專利名稱：包含結(jié)合于EBV(Epstein-Barr病毒)潛在性膜蛋白-1(LMP1)胞內(nèi)域的抗體的藥物組合物的制作方法
包含結(jié)合于EBV (Epste in-Barr病毒)潛在性膜蛋白-1 (LMP1)胞內(nèi)域的抗體的藥物組合物本發(fā)明涉及來源于LMP-I胞內(nèi)域的多肽片段，并涉及特異性結(jié)合這些片段的抗體，涉及它們?cè)诿庖忒煼ê鸵呙缃臃N中的用途。Epstein-Barr病毒(EBV)與幾種人類癌癥相關(guān)鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma)、在 AIDS 患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)禾口禾口月干內(nèi)EBiW- (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)。最近數(shù)據(jù)顯示EBV還涉及鼻NK/T-細(xì)胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及肝內(nèi)膽管癌(intra-h印atic cholangiocarcinoma)。常見于 AIDS 患者的口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia，0HL)也與EBV緊密相關(guān)。因此，EBV既死是親淋巴的(Iymphotropic)，又是趨上皮的(印itheliotropic)。已使用了幾種針對(duì)EBV相關(guān)癌癥的治療方法，包括放射和化學(xué)療法。然而放射和化學(xué)療法產(chǎn)生周知的問題(毒性，劑量等等)。也開發(fā)了幾種細(xì)胞和病毒基因療法，其一般基于病毒和/或細(xì)胞蛋白作為靶。然而，這些療法的效果并不足夠良好。在免疫療法中，也考慮了抗EGFR抗體(表皮生長因子受體)，特別是用于治療癌瘤 (NPC、胸腺、肺、子宮頸癌瘤、結(jié)腸、乳房和頭頸)，因?yàn)榕cEBV相關(guān)或不相關(guān)的上皮腫瘤細(xì)胞表達(dá)EGFR。因此該治療并不是排他地針對(duì)EBV相關(guān)癌瘤的。對(duì)于子宮頸癌和胸腺瘤，正在評(píng)價(jià)治療(單克隆抗體Cetumximab)的效力。然而，用抗EGFR與放射療法組合治療的患者有變得對(duì)放射療法具有抗性的風(fēng)險(xiǎn)。鼻咽癌(NPC)為來源于鼻后腔(retro-nasal cavity)上皮的人惡性腫瘤。其為總是與病毒相關(guān)的人類惡性腫瘤最著名的實(shí)例。Epstein-Ban 病毒(EBV)的全長基因組包含于所有惡性NPC細(xì)胞中，且其編碼可能促成惡性腫瘤表型的病毒蛋白(Decaussin G， Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouh AM, Ooka Τ. 2000. Cancer Res 60 5584-5588 ；Ooka T :2005.于Epstein-Barr Virus. Horizon Press,Annette Griffin :Erle S. Robertson編.第觀章pp 613-630)。盡管EBV感染在人中廣泛存在，但NPC的發(fā)病率取決于地理區(qū)域而變化極大。全球約5-10%的胃癌也與EBV相關(guān)。NPC的活檢(biopsy)總是表達(dá)幾種EBV基因，包括編碼EBERs、EBNAU LMPU LMP2A、BARFO和BARFl的基因。其中，僅LMPl和BARF-I能夠在嚙齒類成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化(Wei 和 Ooka，1989，EMBO J. 8 :2897-903 ；Wang D, Lieboffitz D 和 KieffE. 1985. Cell43 :831-840)并被視為病毒癌基因。LMP1(潛在性膜蛋白-1)屬于在由EBV感染的細(xì)胞表面表達(dá)的潛在性抗原家族，并對(duì)于B細(xì)胞的無限增殖化是不可或缺的。LMPl是由屬于人皰疹病毒4類型1的 Epstein-Barr病毒的基因組編碼的。LMPl具有六個(gè)跨膜域和一個(gè)胞內(nèi)C-端域。所述C-端域包含兩個(gè)主要的功能域=CTARl和CTAR2。稱為LMPl蛋白的“短環(huán)(short loop)，，的胞外域存在于EBV感染的細(xì)胞的表面上。LMBl對(duì)于B細(xì)胞無限增殖化是必需的，其激活幾個(gè)細(xì)胞基因，如NFkB、A20和EGF-R，其轉(zhuǎn)染入上皮細(xì)胞時(shí)可抑制細(xì)胞分化(Ooka T :2005.于 Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin :Erle S. Robertson 編.第 28章pp 613-630.)。然而，LMPl單獨(dú)不能夠使B細(xì)胞無限增殖化，且其需要與五個(gè)其它 ^ν 基因合作(EBERs、LMP2A、EBNA3A、EBNA3B, EBNA2) (Kieff 和 Rickinson，2007，F(xiàn)ields Virology 第 5 版-Fields BN, Knipe DM, Howley PM 編 Lippincott-Williams&Wilkins Publishers Philadelphia，2007，pp. 2603-2654)。常規(guī)地，LMPl 蛋白定位于細(xì)胞膜上。然而最近數(shù)據(jù)顯示LMPl可被分泌，并定位于B95-8細(xì)胞(非人狨猴B淋巴細(xì)胞)培養(yǎng)基中的外來體組分(exosomal component)以及用LMPl重組桿狀病毒感染的昆蟲Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)基(Vazirabadi G, Geiger TR, Coffin WF, Martin J Μ. Links 2003，J Gen Virol. 84 1997-2008 ；Flanagan J,Middeldorp J，Sculley，T. 2003，J Gen Virol 84:1871-9)和 NPC 來源的 c666-l 細(xì)胞系的培養(yǎng)基(Houali Κ,Χ. Wang, Y. Shimizu,D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 和 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 200713 :4993-5000)中。這些外來體組分可能導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的抑制(FlanaganJ，Middeldorp J，Sculley, Τ. 2003J Gen Virol 84 :1871-9)。已顯示在外來體樣泡囊內(nèi)存在的LMP-I激活FGF2表達(dá)(Ceccarelli S， Visco VjRaffa S,Wakisaka N,Pagano J,Torrissi R. 2007Int. J. Cancer 121:1494-506)。LMPl的基本致癌作用是由其對(duì)NFkB的激活確定的。LMPl表達(dá)的抑制導(dǎo)致與NFkB 表達(dá)減弱相聯(lián)系的細(xì)胞凋亡(Kieff和Rickinson，2007，F(xiàn)ieldsVirology第5版-Fields BN, Knipe DM, Howley PM 編 Lippincott-Williams&Wilkins Publishers Philadelphia， 2007，pp.2603-2654)。最近闡明了兩種癌蛋白(LMP1和BARF1)在NPC患者的血清和唾液中的分泌 (Houali K, X.Wang, Y. Shimizu, D.Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ. Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 :4993-5000)，且這些從NPC患者血清純化的癌蛋白在體外顯示強(qiáng)有力的促有絲分裂活性。該促有絲分裂活性可涉及腫瘤的發(fā)育。大多數(shù)在NPC患者血清或在注射C666-1細(xì)胞之后誘導(dǎo)發(fā)育出NPC來源的腫瘤的小鼠血清中發(fā)現(xiàn)的LMPl與外來體樣泡囊相聯(lián)系。該復(fù)合形式，LMPl/外來體，能夠通過自分泌機(jī)制激活細(xì)胞周期，而游離的LMPl (不含外來體)無法激活細(xì)胞周期(Houali Κ,Χ. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 :4993-5000)。US 6，723，695描述了 EBV結(jié)構(gòu)和潛在性蛋白內(nèi)的CTL表位。這些CTL表位對(duì)于針對(duì)EBV感染提供抗病毒免疫可為有效的。已起始了用于治療EBV陽性淋巴瘤的臨床試驗(yàn)。 來源于LMPl的表位來源于LMPl的胞外環(huán)。在免疫療法中，還使用識(shí)別LMPl表位的EBV特異性CTL以供治療何杰金氏病患者。然而，該治療由于細(xì)胞因子的抑制作用而并不成功(Gottschalk等，2002，Adv. Cancer Res. 8 :175-201 ；Bollard 等，2004. J. Exp. Med. 200 :1623-1633)。W003/048337描述了結(jié)合于LMPl的抗體及其在治療方法中的用途。所述抗LMPl 抗體結(jié)合于LMPl暴露于受感染細(xì)胞表面的胞外環(huán)。用這些抗體觀察到的細(xì)胞生長的抑制并未得到清楚的詳細(xì)說明，并可能是由于定位于細(xì)胞膜上的LMPl的中和而非因?yàn)槲挥诜置谌肱囵B(yǎng)基的外來體上的LMPl的結(jié)合。EP-A-1229043描述了不同的來源于LMPl的肽和與其反應(yīng)的抗體試劑。所述多肽和抗體可供制備用于治療EBV感染或EBV陽性腫瘤的藥物。描述了針對(duì)LMPl胞內(nèi)域的抗體。然而，僅涵蓋了具有針對(duì)LMPl胞外環(huán)產(chǎn)生的抗體的藥物組合物。已描述了 LMPl作為B細(xì)胞無限增殖化所需的癌基因的作用。然而，也已描述了其它無限增殖化所需的癌基因。在現(xiàn)有技術(shù)中，已將免疫療法用于針對(duì)暴露于EBV感染細(xì)胞的表面上的LMPl的胞外環(huán)。本發(fā)明提出了基于LMPl功能性抑制的新的免疫療法。令人驚訝的是，LMPl功能的抑制足以阻止和抑制腫瘤形成。本發(fā)明令人意想不到地顯示結(jié)合于LMPl胞內(nèi)域的抗體足以在體外和體內(nèi)均抑制與EBV相關(guān)的腫瘤細(xì)胞的發(fā)育。結(jié)合LMPl胞內(nèi)域的抗體能夠在體內(nèi)中和癌基因，導(dǎo)致在小鼠模型中預(yù)防和抑制腫瘤。該中和可為由于LMPl胞內(nèi)域暴露在外來提表面上的事實(shí)所導(dǎo)致。使用了由BD. Sciences，F(xiàn)rance商業(yè)開發(fā)的單克隆抗-LMPl抗體。該抗體在LMPl 的CTRAl和CTRA2域之間結(jié)合于LMPl的胞內(nèi)域。在注射NPC-來源的上皮腫瘤細(xì)胞之前連續(xù)注射抗LMPl抗體導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)(apparition)的預(yù)防。在腫瘤大小達(dá)到直徑約0. 8cm之后，當(dāng)連續(xù)注射抗LMPl抗體時(shí)，腫瘤退行并完全消失。這代表了對(duì)于用抗LMPl抗體抑制并避免(protect from) EBV陽性腫瘤的免疫療法首個(gè)報(bào)道。將抗LMPl添加入培養(yǎng)基也能夠抑制EBV陽性B細(xì)胞生長，表明基于抗LMPl的免疫療法對(duì)于抑制和避免EBV相關(guān)的淋巴瘤的產(chǎn)生也是有效的。此外，靶向LMPl胞內(nèi)域的免疫療法對(duì)于預(yù)防和治療NPC也是有前途的，因?yàn)榛颊邔?duì)該病毒蛋白顯示非常低的抗體應(yīng)答(Meij P，Vervoort MBHJ, Aarbiou J，van Dissel P, Brink A, Bloemena Ε, Meij er CJLM, Middeldorp JM. 1999. J. Infect. Diseases 179 1108-15)。序列表SEQ ID No. 1 來自人皰疹病毒4類型1的LMPl (潛在性膜蛋白_1)氨基酸序列 (Genbank YP_401722. 1)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是用作藥物的組合物，其包含特異性結(jié)合于來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMPl、具有SEQ ID NO :1的188至386位的序列的多肽的抗體或抗體片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用作藥物的組合物包含特異性結(jié)合于來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少5、 7、10、15、20或50個(gè)氨基酸的片段的抗體或抗體片段。優(yōu)選地，用作藥物的組合物包含特異性結(jié)合于來源于Epstein-Barr病毒蛋白 LMP1、具有SEQ ID NO 1的232至351位的序列的多肽的抗體或抗體片段。甚至更優(yōu)選地，用作藥物的組合物包含特異性結(jié)合于來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽的抗體或抗體片段。本發(fā)明的第二個(gè)目的是用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少10、20或50個(gè)氨基酸的片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用作藥物或用作疫苗的組合物相應(yīng)地包含來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽。優(yōu)選地，用作藥物或用作疫苗的組合物包含來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl、 具有SEQ ID NO 1的232至351位的序列的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用作藥物或用作疫苗的組合物包含來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物或疫苗的組合物，其包含編碼選自下組的多肽的多核苷酸來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少5、7、10、15、20或50個(gè)氨基酸的片段，來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、 具有SEQ ID NO :1的188至386位的序列的多肽或者來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl、 具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽。本發(fā)明涵蓋了藥物組合物和疫苗組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療EBV陽性腫瘤或EBV相關(guān)腫瘤。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、^": 禾口月干內(nèi) EB iW- (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、 鼻 NK/T-細(xì)胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia, 0HL)。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療鼻咽癌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl的肽，其選自下組-具有SEQID NO 1的306至318位序列的肽，-具有SEQID NO 1的306至318位序列的肽的至少5、7或10個(gè)氨基酸的片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及用作藥物的組合物，其包含如本文中所述的特異性結(jié)合于LMPl或其衍生物的胞內(nèi)片段的抗體或抗體片段。本發(fā)明還涉及用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含LMPl的胞內(nèi)域或其片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含編碼LMPl胞內(nèi)域或其片段的多核苷酸。具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽對(duì)應(yīng)于LMPl的胞內(nèi)域，其并不暴露于EBV感染的細(xì)胞的表面上。然而，在本發(fā)明中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)結(jié)合于該域的抗體在體內(nèi)小鼠模型中阻止并減少腫瘤形成。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含a)如本文中所述的有效量的抗體或抗體片段，如本文中所述的有效量的多肽或如本文中所述的有效量的多核苷酸，和b)藥學(xué)上可接受的載體，其可為惰性的或生理活性的。本發(fā)明還提供疫苗組合物，其包含a)如本文中所述的有效量的多肽或如本文中所述的有效量的多核苷酸，和
b)佐劑。如本文中使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂層(coating)、抗細(xì)菌和抗真菌劑等。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等的一種或多種以及其組合。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇或氯化鈉。具體而言，合適的載體的相關(guān)實(shí)例包括(1)杜爾貝科氏磷酸鹽緩沖鹽水(Dulbecco，s phosphate buffered saline), pH 7. 4，含有或不含有約lmg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0. 9%鹽水(0. 9% w/v氯化鈉 (NaCD)JP (3)5% (w/v)右旋糖；且可含有抗氧化劑如色胺和穩(wěn)定劑如Tween 20。本發(fā)明涵蓋的藥物組合物還可含有用于治療與EBV相關(guān)的癌癥的其它治療劑。本發(fā)明的組合物可為多種形式。其包括例如液體、半固體和固體劑型，但優(yōu)選的型式取決于意欲的施用模式和治療應(yīng)用。通常優(yōu)選組合物為可注射或可輸注(infusible) 溶液的形式。優(yōu)選的施用模式是腸胃外(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為快速注射(bolus)或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注來靜脈內(nèi)施用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其通過肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、瘤內(nèi)、瘤周圍 (peritumoral)、損傷內(nèi)(interlesional)或損傷周圍(perilesional)途徑注射，以發(fā)揮局部以及全身的治療效果。用于腸胃外施用的滅菌的組合物可通過將如本發(fā)明中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸以所需量并入合適的溶劑，然后通過微濾滅菌來制備。作為溶劑或運(yùn)載體，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其組合。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇或氯化鈉。這些組合物還可含有佐劑，特別是濕潤劑、等滲劑、乳化劑、分散劑和穩(wěn)定劑。用于腸胃外施用的滅菌的組合物還可以以滅菌的固體組合物的形式制備，其可在使用時(shí)溶解于滅菌水或任何其它可注射的滅菌介質(zhì)。如本文中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸還可經(jīng)口施用。作為用于經(jīng)口施用的固體組合物，可使用片劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、小藥囊(sachet))或顆粒劑。在這些組合物中，將本發(fā)明的活性成分與一種或多種惰性稀釋劑如淀粉、纖維素、蔗糖、乳糖或二氧化硅在氬氣流下混合。這些組合物還可包含除了稀釋劑之外的物質(zhì)，例如一種或多種潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石，著色劑，包被劑(糖衣片劑)或薄膜(glaze)。作為用于經(jīng)口施用的液體組合物，可使用藥學(xué)上可接受的溶液、懸液、乳液、糖漿和酏劑，其含有惰性稀釋劑如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油。這些組合物可包含除了稀釋劑之外的物質(zhì)，例如濕潤劑、增甜劑、增稠劑、芳香基或穩(wěn)定劑產(chǎn)物。劑量取決于所需的效果、治療的持續(xù)時(shí)間和使用的施用途徑。本發(fā)明還涉及使用如本文中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸以供制備用于預(yù)防或治療EBV陽性腫瘤或EBV相關(guān)腫瘤如鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌 (Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，slymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、食道和月干內(nèi)膽管癌(Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、鼻 NK/T—細(xì)胞淋巴瘤 (nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia,0HL)的藥物或疫苗。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸用于預(yù)
7防或治療EBV陽性腫瘤。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用上述公開的含有如本文中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸的藥物組合物或疫苗組合物之一用于預(yù)防或治療EBV 陽性腫瘤。更優(yōu)選地，將其用于預(yù)防或治療鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌 (Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt' s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、食道和月干內(nèi)膽管癌(Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、鼻 NK/T—細(xì)胞淋巴瘤 (nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia, OHL)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將其用于預(yù)防或治療鼻咽癌。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療EBV陽性腫瘤的方法，包括將有效量的如本文中所述的抗體、抗體片段、多肽或多核苷酸施用于有此需要的人或患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt' slymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、 在AIDS患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、食道和肝內(nèi)膽管癌 (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma) > Sl NK/T- Ifiifr Ei^ (nasal NK/ T-cell lymphoma)以及口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia,OHL)的方法。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療鼻咽癌的方法。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含特異性結(jié)合于LMPl或其衍生物胞內(nèi)域的抗體或抗體片段。如本文中使用的術(shù)語“結(jié)合”指抗體和抗體片段是與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的188 至386位的多肽的LMPl的胞內(nèi)域的表位反應(yīng)的，或者是針對(duì)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的188至 386位的多肽的LMPl的胞內(nèi)域產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述抗體與來自SEQ ID NO :1的306至318 位的多肽的表位反應(yīng)，或是針對(duì)來自SEQ ID NO 1的306至318位的多肽產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述抗體特異性結(jié)合于LMPl的胞內(nèi)域，且不與其它抗原交叉反應(yīng)。因此， 所述抗體與一個(gè)特異性抗原反應(yīng)。特異性結(jié)合于LMPl胞內(nèi)域的抗體是商業(yè)上可獲得的，例如可從BD Sciences(France)獲得的抗體S12?；蛘撸禺愋越Y(jié)合于LMPl胞內(nèi)域或其片段的抗體可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。優(yōu)選的抗體是結(jié)合于具有SEQ ID NO :1的306至318位序列的肽的抗體，單克隆抗體S12也特異性結(jié)合于該肽。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合于與抗體S12相同的表位?？贵wS12的表位可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法由本文中所述的具有SEQ ID NO 1 的306至318位的序列的肽出發(fā)來確定。本文中使用的術(shù)語“抗體”為其最廣泛的含意，并具體地涵蓋任何同種型的單克隆抗體如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體和抗體片段。與特異性抗原反應(yīng)的抗體可通過重組方法生成，如選擇噬菌體或類似載體中重組抗體的文庫，或通過用抗原或編碼抗原的核酸對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。典型的IgG抗體由通過二硫鍵連接的兩個(gè)相同的重鏈和兩個(gè)相同的輕鏈組成。每個(gè)重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)。每個(gè)可變區(qū)含有三個(gè)稱為“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”或“高變區(qū)”的區(qū)段，其主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。其通常稱作⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端順序編號(hào)。可變區(qū)的較為高度保守的部分稱為“框架區(qū)”。如本文中使用的“VH”或“VH”指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFV、Fab、Fab，或F(ab，)2片段的重鏈。提及“VL”或“VL”是指抗體的免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或F(ab，)2片段的輕鏈。“多克隆抗體”是在一種或多種其它的非相同抗體存在下產(chǎn)生的抗體。一般而言， 多克隆抗體是由B淋巴細(xì)胞在幾種其它產(chǎn)生非相同抗體的B淋巴細(xì)胞存在下產(chǎn)生的。通常， 多克隆抗體是直接從經(jīng)免疫接種的動(dòng)物獲得的。如本文中使用的“單克隆抗體”為從基本上同源的抗體群獲得的抗體，即形成該群的抗體除了可以以較小量存在的可能天然存在的突變之外是基本上相同的。這些抗體針對(duì)單一的表位，并因此是高度特異性的。“表位”是抗原上抗體結(jié)合的位點(diǎn)。如本文中使用的“嵌合抗體”指其中恒定區(qū)或其部分經(jīng)改變、替代或交換從而使得可變區(qū)連接于不同物種的恒定區(qū)或?qū)儆诹硪环N抗體類型或亞類型的可變區(qū)的抗體?！扒逗峡贵w”還指其中可變區(qū)或其片段經(jīng)改變、替代或交換從而使得恒定區(qū)連接于不同物種的可變區(qū)或?qū)儆诹硪环N抗體型或亞型的可變區(qū)的抗體。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。如本文中使用的術(shù)語“人源化抗體”指含有來源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化的目標(biāo)是減少異種抗體如鼠類抗體的免疫原性，以供將其引入人類，而保留抗體的全抗原結(jié)合親和性和特異性。人源化抗體或經(jīng)適應(yīng)以不被其它哺乳動(dòng)物排斥的抗體，可使用幾種技術(shù)如表面重建(resurfacing)和⑶R移植來產(chǎn)生。人源化嵌合抗體優(yōu)選具有除了下述互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之外的恒定區(qū)和可變區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)實(shí)質(zhì)上和排他地來源于相應(yīng)的人抗體區(qū)和CDR，所述人抗體區(qū)和CDR實(shí)質(zhì)上和排他地來源于除了人之外的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的抗體包含上述討論的全長抗體以及其表位結(jié)合片段。如本文中使用的 “抗體片段”包括抗體任何保留結(jié)合于由全長抗體識(shí)別的表位的能力的部分，通常稱為“表位結(jié)合片段”。抗體片段的實(shí)例包括但不僅限于？油1油，和？(油，)21(1、單鏈？^(8沖力、 單鏈抗體、二硫連接的Fvs (dsFv)和包含VL或VH區(qū)的片段。表位結(jié)合片段，包括單鏈抗體， 可僅包含可變區(qū)或與下述的整體或一部分組合鉸鏈區(qū)、CHI、CH2和CH3域。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含對(duì)應(yīng)于LMPl的胞內(nèi)域或其片段的多肽。術(shù)語多肽“片段”指包含其來源多肽的一部分但非全部的多肽。本發(fā)明的片段保留了其來源的多肽的抗原性質(zhì)。本發(fā)明因此涉及具有SEQ ID NO :1的188至386位序列的多肽的至少5、7、10、15或20個(gè)氨基酸的片段。有利地，本發(fā)明的片段在保留其抗原性質(zhì)的同時(shí)具有最小的大小。本發(fā)明的另一個(gè)目的是來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl的肽，其選自下組-具有SEQID NO 1的306至318位序列的肽，-具有SEQID NO 1的306至318位序列的肽的至少5、7或10個(gè)氨基酸的片段。在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含編碼如上所述對(duì)應(yīng)于LMPl胞內(nèi)域或其片段的多肽的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語“多核苷酸”指可為DNA或RNA類型的單鏈核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈， 或可為cDNA(互補(bǔ))或基因組DNA類型的雙鏈核苷酸鏈。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸是DNA類型，即雙鏈DNA。術(shù)語“多核苷酸”還指修飾的多核苷酸。將本發(fā)明的多核苷酸從其天然環(huán)境分離或純化。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)如Sambrook等所述的(Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 1989)那些或通過化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的另一個(gè)目的是如本文中所述的編碼肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉用于將多核苷酸并入宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、病毒感染、熱休克、 膜的化學(xué)滲透后的轉(zhuǎn)化或細(xì)胞融合。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，包括病毒載體。在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含表達(dá)如上所述的對(duì)應(yīng)于LMPl胞內(nèi)域或其片段的多肽的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。附圖簡述Ml =LMPl蛋白的結(jié)構(gòu)和S12在外來體/LMPl復(fù)合物上的識(shí)別位點(diǎn)。Ml 抗LMPl對(duì)EBV陽性或EBV陰性細(xì)胞系的作用分析抗LMPl對(duì)EBV陽性和EBV陰性B細(xì)胞系以及對(duì)c666_l上皮細(xì)胞系的作用。 在添加5 μ g單克隆抗體S12之后監(jiān)視所述細(xì)胞的存活120小時(shí)?？筁MPl有效地抑制了 c666-l、Raji和IB4的細(xì)胞生長，而未觀察到對(duì)EBV陰性Louckes細(xì)胞系的抑制作用。Ml 對(duì)于用從NPC患者血清分離的外來體/LMPl處理的CEM (人T細(xì)胞)、EBV 陰性AKATA (B細(xì)胞)、Balb/c3T3 (嚙齒類成纖維細(xì)胞)和HaCaT (人上皮細(xì)胞)的MTT測(cè)試分離外來體/LMPl復(fù)合物(ELC)。MTT測(cè)試是用50000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)基以及5 μ 1含有300ng來自NPC患者的復(fù)合物的外來體/LMPl復(fù)合物(SNPC)實(shí)施的。使用具有或不具有FBS，以及從健康個(gè)體分離的外來體(EC-SNP)作為對(duì)照。Louckes 和AKATA 人B細(xì)胞系，CEM，Balb/c3T3和HaCaT。在該外來體/LMPl測(cè)定中添加單克隆抗體S12幾乎完全消除了促有絲分裂活性(ELC+S12)。Mi 單克隆抗體S12對(duì)EBV-AGS細(xì)胞生長的作用。用S12抗體測(cè)試EBV陰性AGS (1)和EBV陽性AGS (2)。將五μ g單克隆S12添加于培養(yǎng)基。對(duì)照細(xì)胞未接受抗體。細(xì)胞存活性是通過考馬斯藍(lán)染色在5日期間測(cè)量的。M5 免疫治療測(cè)定將抗LMP1S12在C666-1細(xì)胞注射之前(b)、同時(shí)(c)和之后(d)注射。將50 μ g 抗體腹膜內(nèi)(intrapenetorially)注射。將IO7個(gè)細(xì)胞(c666_l)皮下注射。圖中表示的值對(duì)應(yīng)于以mm測(cè)量的平均腫瘤直徑大小。方案1 對(duì)于C666-1為(b)及S12 ；方案2 對(duì)于 C666-1為(c)及S12 ；方案3 對(duì)于C666-1為(d)及S12。無任何抗體，在注射c666_l細(xì)胞之后的腫瘤形成(a)。M6 免疫治療測(cè)定將抗LMPlS 12在EBV-AGS細(xì)胞注射之前(b)、同時(shí)(c)和之后(d)注射。將50 μ g 抗體腹膜內(nèi)(intrapenetorially)注射。將IO7個(gè)細(xì)胞(EBV-AGS)皮下注射。圖中表示的值對(duì)應(yīng)于以mm測(cè)量的平均腫瘤直徑大小。方案1 對(duì)于EBV-AGS為(b)及S12 ；方案2 對(duì)于 EBV-AGS為(c)及S12 ；方案1 對(duì)于EBV-AGS為(d)及S12。無任何抗體，在注射AGS-EBV 細(xì)胞之后的腫瘤形成(a)。
Ml 抗EBV DNA酶的作用將50 μ g兔多克隆抗EBV DNA酶用于在20日的期間內(nèi)每5日進(jìn)行治療，然后注射 IO6個(gè)C666-1細(xì)胞。監(jiān)視腫瘤形成?？贵w對(duì)腫瘤形成無抑制作用。圖8 抗兔或抗小鼠的作用將50 μ g抗小鼠Ig在20日的期間內(nèi)每5日進(jìn)行治療，然后注射IO6個(gè)C666-1細(xì)胞。監(jiān)視腫瘤形成?？贵w對(duì)腫瘤形成無抑制作用。M9 通過免疫印跡在小鼠血清和腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)LMPl/外來體復(fù)合物分離LMPl/外來體復(fù)合物，并在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析?？乖贵w復(fù)合物通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL ；Amersham)檢測(cè)。在來自形成c666_l或EBV-AGS 腫瘤的小鼠的血清中分析LMPl的存在(1)。陽性對(duì)照為P3HR1細(xì)胞。從血清分離的LMPl/ 外來體復(fù)合物0)S-c666-l。從腫瘤分離的LMPl/外來體復(fù)合物(3) :MT-c666_l。通過二級(jí)兔抗Ig顯示S12)。使用商業(yè)的小鼠Ig作為陽性對(duì)照Ig(l，2，3)。

圖10 外來體/LMP1/S12復(fù)合物從形成C666-1腫瘤的小鼠血清純化外來體/LMP1/S12復(fù)合物并對(duì)其用抗小鼠 Ig (用于檢測(cè)S12)或抗⑶63 (用于檢測(cè)外來體)處理。通過IOnm金標(biāo)記的小鼠Ig和5nm 金標(biāo)記的抗CD63檢測(cè)外來體/LMP1/S12復(fù)合物。正常外來體未經(jīng)這些抗體處理的外來體 /LMP1/S12。通過忽略一抗或用非免疫血清替代來作為免疫特異性的對(duì)照。圖 11A :NF-kB 在 c666-l、AGS、EBV-AGS、c666-l、c666-l 腫瘤和 EBV-AGS 腫瘤中的翻譯表達(dá)。a :NF-kB 五個(gè)組分(p65、p50、p52、RelB 和 c_Rel)的表達(dá)通過 ELISA 測(cè)試 (TransAM NFkB 家族試劑盒Ref，43四6，Active-Motif，Belgium)分析。對(duì) AGS、EBV-AGS、 EBV-AGS+S12、EBV-AGS 腫瘤、c666-l、c666-l+S12、c666_l 腫瘤、Raji 和經(jīng) S12 處理的 Raji 就NF-kB的五個(gè)組分的表達(dá)進(jìn)行分析。NF-kB的主要組分p65和p50在Raji中激活，且S12 的存在顯著抑制了這些組分。組分的表達(dá)在腫瘤中激活，而培養(yǎng)中的細(xì)胞顯示這些組分的基礎(chǔ)表達(dá)。b 當(dāng)在體外用從NPC血清分離的LMPl/外來體復(fù)合物處理Louckes細(xì)胞時(shí) (Louckes+ELC)觀察到這些組分的激活(b)。S12抗體的存在完全減少了該激活，表明該激活是由于與外來體復(fù)合的LMPl(Louckes+ELC+S12)的存在所致。作為陽性對(duì)照，S12抗體也完全抑制了 Raji細(xì)胞(Raji)中p65和p50的顯著表達(dá)(Raji+S12)。
實(shí)施例用抗LMP-I處理用于腫瘤抑制我們顯示用抗LMP-I抗體的治療1)抑制NPC來源和GC來源的腫瘤和2、避免NPC 來源和GC來源的腫瘤的形成。為了闡明抗LMP-I抗體作為EBV相關(guān)癌瘤(NPC和GC)的保護(hù)和抑制劑，我們使用了之前在我們實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)的動(dòng)物模型(裸鼠MHouali K, X.ffang, Y. Shimizu, D.Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 T. Ooka. Clin. Cancer Res. 13 4993-5000 ；Sheng W, Decaussin, G.，Sumner, S.禾口 Ooka，Τ. 2001. Oncogene 20 1176-1185)。本文中使用的裸鼠來自Harland (France)，產(chǎn)自意大利株系Hsd =Athymic Nude-Foxlnu0我們也測(cè)試了 HsdCpb =NMRI-Foxlnu0其年齡為4周。其性別為雄性。其4周時(shí)重量為約19-21g。對(duì)于對(duì)抗LMP-I抗體的作用的體外分析，在EBV陽性的NPC來源的c666_l和GC來源的EBV-AGS上皮細(xì)胞系和EBV陽性或EBV陰性的人B細(xì)胞系中檢查單克隆抗LMP-1S12?？筁MPl 抗體 S12 由 BD Sciences(France)商業(yè)化，產(chǎn)品號(hào)559898。該抗體識(shí)別LMPl蛋白的C端區(qū)，301-318位氨基酸，CTAR2附近(參見圖1)。當(dāng)將 NPC 來源的 c666-l (Cheung ST，Huang DP, Hui AB, Lo Kff, Ko CW，Tsang YS, Wong N, Whitney BM, Lee JC. Int J Cancer 1999 ；83 :121-6)或 GC 來源的 EBV 陽性 AGS(Kassis J, Maeda A, Teramoto N, Takada, K, Wu C, Wells A. Int. J. Cancer 2002 ；99 644-51)上皮細(xì)胞注射入裸鼠時(shí)，可誘導(dǎo)NPC來源的腫瘤。然后我們?cè)谶@些小鼠中分析抗 LMPl抗體的作用。一般而言，不具有EBV基因組的AGS細(xì)胞當(dāng)注射入裸鼠時(shí)并不誘導(dǎo)任何腫瘤，但在裸鼠中，用EBV陽性AGS時(shí)形成GC來源的腫瘤。之前從未觀察到該現(xiàn)象。體外實(shí)騎首先，對(duì)于EBV陽性C666-1和EBV陽性AGS上皮細(xì)胞系、EBV陽性人IB4B細(xì)胞系、 EBV陽性人RajiB細(xì)胞系和EBV陰性人LouckesB細(xì)胞系在體外培養(yǎng)中分析抗LMPl抗體(添加于培養(yǎng)基中)的作用。將5yg抗LMPl (對(duì)于105個(gè)細(xì)胞)添加于培養(yǎng)基。在120小時(shí)期間觀察細(xì)胞生長的進(jìn)化(圖2)。當(dāng)用5yg S12抗LMP-I抗體(添加于培養(yǎng)基)中和分泌的LMP-I癌蛋白時(shí)，C666-1 如圖2-3的存活曲線所示開始死亡。在添加抗體之后，存活細(xì)胞在M小時(shí)之后減少至78 %， 在48小時(shí)之后減少至50 %，在72小時(shí)之后減少至25 %，在96小時(shí)之后減少至7 %，且 C666-1細(xì)胞在120小時(shí)(5日)之后全部死亡。這表明LMP-I/外來體的促有絲分裂活性直接涉及主要的細(xì)胞激活過程(Houali K，X. Wang，Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 13 :4993-5000)。在EBV陽性人Raji (圖1-1)和IB4B細(xì)胞系(圖2-4)中觀察到類似的抑制作用。 在兩個(gè)EBV陽性B細(xì)胞系中抑制作用均為劇烈的(圖2-1和4)在添加抗體之后，存活細(xì)胞在M小時(shí)之后減少至75%，在48小時(shí)之后減少至13%，在72小時(shí)之后減少至10%，在 96小時(shí)之后減少至5-7%，且細(xì)胞在120小時(shí)(5日)之后全部死亡。對(duì)于EBV陰性LouckesB細(xì)胞系未觀察到上述抑制作用(圖2_2)?？偠灾?，抗LMP-I抗體可抑制EBV陽性c666_l上皮細(xì)胞和表達(dá)LMP-I蛋白的 EBV陽性B細(xì)胞的細(xì)胞生長。該結(jié)果表明抗LMP-I與從細(xì)胞分泌的LMP-I/外來體復(fù)合，然后該復(fù)合物可進(jìn)入細(xì)胞?？赡芤坏┰搹?fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，其通過抑制NFkB表達(dá)來觸發(fā)細(xì)胞死亡(參見體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分和圖巧)。為了驗(yàn)證該假設(shè)，將Raji細(xì)胞與5yg S12在96小時(shí)期間在與圖2_1 (人Raji B 細(xì)胞)相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每對(duì)小時(shí)，收集細(xì)胞，將其置于載玻片上，并用丙酮固定使其滲透。細(xì)胞中外來體/LMP-1/S12復(fù)合物的存在用偶聯(lián)熒光素(fluoscein)的抗小鼠Ig來檢測(cè)。在未經(jīng)S12處理的Raji中未觀察到熒光(圖2，Raji+小鼠Ig)，而在用S12處理 M小時(shí)之后，Raji在細(xì)胞膜附近顯示斑駁的(patched)免疫熒光。在96小時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分觀察到重要的免疫熒光。這表明從腫瘤細(xì)胞分泌的外來體/LMP-I可與S12復(fù)合，然后LMPl/外來體/S12復(fù)合物可被吸收入細(xì)胞并到達(dá)細(xì)胞核。在未經(jīng)S12處理的細(xì)胞中獲得的陰性反應(yīng)表明抗體S12本身不會(huì)被吸收入細(xì)胞。然后我們驗(yàn)證了相似的顯像(LMP1/外來體復(fù)合物被吸收入細(xì)胞)是否也發(fā)生在將LMPl/外來體復(fù)合物(ELC)直接添加在EBV陰性細(xì)胞系的培養(yǎng)基時(shí)。對(duì)此，我們首先從 NPC患者的血清純化了外來體/LMP-I的復(fù)合物，然后將其直接添加在EBV陰性細(xì)胞的培養(yǎng)基中。將人T細(xì)胞系CEMl和人B細(xì)胞系Louckes與1 μ gELC培養(yǎng)。固定細(xì)胞，然后將其滲透化。外來體/LMP-I復(fù)合物的存在通過共聚焦顯微鏡使用抗-LMP-1S12和抗⑶63 (外來體的特異性標(biāo)記)在M小時(shí)期間內(nèi)搜索。為了定位核，用Dapi對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。用一抗 S12或抗CD63以1/1000的稀釋度進(jìn)行溫育，然后與Alexa fluo 488IgG山羊抗小鼠IgG作為二抗溫育。用羅丹明的紅色熒光檢測(cè)LMPl而用熒光素的綠色熒光檢測(cè)CD63。將細(xì)胞在 356nm(Dapi)和 488nm(Alexa)激發(fā)。兩種抗體(抗LMP-I和抗⑶6 共定位于細(xì)胞區(qū)室細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。這表明外來體/LMP-1/S12復(fù)合物可被吸收，與之前用ELC的觀察一致。在免疫電子顯微鏡上確證了這些胞內(nèi)定位。對(duì)兩種細(xì)胞系進(jìn)行了電子顯微鏡分析-l)用1 μ g來源于NPC血清的LMPl/外來體復(fù)合物處理的人LouckesB細(xì)胞系和-2)僅用S12處理的人Raji B細(xì)胞系。將Louckes細(xì)胞用從NPC純化的外來體/LMP-I復(fù)合物處理48小時(shí)。在凍結(jié)狀態(tài)切割細(xì)胞沉淀(pellet)，然后將其置于載玻片。⑶63通過與IOnm金珠偶聯(lián)的抗⑶63檢測(cè)。LMP-1通過與5nm金珠偶聯(lián)的S12檢測(cè)。將Raji細(xì)胞用S12抗體處理48小時(shí)，然后固定。用抗小鼠Ig(用于S12)或抗 ⑶63(用于外來體)之一處理載玻片?？剐∈驣g (與5nm金珠偶聯(lián))與位于外來體/LMP-I/ S12復(fù)合物上的S12抗體反應(yīng)，而抗⑶63 (與IOnm金珠偶聯(lián))用于位于相同外來體上的 CD63。在外來體泡囊、多重小泡(multi-vesicule)、腔(cavity)和核中有陽性反應(yīng)。從NPC患者血清分離的外來體/LMP-I復(fù)合物在MTT測(cè)試中具有強(qiáng)力的促有絲分裂活性(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 13 :4993-5000)。對(duì)不同的細(xì)胞系進(jìn)行了比較性研究以檢查來自NPC患者血清的外來體/ LMP-I復(fù)合物(ELC)和來自正常個(gè)體血清的外來體(EC)是否具有促有絲分裂活性。對(duì) AKATA (EBV-變體)、Louckes (B細(xì)胞)、CEM_1 (Τ細(xì)胞)、Balb/c3T3 (嚙齒類成纖維細(xì)胞)和 EBV陰性人上皮HaCaT細(xì)胞系進(jìn)行了該檢查(圖3)。對(duì)用300ng從NPC患者純化的外來體/LMP-1復(fù)合物處理50000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1 培養(yǎng)基(無FCS)實(shí)施了 MTT測(cè)試(SNPC)。使用含或不含F(xiàn)BS以及從健康個(gè)體分離的外來體(EC-SNF)作為對(duì)照(圖4)。來自NPC的外來體/LMP-I復(fù)合物顯示強(qiáng)力的促有絲分裂活性。用ECL獲得的值(SNPC)與用FBS獲得的值相當(dāng)，而PBS和來自健康個(gè)體的EC(SNP)顯示基線值。用ELC獲得的促有絲分裂激活(SNPC)來自外來體中LMP-I的存在，因?yàn)樵谕鈦眢w/LMP-I測(cè)定中添加S12消除了幾乎全部用外來體/LMP-I復(fù)合物誘導(dǎo)的促有絲分裂活性(ELC+S12)(圖4， ELC(SNPC)+S12)。通過抗LMP-I誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可與NFkB表達(dá)的抑制相關(guān)，特別是通過與外來體復(fù)合的LMP-I激活的NFkB的兩個(gè)主要組分(p65和p50)(參見圖11)。游離LMP-I (未與外來體復(fù)合)無法激活細(xì)胞周期(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini，A. Bouguermouh 禾口 Τ. Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 :4993-5000)。此夕卜，我們的數(shù)據(jù)顯示從健康個(gè)體純化的外來體(EC =SNP)無法激活細(xì)胞周期(圖4)。總而言之，LMP-I的促有絲分裂活性需要其與外來體相結(jié)合。最后，我們的數(shù)據(jù)闡明了外來體/LMP-I復(fù)合形式能夠抑制NFkB表達(dá)。在經(jīng)S12處理的C666-1和經(jīng)S12處理的Raji細(xì)胞中完全抑制了 NFkB的表達(dá)(圖 11)。我們的數(shù)據(jù)表明迄今文獻(xiàn)中報(bào)道的LMP-I對(duì)NFkB的抑制可能是來自其與進(jìn)入細(xì)胞的外來體的復(fù)合物。該觀察可為我們提供關(guān)于LMP-I誘導(dǎo)的致癌機(jī)理的新概念。在EBV-AGS細(xì)胞系中研究了抗LMP-I的作用。用抗LMP-I處理AGS和EBV-AGS細(xì)胞系(圖4-1和圖4-2)?？筁MP-I并不顯示任何對(duì)AGS細(xì)胞生長的抑制(圖4_1)，而抗LMP-I在72小時(shí)期間停止細(xì)胞生長。然而，所有細(xì)胞在直至120小時(shí)仍然存活(圖4-2)。對(duì)于體外培養(yǎng)的EBV-AGS，LMP-I轉(zhuǎn)錄幾乎是陰性的。因此對(duì)于這些細(xì)胞，抗LMP-I 不具毒性。然而，實(shí)際上沒有關(guān)于抑制細(xì)胞生長而無細(xì)胞死亡的解釋。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們?cè)谄は伦⑸銲O7個(gè)來自EBV相關(guān)腫瘤的培養(yǎng)細(xì)胞的裸鼠中研究了抗LMP-I抗體的活性，所述細(xì)胞為C666-1細(xì)胞(來源于NPC)或EBV陽性AGS (來源于GC)。用C666-1細(xì)胞，可在第二或第三日在未經(jīng)處理的小鼠中檢測(cè)到腫瘤，在第4日達(dá)到約2mm的直徑，而在第8日為8mm，然后第14日為16mm而在第20日為20mm (圖5-1)對(duì)于EBV-AGS細(xì)胞，是C666-1細(xì)胞的約1. 5倍。用EBV陽性AGS細(xì)胞，可在第二或第三日在未經(jīng)處理的小鼠中檢測(cè)到腫瘤，在第 4日達(dá)到約3mm的直徑，而在第8日為15mm，然后第14日為25mm而在20日時(shí)為30mm (圖 6-1)。誘導(dǎo)的腫瘤(以mm表示的腫瘤直徑大小)對(duì)于EBV-AGS細(xì)胞比C666-1細(xì)胞略大， 為約1.5倍(圖5-a和圖6-e)。為了分析抗LMP-I的作用，對(duì)于每只小鼠將25 μ g單克隆抗LMP-1S12通過腹膜內(nèi)途徑以三種方案注射方案#1，在預(yù)防方案中，將抗LMP-1S12以5次25yg腹膜內(nèi)注射以5日間隔施用， 結(jié)束后三日(finishing 3days)，進(jìn)行腫瘤攻擊(對(duì)于c666_l為圖5_b，而對(duì)于EBV-AGS為圖 6-f)。方案#2，與腫瘤攻擊同時(shí)開始連續(xù)5日每日進(jìn)行注射(對(duì)于C666-1為圖5-c，而
14對(duì)于EBV-AGS為圖6-g)。方案#3，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到直徑約0. 8cm時(shí)進(jìn)行5次注射(每日一次注射)(對(duì)于 C666-1 為圖 5-d，而對(duì)于 EBV-AGS 為圖 6_h)。方案#1和#2用于預(yù)防而方案#3用于腫瘤治療。用抗LMP-I進(jìn)行的預(yù)防(方案#1-對(duì)于C666-1為圖5-b，而對(duì)于EBV-AGS為圖 6-f)或同時(shí)(方案#2-對(duì)于C666-1為圖5-c，而對(duì)于EBV-AGS為圖6-g)處理對(duì)于兩個(gè)細(xì)胞系均在所有經(jīng)處理的小鼠中至少3個(gè)月內(nèi)完全消除了腫瘤的出現(xiàn)。即使當(dāng)腫瘤已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)?shù)拇笮r(shí)，注射抗LMP-I抗體也為高度有效的。在每日注射抗LMP-I抗體5日之后，約8mm(c666-l)和約15mm(EBV-AGS)的瘤迅速穩(wěn)定，然后持續(xù)退行(對(duì)于C666-1為圖5-d，而對(duì)于EBV-AGS為圖6_h)。腫瘤物質(zhì)在治療開始11日之后完全消失，且小鼠在至少3個(gè)月內(nèi)保持無腫瘤。為了確證抗LMP-I對(duì)抑制腫瘤生長的特異性，我們將EBV編碼的DNA酶抗體或小鼠單克隆抗Ig抗體分別以方案#1(預(yù)防)注射。在預(yù)防方案中，將抗EBV-DNA酶或抗小鼠 Ig作為5次25 μ g的腹膜內(nèi)注射以5日間隔施用，結(jié)束后3日進(jìn)行腫瘤攻擊。當(dāng)在方案#1 (預(yù)防)中未經(jīng)或經(jīng)抗DNA酶處理的動(dòng)物用C666-1 (圖7)或用抗小鼠Ig(圖8)替代抗LMP-I用作對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，顯示快速的腫瘤生長(圖7和圖8)。這表明對(duì)腫瘤形成的特異性抑制可能是由于S12抗LMP-I中和LMP-I蛋白所致。抗小鼠Ig購自 Sigma(France)，產(chǎn)品號(hào) 62197。本文使用的兔多克隆抗DNA酶是在我們的實(shí)驗(yàn)室中從通過桿狀病毒系統(tǒng)獲得的 EBV-DNA 酶產(chǎn)生的(Sbih-Lammali F, Berger F, Busson P 和 Ooka T, 1996, Virology, 222 64-74)(Zeng Y, Middeldorp J, Madjar JJ 禾口 Ooka T, 1997, Virology 239:285-295)。然后我們檢查了抗LMP-I和LMP-I蛋白的復(fù)合物是否存在于血清以及腫瘤細(xì)胞中。我們通過免疫印跡方法分析了來自形成腫瘤的小鼠的血清和腫瘤。LMP-I 存在于攜帶 c666-l (圖 9-l，c666_l)和 EBV-AGS (圖 9_1，EBV_AGS)的小鼠的血清中。用于該實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照來自人P3HR1B細(xì)胞的細(xì)胞提取物。LMP-I蛋白作為公知的p63kDa蛋白質(zhì)被檢測(cè)到。然后我們?cè)谛纬赡[瘤之后用抗體處理的小鼠中研究了這些血清組分(方案#3)。 通過超離心純化了與外來體復(fù)合的 LMP-I (Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bouguermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 13 :4993-5000)。通過Wfestern印跡分析經(jīng)c666_l處理的小鼠血清中的復(fù)合物，顯示與兔免疫球蛋白(圖9-2 :S-c666-l-Ig)相結(jié)合的LMP-I的存在(圖9-2 :S-c666_l)。添加商業(yè)的小鼠 Ig作為陽性對(duì)照(圖9-2:Ig)。類似的復(fù)合物也存在于與兔免疫球蛋白(圖9-3 :MT-c666-l-Ig)相聯(lián)系的腫瘤活檢中(圖9-3，MT-C666-1)。添加商業(yè)的小鼠Ig作為陽性對(duì)照(圖9-3 :Ig)在經(jīng)S12處理的形成C666-1腫瘤的小鼠血清中搜索到外來體/LMP-I/小鼠Ig復(fù)合物的存在(圖10)。通過差速超離心從形成C666-1腫瘤的小鼠血清純化外來體/LMP-1/S12復(fù)合物， 并用抗小鼠Ig(用于檢測(cè)S12)或抗⑶63 (用于檢測(cè)外來體)處理。通過IOnm金標(biāo)記的小鼠Ig和通過5nm金標(biāo)記的抗⑶63檢測(cè)外來體/LMP-1/S12復(fù)合物。正常外來體未經(jīng)這些抗體處理的外來體/LMP-11/S12(抗小鼠Ig和抗⑶63 (圖10)來自經(jīng)S12處理的注射了 C666-1的小鼠的外來體)。 通過略去一抗或用非免疫血清(來自正常小鼠的外來體)替代一抗來作為免疫特異性的對(duì)照。 為了更準(zhǔn)確地顯示外來體/LMP-I/小鼠Ig復(fù)合物，對(duì)從放置于載玻片上并用丙酮固定的腫瘤活檢提取的C666-1和EBV-AGS腫瘤細(xì)胞搜索該復(fù)合物。令人驚訝地，我們?cè)趶膩碜越?jīng)適當(dāng)處理的小鼠的腫瘤活檢分離的細(xì)胞之內(nèi)發(fā)現(xiàn)了外來體/LMP-I/小鼠Ig復(fù)合物。該復(fù)合物是通過針對(duì)S12的抗小鼠Ig發(fā)現(xiàn)的。在兩種腫瘤(LMP-lc666-l和LMP-1EBV-AGS)中，可見外來體/LMP-I/小鼠Ig復(fù)合物為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的斑點(diǎn)(patch)。顯然，通過與其特異性抗體結(jié)合而致使這些通常促有絲分裂的組分失去效力。從經(jīng)S12抗體處理的小鼠血清獲得的復(fù)合物與抗小鼠Ig和抗⑶63反應(yīng)，確證了 LMP-I/外來體復(fù)合物的存在。顯然，抗體中和了 LMP-I/外來體復(fù)合物的促有絲分裂活性，并隨后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。令人驚訝的是，S12抗體在植入EBV-AGS的小鼠中抑制腫瘤生長(圖6，f. g. h)，盡管這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)并未產(chǎn)生可檢測(cè)的LMP-I表達(dá)(Kassis J，Maeda A, Teramoto N， Takada, K, Wu C, Wells A. Int. J. Cancer 2002 ；99 :644-51)(亦參見圖 9 和
)。對(duì)離體和培養(yǎng)中的EBV-AGS細(xì)胞通過半定量RT-PCR比較了 LMP-I的轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)LMP-I表達(dá)G79bp條帶)在EBV-AGS細(xì)胞培養(yǎng)物中幾乎不存在，而其表達(dá)在腫瘤活檢中為陽性。如預(yù)期的，對(duì)基因組序列(未剪接的序列)的擴(kuò)增給出640bp的條帶。通過 RT-PCR擴(kuò)增的序列對(duì)應(yīng)于LMPlmRNA。我們通過定量RT-PCR確證了這些結(jié)果。相對(duì)表達(dá)通過BARFlmRNA/肌動(dòng)蛋白mRNA的百分比(% )來表示。在c666_l腫瘤(c666-l/c666-l_T) 中，轉(zhuǎn)錄水平與從培養(yǎng)細(xì)胞(C666-1)獲得的值相比幾乎為7倍。在EBV-AGS腫瘤中觀察到 BARFl轉(zhuǎn)錄的顯著高的激活，而幾乎未在培養(yǎng)中的EBV-AGS細(xì)胞中觀察到轉(zhuǎn)錄。因此，抗LMP-I對(duì)EBV-AGS腫瘤的抑制作用是由于腫瘤中LMP-I表達(dá)的激活所致。 迄今從未進(jìn)行過這些觀察。LMP-I 激活 NF-kB 表達(dá)(Kieff 和 Rickinson，2007， Fields Virology 第 5 版-Fields BN, Knipe DM, Howley PM 編 Lippincott—Williams&Wilkins Publishers Philadelphia，2007，pp. 2603-2654)。我們通過 ELISA 測(cè)試檢查了 NF_kB 五個(gè)組分的表達(dá)(TransAM NFkB 家族 Kit :Ref. 43296, Active-Motif, France)。我們發(fā)現(xiàn)在處理 24 小時(shí)之后，用S12抗體的處理完全抑制了 Raji和C666-1細(xì)胞中的NF_kB p65和p50，NF-kB 家族的重要組分(圖Ila :c666-l+S12和Raji+12)，表明這些細(xì)胞中NF_kB p65和p50的表達(dá)完全依賴于LMP-I的激活。不表達(dá)LMP-I的EBV-AGS持續(xù)顯示在S12處理之后NF_kB p65和p50的基礎(chǔ)表達(dá)(圖Ila)，表明另一種激活途徑。p65和p50還在兩種類型的腫瘤 (NPC c666-1 Tum和GC EBV-AGSTum)中顯著激活。當(dāng)在體外用從NPC血清分離的LMP1 / 外來體復(fù)合物處理Louckes細(xì)胞時(shí)(Louckes+ELC)，觀察到這些組分的激活(圖lib)。 S12抗體的存在完全減少了該激活，表明該激活是由于與外來體復(fù)合的LMPl的存在所致 (Louckes+ELC+S12)。作為陽性對(duì)照，S12抗體也完全抑制了 Raji細(xì)胞(Raji)中p65和p50的顯著表達(dá)(圖lib :Raji+S12)。基于通過抗LMP-I的免疫療法的治療和預(yù)防不僅對(duì)于NPC類型的癌瘤有效，而且對(duì)于GC類型的癌瘤也是有效的。在體內(nèi)和體外觀察到抗LMPl 的抑制作用。
權(quán)利要求
1.用作藥物的組合物，其包含特異性結(jié)合于來源于Epstein-Ban·病毒蛋白LMP1、具有 SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的抗體或抗體片段。
2.權(quán)利要求1的用作藥物的組合物，其包含特異性結(jié)合于來源于Epstein-Ban·病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少10個(gè)氨基酸的片段的抗體或抗體片段。
3.權(quán)利要求1的用作藥物的組合物，其包含特異性結(jié)合于來源于Epstein-Ban·病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽的抗體或抗體片段。
4.用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有 SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少10個(gè)氨基酸的片段。
5.權(quán)利要求4的用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含來源于Epstein-Barr病毒蛋白 LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽。
6.權(quán)利要求4的用作藥物或用作疫苗的組合物，其包含來源于Epstein-Barr病毒蛋白 LMP1、具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽。
7.用作藥物或疫苗的組合物，其包含編碼選自下組的多肽的多核苷酸來源于 Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的188至386位的序列的多肽的至少10 個(gè)氨基酸的片段，來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl、具有SEQ ID NO :1的188至386位的序列的多肽或者來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMP1、具有SEQ ID NO 1的306至318位的序列的多肽。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的組合物，用于預(yù)防或治療EBV陽性腫瘤。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的組合物，用于預(yù)防或治療鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt' slymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中誘導(dǎo)的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、禾口月干內(nèi) ||旦 iW I (Esophage and blntrahepatic cholangiocarcinoma) > 鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛狀白斑(Oral hairy leucoplasia, 0HL)。
10.權(quán)利要求8的組合物，用于預(yù)防或治療鼻咽癌。
11.來源于Epstein-Barr病毒蛋白LMPl的肽，其選自下組-具有SEQ ID NO 1的306至318位序列的肽，-具有SEQ ID NO 1的306至318位序列的肽的至少5個(gè)氨基酸的片段。
12.編碼權(quán)利要求11的肽的多核苷酸。
13.用權(quán)利要求12的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含特異性結(jié)合于EBV蛋白LMP1胞內(nèi)域的抗體的藥物和疫苗組合物。
文檔編號(hào)C07K16/08GK102177177SQ200980139961
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者大岡忠正 申請(qǐng)人:克勞德伯納德里昂第一大學(xué), 國家科學(xué)研究中心