三萜皂苷化合物1和2有抗腫瘤和醛糖還原酶抑制活性，可用于抗腫瘤和治療糖尿病藥物的開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07J53/00GK101851266SQ20101016404
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者孟大利, 李寧, 李銑, 肖皖 申請(qǐng)人:沈陽藥科大學(xué)