專利名稱：液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用液-固萃取體系從血液中分離純化血清白蛋白的方法，更具體地說是涉及用液-固萃取體系從人血漿或牛血漿中純化血清白蛋白的方法。更具體地說， 是通過分子識別機理，用聚乙二醇(PEG) 二元脂肪酸修飾物混合聚合物-鹽-水液-固親 和萃取法從血液中提取血清白蛋白。
背景技術：
血清白蛋白是一種水溶性很強的蛋白，結構穩(wěn)定，能結合多種小分子，在醫(yī)學臨床 及生物領域有著廣泛的應用。蛋白質的分離純化原理主要基于溶解度差異、電荷差異、分子 大小、疏水作用、生物親和差異來達到分離的。作為生物分子，蛋白質的分離純化與其它化 學產品的分離有很大的差異通常完成一次產品的純化需要好幾種方法結合使用，一般分 為前處理、粗分離、細分離和結晶四個步驟。隨著人類對蛋白質認識的深入，分離純化方法 也一直在改進，當今純化研究的重點在提高純度、回收率，降低成本、減少繁冗的操作時間 和步驟。目前，血清白蛋白的分離純化方法有很多種，各自都具有一定的特點，歸納起來主 要有以下方法1、利用溶解度差異分離純化血清白蛋白沉淀法是一種初級分離技術，但是，多步操作也可以獲得高純度的目標產品。(1)鹽沉淀法蛋白質在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，采用添加中性鹽的 方法使各種蛋白質依次分別沉淀出來的方法，叫鹽析法，比如硫酸銨、利凡諾、辛酸鹽沉淀 法。但是鹽析法可能產生蛋白質聚合體或蛋白質變性，影響藥用效果，自動化程度低、生產 周期長、成本高、純化倍數低。因此，在目前的實際應用中受到一定的限制。(2)有機溶劑沉淀法向蛋白質溶液中加入乙醇等水溶性溶劑之后，水的活度降低，利用有機溶劑較低 的介電常數來沉淀白蛋白。最常用的是冷乙醇沉淀法，即著名的Cohn法。雖然廣泛應用于 工業(yè)生產，但乙醇沉淀法也有一些不足乙醇是一種非特異性沉淀劑，盡管對人血清白蛋白 HSA生產效果顯著，但產品純度不是很高；作為有機溶劑的乙醇還可能使蛋白質發(fā)生聚集 變性或者二級構象改變；生產不易實現自動化，生產周期長；在非封閉式的環(huán)境中有機溶 劑對工作人員危害也較大，同時也有可能由于環(huán)境不潔造成產品污染。(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法PEG沉淀的條件溫和，可以避免蛋白質聚集或變性，而且沉淀完全，但大量PEG價 格較貴，從白蛋白溶液中除去在工業(yè)生產上需較大成本。Μ. I. Jimenez等人將聚乙二醇和乙 醇結合來純化血清白蛋白，分離迅速，并達到了實驗室中等分離規(guī)模。但又用到了有機溶劑乙醇。2、利用電荷差異分離純化血清白蛋白
(1)離子交換色譜這是迄今利用較廣泛的色譜技術，在純化中占了 75%。因為它具有分辨率高，交換 容量大以及明確的作用機理等特點。在白蛋白的分離純化上有很重要的作用。但色譜柱的 再生、保存、使用步驟煩瑣，以及容易出現柱阻塞等問題，限制了它的進一步使用。(2)電泳法電泳分離的原理和操作形式多樣，經過幾十年的發(fā)展，成為分離純化，特別是鑒定 蛋白質的有力工具，現在正向綜合方向發(fā)展。尹開吉等利用壓力驅動的毛細管等電聚焦分 離牛血清白蛋白和血紅蛋白，得到了理想的分離結果，且操作簡單。K. A. Denton等用中性涂 布的高效毛細管分離臨床用HSA，得到了八種組分峰。但是電泳法分離純化蛋白質的量很 少，不屬制備范疇，無法滿足制備需求，且電泳過程中產生的熱量可能導致蛋白質變性，并 且成本也很高。3、利用分子大小差異(1)凝膠層析法這是20世紀60年代初發(fā)展起來的一種簡單有效的技術。利用凝膠分子篩對大 小、形狀不同的蛋白進行分離。分子大小相差25%的樣品，通過單一的凝膠就可以完全分 開。應用于提純蛋白質、激素、核酸等。同時還可以進行脫鹽、濃縮、脫色、去熱原。具有分 離效果好、操作簡單方便、分離廣泛及不影響生物活性的特點。但是分辨率不高，分離操作 較慢，對于質量差異不大的樣品難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品黏度不宜太 高。凝膠顆粒有時還有非特異性的吸附現象。(2)離心法離心法具有可以迅速將沉淀和上清液分開、應用范圍廣，成本低等特點，但無法獲 得純度很高的產品。并且受樣品濃度影響，離心力過大常會導致樣品顆粒變性、聚集而失 活。4、利用特殊選擇性分離純化血清白蛋白楊利等用IDA型固定化鎳離子金屬螯合親和膜色譜對HSA分離純化，產品經毛細 管電泳分析，純度與Sigma公司的電泳純HSA相當，回收率可達85%以上。Sinan Akgol等用苯乙二醇二聚異丁烯酸和二羥乙基異丁烯在水分散介質里通過 基團懸浮聚合得聚合物珠，從人血漿中吸附HSA量，為95. 7mg. g_l，純度為88%，珠可重復 使用未見吸附容量顯著減少。隨著材料科學的發(fā)展，納米技術，膜技術等現代化的材料與蛋白質生物親和性結 合，正在成為未來分離純化發(fā)展的一個新興方向。5、萃取法利用溶質在互不相溶的兩相之間分配系數的不同而使溶質得到純化或濃縮的方 法稱為萃取。用于血清白蛋白萃取的方法主要有反膠團萃取法、雙水相萃取法等。(1)反膠團萃取法比如Tianxi Zhang等用游離的Cibacron Blue 3GA組成的反膠團萃取BSA。 Gordon C. Kresheck等加熱含有乙酸二甲次膦酸氧化物和蛋白質的水溶液形成雙水相并分 離BSA。李詳村等用CATB (十六烷基三甲基溴化銨)/異辛烷/正戊醇反膠團萃取法純化 BSA等，但此法始終處于基礎研究階段，工業(yè)運用還有很多問題，無制備級研究報道。
(2)雙水相萃取法從1955年Albertson發(fā)明雙水相體系到1979年德國人kula等人將雙水相萃取 技術應用于生物產品分離，目前已經成功的應用于蛋白質、核酸、病毒等生物產品的分離純 化，雙水相體系也成功的應用到生物轉化以及生物分析中。近年來，雙水相萃取技術的分離 對象進一步擴大到抗生素、多肽、氨基酸、重金屬和植物有效成分中的小分子物質。雙水相 技術應用于血清白蛋白分離純化的報道較多，比如鄧凡政等用四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪 唑([Bmim]BF4)和KH2PO4形成的離子液體雙水相體系萃取分離BSA。在最佳條件下離子液體 雙水相體系對BSA有較高的正向萃取率。童愛軍等利用陰陽離子型表面活性劑雙水相萃取 色氨酸衍生物和牛血清白蛋白。Graham Ε. McCreath等人在乳劑親和血清白蛋白分離上也 取得了一定的成果。雙水相萃取成為新興生物技術產業(yè)研究的熱點，主要是該技術對于生 物物質的分離和純化表現出特有的優(yōu)點和獨有的技術優(yōu)勢雙水相萃取體系萃取蛋白也存 在明顯的不足，選擇性不高，只能作為蛋白質的粗分離和蛋白質的濃縮，成相鹽(如聚乙二 醇或葡聚糖)價格昂貴，成本較高，工業(yè)化困難。對于雙水相萃取體系由于兩相密度相近， 相系粘度很大，導致相分離困難，需借助離心操作，另外，由于高聚物的性質，生物大分子在 兩相界面存在較強的吸附及乳化作用，導致蛋白質的兩相滯留。人血清白蛋白(Human serum albumin HSA)是人血漿中最豐富的蛋白質，血漿中 血清白蛋白含量約占總血漿蛋白質含量的60%，血清白蛋白在人體內具有重要的作用，是 迄今為止用量最大的蛋白質藥物，HSA的純化非常關鍵。目前市場上銷售的HAS或牛血清 白蛋白(BSA)商品均由血漿純化而得。由于生物分子的特殊柔性、安全要求以及對分離條 件要求很高，使適用于化工領域的技術無法應用于血清白蛋白分離純化。同時，由于生物制 品的分離純化成本大約占其總成本的60-90%，因此需要選擇可靠、安全、低成本的人血清 白蛋白分離純化方法。近年許多實驗室和公司已陸續(xù)嘗試通過遺傳工程方法獲取HSA，但是 也遇到了同樣的分離純化難題。作為藥物制品的HSA，不論怎樣制備，它自身的特點和用途 都決定了純化的復雜性。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，用該方法 純化可得到高純度、結構未變、未聚合的血清白蛋白，并將通常需進行的血漿前處理、粗分 離、細分離一步完成。本發(fā)明的技術方案為液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，按以下步驟進行(1)、液-固萃取體 系形成將長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無機鹽形成液-固萃取體 系，并且液_固萃取體系中無機鹽的濃度為0. 5-3. 5mol ·廠1，聚合物吐溫80的質量濃度為 3 20%，長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物的濃度為0. 2 3. Omg ^mr1，調節(jié)pH 3. 5-9. 5 ； (2)、在上述液-固萃取體系中加入血樣，置于電動震蕩機上平置振蕩2-10分鐘，優(yōu)選4-6 分鐘，取下倒置10-20分鐘，優(yōu)選12-16分鐘，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白 被萃入固相；(3)、將第(2)步的固相加蒸餾水溶解后，使體系酸度在pH 3-9范圍內，并加入 無機鹽使體系的無機鹽濃度達到0. 5-3. 5mol · L—1，置于電動震蕩機上平置振蕩2_10分鐘， 優(yōu)選4-6分鐘，取下倒置10-20分鐘，優(yōu)選12-16分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、將第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行 透析，將留在透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。所述的長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物為碳十二長鏈二元脂肪酸聚乙二醇、碳 十四長鏈二元脂肪酸聚乙二醇或碳十六長鏈二元脂肪酸聚乙二醇。所述的無機鹽為磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸銨或檸檬酸鈉。本發(fā)明利用長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物_無機鹽_水 液-固萃取體系直接對牛血漿、人血漿中血清白蛋白進行選擇性萃取，經過一次正萃，一次 反萃和透析、凍干后即可得到純度大于98%的血清白蛋白干粉。通過實驗證明，采用該體系 能夠獲得理想的固相收得率和反萃取率，而且操作簡單，全血漿樣品經過一次正萃，一次反 萃，透析后即可獲得較為滿意的純度，為血清白蛋白SA的分離純化提供了一種簡易、快速、 成本低廉的方法。通過中科院查新檢索查閱國內外相關文獻，未見報道。在此體系中，經過優(yōu)化萃取條件，牛血清白蛋白、人血清白蛋白混合分配系數K (K =固相中血清白蛋白濃度液相中血清白蛋白濃度)均可達到1000 ；—次正相萃取固相收 得率R(R=萃取分相后固相血清白蛋白的量加入體系的血清白蛋白的總量)可達100%， 一次反萃取率也可達到100%。經高效液相色譜、SDS-PAGE凝膠電泳法驗證純度不低于美 國sigma公司所購試劑(98% )，并用熒光法檢驗蛋白構象與sigma公司產品一致，未發(fā)生 變化。本發(fā)明利用聚合物-鹽-水液_固萃取體系克服了雙水相技術和反膠團技術萃取 蛋白的缺陷，相系清晰，界面無乳化。與傳統(tǒng)有機溶劑液_液萃取體系比較，該體系不僅能 萃取電中性物質，還能萃取帶電荷的化合物，該體系不使用揮發(fā)性有機溶劑，無毒性，安全， 成相容易，分相操作不需特殊技術處理，成相后直接傾倒出液相即可，無需雙水相萃取中的 離心等操作，成相聚合物及鹽對生物活性物質有穩(wěn)定和保護作用，且不存在似雙水相萃取 中被萃物質滯留于相界面的問題，現用分子識別機理萃取分離選擇性好、消耗低，是易于規(guī) 模放大的分離新技術。


圖1標準HSA的XRD譜圖。圖2提取蛋白的XRD譜圖。圖 3SDS-PAGE 電泳圖。圖4為標準HSA和萃取HSA的熒光發(fā)射光譜圖。1_標準HSA，2_人血漿。圖5為SDS-PAGE凝膠電泳圖。圖6為粗血漿、標準品、萃取蛋白的SDS-PAGE圖。圖7為2mg. mL"1標準品蛋白HPCE圖。圖 8 為 2mg. ml/1 粗蛋白 HPCE 圖。圖9為2mg. ml/1萃取蛋白HPCE圖。圖10為標準白蛋白的HPLC圖。圖11為萃取白蛋白的HPLC圖。圖12為粗血漿的HPLC圖。圖13為10%全牛血清經萃取分離后透析袋中溶液(254nm)的HPLC圖。
圖14為萃取分離前的血樣10%的全牛血清(254nm)的HPLC圖。圖15為4mg/mL標準血清白蛋白(sigma分裝)(280nm)的HPLC圖。圖16為10%全牛血清經萃取分離后透析袋中溶液(280nm)的HPLC圖。圖17為C12PEG、C14PEG, C16PEG修飾物萃取率對比圖。
具體實施例方式實施例一碳十六長鏈二元脂肪酸聚乙二醇(C16PEG)修飾物混合吐溫80-磷酸 鉀_水液_固萃取體系分離純化HSA1.萃取方法依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 4克C16PEG修飾物、0. 8毫升吐溫80儲備液，6. 3克 磷酸鉀溶液于比色管中，PH在6. 5-9. 5范圍內，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩5 分鐘，混合均勻，靜置后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內，并加入6. O克磷酸鉀，置于電 動震蕩機上平置振蕩5分鐘，取下倒置20分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋 中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉38毫克。2.純度檢測1)XRD初步探究通過XRD將上述制得的血清白蛋白凍干粉末進行初步探究，從圖1，圖2可以看出， 提取得到的蛋白粉末與標準品的衍射峰個數一致，均為二個衍射峰，標準品[瓊脂糖凝膠 電泳法，98-99% (agarose gelelectrophoresis), lyophilized powder (Sigma)]。2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳檢測10%分離膠二次水 2mL，l. 5M ρΗ8· 8Tris_HCl 1. 25mL，30%雙丙烯酰胺 1. 65mL， 10% SDS(十二烷基硫酸鈉)50yL，10%過硫酸銨40yL，TEMED (四甲基二乙胺)5yL 5 % 濃縮膠(二次水 1. 37mL，0. 5ΜρΗ6· 8Tris-HCll. 12mL，30 % 雙丙烯酰胺 0. 5mL, 10 % SDS30 μ L, 10%過硫酸銨 20 μ L, TEMED2 μ L)。步驟1 將玻璃板、樣品梳、電泳槽用洗滌劑洗凈，用二次水沖洗數次，再用乙醇 擦拭晾干2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，裝好玻璃板3 按上述比例配制10%分 離膠5mL，混勻；向玻璃板間灌制分離膠，立即加入二次水覆蓋，大約20min后膠可聚合(視 溫度而定)4 按上述比例配制5%濃縮膠，混勻；5 將覆蓋水用濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入 樣品梳；6 待濃縮膠成膠后，拔掉梳子，點樣；7 裝好電泳系統(tǒng)，先將梳孔用電泳緩沖液加 滿，然后加入電泳緩沖液開始電泳。8 先從穩(wěn)流開始，電流每五分鐘調大5毫安，直到溴酚 藍前沿跑到分離膠與濃縮膠交界處，然后打到穩(wěn)壓100KV。溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電 泳，約需2-3小時左右；9.卸下膠板，剝離膠放入考馬斯亮藍染色液中，室溫染色10小時左 右；加入脫色液脫色，每20min更換一次脫色液(冰乙酸乙醇蒸餾水為1 4. 5 4. 5) 至完全脫凈，得到圖3。從左到右依次為人血漿樣品、標準品、萃取HSA。人血漿樣品濃度為 2mg. ι ΙΛ 標準品(sigma) lmg. mL—1，萃取蛋白 1. 5mg. πι Λ 點樣量均為 10 μ L。由圖3可知萃取蛋白與標準品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說 明經過此方法能選擇性地從人血漿中直接分離純化HSA。
3)熒光法檢測HSA蛋白活性在激發(fā)波長222nm下，得到發(fā)射波長在260-420nm范圍的標準HSA和本實施例一 萃取HSA熒光光譜圖4，白蛋白中色氨酸的殘基是三個能自然發(fā)出熒光的芳香氨基酸之一。 從圖4可以看出，萃取HSA和標準HSA的最大熒光強度波長一致，沒有明顯的峰值移動，說 明結構沒有改變，相關文獻報道如果結構改變，最大吸收波長會紅移或者藍移。實施例二 C16PEG修飾物混合吐溫80-檸檬酸鈉-水液-固萃取體系分離純化HSA1.萃取方法依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 6克C16PEG修飾物、0. 75毫升吐溫80儲備液，2. 8克 檸檬酸鈉溶液于比色管中，PH在4. 1-6. 2范圍內，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩 10分鐘，混合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用 蒸餾水將聚合物固相定容至10. OmL，使體系酸度在PH 3. 0-5. 2范圍內，并加入2. 4克檸檬 酸鈉，置于電動震蕩機上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和 鹽水液相，血清白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在 透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉6. 1毫克。2.純度檢測電泳實驗條件同磷酸鹽體系，從左到有分別為粗蛋白，標準品，萃取蛋白。由圖5 可知萃取蛋白與標準品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說明經過此體系同 樣能選擇性地從人血漿中直接分離純化HSA。實施例三C12PEG修飾物混合吐80-碳酸鉀鹽-水液-固萃取體系分離純化HSA依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 55克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲備液，1. 7克 碳酸鉀鹽溶液于比色管中，PH7. 0-8. 5，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩2分鐘，混 合均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內，并加入1. 7克碳酸鉀鹽，置于電 動震蕩機上平置振蕩2分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋 中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉5. 8毫克。一次正萃固相收得率可達80%以上，一次反萃取率大于50%。實施例四C12PEG修 飾物混合吐溫80-檸檬酸鈉-水液-固萃取體系分離純化HSA依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 4克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲備液，2. 4克 檸檬酸鈉溶液于比色管中，PH4. 0-6. 0加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩5分鐘，混 合均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內，并加入2. 2克檸檬酸鈉，置于 電動震蕩機上平置振蕩5分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血 清白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析 袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉6. 2毫克。一次正萃固相收得率可達60%以上，一次反萃取率可達55%。以下是對牛血清白蛋白的萃取實施例 實施例五C16PEG修飾物混合吐溫80-磷酸鈉-水液-固萃取體系分離純化BSA
1.萃取方法
依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 64克C16PEG修飾物、1. 1毫升吐溫80儲備液，4. 4克 磷酸鈉溶液于比色管中，PH4. 8-8. 1，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩5分鐘，混合 均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚合 物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內，并加入4. O克磷酸鈉，置于電動 震蕩機上平置振蕩5分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白 蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋中 的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉28毫克。在最佳條件下，一次正相萃取率可達100% ；—次反萃取率可達70%。2.純度檢測1) SDS-PAGE 的檢測電泳條件同前，粗牛血漿濃度為5mg. mL—1，BSA標準品濃度為lmg. mL—1，萃取蛋白濃 度為1. 5mg. mL—1，點樣量均為8 μ L，從左到有分別為粗蛋白，標準品，萃取蛋白。由圖6可知萃取蛋白與標準品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說 明經過此體系也能選擇性地從牛血漿中直接分離純化BSA。2)高效毛細管電泳HPCE的檢測配制BSA標準品2mg. mL—1，新生牛血漿2mg. mL—1，萃取所得的BSA2mg. mL—1，利用 毛細管電泳進行蛋白純度檢測，進樣前樣品用0.22um微孔濾膜過濾。毛細管有效長度 50mmX 75um，采用壓力進樣，先用0. Imol · L-1NaOH溶液沖洗3min，再依次用二次蒸餾水， 20mmol · pH = 9. 1的硼酸鈉緩沖溶液，二次蒸餾水各沖洗5min. 2次實驗間隔中用 0. Imol · IZ1NaOH 溶液沖洗 3min。分別用20mmol · Λ 30mmol · Λ 40mmol .L—1 的硼酸鈉(pH = 9. 1)做背景緩沖液， 用毛細管電泳對5mg · πιΓ1新生牛血漿白蛋白檢測，進樣壓力為2psi，進樣時間為20sec， 20°C下用5kV的分離電壓，檢測波長為191nm。研究表明20mmol · Γ1硼酸鈉緩沖液對蛋白 具有較好的分離，因此選擇20mmol · L—1硼酸鈉緩沖溶液做背景緩沖液。分別試驗分離電壓15KV，10KV, 5KV，背景緩沖液，20mmol · L—1，pH = 9. 1進樣壓力 為2psi，進樣時間為20sec，20°C下檢測波長為191nm。當分離電壓為5、10、15KV時，萃取蛋 白與標樣蛋白均比血漿所得電泳峰少，初步說明血漿經過萃取得到了提純的蛋白，電壓越 大，樣品出峰時間越早，但分離效果較差，故選用5KV進樣壓力為lpsi，進樣時間為lOsec。背景緩沖液，20mmol -^,pH = 9. 1硼砂緩 沖液，20°C下檢測波長為191nm，分離電壓5KV。得圖5-8，5-9，5-10。從圖7、圖8、圖9可以看出通過HPCE檢測，粗蛋白和萃取蛋白、標準品有明顯的差 異，經過提取的蛋白得到了純化。因sigma公司制品是結晶后產品，單位體積濃度比我們的 凍干粉略大，這一點從電泳圖的響應上也可看出。實施例六C16PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨鹽-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. O毫升BSA溶液、0. 4克C16PEG修飾物、1. 2毫升吐溫80儲備液，2. 2克 硫酸銨溶液于比色管中，PH 3. 3-5. 8，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩8分鐘，混 合均勻，靜置12分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH2. 5-4. 5范圍內，并加入2. O克硫酸銨，置于電動震蕩機上平置振蕩8分鐘，取下倒置12分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血 清白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋中的 大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉12毫克。在最佳條件下，一次正萃取率可達100% ；—次反萃取率可達70%。2.純度檢測HPLC純度檢測色譜條件流動相A :pH = 5. 0,0. 2M的磷酸二氫鈉緩沖液；流動相B :40%乙腈水 溶液。檢測波長280nm ；柱溫30°C ；流速Iml · mirT1 ；HatichiDL7000高效液相色譜儀，單 泵四流路，二極管陣列紫外檢測器。反相C18柱，25cm*4. 6mm。洗脫方式0minl00 % pH = 5. 0,0. 2M的磷酸二氫鈉緩沖液(A)線形梯度-IOminlOO% 40%乙腈水溶液(B)洗脫，維持 2min,從100% B線形梯度-IOmin再回到100% A。(緩沖液經過0. 45 μ m的纖維微孔濾膜 過濾脫氣)HSA標準品，萃取HSA，牛血漿樣品配置成一定濃度的溶液，經過0. 22 μ m的微孔 濾膜過濾后進樣。標準白蛋白，萃取白蛋白，血漿濃度均為4mg. ml/1進樣量為10yL。從圖10、圖11、圖12可看出，同濃度的萃取蛋白和標準蛋白響應基本是粗血漿中 的一倍，說明此體系也能純化BSA。通過HPLC對萃取BSA進行了初步的純度檢測，確知經 過萃取BSA與標準品成分基本一致，與粗蛋白相比，主要成分響應也明顯提高。在實際應用 中，選擇合適的鹽對高效分離蛋白，節(jié)約成本有重要的意義。實施例七C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨鹽-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 3克C12PEG修飾物、1. 1毫升吐溫80儲備液，2. 5克 硫酸銨溶液于比色管中，加水定容到10. OmL,PH 3. 1-6. 2，在電動震蕩機中振蕩10分鐘，混 合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內，并加入2. 2克硫酸銨，置于電動 震蕩機上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋中的大 分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉9. 7毫克。在最佳條件下，一次正相萃取率可達70% ；—次反萃取率可達91. 69%。2.純度檢測HPLC純度檢測利用硫酸銨萃取體系最佳條件對牛血清樣品進行一次正萃，一次反萃，將反萃后 液相透析，透析液進行HPLC分析。由中國農科院油料作物研究所張聞老師測試的HPLC結 果如圖13、圖14所示。從圖13、圖14兩圖的對比中不難看出，在同樣測定條件下萃取分離前血樣譜圖 中吸收峰很多，且分離效能很低，萃取分離后透析袋中的血樣吸收峰明顯減少，保留時間為 5.076的組分峰高(46mAU)比血樣中相應保留時間組分(5. 134)峰高(6mAU)高出約7_8 倍，可是反萃后液相血清濃度大約比圖15的10%血清低20倍，不考慮透析過程中的稀釋， 可明顯看出有組分被提純。這說明，通過本課題所選用的C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨-水液-固萃取 體系一次正萃，一次反萃，透析后能夠使血樣純化。
從圖15、圖16兩圖可以看出，萃取分離后的透析袋中血樣譜圖與標準BSA(98%， sigimaCo.)的譜圖在同樣測定條件下，所出峰的個數相近，白蛋白是一類結構和功能相近 的蛋白組，標準BSA譜圖中保留時間為2. 531，3. 786，5. 503，10. 069四種主成分的總量應 占到98%的大部分，而透析袋中血樣的譜峰，除溶劑峰1.769外，大部分也是由保留時間為 2. 519，3. 809,5. 471，10. 154的四種主成分所代表，由此可以初步知道通過本課題所選用的 C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨-水液-固萃取體系一次正萃，一次反萃，透析后能夠使 全血清樣的純度達到與sigima公司標準品相當的純度。[色譜條件=Aginent1100液相色譜儀，反向C18柱，tc = 30°C，流速1.Oml/min ； 流動相A :pH5. O磷酸鹽(0. 2mol/L磷酸二氫鈉)緩沖液；流動相B :40%乙腈水溶液；梯度 洗脫方式0minl00% A線性梯度-IOmin到100% B洗脫，維持2min再回到100% A。二極 管列陣檢測器；標準牛血清白蛋白(98% )濃度4mg/mL，進樣量是IOuL ；血樣10%的全牛 血清，進樣量IOuL ；10%全牛血清經萃取分離后透析袋中溶液，進樣量是10uL。]實施例八C12PEG修飾物混合吐溫80-磷酸鉀-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 6克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲備液，5. 3克 磷酸鉀溶液于25. OmL比色管中，pH6. 3-9. 0，加水定容到10. OmL，在電動震蕩機中振蕩10 分鐘，混合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸 餾水將聚合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內，并加入5. 0克磷酸鉀， 置于電動震蕩機上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液 相，血清白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在 透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉7. 9毫克。在最佳條件下，一次正萃取率可達90 %，一次反萃取率可達70 %。2. C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾物固相收得率對比C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾物對血清白蛋白的親和力依次增大，本課題所采用的長 鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80-鹽-水液-固萃取體系中，以檸檬酸鹽體系為 例，在相同條件下，各自的固相收得率和分配系數如圖17所示，體系檸檬酸0. 9mol · Γ1 ； 吐溫 80 6% (ν/ν)長鏈二元脂肪酸修飾物2.4% (w/v) ；pH5.00，溫度20°C a. (R) %, b. LgK0從圖17可以看出，20°C時，在本課題所采用的長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物 混合吐溫80-鹽-水液-固萃取體系中，在同樣萃取條件下，C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾 物對HSA的親和力依次增大。一次萃取固相收得率1 %從40%— 70%— 90%，lgK從 1.6-1.85- 3. 0，在條件實驗中選用萃取效果好的可達到明顯優(yōu)越的結果。
權利要求
液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)、液-固萃取體系形成將長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無機鹽形成液-固萃取體系，并且液-固萃取體系中無機鹽的濃度為0.5-3.5mol·L-1，聚合物吐溫80的質量濃度為3～20％，長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物的濃度為0.2～3.0mg·mL-1，調節(jié)pH 3.5-9.5；(2)、在上述液-固萃取體系中加入血樣，置于電動震蕩機上平置振蕩2-10分鐘，取下倒置10-20分鐘，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被萃入固相；(3)、將第(2)步的固相加蒸餾水溶解后，使體系酸度在pH 3-9范圍內，并加入無機鹽使體系的無機鹽濃度達到0.5-3.5mol·L-1，置于電動震蕩機上平置振蕩2-10分鐘，取下倒置10-20分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、將第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。
2.根據權利要求1所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于 所述的長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物為碳十二長鏈二元脂肪酸聚乙二醇、碳十四長鏈二 元脂肪酸聚乙二醇或碳十六長鏈二元脂肪酸聚乙二醇。
3.根據權利要求1所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于 所述的無機鹽為磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸銨或檸檬酸鈉。
4.根據權利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于置于電動震蕩機上平置振蕩4-6分鐘。
5.根據權利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于取下倒置12-16分鐘。
6.根據權利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于正萃、反萃后需透析凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，按以下步驟進行將長鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無機鹽形成液-固萃取體系，調pH；在液-固萃取體系中加入血樣，置于電動震蕩機上平置振蕩，取下倒置，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被萃入固相；再將固相加蒸餾水溶解后，調pH并加入無機鹽，置于電動震蕩機上平置振蕩，取下倒置，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進行透析，將留在透析袋中的血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。用本發(fā)明純化得到高純度、結構未變、未聚合的血清白蛋白，并將通常需對血漿進行前處理、粗分離、細分離一步完成。
文檔編號C07K1/14GK101830979SQ20101015320
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者劉波, 沈靜茹, 雷灼霖 申請人:中南民族大學