專利名稱：抗胰腺癌抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼠源、嵌合、人源化及人源抗體及其片段，該抗體及其片段以高選擇性 和高頻率與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合，與其它癌細(xì)胞結(jié)合的程度較低，且與正常的胰腺細(xì)胞或胰腺 炎的結(jié)合不明顯。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該抗體或片段是PAM4抗體或片段。所述抗體可用于 癌癥(特別是胰腺癌)的檢測(cè)、診斷和治療。在具體的實(shí)施例中，所述抗體可用于早期胰腺 癌的檢測(cè)和/或診斷。相關(guān)技術(shù)胰腺癌是胰腺的惡性生長(zhǎng)，主要發(fā)生在胰管細(xì)胞內(nèi)。這種疾病是第九大常見(jiàn)形式 的癌癥，還分別是男性和女性癌癥死亡的第四和第五大主要原因。胰腺癌幾乎總是致命性 的，五年的生存率不到3%。胰腺癌最常見(jiàn)的癥狀包括黃疸、腹部疼痛以及體重減輕，這些與其它表現(xiàn)因素一 起在本質(zhì)上是非特異性的。因此，在腫瘤生長(zhǎng)的早期診斷胰腺癌常常是困難的，需要大量 的診斷性病情檢查，很多時(shí)候包括探查性手術(shù)。內(nèi)鏡超聲檢查術(shù)和計(jì)算斷層照相法是當(dāng)前 可用的胰腺癌診斷的最好的非侵入性方式。然而可靠地檢測(cè)小腫瘤以及區(qū)別胰腺癌與局 灶性胰腺炎是困難的。目前大部分胰腺癌患者在晚期被診斷出來(lái)，此時(shí)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到囊 體的外部，從而侵害周圍的器官和/或已經(jīng)廣泛地轉(zhuǎn)移(Gold等人，Crit. Rev. Oncology/ Hematology, 39 147-54 (2001))。在臨床環(huán)境下，該疾病的晚期檢測(cè)是常見(jiàn)的，而早期胰腺 癌診斷是罕見(jiàn)的。當(dāng)前可用的胰腺癌的治療程序均不能達(dá)到痊愈之目的，也不會(huì)顯著延長(zhǎng)生存時(shí) 間。手術(shù)切除是提供生存機(jī)會(huì)的唯一形式。然而，由于腫瘤負(fù)荷較大，僅有10%至25%的 患者適合“根治性切除術(shù)”。對(duì)于那些經(jīng)過(guò)手術(shù)治療的患者來(lái)說(shuō)，五年生存率仍然很低，平均 僅約為10%。胰腺癌的早期檢測(cè)和診斷以及該疾病的適當(dāng)分期將提供增強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)。許多實(shí) 驗(yàn)室正在進(jìn)行診斷程序的開(kāi)發(fā)，這種開(kāi)發(fā)是基于腫瘤相關(guān)標(biāo)記物向血流中的釋放以及檢測(cè) 活檢標(biāo)本中的標(biāo)記物質(zhì)。對(duì)于胰腺癌來(lái)說(shuō)，最佳的腫瘤相關(guān)標(biāo)記物是CA19. 9的免疫測(cè)定。在70%的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)高水平的這種涎化Lea表位結(jié)構(gòu)，但在任何所檢查的局灶性胰 腺炎標(biāo)本中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。然而，在許多其它惡性和良性病癥中也發(fā)現(xiàn)CA19. 9水平提高了， 因此目前該測(cè)定尚不能用于診斷。然而，該測(cè)定對(duì)于監(jiān)測(cè)是有用的，術(shù)后CA19. 9血清水平 的持續(xù)增加表明預(yù)后不良。在不同的癌癥發(fā)展階段，已經(jīng)報(bào)道了許多其它單克隆抗體(MAb) 以及用于診斷的免疫測(cè)定。這些抗體包括但不限于DUPAN2、SPANU B72. 3、Ia3和各種抗 CEA (癌胚抗原或CEACAM5)抗體。已經(jīng)對(duì)抗體(特別是MAb)和基因工程抗體或抗體片段進(jìn)行了廣泛的測(cè)試，并顯 示出它們?cè)诎ò┌Y、自身免疫疾病、傳染病、炎癥性疾病和心血管疾病在內(nèi)的各種人類 疾病的檢測(cè)和治療中很有價(jià)值[Filpula 和 McGuire，Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9 231-245]?？贵w或抗體衍生制劑的臨床效用主要取決于其同與特定疾病相關(guān)的特異性靶抗 原結(jié)合的能力。在人類疾病的檢測(cè)和治療階段期間，特別是如果診斷或治療劑對(duì)體內(nèi)正常 組織有毒時(shí)，選擇性對(duì)于將診斷或治療劑(如藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、激素拮抗劑、酶、 酶抑制劑、寡核苷酸、生長(zhǎng)因子、放射性核素、血管生成抑制劑或金屬)遞送至靶位置來(lái)說(shuō) 是有價(jià)值的。在包括卵巢癌、結(jié)腸癌、甲狀腺髓樣癌和淋巴瘤在內(nèi)的許多惡性腫瘤中使用放 射性標(biāo)記抗體已經(jīng)取得了一定的成功。還證明了這種技術(shù)對(duì)胰腺癌也是有效的。然而，先 前報(bào)道的針對(duì)胰腺癌抗原的抗體迄今并沒(méi)有成功地用來(lái)有效地治療或早期檢測(cè)和/或診 斷胰腺癌。一種建議的將制劑遞送至靶位點(diǎn)的方法(稱為直接靶向)是設(shè)計(jì)用來(lái)以攜帶診斷 或治療劑的抗體靶向特異性抗原的技術(shù)。就腫瘤來(lái)說(shuō)，直接靶向方法利用通過(guò)其抗原識(shí)別 靶腫瘤的標(biāo)記抗腫瘤單特異性抗體。該技術(shù)涉及將標(biāo)記的單特異性抗體注射給患者并使抗 體定位于靶腫瘤以獲得診斷或治療效果。未結(jié)合的抗體從體內(nèi)清除。另一種建議的解決方案被稱為“親和力增強(qiáng)系統(tǒng)”(AES)，是設(shè)計(jì)用來(lái)克服由攜帶 診斷或治療劑的抗體直接靶向腫瘤的缺陷的技術(shù)[美國(guó)專利No. 5，256，395 (1993), Barbet 等人，Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals 14:153—166(1999)]。AES 禾Ij用標(biāo)記的 二價(jià)半抗原和識(shí)別靶腫瘤及標(biāo)記半抗原兩者的抗腫瘤/抗半抗原雙特異性抗體。具有更高 價(jià)數(shù)的半抗原和具有更高特異性的抗體也可用于此程序。該技術(shù)涉及把抗體注射給患者并 使其定位于靶腫瘤。在使未結(jié)合的抗體從血流中清除的足夠量的時(shí)間過(guò)后，施用標(biāo)記的半 抗原。半抗原與位于靶細(xì)胞位點(diǎn)的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合，從而獲得診斷或治療效果，而未 結(jié)合的半抗原則迅速?gòu)捏w內(nèi)清除。Barbet提到了二價(jià)半抗原可與雙特異性抗體交聯(lián)的可能 性(當(dāng)后者與腫瘤表面結(jié)合時(shí))。作為結(jié)果，標(biāo)記的復(fù)合物更穩(wěn)定，并且在腫瘤處停留的時(shí) 間更長(zhǎng)。本領(lǐng)域中需要這樣的抗體，與正常的胰腺組織和其它正常組織相比，該抗體對(duì)胰 腺癌和其它類型的癌癥表現(xiàn)出高選擇性。具體來(lái)說(shuō)，仍然需要這樣的抗體，其可用作胰腺癌 的診斷和/或治療工具(優(yōu)選在疾病的早期)，并且在靶抗原處顯示出增強(qiáng)的吸收，與健康 個(gè)體血液中的成分結(jié)合減少，并因此在有毒治療劑與這種抗體共軛時(shí)，其也對(duì)正常的組織 和細(xì)胞提供最佳的保護(hù)。使用這種抗體檢測(cè)體液(特別是血液)中的胰腺癌相關(guān)抗原可改 善這種疾病的早期診斷，只要它能夠?qū)⑦@種疾病與良性疾病很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)就行，同時(shí)也 可用來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)，并且也有可能通過(guò)指示疾病負(fù)擔(dān)而加強(qiáng)預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
在各種實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合而很少或不與正?；蚍悄[瘤性胰 腺細(xì)胞結(jié)合的抗體、抗原結(jié)合抗體片段及融合蛋白。優(yōu)選地，抗體與諸如PanIN-IA和IB以 及PanIN-2的最早期的胰腺癌結(jié)合。更優(yōu)選地，抗體與80%至90%或更多的人侵襲性胰腺 癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤、PanIN-IA, PanIN-IB和PanIN-2病變結(jié)合。最優(yōu)選地，抗體 可區(qū)分早期胰腺癌與諸如胰腺炎之類的非惡性病癥。這種抗體對(duì)癌癥的早期檢測(cè)及早期胰 腺癌與良性胰腺病癥之間的鑒別診斷特別有用。在優(yōu)選的實(shí)施例中，這種抗體可用于疑似 患有早期胰腺癌或某些其它癌癥的個(gè)體之樣本的體內(nèi)或體外分析。所述抗體、抗體片段或融合蛋白可以是通過(guò)用粘蛋白免疫和/或選擇而獲得的， 且優(yōu)選對(duì)胰腺癌的粘蛋白是反應(yīng)性的。因此，所述抗體、抗體片段和融合蛋白優(yōu)選與和胰腺 癌細(xì)胞相關(guān)的抗原結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體、抗體片段或融合蛋白可與在胰腺癌中表達(dá)的 粘蛋白(如MUC-I或MUC-5)結(jié)合。在某些實(shí)施例中，所述抗體、抗體片段或融合蛋白可與 用MUC-I抗原轉(zhuǎn)染并表達(dá)MUC-I抗原的細(xì)胞結(jié)合。在可供選擇的實(shí)施例中，所述抗體、抗體片段或融合蛋白可與合成肽序列結(jié) 合，例如與噬菌體展示肽結(jié)合。可與抗胰腺癌抗體結(jié)合的示例性肽包括但不限于 WTffNITKAYPLP (SEQ ID NO 29)和 ACPEffffGTTC (SEQ ID NO :30)。這種合成肽可以是直鏈的 或環(huán)狀的，并且可以同與內(nèi)源性胰腺癌抗原結(jié)合的抗體競(jìng)爭(zhēng)或不競(jìng)爭(zhēng)。合成肽序列的某些 位置上的氨基酸對(duì)于抗體結(jié)合來(lái)說(shuō)可能沒(méi)有其它氨基酸那樣重要。例如，在SEQ ID N0:29 中，可改變肽序列的位置7、8和11上的殘基K、A和L而仍然保持抗體結(jié)合。類似地，在SEQ ID NO 30中，可改變序列的位置8和9上的蘇氨酸殘基，盡管位置9上的蘇氨酸的取代可 顯著地影響與肽的抗體結(jié)合。在其它優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體與靶胰腺癌抗原的結(jié)合受到用諸如二硫蘇糖醇 (DTT)和/或高碘酸鹽之類的試劑處理靶抗原的抑制。因此，抗體與胰腺癌抗原的結(jié)合可取 決于二硫鍵的存在與否和/或靶抗原的糖基化狀態(tài)。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，由目標(biāo)抗體所 識(shí)別的表位不與其它報(bào)告的粘蛋白特異性抗體(如MA5抗體、CLH2-2抗體和/或45M1抗 體)發(fā)生交叉反應(yīng)(參見(jiàn)例如 Major 等人，J Histochem Cytochem. 35 139-48，1987 ；Dion 等人 Hybridoma 10:595-610,1991)。目標(biāo)抗體或片段可以是裸抗體或片段，或者優(yōu)選與至少一種治療和/或診斷劑共 軛以用于將制劑遞送至靶組織。在可供選擇的實(shí)施例中，PAM4抗體或片段可以是雙特異性 融合蛋白或抗體的一部分，具有對(duì)于靶細(xì)胞抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)于與靶向性構(gòu)建體共 軛的半抗原的第二結(jié)合位點(diǎn)。靶向性構(gòu)建體可轉(zhuǎn)而附著于至少一種可用在預(yù)靶向技術(shù)中的 治療和/或診斷劑。在優(yōu)選的實(shí)施例中，目標(biāo)抗體、抗體片段或融合蛋白包含鼠源、嵌合、人源化或人 源PAM4抗體或片段。這種PAM4抗體或片段優(yōu)選包含鼠源PAM4抗體的CDR序列，如輕 鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO 1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO 3)；以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID NO :4)、 CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO 5)和 CDR3(GFGGSYGFAY, SEQ ID NO 6)。具體的實(shí)施例可涉及鼠源PAM4抗體的組合物和使用方法，鼠源PAM4抗體優(yōu)選包 含如圖IA和圖IB所公開(kāi)的鼠源PAM4可變區(qū)序列(SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :11)。這種鼠源PAM4抗體或片段可用于離體或體外診斷技術(shù)，如組織樣本的免疫組織化學(xué)分析或體 液樣本的免疫測(cè)定，上述樣本取自疑患有胰腺癌或其它類型癌癥的受試者。其它具體的實(shí)施例可涉及嵌合PAM4抗體的組合物和使用方法，所述嵌合PAM4抗 體包含附著于人源抗體恒定區(qū)序列的鼠源可變區(qū)序列。優(yōu)選地，嵌合PAM4抗體或片段包含 圖2A和圖2B所示的cPAM4可變區(qū)序列(SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13)。這種嵌合抗體 在人體中比鼠源抗體的免疫原性要低，同時(shí)保持母體鼠源抗體的抗原結(jié)合特異性。嵌合抗 體用于癌癥的診斷和/或治療是本領(lǐng)域中熟知的。又一具體的實(shí)施例可涉及人源化PAM4抗體或其片段的組合物和使用方法，所述 人源化PAM4抗體或其片段包含如上討論的鼠源PAM4MAb的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及人源抗 體框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，人源化PAM4抗體或其片段的輕鏈和重 鏈可變區(qū)的FR包含至少一個(gè)從鼠源PAM4MAb的相應(yīng)FR上取代的氨基酸。還更優(yōu)選的是， 人源化PAM4抗體或其片段可包含至少一個(gè)選自鼠源PAM4重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基5、27、 30、38、48、66、67和69的氨基酸殘基(

圖1B)和/或至少一個(gè)選自鼠源PAM4輕鏈可變區(qū)的 氨基酸殘基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸(圖1A)。最優(yōu)選的是，人源化PAM4抗體 或其片段包含圖4B的hPAM4VH氨基酸序列(SEQID NO 19)和圖4A的hPAM4VK氨基酸序列 (SEQ ID NO 16)。在可供選擇的實(shí)施例中，抗胰腺癌抗體可以是同與嵌合PAM4(cPAM4)抗體相同的 抗原決定簇(表位)結(jié)合的鼠源、嵌合、人源化或人源抗體。如下面所討論，CPAM4抗體是 包含輕鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO :1)、CDR2 (STSNLAS, SEQID NO 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO 3)以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SYVLH, SEQ ID NO 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO 5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO 6)的抗 體。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)識(shí)別與相同抗原決定簇結(jié)合的抗體，例如通過(guò)使用cPAM4 抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗體和人胰腺粘蛋白作為靶抗原的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究(參見(jiàn)，例如下面的段落
的實(shí)例1)。阻斷(競(jìng)爭(zhēng))與CPAM4抗體的人胰腺粘蛋白結(jié)合的抗體被稱為交叉阻 斷抗體。優(yōu)選地，用包含人胰腺癌粘蛋白的提取物通過(guò)免疫法制備這種交叉阻斷抗體。另一實(shí)施例是癌細(xì)胞靶向診斷免疫共軛物，其包含與至少一種診斷(或檢測(cè))劑 結(jié)合的抗胰腺癌抗體、抗體片段或融合蛋白。優(yōu)選地，診斷劑選自放射性核素、造影劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑、順磁 離子、酶和光敏診斷劑。還更優(yōu)選地，診斷劑是能量在20至4000keV之間的放射性核素或 選自 110In、mh、177Lu、18F、52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc, 1201、 1231 , 1241 , 1251 , 131 1 , 154-158Gd,32P,nC,13N,150,186Re,188Re, 51Mn、52mMru55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、 83Sr或其它、-、或正電子發(fā)射體的放射性核素。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，如下面的實(shí) 例所述，診斷放射性核素18F用于標(biāo)記和PET成像。18F可通過(guò)以下方式附著于抗體、抗體片 段或肽，與諸如鋁之類的金屬絡(luò)合，18F-金屬絡(luò)合物與同靶向蛋白、肽或其它分子共軛的螯
I=I邵刀圣口 I=I O同樣優(yōu)選的是，診斷劑是順磁離子，如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷 (II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、 鈥(III)和鉺(III)，或者是不透輻射的材料，如鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、 碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、碘古酰胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、碘舒美酸(iosemetic acid)、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、 碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影鹽、丙碘酮和氯化亞鉈。還在其它實(shí)施例中，診斷劑是熒光標(biāo)記化合物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物或生物發(fā)光 化合物，其中熒光標(biāo)記化合物選自異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋 白、鄰苯二醛和熒光胺；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物選自魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖 啶鹽和草酸酯；生物發(fā)光化合物選自熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。在另一實(shí)施例中， 診斷免疫共軛物用于外科手術(shù)中、內(nèi)窺鏡檢查或血管內(nèi)腫瘤診斷。另一實(shí)施例是癌細(xì)胞靶向治療免疫共軛物，其包含與至少一種治療劑結(jié)合的抗體 或其片段或融合蛋白。優(yōu)選地，治療劑選自放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素拮抗劑、酶、 諸如反義寡核苷酸或siRNA之類的寡核苷酸、酶抑制劑、光敏治療劑、諸如藥物或毒素的細(xì) 胞毒素劑、血管生成抑制劑和促凋亡劑。在使用不止一種治療劑的實(shí)施例中，治療劑可包含 同一治療劑的多個(gè)拷貝或者另外包含不同治療劑的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，諸如反義分子或抑制bcl-2表達(dá)的siRNA (如美國(guó)專利 No. 5，734，033中所述，該專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文)之類的寡核苷酸可與免 疫共軛物或抗體融合蛋白共軛，或者形成免疫共軛物或抗體融合蛋白的治療劑部分?；蛘?， 寡核苷酸可與裸的或共軛的抗胰腺癌抗體或抗體片段(如PAM4抗體)同時(shí)或相繼地施用。 在優(yōu)選的實(shí)施例中，寡核苷酸是針對(duì)致癌基因或致癌基因產(chǎn)物(如bcl-2、p53、ras或其它 熟知的致癌基因)的反義寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施例中，治療劑是細(xì)胞毒素劑，如藥物或毒素。還優(yōu)選的是，所述藥物 選自氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉 素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位 絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素拮抗劑、內(nèi)皮抑素、 紫杉醇、喜樹(shù)堿、SN-38、阿毒素及其類似物、抗代謝物、烷化劑、抗有絲分裂物、抗血管生成 劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC 抑制劑、促凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-Il以及它們的組合。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，治療劑是選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核 糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)素、白喉毒素、假單 胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素以及它們的組合的毒素。或者是選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng) 因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞 生成素、促血小板生成素以及它們的組合的免疫調(diào)節(jié)劑。在其它優(yōu)選的實(shí)施例中，治療劑是選自lllIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、 67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、lllAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、 186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、 143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和2IlPb以及它們的組合的放射性核素。還優(yōu) 選的是隨俄歇發(fā)射粒子充分衰變的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67, Br_80m、Tc_99m、 Rh-103m、Pt-109、In-Ill、Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和 Ir-192。可用的 β -粒子發(fā) 射核素的衰變能優(yōu)選< 1，OOOkeV，更優(yōu)選< IOOkeV,最優(yōu)選< 70keV。還優(yōu)選的是隨α -粒 子的生成充分衰變的放射性核素。這種放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、 Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213 和 Fm-255。可用的 α -粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選為2，000-10, OOOkeV,更優(yōu)選為3，000-8, OOOkeV,最優(yōu)選 為4, 000-7, OOOkeV0有用的其它可能的放射性同位素包括11C、13N、150、75Br、198Au、 224AcU26IU33I,77BrU13mIn,95Ru,97RuU03RuU05RuU07Hg,203HgU21mTeU22mTe, 125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、 57&)、58(0、510、59!^、7556、20111、2254(；、7681~、169%等。在其它的實(shí)施例中，治療劑是選 自色原和染料的光敏治療劑。或者，治療劑是選自蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ -V-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇 脫氫酶、α -磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、 葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、 葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶的酶。這種酶例如可以和前體藥物結(jié)合使用，該前體藥物以相 對(duì)無(wú)毒性的形式施用并由酶在靶位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素劑。在其它替代形式中，藥物可由受 試者體內(nèi)的內(nèi)源性酶轉(zhuǎn)化為毒性較低的形式，但是也可由治療酶重新轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素的形 式。還可設(shè)想的是多價(jià)多特異性抗體或其片段，其包含至少一個(gè)對(duì)ΡΑΜ4靶抗原具有 親和力的結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)或多個(gè)對(duì)半抗原分子具有親和力的半抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地， 抗體或其片段是嵌合、人源化或全人抗體或其片段。半抗原分子可與靶向性構(gòu)建體共軛以 用于遞送一種或多種治療和/或診斷劑。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，如下面的實(shí)例所述，多價(jià) 抗體或其片段可以通過(guò)對(duì)接和鎖定(dock-and-lock，DNL)技術(shù)制備。如下所述，將結(jié)合了 hPAM4抗體片段的示例性DNL構(gòu)建體表示為TFlO。還可設(shè)想的是雙特異性抗體或其片段，其包含至少一個(gè)對(duì)PAM4靶抗原具有親和 力的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)選自以下的靶向性構(gòu)建體/共軛物具有親和力的結(jié)合位點(diǎn)DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP271)、DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP277)、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 288)、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 0281)、 NOTA-ITC benzyl-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 449)、NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP460)、NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 461)、NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 462)、NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP 465)、C-NETA-succinyl-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP467)、S-NETA-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP469)禾口L-NETA-succinyl-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 (IMP470)，其能夠攜帶至少一種診斷和/或治療劑。其它適用的靶向性構(gòu)建體公開(kāi)在例如專 利號(hào)為 6，576，746,6, 962，702,7, 052，872,7, 138，103,7, 172，751 和 7，405，320 的美國(guó)專利 以及序列號(hào)為12/112，289的美國(guó)專利申請(qǐng)中，以上內(nèi)容每個(gè)的實(shí)例部分以引用的方式并 入本文。其它實(shí)施例涉及包含至少二個(gè)如本文描述的抗胰腺癌抗體和其片段的融合蛋白 或其片段?；蛘?，融合蛋白或其片段可包含至少一個(gè)第一抗胰腺癌抗體或其片段以及至少一個(gè)第二 MAb或其片段。優(yōu)選地，第二 MAb與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合，所述腫瘤相關(guān)抗原例如 選自 CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、Lea、Lewis 抗原 Le(y)、CSAp、胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)、上皮糖蛋白_1 (EGP-I)、上皮糖蛋白-2 (EGP-2)、 CD-80、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)、碳酸酐酶 IX、腱生蛋白(tenascin)、IL-6、HLA-DR、CD40、 CD74 (例如，mi latuzumab)、CD 138 (多配體聚糖 _1)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC_5ac、 MUC-16、MUC-17, TAG-72、EGFR、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管生成因子(例如VEGF和 P1GF)、致癌基因產(chǎn)物(例如，bcl-2、KraS、p53)、CMET、HER2/neu以及與胃癌和結(jié)腸直腸癌 相關(guān)的抗原。抗體融合蛋白或其片段可進(jìn)一步包含至少一種診斷和/或治療劑。本文還描述了包含編碼本文所述的抗胰腺癌抗體、融合蛋白、多特異性抗體、雙 特異性抗體或其片段的DNA序列。其它實(shí)施例涉及包含編碼DNA序列的抗體的表達(dá)載 體和/或宿主細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可以是用突變Bcl-2基因，例如 三倍突變Bcl-2基因(T69E，S70E, S87E)轉(zhuǎn)化的Sp2/0細(xì)胞系，已經(jīng)使所述基因適應(yīng)于 細(xì)胞轉(zhuǎn)化和在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(參見(jiàn)，例如，2005年7月25日提交的美國(guó)專利 申請(qǐng)No. 11/187，863(現(xiàn)在授權(quán)的美國(guó)專利No.7，531，327)、2006年7月14日提交的 No. 11/487，215(現(xiàn)在授權(quán)的美國(guó)專利No. 7，537，930)以及2007年10月M日提交的 No. 11/877，728，這些專利中的每個(gè)的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。另一實(shí)施例涉及向靶物質(zhì)遞送診斷或治療劑或其組合的方法，包括(i)提供包含 與至少一種診斷和/或治療劑共軛的抗胰腺癌抗體或片段(如PAM4抗體或片段)的組合 物，以及(ii)對(duì)有需要的受試者施用本文中請(qǐng)求保護(hù)的抗體、抗體片段或融合蛋白中的任 一種的診斷或治療共軛物。還可設(shè)想對(duì)靶物質(zhì)遞送診斷劑、治療劑或它們的組合的方法，包括(a)對(duì)受試者 施用多價(jià)多特異性或雙特異性抗體或其片段中的任何一種，該多價(jià)、多特異性或雙特異性 抗體或其片段具有對(duì)PAM4抗原的親和力，且包含一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合位點(diǎn)；(b)等待足 夠量的時(shí)間以便使未與PAM4抗原結(jié)合的抗體從受試者血流中清除；以及(c)對(duì)所述受試者 施用包含與抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的診斷劑、治療劑或其組合的載體分子。優(yōu)選地，載體分子 與抗體的不止一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。本文描述了診斷或治療癌癥的方法，包括(a)對(duì)受試者施用本文請(qǐng)求保護(hù)的多 價(jià)、多特異性抗體或其片段中的任何一種，該多價(jià)多特異性抗體或其片段具有對(duì)PAM4抗原 的親和力，且包含一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合位點(diǎn)；(b)等待足夠量的時(shí)間以便使未結(jié)合的抗 體從受試者血流中清除；以及(c)對(duì)所述受試者施用包含與抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的診斷 劑、治療劑或其組合的載體分子。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述癌是胰腺癌。還優(yōu)選的是，該方 法可用于病變組織的術(shù)中鑒定、病變組織的內(nèi)窺鏡鑒定或病變組織的血管內(nèi)鑒定。另一實(shí)施例是治療受試者惡性腫瘤的方法，包括對(duì)所述受試者施用治療上有效量 的抗體或其片段，該抗體或其片段與PAM4抗原結(jié)合，任選與至少一種治療劑共軛?；蛘呖?體或其片段可以為裸抗體或其片段。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，在施用如上所述的另一種治療 劑之前、同時(shí)或之后施用所述抗體或片段。本文考慮到診斷受試者惡性腫瘤尤其是胰腺癌的方法，包括(a)對(duì)所述受試者施 用包括與PAM4抗原結(jié)合的抗體或其片段的診斷共軛物，其中所述MAb或其片段與至少一 種診斷劑共軛；以及(b)檢測(cè)結(jié)合至胰腺癌細(xì)胞或其它惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記抗體的存在與否，其中抗體的結(jié)合用于診斷胰腺癌或其它惡性腫瘤的存在與否。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體 或片段與胰腺癌結(jié)合而不與正常胰腺組織、胰腺炎或其它非惡性腫瘤結(jié)合。在次優(yōu)選的實(shí) 施例中，與非惡性腫瘤細(xì)胞相比，抗體或片段以顯著較高的水平與癌細(xì)胞結(jié)合，從而使得可 以從非惡性腫瘤中鑒別診斷癌癥。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，診斷劑可以是通過(guò)PET成像檢測(cè) 的F-18標(biāo)記的分子。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，諸如hPAM4抗體的抗胰腺癌抗體的使用使得可在惡性疾病 的早期以高特異性和靈敏度檢測(cè)和/或診斷胰腺癌。優(yōu)選地，診斷抗體或片段可以標(biāo)記至 少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選約100%的高、中和 低分化的胰腺癌以及90%或更多的侵襲性胰腺癌。所使用的抗胰腺癌抗體優(yōu)選可以檢測(cè) 85%或更多的PanIN-lA、PanIN_lB、PanIN_2、IPMN和MCN癌前病變。最優(yōu)選的是，使用抗 胰腺癌抗體的免疫測(cè)定可以檢測(cè)89 %或更多的全部PanIN、86 %或更多的IPMN以及92 %或 更多的MCN?？晒┻x擇的實(shí)施例涉及通過(guò)血液、血漿或血清樣本的體外分析而檢測(cè)個(gè)體中PAM4 抗原和/或診斷個(gè)體中胰腺癌的方法。優(yōu)選地，在使用諸如PAM4抗體的抗胰腺癌抗體處理 樣本以用于免疫檢測(cè)之前，使用諸如丁醇的有機(jī)溶劑對(duì)樣本進(jìn)行有機(jī)相提取。繼有機(jī)相提 取之后，使用諸如ELISA、夾心法免疫測(cè)定、固相RIA及類似技術(shù)的本領(lǐng)域已知的多種免疫 測(cè)定技術(shù)中的任一種來(lái)分析水相，以確定樣本中是否存在PAM4抗原。另一個(gè)實(shí)施例涉及治療受試者癌細(xì)胞的方法，包括對(duì)所述受試者施用包括與PAM4 抗原結(jié)合的裸抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步 包括施用第二裸抗體或其片段，其選自CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、抗-CEA、 抗-CEACAM6、抗-EGP-I、抗-EGP-2、抗-Lea、由Lewis抗原Le (y)定義的抗體、以及抗CSAp、 MUC-I、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、TAG_72、EGFR、CD40、HLA_DR、CD74、 ⑶138、血管生成因子(如，VEGF和胎盤樣生長(zhǎng)因子(PlGF))、胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)、腱 生蛋白、血小板源生長(zhǎng)因子、IL-6、致癌基因產(chǎn)物、cMET和HER2/neu的抗體。又一個(gè)實(shí)施例涉及診斷受試者中惡性腫瘤的方法，包括⑴用包括與PAM4抗原結(jié) 合的抗體或其片段的組合物對(duì)來(lái)自所述受試者的標(biāo)本進(jìn)行體外診斷化驗(yàn)，以及(ii)檢測(cè) 標(biāo)本中與惡性腫瘤細(xì)胞結(jié)合的抗體或片段的存在與否。優(yōu)選地，惡性腫瘤是癌。更優(yōu)選的 是，癌是胰腺癌。附圖簡(jiǎn)述圖1.鼠源PAM4抗體的可變區(qū)cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖IA示出鼠源 PAM4Vk 的 DNA (SEQ ID NO :8)和氨基酸(SEQ ID NO :9)序列。圖 IB 示出鼠源 PAM4VH 的 DNA(SEQ ID NO 10)和氨基酸(SEQ ID NO 11)序列。由對(duì)應(yīng)的DNA序列編碼的氨基酸序 列以一個(gè)字母代碼給出在核苷酸序列的下方。核苷酸序列的編碼在右側(cè)給出。CDR區(qū)的氨 基酸殘基以加粗并以下劃線的形式給出。如氨基酸殘基上方的編碼所示，對(duì)氨基酸殘基使 用Kabat Ig分子編碼。用字母編碼的氨基酸殘基為由Kabat編碼方案所定義的插入殘基。 插入殘基與前一個(gè)殘基的前面的位數(shù)相同。例如，圖IB中殘基82、82A、82B和82C分別以 82、A、B禾口 C表示。圖2. Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的嵌合PAM4(cPAM4)重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。圖 2A示出cPAM4Vk的氨基酸序列(SEQ ID NO :1 。圖2B示出cPAM4VH的氨基酸序列(SEQID N0:13)。序列以一個(gè)字母代碼給出。CDR區(qū)的氨基酸殘基以粗體和下劃線的形式示出。 氨基酸的編碼與圖1相同。圖3.人源抗體、PAM4和hPAM4的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的對(duì)比。圖3A 示出人源抗體 Walker (SEQ ID NO :14)與 PAM4(SEQ ID NO 9)禾口 hPAM4(SEQ ID NO :16)的 Vk氨基酸序列對(duì)比，且圖3B示出人源抗體Wil2(FRl-3) (SEQ ID NO :17)和NEWM(FR4) (SEQ ID NO 28)與 PAM4(SEQ ID NO :11)禾口 hPAM4(SEQ ID NO :19)的 VH氨基酸序列對(duì)比。圓點(diǎn) 表示與人源或人源化抗體的對(duì)應(yīng)殘基相同的PAM4的殘基?？蛐螀^(qū)表示CDR區(qū)。hPAM4的 N-和C-端殘基(下劃線)通過(guò)所用的分期載體(staging vector)固定。與圖1中一樣使 用Kabat Ig分子編碼方案來(lái)編碼殘基。圖4. Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的人源化PAM4 (hPAM4)重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸 序列。圖4A示出hPAM4VK的DNA(SEQ ID NO 15)和氨基酸(SEQ ID NO 16)序列，且圖4B 示出hPAM4VH的DNA(SEQ ID NO :18)和氨基酸(SEQ ID N0:19)序列。核苷酸序列的編碼 在右側(cè)給出。由對(duì)應(yīng)的DNA序列編碼的氨基酸序列以一個(gè)字母代碼給出。CDR區(qū)的氨基酸 殘基以粗體和下劃線的形式示出。與圖IA和圖IB中一樣將Kabat Ig分子編碼方案用于 氨基酸殘基。圖5.與嵌合PAM4的cPAM4相比，人源化PAM4抗體的hPAM4的結(jié)合活性。hPAM4 以菱形示出而cPAM4以封閉的圓示出。結(jié)果指出當(dāng)與125I_cPAM4競(jìng)爭(zhēng)與CaPanl抗原結(jié)合 時(shí)，hPAM4抗體和cPAM4的比較結(jié)合活性。圖6.患有不能手術(shù)的轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者用分次9°Y_hPAM4加吉西他濱治療的治 療前(左側(cè))和治療后(右側(cè))的PET/CT融合圖像。圓圈表示原發(fā)病灶的位置，其顯示治 療后PET/CT強(qiáng)度的顯著降低。圖7.患有不能手術(shù)的轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者用分次9°Y_hPAM4加吉西他濱治療的治 療前(左側(cè))和治療后(右側(cè))的3D PET圖像。箭頭指向原發(fā)病灶(右邊)和轉(zhuǎn)移(左 邊)的位置，其中的每一個(gè)顯示用放射性標(biāo)記的hPAM4加吉西他濱治療后PET圖像強(qiáng)度的 顯著降低。圖8.使用或不使用預(yù)靶向TFlO雙特異性抗胰腺癌粘蛋白抗體的情況下，使用 111^i標(biāo)記的diHSG肽(IMP288)的腫瘤體內(nèi)成像。圖8A-顯示腫瘤位置(箭頭)的小鼠。 圖8B顯示在TFlO雙特異性抗體存在(上方)和不存在(下方)的情況下用111In-標(biāo)記 的IMP288檢測(cè)到的腫瘤。圖 9. TF10、PAM4-IgG、PAM4-F(ab‘ )2 和單價(jià) bsPAM4 化學(xué)共軛物(PAM4_Fab‘ χ anti-DTPA-Fab')的示例性結(jié)合曲線。通過(guò)ELISA試驗(yàn)測(cè)定與靶粘蛋白抗原的結(jié)合。
圖10. CaPanl人胰腺癌異種移植物( 0. 25g)的免疫閃爍成像。㈧注 射雙特異性 TF10(80yg，5. 07xl0-1Qmol)然后 16 小時(shí)后施用 luIn-IMP-288 (30 μ Ci, δ.Ο χΙΟ-^πιοΙ)的小鼠圖像。圖像拍攝于3小時(shí)后。增強(qiáng)圖像的背景強(qiáng)度以與單獨(dú)施用 luIn-IMP-288(30yCi,5. 07xl0"nmol)時(shí)得到的圖像強(qiáng)度相當(dāng)。(B)單獨(dú)施用 mh-IMP_288 的小鼠中沒(méi)有觀察到靶向。(C)施用mh-D0TA-PAM4-IgGO0l·! Ci，50y 小時(shí)后拍攝的 小鼠圖像。盡管腫瘤是可見(jiàn)的，但是此時(shí)仍顯示相當(dāng)?shù)谋镜追派湫浴?圖11.攜帶有CaPanl人胰腺癌異種移植物的裸小鼠中 ulIn-D0TA-PAM4-IgG (20 μ Ci, 50 μ g)和 TF10-預(yù)靶向 luIn-IMP-288 (80 μ g, 5. 07xl(Tlclmol的TFlO然后16小時(shí)后施用30 μ Ci, 5. 07xl0"nmol的luIn-IMP-288)的擴(kuò)展生物分布(動(dòng) 物的預(yù)靶向和IgG組的平均腫瘤重量分別為+/-SD，0. 28+/-0. 21和0. 10+/-0. 06g)。圖 12.用 0. 15mCi 的 90Y_hPAM4IgG，或 0. 25 或 0. 50mCi 的 TFlO 預(yù)靶向 90Υ_ΙΜΡ_288 對(duì)確診的( 0. 4cm3)CaPanl腫瘤的單次治療的治療活性。圖13. PT-RAIT療法的吉西他濱增強(qiáng)作用效果。圖14.西妥昔單抗與吉西他濱和PT-RAIT組合的效果。圖15.使用基于PAM4的免疫測(cè)定的胰腺癌鑒別診斷。紅線顯示根據(jù)ROC分析的 為陽(yáng)性結(jié)果所選的截止水平。圖16.健康志愿者和患有各期胰腺癌的個(gè)體的患者血清中PAM4抗原的頻率分布。圖17. PAM4血清免疫測(cè)定的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式定義除非另外指明，“一個(gè)”或“一種”指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)。如本文所用，“約”指正或負(fù)10%。例如“約100”將包括90和110之間的任何數(shù)。術(shù)語(yǔ)“基本上小于，，指至少小于90 %、更優(yōu)選95 %，更優(yōu)選98 %、更優(yōu)選99 %、更 優(yōu)選99.9%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“PAM4抗體”包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人源PAM4 抗體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，PAM4抗體或其抗原結(jié)合片段包括SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6 的⑶R序列。如本文所用，“PAM4抗原”是由PAM4抗體結(jié)合的抗原。在優(yōu)選的實(shí)施例中，用DTT 或高碘酸鹽處理PAM4抗原抑制或阻止PAM4抗體的結(jié)合。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，PAM4抗原 是由胰腺癌細(xì)胞表達(dá)的粘蛋白的表位，諸如MUC-I或MUC-5。如本文所用，“抗胰腺癌抗體”是具有與PAM4抗體相同的診斷、治療和結(jié)合特性的 抗體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，“抗胰腺癌抗體”與PAM4抗體一樣結(jié)合于相同的表位?！胺莾?nèi)分泌胰腺癌”通常指產(chǎn)生于外分泌胰腺的癌癥。該術(shù)語(yǔ)不包括胰腺胰島瘤并 包括胰腺癌、惡性胰腺癌、腺鱗狀癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和巨大細(xì)胞癌以及諸如胰腺上皮內(nèi)瘤 變(PanIN)、粘液性囊性腫瘤(MCN)和胰內(nèi)粘液性腫瘤(IPMN)的癌前病變，其是腫瘤但還 不是惡性的。術(shù)語(yǔ)“胰腺癌”和“非內(nèi)分泌胰腺癌”在本文中互換使用。如本文所述，抗體指全長(zhǎng)的(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重組 過(guò)程形成的)免疫球蛋白分子(即，IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性 結(jié)合)部分，如抗體片段?？贵w片段是抗體的一部分，諸如F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。不管結(jié)構(gòu)如 何，抗體片段與由全長(zhǎng)抗體識(shí)別的同一抗原結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”還包括由抗體的可變區(qū) 構(gòu)成的獨(dú)立片段，諸如由重鏈和輕鏈的可變區(qū)和重組單鏈多肽分子構(gòu)成的"Fv"片段，其 中所述重鏈和輕鏈可變區(qū)由肽連接基("scFv蛋白")連接。裸抗體是不與治療或診斷劑共軛的抗體或其片段。通常來(lái)講，抗體分子的Fc部分 提供效應(yīng)器功能，諸如補(bǔ)體介導(dǎo)性細(xì)胞毒性(CDC)和ADCC (抗體依賴性細(xì)胞毒性)，這將運(yùn) 用機(jī)理從而使得細(xì)胞溶解。然而，可能不要求使用諸如信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其它機(jī)理使Fc部分發(fā)揮治療功能。裸抗體包括多克隆和單克隆抗體以及融合蛋白和某些重組抗體，諸如 嵌合抗體、人源化抗體或人源抗體。嵌合抗體是含有可變域的重組蛋白，可變域包括衍生自一個(gè)物種的抗體(優(yōu)選嚙 齒類動(dòng)物抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，而抗體分子的恒定域衍生自人源抗體的恒定域。對(duì)于 獸醫(yī)應(yīng)用，嵌合抗體的恒定域可衍生自諸如貓或狗之類的其它物種的恒定域。人源化抗體是重組蛋白，其中將一個(gè)物種的抗體(例如嚙齒類動(dòng)物抗體)的CDR 從嚙齒類動(dòng)物抗體的可變重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)變?yōu)槿嗽粗劓満洼p鏈可變域(例如骨架區(qū)序列)。 抗體分子的恒定域衍生自人源抗體的恒定域。在某些實(shí)施例中，母體(嚙齒類動(dòng)物)抗體 的有限數(shù)量的骨架區(qū)氨基酸殘基可被取代進(jìn)入人源抗體骨架區(qū)序列。人源抗體是例如衍生自轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體，該轉(zhuǎn)基因小鼠已被“基因改造”以響 應(yīng)于抗原刺激而產(chǎn)生特異性人源抗體。在這種技術(shù)中，將人源重鏈和輕鏈基因座元件引入 衍生自胚胎干細(xì)胞系的小鼠細(xì)胞株中，該胚胎干細(xì)胞系包含內(nèi)源性鼠源重鏈和輕鏈基因座 的定向破壞。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對(duì)特定抗原特異的人源抗體，并且小鼠可用來(lái)產(chǎn)生分泌人 源抗體的雜交瘤細(xì)胞。Green 等，Nature Genet. 7 :13(1994)、Lonberg 等，Nature 368 856(1994)和Taylor等，Int. Immun. 6 :579(1994)描述了從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人源抗體的方 法。還可以通過(guò)基因或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體展示技術(shù)來(lái)構(gòu)建全人源抗體，所有這些 方法在本領(lǐng)域中都是已知的。參見(jiàn)例如McCafferty等，Nature 348 :552-553(1990)，由未 免疫供體的免疫球蛋白可變域基因譜型體外產(chǎn)生人源抗體或其片段。在本技術(shù)中，將抗體 可變域基因在框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體的主或次外殼蛋白基因上，并以功能性抗體片段展示 在噬菌體粒子的表面。由于絲狀粒子含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能 性特性的選擇也導(dǎo)致編碼表現(xiàn)那些特性的抗體的基因的選擇。這樣，噬菌體模擬B細(xì)胞的 一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行，供參考，可以參見(jiàn)例如Johnson和Chiswell， Current Opiniion inStructural Biology 3 :5564-571 (1993)。也可以通過(guò)體外活化B 細(xì) 胞而產(chǎn)生人源抗體。參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5，567，610和No. 5，229，275，以上各專利的實(shí)例部分 以引用的方式并入本文。治療劑是化合物、分子或原子，其與抗體部分單獨(dú)、同時(shí)或相繼施用或與抗體部分 (即，抗體或抗體片段或亞片段)共軛，并且該治療劑在疾病治療中很有用。治療劑的實(shí)例 包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、促凋亡劑、抗血管生成劑、硼化 合物、光敏劑或染料和放射性同位素。使用的治療劑在下面進(jìn)行更詳細(xì)地描述。診斷劑是分子、原子或其它可檢測(cè)部分，其可與抗體部分或靶向構(gòu)建體共軛而施 用，并且可通過(guò)定位包含靶抗原的細(xì)胞而用于檢測(cè)或診斷疾病。有用的診斷劑包括但不限 于放射性同位素、染料(諸如使用生物素-鏈霉親和素復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或 分子以及用于磁共振成像(MRI)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)的增強(qiáng)劑(例如，順磁性離 子)。優(yōu)選地，診斷劑選自放射性同位素、用在磁共振成像中的增強(qiáng)劑和熒光化合物。為了 用放射性金屬或順磁性離子負(fù)荷抗體組分，有必要使抗體組分和具有長(zhǎng)尾的試劑反應(yīng)，該 長(zhǎng)尾附著有多個(gè)用于結(jié)合離子的螯合基團(tuán)。這樣的尾可以是諸如聚賴氨酸、多聚糖或其它 具有側(cè)基的衍生的或可衍生的鏈的聚合物，該側(cè)基可結(jié)合螯合基團(tuán)，諸如例如乙二胺四乙 酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA, ΝΟΤΑ、ΝΕΤΑ、卩卜啉、聚胺、冠狀醚、雙縮氨硫脲、 聚肟以及已知可用于此目的的有用的類似基團(tuán)。使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法將螯合物連接到抗體上。螯合物通常通過(guò)基團(tuán)連接于抗體，從而以最低的免疫活性損失和最小的凝集和/或內(nèi) 部交聯(lián)與分子形成鍵。其它更獨(dú)特的用于將螯合物與抗體共軛的方法和試劑公開(kāi)在美國(guó)專 利No. 4，擬4，659中，該專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。尤其有用的金屬-螯合 物組合包括2-芐基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物，它們?cè)谕ǔＤ芰糠秶鸀?0keV至 4000keV 內(nèi)與諸如 125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、mh、^GdH11。、1、、15。和 76Br的診斷同位素一起使用以用于放射成像。當(dāng)與諸如錳、鐵和釓的非放射性金屬絡(luò)合時(shí)， 相同的螯合物當(dāng)與本發(fā)明的抗體一同使用時(shí)對(duì)MRI有用。諸如N0TA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬 烷-N，N'，N"-三醋酸)、D0TA(l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四醋酸)和TETA(p-溴乙酰 氨基-芐基-四乙胺四醋酸)的巨環(huán)螯合物與多種金屬和放射金屬一起使用，更特別是分 別與鎵、銥和銅之類的放射性核素一起使用?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)受關(guān)注的金屬調(diào)整環(huán)的大小而使 得這些金屬-螯合物絡(luò)合物很穩(wěn)定。本發(fā)明包括諸如巨環(huán)聚醚的其它環(huán)形螯合物，此類環(huán) 形螯合物因穩(wěn)定結(jié)合諸如223Ra的核素以用于放射免疫治療(RAIT)而受到關(guān)注。最近，在 PET成像中使用的18F原子實(shí)質(zhì)上標(biāo)記任何分子的一般實(shí)用的技術(shù)已在美國(guó)專利申請(qǐng)序列 號(hào)12/112，觀9(現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利No. 7，563，433)中有所描述，該專利的實(shí)例部分以引 用的方式并入本文。免疫共軛物是與至少一種治療和/或診斷劑共軛的抗體、抗體片段或融合蛋白。 診斷劑可包括放射性核素或非放射性核素、造影劑(諸如用于磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層掃 描或超聲)，并且放射性核素可以是Y-、β_、α-、俄歇電子或正電子放射同位素。治療劑 可以是用于治療諸如癌癥的病情的任何制劑，在下面進(jìn)行更詳細(xì)地描述。表達(dá)載體是包括在宿主細(xì)胞中所表達(dá)的基因的DNA分子。通常，基因表達(dá)在某些 調(diào)控元件的控制下進(jìn)行，調(diào)控元件包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元件和增 強(qiáng)子。據(jù)說(shuō)這樣的基因“可操作地連接到”調(diào)控元件。重組宿主可以是任何含有克隆載體或表達(dá)載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ) 還包括那些經(jīng)基因工程改造以在宿主細(xì)胞染色體或基因組中含有一個(gè)或多個(gè)克隆基因的 原核或真核細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括諸如SP2/0細(xì)胞和NSO 細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞、以及中國(guó)地鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞株和其它可用于表達(dá)抗體 的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。如在2005年7月25日提交的11/187，863(現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利 No. 7，531，327)、2006年7月14日提交的11/487，215 (現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利No. 7，537，930) 以及2007年10月M日提交的11/877，728中所描述，對(duì)表達(dá)mAb和其它融合蛋白也特別 有用的是Sp2/0細(xì)胞，該Sp2/0細(xì)胞用諸如Bcl-EEE基因的凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染，而且適合在無(wú) 血清條件下生長(zhǎng)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染，以上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中兩個(gè)或更多個(gè) 具有相同或不同特異性的相同或不同的天然抗體、單鏈抗體或抗體片段連接。融合蛋白的 化合價(jià)表示融合蛋白具有的與抗原或表位結(jié)合的結(jié)合臂或位點(diǎn)的全部數(shù)量，即，單價(jià)的、二 價(jià)的、三價(jià)的或多價(jià)的?？贵w融合蛋白的多價(jià)指可在結(jié)合抗原中充分利用多種相互作用， 并因此增強(qiáng)結(jié)合至抗原的親合力。特異性表示多少個(gè)抗原或表位可與抗體融合蛋白結(jié)合， 即，單特異性的、雙特異性的、三特異性的、多特異性的。利用這些定義，天然抗體例如IgG 是二價(jià)的，原因是其有兩個(gè)結(jié)合臂，但其是單特異性的，原因是其與一個(gè)抗原結(jié)合。單特異 性的多價(jià)融合蛋白具有不止一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)，但是僅與同一抗原上的相同或不同的表位結(jié)合，例如具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈抗體與同一抗原發(fā)生反應(yīng)。融合蛋白可包括不同抗體 組分的多價(jià)或多特異性組合或相同抗體組分的多個(gè)拷貝。融合蛋白可另外包括治療劑。適 用于此類融合蛋白的治療劑的例子包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白”)和毒 素(“抗體-毒素融合蛋白”)。一種優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選重組RNA 酶。多特異性抗體是可以同時(shí)與至少兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的靶結(jié)合的抗體，該不同的結(jié) 構(gòu)為例如，兩個(gè)不同的抗原、同一抗原上兩個(gè)不同的表位、或半抗原和/或抗原或表位。多 特異性的多價(jià)抗體是具有不止一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)建體，并且該結(jié)合位點(diǎn)具有不同的特異 性。雙特異性抗體是可以同時(shí)與兩個(gè)不同的靶結(jié)合的抗體。雙特異性抗體(bsAb)和 雙特異性抗體片段(bsFab)可具有至少一個(gè)特異性地結(jié)合至例如與腫瘤相關(guān)的抗原的臂， 以及至少一個(gè)特異性地結(jié)合至攜帶治療或診斷劑的靶向共軛物的其它臂。采用分子工程可 產(chǎn)生多種雙特異性融合蛋白。PAM4 抗體本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例涉及以高選擇性與胰腺癌反應(yīng)的抗體，這與正常或良性的胰 腺組織相反。抗胰腺癌抗體或其片段優(yōu)選由人胰腺腫瘤的粗粘蛋白制劑進(jìn)行培養(yǎng)而得，盡 管也可使用部分純化或均勻純化的粘蛋白。這種抗體的非限制性實(shí)例是PAM4抗體。通過(guò)采用衍生自異種移植物RIP-I人胰腺癌作為免疫原而研發(fā)了鼠源 PAM4 (mPAM4)抗體(Gold 等，Int. J. Cancer, 57 =204-210,1994)。如下所述，抗體交叉反應(yīng)和 免疫組織化學(xué)染色研究表明PAM4抗體識(shí)別靶胰腺癌抗原上的唯一和新型表位。如在實(shí)例2 中描述的那些免疫組織化學(xué)染色研究顯示PAM4 Mab與由乳腺、胰腺和其它癌細(xì)胞所表達(dá) 的抗原結(jié)合，而與正常人組織的結(jié)合有限，然而，最高的表達(dá)通常由胰腺癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。因此， PAM4抗體對(duì)胰腺癌具有相對(duì)的特異性，并優(yōu)選結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。PAM4抗體與可內(nèi)在化的靶 表位反應(yīng)。該表位主要通過(guò)與胰腺癌相關(guān)的抗原而不是與局灶性胰腺炎或正常胰腺組織相 關(guān)的抗原而表達(dá)。通過(guò)用DTT或高碘酸鹽處理抗原可抑制PAM4抗體與PAM4表位的結(jié)合。 在動(dòng)物模型中使用放射性標(biāo)記PAM4MAb的定位和治療研究顯示出腫瘤靶向和治療功效。PAM4抗體與PAM4抗原結(jié)合，這通過(guò)許多器官和腫瘤型表達(dá)，但是優(yōu)選表達(dá)在胰腺 癌細(xì)胞中。諸如實(shí)例3中用PAM4MAb的研究表明該抗體表現(xiàn)幾種重要的特性，從而使得該 抗體成為臨床診斷和治療應(yīng)用的良好候選物。PAM4抗原對(duì)胰腺癌和其它癌癥的診斷和治療 提供有用的靶。PAM4抗體明顯地識(shí)別胰腺癌抗原的表位，而該胰腺癌抗原表位與被非PAM4 抗胰腺癌抗體(CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、CEACAM5、B72. 3、抗-Lea 和其它抗-Lewis 抗 原)識(shí)別的表位不同。適合與PAM4抗體結(jié)合或共同使用的抗體包括，例如，抗體CA19. 9、DUPAN2、SPAN1、 Nd2、B72. 3、CC49、抗-CEA、抗-CEACAM6、抗 _1^、抗-HLA-DR、抗-CD40、抗-CD74、抗-CD138, 以及由Lewis抗原Le (y)定義的抗體、或結(jié)腸特異性抗原_p (CSAp)的抗體、MUC-1、MUC-2、 MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17，EGP-1、EGP-2、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例 如，VEGF和P1GF)、胰島素類生長(zhǎng)因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源生長(zhǎng)因子和IL-6、以 及致癌基因的產(chǎn)物(bcl-2、Kras, p53)、cMET、和諸如Epstein等發(fā)明的專利(美國(guó)專利 No. 6，071, 491、No. 6，017, 514、No. 5，019, 368 和 No. 5，882，626)中描述的腫瘤壞死物質(zhì)的抗體。這類抗體對(duì)補(bǔ)充PAM4抗體免疫檢測(cè)和免疫治療方法會(huì)非常有用。當(dāng)在PAM4抗體的 施用之前、一起或之后施用時(shí)，這些和其它治療劑可以與諸如PAM4抗體的抗胰腺癌抗體協(xié) 同起作用。在治療應(yīng)用中，單獨(dú)結(jié)合PAM4抗體或結(jié)合其它與腫瘤相關(guān)的抗體(一個(gè)例子是 CD40的抗體)的抗體也非常有用，所述抗體對(duì)與對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)器細(xì)胞功能有關(guān)的免疫 調(diào)節(jié)劑有競(jìng)爭(zhēng)性或頡抗性。iTodryk 等，J. Immunol Methods, 248 :139-147(2001) ；Turner 等，J. Immunol, 166 :89-94 (2001)) 抗致癌基因的標(biāo)記物或產(chǎn)物(例如bcl_2、Kras、p53、 cMET)的抗體，或抗血管生成因子的抗體，諸如VEGFR和胎盤類生長(zhǎng)因子(PlGF)也很有用。與不同的PAM4抗原的表位結(jié)合的另一種PAM4樣抗體的可獲得性對(duì)雙決定簇酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是重要的，其用于檢測(cè)臨床樣本中的PAM4抗原。在實(shí)例1和5中描 述了 ELISA試驗(yàn)。描述于本文的鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源PAM4抗體及其片段對(duì)用 于診斷和/或治療方法的抗胰腺癌抗體是示例性的。下面的實(shí)例公開(kāi)了人源化PMA4抗體 的構(gòu)造和使用的優(yōu)選實(shí)施例。由于非人源單克隆抗體可被人類宿主識(shí)別為外源蛋白質(zhì)，并 且重復(fù)注射會(huì)導(dǎo)致有害的超敏反應(yīng)，因此鼠源抗體序列的人源化可以減少患者可能經(jīng)受的 不利的免疫反應(yīng)。對(duì)于鼠基單克隆抗體，這通常被稱為人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。優(yōu)選地， 人源化抗胰腺癌抗體或其片段的骨架區(qū)有些人殘基被與其相對(duì)應(yīng)的鼠殘基取代。也優(yōu)選的 是兩種不同的人源抗體的骨架序列的組合用于VH?？贵w分子的恒定域衍生自人源抗體的那 些。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是諸如人源PAM4抗體的人源抗胰腺癌抗體。人源抗體是例 如衍生自轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體，該轉(zhuǎn)基因小鼠已被“基因改造”以響應(yīng)于抗原刺激而產(chǎn)生特異 性人源抗體。在這種技術(shù)中，將人源重鏈和輕鏈基因座元件引入衍生自胚胎干細(xì)胞系的小 鼠細(xì)胞株中，該胚胎干細(xì)胞系包含內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座的定向破壞。轉(zhuǎn)基因小鼠可合 成對(duì)人源抗原特異的人源抗體，并且小鼠可用來(lái)產(chǎn)生分泌人源抗體的雜交瘤細(xì)胞。Green 等，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等，Nature 368 :856(1994)和 Taylor 等，ht. Immun. 6 =579(1994)描述了從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人源抗體的方法。還可以通過(guò)基因或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體顯示技術(shù)來(lái)構(gòu)建全人源抗體，所有 這些技術(shù)在本領(lǐng)域中都是已知的。參見(jiàn)例如McCafferty等，Nature 348 :552-553(1990)由 未免疫供體的免疫球蛋白可變域基因譜型體外產(chǎn)生人源抗體或其片段。在該技術(shù)中，將抗 體可變域基因在框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體的主或次外殼蛋白基因上，并以功能性抗體片段展 示在噬菌體粒子的表面。由于絲狀粒子含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功 能性特性的選擇也導(dǎo)致編碼表現(xiàn)那些特性的抗體的基因的選擇。這樣，噬菌體模擬B細(xì)胞 的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行，供參考，可以參見(jiàn)例如Johnson和Chiswell， Current Opiniion in Structural Biology 3:5564-571(1993)?？贵w制備特異性抗原的單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法獲得。參 見(jiàn)例如 Kohler 和 Milstein, Nature 256 :495(1975)及 Coligan 等(編著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第一卷，第 2· 5. 1-2. 6· 7 頁(yè)(John Wiley & Sons 1991)(下文 稱"Coligan")。簡(jiǎn)言之，通過(guò)給小鼠注射含有諸如PAM4抗原的胰腺癌的粘蛋白的組合物、除去血清樣本驗(yàn)證抗體產(chǎn)生的存在與否、除去脾以獲得B淋巴細(xì)胞、使B淋巴細(xì)胞和骨 髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞、克隆雜交瘤細(xì)胞、挑選產(chǎn)生PAM4抗原的抗體的陽(yáng)性克 隆、培養(yǎng)產(chǎn)生PAM4抗原的抗體的克隆、并從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中分離抗胰腺癌抗體，從而 可獲得抗胰腺癌MAb。初步培養(yǎng)免疫原的抗體之后，抗體可被定序并隨后可通過(guò)重組技術(shù)制備以產(chǎn)生嵌 合或人源化抗體。鼠源抗體和抗體片段的嵌合是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。衍生自嵌合的 單克隆抗體的抗體組分的使用減少了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問(wèn)題。用于克隆鼠免疫球蛋白可變域的常用技術(shù)描述在例如出版物Orlandi等，Proc Nat' 1 Acad. Sci. USA 86 :3833 (1989)中，該出版物以引用的方式并入本文。一般而言， 鼠源抗體的可變輕鏈)和VH(可變重鏈)序列可以通過(guò)多種諸如RT-PCR、5' -RACE和 cDNA庫(kù)篩選的分子克隆程序獲得。特別地，通過(guò)RT-PCR從雜交瘤細(xì)胞由PCR擴(kuò)增克隆鼠 源PAM4MAb的Vh和Vk序列，并且它們的序列通過(guò)DNA定序而確定。如Orlandi等，(ftx)c Natl. Acad. Sci.，USA，86 =3833,1989)所述，為確定它們的真實(shí)性，克隆的Vh和Vk基因可在 細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)為嵌合 AbjB Orlandi 等(Proc Natl. Acad. Sci.，USA, 86 :3833,1989) 所描述。在優(yōu)選的實(shí)施例中，嵌合PAM4抗體或抗體片段包括鼠源PAM4MAb的互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)和骨架區(qū)(FR)以及人源抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中嵌合PAM4的輕鏈可變 區(qū)的CDR包括具有氨基酸序列SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO 1)的CDRl、具有氨基酸序列 STSNLAS (SEQ ID NO 2)的 CDR2 和具有氨基酸序列 HQWNRYPYT(SEQ IDNO 3)的 CDR3 ；而嵌 合PAM4MAb的重鏈可變區(qū)的⑶R包括具有氨基酸序列SYVLH (SEQ ID NO 4)的⑶R1、具有氨 基酸序列 YINPYNDGTQYNEKFKG(SEQ ID NO 5)的 CDR2 和具有氨基酸序列 GFGGSYGFAY(SEQ ID NO 6)的CDR3。衍生自嵌合單克隆抗體的抗體組分的使用減少與鼠恒定區(qū)的免疫原性 相關(guān)的潛在問(wèn)題。鼠源抗體和抗體片段的人源化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是已知的。制備人源化 MAb 的技術(shù)公開(kāi)在，例如 Carter 等，Proc Nat' 1 Acad. Sci. USA 89 :4285(1992)、Singer 等，J. Immun. 150 :2844(1992)、Mountain 等，Biotechnol Genet Eng Rev. 10:1(1992)以及 Coligan第10. 19. 1-10. 19. 11頁(yè)，以上各文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。例如，可通過(guò)將鼠免 疫球蛋白的可變重鏈和可變輕鏈的鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變域，然后以相對(duì)應(yīng)的鼠殘基 取代骨架區(qū)內(nèi)人殘基從而制備人源化單克隆抗體。除了人恒定區(qū)序列，人骨架區(qū)序列的使 用進(jìn)一步減少誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)的機(jī)會(huì)。根據(jù)如上所述得到的PAM4可變區(qū)序列，如Leung等(MolImmunol. 32 1413(1995))所述可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建人源化PAM4抗體，該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。實(shí)例 1描述了用來(lái)構(gòu)建hPAM4MAb的人源化過(guò)程。用于制備hPAM4抗體的引物的核苷酸序列在下面的實(shí)例1中進(jìn)行討論。在優(yōu)選的 實(shí)施例中，人源化PAM4抗體或抗體片段包括上面公開(kāi)的輕鏈和重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO :6)。還優(yōu)選的是，人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的FR包括至少一個(gè)由鼠 源PAM4MAb所述對(duì)應(yīng)的FR取代氨基酸。例如人源PAM4的全人源抗體可以從轉(zhuǎn)基因非人類的動(dòng)物而獲得。參見(jiàn)例如 Mendez 等，Nature Genetics，15 :146-156 (1997)、美國(guó)專利 No. 5，633，425。例如，可從具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因鼠中回收人源抗體。通過(guò)失活內(nèi)源免疫球蛋白基因并引入 人免疫球蛋白基因座而人源化鼠體液免疫系統(tǒng)。人免疫球蛋白基因座極其復(fù)雜并包括大量 不連續(xù)片段，該大量不連續(xù)片段一起幾乎占到人基因組的0.2%。為確保轉(zhuǎn)基因小鼠可以 產(chǎn)生足夠量的抗體譜，必須將人重鏈和輕鏈基因座的大部分引入鼠基因組。該過(guò)程逐步完 成，其以含有生殖細(xì)胞系結(jié)構(gòu)中人重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的酵母人工染色體(YAC) 的形成開(kāi)始。由于每個(gè)插入物的大小約為1Mb，因此YAC構(gòu)建需要免疫球蛋白基因座的重 疊片段的同源重組。將一個(gè)含有重鏈基因座和一個(gè)含有輕鏈基因座的兩個(gè)YAC通過(guò)含YAC 酵母球芽與鼠胚胎干細(xì)胞的融合而分別引入小鼠。然后將胚胎干細(xì)胞克隆顯微注射入鼠胚 泡。對(duì)所得的嵌合雄鼠篩選其通過(guò)生殖細(xì)胞系傳遞YAC的能力因具有通過(guò)它們的生殖細(xì)胞系傳遞YAC的能力而篩選所得的嵌合雄鼠，并用在鼠 源抗體制備中有缺陷的小鼠進(jìn)行繁殖。繁殖兩種轉(zhuǎn)基因菌株，一種包含人重鏈基因座而另 一種包含人輕鏈基因座，從而產(chǎn)生響應(yīng)于免疫的人源抗體的后代。使用本領(lǐng)域中已知的方法可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備抗體。在一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)染 瘤培養(yǎng)物用于無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于人源化抗體的制備而言，使用HSFM在轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞可生長(zhǎng) 為500ml的培養(yǎng)物。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行離心并通過(guò)0. 2urn的膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾的培養(yǎng) 基以lml/min的流速通過(guò)蛋白質(zhì)-A柱(1x3cm)。然后用約10柱體積的PBS洗滌樹(shù)脂，并用 含有IOmM的EDTAWO. IM甘氨酸緩沖液(pH 3. 5)從柱上洗脫蛋白質(zhì)A結(jié)合抗體。將1. Oml 的鎦分收集在含有10 μ 1的3M Tris (pH 8.6)的試管中，并且蛋白質(zhì)濃度由下的 吸光度確定。收集峰值餾分，用PBS透析，例如用Centricon 30過(guò)濾器(Amicon，Beverly， ΜΑ)濃縮抗體。用ELISA確定抗體濃度，并且用PBS將其濃度調(diào)節(jié)到約lmg/ml。方便地將 0.01% (重量/體積)的疊氮化鈉加到樣本中作為防腐劑?？贵w可通過(guò)多種已知的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化。這類分離技術(shù)包 括使用蛋白A親和層析法、尺寸排阻層析法和離子交換層析法。參見(jiàn)例如Coligan第 2. 7. 1-2. 7. 12 頁(yè)和第 2. 9. 1-2. 9. 3 頁(yè)。另夕卜，參見(jiàn) Baines 等，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 10 卷中的〃 Purification of Immunoglobulin G(IgG)，“第 79-104 頁(yè) (TheHumana Press, Inc. 1992)。抗胰腺癌MAb可以通過(guò)多種本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的技術(shù)來(lái)表征。例如，抗體結(jié) 合到PAM4抗原的能力可以使用間接酶免疫測(cè)定法、流式細(xì)胞分析、ELISA或蛋白質(zhì)印跡分 析來(lái)驗(yàn)證?？贵w片段抗體片段是抗體的抗原結(jié)合部分，諸如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、 scFv等等?？梢酝ㄟ^(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特異表位的抗體片段。例如，可以通過(guò)抗體分子 的胃蛋白酶消化而制備F(ab' )2片段。這些和其它方法描述在，例如Goldenberg的美 國(guó)專禾Ij No. 4，036，945和No. 4，331，647以及其包含的參考文獻(xiàn)中。另外，參見(jiàn)Nisonoff 等，ArchBiochem. Biophys. 89 :230(1960) 、Porter, Biochem. J. 73 :119(1959)、 Edelman 等，在METHODS IN ENZYM0L0GY第1卷中，第422頁(yè)(學(xué)術(shù)出版社，1967)以及Coligan第 2. 8. 1-2. 8. 10頁(yè)和第2. 10-2. 10. 4頁(yè)?；蛘?，可以構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989， Science, 246 :1274-1281)以使得快速和容易地識(shí)別具有所需特異性的單克隆Fab ‘片段。單鏈Fv分子(scFv)包括VL域和VH域。VL域和VH域締合以形成靶結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)域進(jìn)一步由肽連接基(L)共價(jià)連接。如果VL域是scFv分子的N端部分，則scFv分子 表示為VL-L-VH ；或如果VH域是scFv分子的N端部分，則scFv分子則表示為VH-L-VL。用 于制備scFv分子和設(shè)計(jì)合適的肽連接基的方法描述在美國(guó)專利No. 4，704，692、美國(guó)專利 No. 4，946，778、R-Raag 和 M. Whitlow，“ SingleChain Fvs" . FASEB Vol 9 :73-80(1995) 以及 R. E. Bird 和 B. W. Walker, Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH, Vol 9 :132-137(1991)中。其它抗體片段，例如單域抗體片段，在本領(lǐng)域是已知的并且可用在所請(qǐng)求保護(hù)的 構(gòu)建體中。可采用標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)例如從駱駝、羊駝或美洲鴕中獲得單域抗體(VHH)。(參見(jiàn) 例如 Muyldermans 等，TIBS 26 230_2；35，2001、Yau 等，J Immunol Methods 281:161-75， 2003、Maass 等，J Immunol Methods 324 :13_25，2007)。VHH可具有有效的抗原結(jié)合能力并 且可與對(duì)常規(guī)VH-VL隱蔽的新型表位相互作用(Muyldermans等，2001)。羊駝血清IgG包 含約50%的駱駝科重鏈僅有的LgG抗體(HCAb) (Maass等，2007)。可用已知的諸如TNF- α 的抗原免疫羊駝，而且可分離與靶抗原結(jié)合并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。擴(kuò)增幾 乎所有羊駝VHH編碼序列的PCR引物已經(jīng)被識(shí)別并可用來(lái)構(gòu)建羊駝VHH噬菌體展示庫(kù)，該 羊駝VHH噬菌體展示庫(kù)可用于采用本領(lǐng)域所已知的標(biāo)準(zhǔn)篩選技術(shù)來(lái)分離抗體片段(Maass 等，2007)。抗體片段也可以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的蛋白質(zhì)水解或在大腸桿菌或其它宿主中表達(dá)編 碼該片段的DNA而制備?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全長(zhǎng)抗體而獲得抗 體片段。例如，通過(guò)用胃蛋白酶使抗體酶裂解而制備抗體片段以得到大約IOOkd的片段，表 示為F(ab' )2。可使用硫醇還原劑進(jìn)一步裂解該片段，并可選為由二硫鍵的裂解所得到的 巰基基團(tuán)的保護(hù)基，以產(chǎn)生大約50Kd的Fab'單價(jià)片段。或者，使用胃蛋白酶的酶裂解直接 產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。另一種形式的抗體片段是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是抗體可變 區(qū)的片段，其在結(jié)構(gòu)上與和抗體結(jié)合的表位互補(bǔ)并比可變區(qū)的其它部分更可變。因此， ⑶R有時(shí)被稱為高變區(qū)?？勺儏^(qū)包括三個(gè)⑶R。⑶R可通過(guò)構(gòu)建編碼受關(guān)注抗體的⑶R 的基因而獲得。制備這種基因的方式例如是使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以從抗體產(chǎn)生細(xì) 胞的 RNA 合成可變區(qū)。參見(jiàn)，例如 Larrick 等，Methods :A Companion toMethods in Enzymology 2 :106(1991)、MONOCLONAL ANTIBODIES :PR0DUCTI0N, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等(編著)中第 I66-I79 頁(yè)，Courtenay-Luck，“ Genetic Manipulationof Monoclonal Antibodies,“(劍橋大學(xué)出版社，1995)、以及 MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(編著)中第 137-185 頁(yè)，Ward 等， “Genetic Manipulation andExpression of Antibodies, " (ffiley-Liss, Inc. 1995)。只要片段與由完整抗體識(shí)別的抗原結(jié)合，也可使用其它裂解抗體的方法，如分離 重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段、片段的進(jìn)一步裂解或其它酶、化學(xué)或基因技術(shù)?？贵w融合蛋白包括受關(guān)注抗胰腺癌抗體的融合蛋白可通過(guò)多種常規(guī)程序來(lái)制備，從戊二醛連接 到官能團(tuán)之間更特異的連接。通過(guò)抗體或片段上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，例如氨基、羧基、 苯基、硫醇或羥基，包括本文所述的融合蛋白的抗體和/或抗體片段彼此優(yōu)選直接或通過(guò)連接基部分相互共價(jià)結(jié)合。除戊二醛之外，可使用多種常規(guī)連接基，例如二異氰酸酯、二 異硫氰酸酯(diiosothiocyanate)、二(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、羥基馬來(lái)酰亞胺 (maleimidehydroxy)琥珀酰亞胺酯等等。制備融合蛋白的簡(jiǎn)單方法是在存在戊二醛存在時(shí)將抗體或片段混合。起始席夫堿 (Schiff base)連接，例如可通過(guò)硼氫化物還原至仲胺而穩(wěn)定?？墒褂枚惲蚯杷狨セ蛱级?亞胺取代戊二醛作為非位點(diǎn)特異性連接基。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體融合蛋白包括抗胰腺癌 MAb或其片段，其中Mab與PAM4抗原結(jié)合。融合蛋白和其片段優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。這種 單價(jià)單特異性MAb用于抗原的直接靶向，其中MAb附著于治療劑、診斷劑或它們的組合，而 且將蛋白質(zhì)直接施用給患者。相反，融合蛋白可包括至少兩個(gè)與PAM4抗原的不同表位結(jié)合的抗胰腺癌MAb。 例如，MAb可產(chǎn)生抗原特異性雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體，它們是多價(jià)的但對(duì)PAM4抗 原是單特異性的。兩個(gè)或多個(gè)scFv分子的非共價(jià)締合可形成功能性雙鏈抗體、三鏈抗體 和四鏈抗體。單特異性抗體是同一 scFv的同源二聚體，其中每個(gè)scFv包括所選抗體的 VH域，其通過(guò)短連接基連接到同一抗體的VL域。雙鏈抗體是由兩個(gè)scFv的締合而形成 的二價(jià)二聚體，產(chǎn)生兩個(gè)Fv結(jié)合位點(diǎn)。三鏈抗體由三個(gè)scFv形成三價(jià)三聚體而得到， 產(chǎn)生三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；并且四鏈抗體是四個(gè)scFv的四價(jià)四聚體，產(chǎn)生四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。使用 含有重組基因構(gòu)建體(含有VHl-連接基-VL1)的表達(dá)載體已經(jīng)制備了若干單特異性雙 鏈抗體。參見(jiàn) Holliger 等，Proc Natl. Acad. Sci USA 90 :6444-6448 (1993)、Atwell 等， Molecular Immunology 33 :1301-1302(1996)、Holliger 等，Nature Biotechnology 15: 632-631(1997) ；Helfrich 等，Int J Cancer 76:232-239(1998) ；Kipriyanov 等，Int J Cancer 77 :763-772 (1998)、Holiger 等，Cancer Research 59 :2909-2916 (1999)) 構(gòu)建 scFv的方法描述于美國(guó)專利No. 4，946，778(1990)和美國(guó)專利No. 5，132，405(1992)中，以 上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文?；趕cFv制備多價(jià)單特異性抗體的方法公 開(kāi)在美國(guó)專利 No. 5，837，242 (1998)、美國(guó)專利 No. 5，844，094 (1998)和 W0-98/44001 (1998) 中，以上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。多價(jià)單特異性抗體融合蛋白與可位于 同一抗原或不同抗原上的兩個(gè)或更多個(gè)同種類型的表位結(jié)合。增加的化合價(jià)允許其它的相 互作用、增強(qiáng)的親和力和更長(zhǎng)的停留時(shí)間。這些抗體融合蛋白可用在直接靶向系統(tǒng)中，其中 抗體融合蛋白與治療劑、診斷劑或它們的組合共軛并直接施用給對(duì)其有需求的患者。優(yōu)選的實(shí)施例是多價(jià)多特異性抗體或其片段，其包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)PAM4靶表位 有親和力的抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及一個(gè)或多個(gè)與胰腺癌相關(guān)的其它表位的其它結(jié)合位點(diǎn)。由 于這種融合蛋白與至少兩個(gè)不同的表位結(jié)合，所以其是多特異性的，上述兩個(gè)不同的表位 可位于相同或不同的抗原上。例如，融合蛋白可包括不止一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，第一位點(diǎn)對(duì) PAM4抗原表位具有親和力，而第二位點(diǎn)對(duì)諸如TAG-72或CEA的其它靶抗原具有親和力。另 一個(gè)例子是雙特異性抗體融合蛋白，其可包括CA19. 9MAb (或其片段)和PAM4MAb (或其片 段)。這樣的融合蛋白將對(duì)CA19.9以及PAM4抗原具有親和力?？贵w融合蛋白和其片段可 用在直接靶向系統(tǒng)中，其中抗體融合蛋白與治療劑、診斷劑或它們的組合共軛并直接施用 給對(duì)其有需求的患者。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是多價(jià)多特異性抗體，其包括至少一個(gè)對(duì)PAM4靶表位有親 和力的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)半抗原分子有親和力的半抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，雙特異性融合蛋白可包括679MAb (或其片段)和PAM4MAb (或其片段)。單克隆679抗體以高親和力 與包含三肽部分組胺琥珀酰胺甘氨酸胺(histamine succinyl glycyl) (HSG)的分子結(jié)合。 這樣的雙特異性PAM4抗體融合蛋白，例如，可通過(guò)從如上所述的679獲得F(ab' )2片段 而制備。用DTT緩慢地還原679F(ab' )2片段的鏈間二硫鍵以形成Fab‘ -SH片段，其中 要注意避開(kāi)輕-重鏈連接。用過(guò)量的雙馬來(lái)酰亞胺連接基(1，1' _(亞甲基二-4，1-亞苯 基)雙馬來(lái)酰亞胺)激活一個(gè)或多個(gè)SH基團(tuán)。PAM4MAb轉(zhuǎn)化為Fab' -SH，然后與活化的 679Fab' -SH片段反應(yīng)以得到雙特異性抗體融合蛋白。諸如這樣的雙特異性抗體融合蛋白 可用在親和力增強(qiáng)系統(tǒng)中，其中用融合蛋白預(yù)靶向靶抗原，隨后用附著于包含一個(gè)或多個(gè) HSG半抗原的載體部分(靶向構(gòu)建體)的診斷或治療劑靶向。在替代的優(yōu)選實(shí)施例中，可以 制備諸如TFlO的DNL基hPAM4-679構(gòu)建體并按下面實(shí)例所述而使用?？赏ㄟ^(guò)多種常規(guī)方法和基因工程來(lái)制備雙特異性抗體，常規(guī)方法為例如全I(xiàn)gG、或 優(yōu)選F(ab' )2片段的混合物的二硫化物裂解和改造，融合不止一種雜交瘤細(xì)胞以形成多 瘤病毒，其產(chǎn)生具有不止一種特異性的抗體。通過(guò)Fab'片段的氧化裂解已經(jīng)制備了雙特 異性抗體融合蛋白，該Fab'片段得自不同抗體的還原裂解。這可以有利地進(jìn)行，方式是 混合兩種不同的由兩種不同抗體的胃蛋白酶消化而產(chǎn)生的F(ab' )2片段，還原裂解以形 成Fab'片段的混合物，然后進(jìn)行二硫鍵的氧化改造以產(chǎn)生包括雙特異性抗體融合蛋白的 F(ab' )2片段混合物，該雙特異性抗體融合蛋白包含對(duì)每個(gè)原表位特異的Fab'部分。例 如在 Nisonoff 等，Arch Biochem Biophys. 93 :470 (1961)、Hmmerling 等，J Exp Med. 128 1461(1968)以及美國(guó)專利No. 4，331，647中可以找到制備抗體融合蛋白的一般技術(shù)。通過(guò)使用諸如羥基馬來(lái)酰亞胺琥珀酰亞胺酯的異雙官能連接基可得到更具選擇 性的連接。使酯和抗體或片段反應(yīng)將在抗體或片段上衍生氨基，并且該衍生物可以隨后和 例如具有游離巰基基團(tuán)的抗體Fab片段(或具有通過(guò)例如Traut試劑附加到其上的巰基基 團(tuán)的較大片段或完整抗體)反應(yīng)。這樣的連接基不太可能交聯(lián)于同一抗體中的基團(tuán)并改善 連接的選擇性。連接位于遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上的抗體或片段是有利的。如上所述，這可 以通過(guò)例如至裂解的鏈間巰基基團(tuán)的連接來(lái)完成。另一方法涉及使具有氧化的碳水化合 物部分的抗體與具有至少一種游離胺功能的抗體反應(yīng)。這產(chǎn)生起始席夫堿連接，其優(yōu)選 通過(guò)還原至仲胺，例如通過(guò)硼氫化物還原而穩(wěn)定以形成最終復(fù)合物。對(duì)于小分子，這種位 點(diǎn)特異性連接公開(kāi)在美國(guó)專利No. 4，671，958中，而對(duì)于較大的附加物則公開(kāi)在美國(guó)專利 No. 4，699，784中，以上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。具有長(zhǎng)度大于12個(gè)氨基酸殘基的連接基(例如15個(gè)或18個(gè)殘基連接基)WkFv 允許在同一鏈上的VH和VL域之間的相互作用，并且通常形成單體、二聚體(稱為雙鏈抗 體)和少量較大質(zhì)量多聚體的混合物(Kortt等，Eur J Biochem. (1994)221 :151-157)。然 而，具有長(zhǎng)度為5個(gè)或更少氨基酸殘基的連接基的kFv抑制同一鏈上的VH和VL域的分子 內(nèi)的配對(duì)，迫使與不同鏈上的VH和VL域的配對(duì)。3個(gè)和12個(gè)殘基之間的連接基主要形成 二聚體(Atwell 等，ProteinEngineering(1999) 12 :597-604)。通過(guò) O 和 2 個(gè)殘基之間的 連接基形成三聚體的(稱為三鏈抗體)、四聚體的(稱為四鏈抗體)或更高低聚物的結(jié)構(gòu) WscFv ；然而，除連接基長(zhǎng)度之外，低聚反應(yīng)的準(zhǔn)確模式看來(lái)還取決于組合物以及V域的取 向。
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最近，以幾乎任何所需的組合構(gòu)建抗體、抗體片段和/或其它效應(yīng)器部分的混合 物的新型技術(shù)已經(jīng)描述于2006年3月M日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/389，358 (現(xiàn)在 發(fā)布的美國(guó)專利7，550，143),2006年3月觀日提交的11/391，584 (現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利 7，521，056) ,2006 年 6 月 29 日提交的 11/478，021 (現(xiàn)在發(fā)布的 7，534，866) ,2006 年 12 月 5日提交的11/633，729(現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利7，527，787)、以及2007年10月沈日提交的 11/925，408，以上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。一般被稱為對(duì)接和鎖定的技 術(shù)涉及融合蛋白的制備，該融合蛋白在它們的N端或C端具有兩個(gè)互補(bǔ)肽序列中的一個(gè)，被 稱為二聚和停靠域(DDD)和錨定域(AD)序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，DDD序列衍生自cAMP依 賴的蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基，而AD序列衍生自A型激酶錨定蛋白(AKAP)的序列。DDD序列形 成與AD序列結(jié)合的二聚體，這使得形成三聚體、四聚體、六聚體或多種其它復(fù)合物中的任 一種。通過(guò)將諸如抗體或抗體片段的效應(yīng)器部分附著于DDD和AD序列，復(fù)合物可由抗體或 抗體片段的任何所選組合而形成。通過(guò)形成二硫鍵和其它連接可使DNL復(fù)合物共價(jià)穩(wěn)定?？墒褂冒ㄈ魏我阎目筎AA抗體的抗原結(jié)合可變區(qū)序列的雙特異性抗體，包括 但不限于hPAM4 (美國(guó)專利No. 7，282, 567)、hA20 (美國(guó)專利No. 7，251，164)、hA19 (美國(guó)專 利 No. 7，109，304)、hIMMU31 (美國(guó)專利 No. 7，300，655)、hLLl (美國(guó)專利 No. 7，312，318)、 hLL2 (美國(guó)專禾Ij No. 7，074，403)、hMu-9 (美國(guó)專利 No. 7，387，773)、hL243 (美國(guó)專利申 it No. 11/368，296)、hMN_14(美國(guó)專利 No. 6，676，924)、hRS7(美國(guó)專利 No. 7，238，785)、 hMN-3(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/672，278)和hRl (2009年1月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)序列號(hào)61/145，896)，以上所引用各專利或申請(qǐng)的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。所使用的其它抗體可從很多已知的來(lái)源商購(gòu)獲得。例如，多種抗體分泌雜交瘤細(xì) 胞株可得自 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)。許多抗各種疾病 靶的抗體，包括但不限于與腫瘤相關(guān)的抗原，所述抗原已存放于ATCC和/或已經(jīng)公布了可 變區(qū)序列并且在所要求保護(hù)的方法和組合物中可用。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No. 7，312，318、
7,,282，567、7，151，164、7,074，403、7,060，802、7,056，509、7，049，060’.7:,045,,132、7，041，803、7，041，802、7，041，293、7，038，018>7:’ 037:’ 498、7，012，133、7，001，598、6，998，468、6，994，976、6，994，852、6，989，241、6:,974;,863、6，965，018、6，964，854、6，962，981、6，962，813、6，956，107、6，951，924、6:,949,244、6，946，129、6，943，020、6，939，547、6，921，645、6，921，645、6，921，533、6:,919;,433、6，919，078、6，916，475、6，905，681、6，899，879、6，893，625、6，887，468>6,,887,,466、6，884，594、6，881，405、6，878，812、6，875，580、6，872，568、6，867，006、6:’ 864:’ 062、6，861，511、6，861，227、6，861，226、6，838，282、6，835，549、6，835，370、6:,824;,780、6，824，778、6，812，206、6，793，924、6，783，758、6，770，450、6，767，711、6:,764;,688、6，764，681、6，764，679、6，743，898、6:,733;,981’.6，730，307、6，720，15、,6，716，966-.6,709，653、6，693，176、6，692，908、6，689，607、6，689，362、6，689，355>6,,682,,737、6，682，736、6，682，734、6，673，344,6，653，104、6，652，852、6，635，482、6，630，144、6，610，833、6，610，294、6，605，441、6，605，279、6，596，852、6，592，868、6，576，745、6，572；856、6，566，076、6，562，618、6，545，130、6，544，749、6，534，058、6:,528;,625、6，528，269、6，521，227、6，518，404,6，511，665、6，491，915、6，488，930、6:,482;,598、6，482，408、6，479，247、6，468，531、6，468，529、6，465，173、6，461，823>6,,458,,356、6，455，044、6，455，040、6，451，310,6,444，206、6，441，143,6,432，404,6，432，402、6，419，928、6，413，726、6，406，694,6，403，770、6，403，091,6，395，276,6,395，274、6，387，350、6，383，759、6，383，484,6，376，654、6，372，215,6,359，126,6,355，481、6，355，444、6，355，245、6，355，244,6,346，246、6，344，198,6,340，571,6，340，459、6，331，175、6，306，393、6，254，868,6，187，287、6，183，744,6，129，914,6,120，767、6，096，289、6，077，499、5，922，302,5，874，540、5，814，440,5，798，229,5，789，554、5，776，456、5，736，119、
5，716，595,5, 677，136,5, 587，459,5, 443，953,5, 525，338，以上各專利的實(shí)例部分以引用
的方式并入本文。這些僅僅是示例性的并且許多其它抗體及其雜交瘤細(xì)胞在本領(lǐng)域中是已 知的。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可通過(guò)對(duì)ATCC、NCBI和/或USPTO數(shù)據(jù)庫(kù)簡(jiǎn)單的檢索而獲得幾乎 抗任何疾病相關(guān)抗原的抗體序列或抗體分泌雜交瘤細(xì)胞，上述數(shù)據(jù)庫(kù)含有抗所選受關(guān)注的 與疾病相關(guān)靶的抗體。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可將克隆抗體的抗原結(jié)合域擴(kuò)增、切除 或結(jié)扎到表達(dá)載體中、轉(zhuǎn)染到適合的宿主細(xì)胞中并用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)。預(yù)靶向雙特異性或多特異性抗體可用在預(yù)靶向技術(shù)中。預(yù)靶向是多步過(guò)程，起初其是研 發(fā)用以解決直接靶向抗體的血液緩慢清除，其對(duì)諸如骨髓的正常組織具有不良毒性。使用 預(yù)靶向?qū)⒎派湫院怂鼗蚱渌委焺└街诳稍跀?shù)分鐘內(nèi)從血液清除的小遞送分子(靶向 構(gòu)建體或靶向共軛物)。首先施用對(duì)靶向構(gòu)建體以及靶抗原具有的結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)靶向雙特 異性或多特異性抗體，使游離的抗體從循環(huán)中清除，然后施用靶向構(gòu)建體。預(yù)靶向方法在本領(lǐng)域是已知的，例如公開(kāi)在Goodwin等，美國(guó)專利No. 4，863，713、 Goodwin 等，J. Nucl. Med. 29 :226，1988、Hnatowich 等，J. Nucl. Med. 28 :1294,1987、Oehr 等，J. Nucl. Med. 29 :728，1988、Klibanov 等，J. Nucl. Med. 29 :1951,1988, Sinitsyn 等， J. Nucl. Med. 30 :66，1989、Kalofonos 等，J. Nucl. Med. 31 :1791, 1990、Schechter 等， Int. J. Cancer 48 :167，1991、Paganelli 等，Cancer Res. 51 :5960,1991、Paganelli 等， Nucl. Med. Commun. 12 :211，1991、美國(guó)專利 No. 5，256，395、Mickney 等，Cancer Res. 51 6650，1991、Yuan 等，Cancer Res. 51 :3119，1991、美國(guó)專利 No. 6，077，499、美國(guó)專利序 列號(hào)09/597，580、美國(guó)專利序列號(hào)10/361，026、美國(guó)專利序列號(hào)09/337，756、美國(guó)專利 序列號(hào)09/823，746、美國(guó)專利序列號(hào)10/116，116、美國(guó)專利序列號(hào)09/382，186、美國(guó)專 利序列號(hào) 10/150，654、美國(guó)專利 No. 6，090，381、U. S. Pat. No. 6，472，511、美國(guó)專利序列 號(hào)10/114，315、美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/386，411、美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/345,641、 美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/3328, 835、美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/426, 379、美國(guó)專利序列號(hào) 09/823，746、美國(guó)專利序列號(hào)09/337，756、美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/342, 103和美國(guó)專利 No. 6，962，702 中。可提供治療或診斷受試者疾病或紊亂的預(yù)靶向方法，方式為(1)向受試者施用 雙特異性抗體或抗原結(jié)合抗體片段；( 可選地向受試者施用清除組合物，并且使組合物 從循環(huán)中清除抗體；以及(3)向受試者施用包含一種或多種螯合或化合治療劑或診斷劑的 靶向構(gòu)建體。該技術(shù)也可用于抗體依賴性酶前體藥物療法(ADEPT)，方式是施用與靶向構(gòu)建 體共軛的酶，然后施用通過(guò)酶轉(zhuǎn)化為活性形式的前體藥物。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞表達(dá)載體是包括在宿主細(xì)胞中所表達(dá)的基因的DNA分子。通常，基因表達(dá)在某些調(diào)控元件的控制下進(jìn)行，調(diào)控元件包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元件和增 強(qiáng)子。據(jù)說(shuō)這樣的基因“可操作地連接到”調(diào)控元件。啟動(dòng)子是指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序 列。結(jié)構(gòu)基因是被轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)的DNA序列，然后信使RNA被翻譯為肽或蛋白質(zhì)。 如果啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么響應(yīng)于誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)錄的速率增加。相反，如果啟動(dòng)子是組 成型啟動(dòng)子，那么轉(zhuǎn)錄的速率不受誘導(dǎo)劑的調(diào)控。增強(qiáng)子是不管其相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的 距離或取向而可增加轉(zhuǎn)錄效率的DNA調(diào)控元件。單獨(dú)的DNA分子是沒(méi)有并入細(xì)胞或有機(jī)體的染色體DNA的DNA片段。在優(yōu)選的實(shí) 施例中，待表達(dá)的DNA序列將被包裝進(jìn)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中其優(yōu)選 地并入宿主細(xì)胞染色體DNA。例如通過(guò)化學(xué)合成較短的寡核苷酸并裝配成蛋白質(zhì)編碼序列 而構(gòu)建任何所選序列的核酸的方法在本領(lǐng)域是已知的。作為另外一種選擇，可以使用限制 性核酸內(nèi)切酶切割受關(guān)注的DNA序列并拼接在一起以制備所選的蛋白質(zhì)編碼序列。在所編 碼的蛋白序列中產(chǎn)生特定變化的其它技術(shù)(諸如定點(diǎn)誘變)也是已知的?？寺≥d體是DNA分子，諸如質(zhì)粒、粘?；蚴删w，其具有在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的 能力?？寺≥d體通常包含一個(gè)或少數(shù)的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以及標(biāo)記物基因，其中 在所述限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)上外源DNA序列可以可測(cè)的方式插入而沒(méi)有損失載體的基 本生物功能，所述標(biāo)記物基因適用于用克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的識(shí)別和選擇。標(biāo)記物基因通 常包括對(duì)四環(huán)素、氨芐青霉素、卡那霉素或其它抗生素有耐藥性的基因。重組宿主可以是包 含克隆載體或表達(dá)載體的任何原核或真核細(xì)胞。這個(gè)術(shù)語(yǔ)還包括那些已經(jīng)被基因工程改造 的原核或真核細(xì)胞以在宿主細(xì)胞的染色體或基因組中包含一個(gè)或多個(gè)克隆基因。合適的宿主細(xì)胞包括微生物或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主是人細(xì)胞系PER. C6，其研發(fā)用于產(chǎn)生MAb和其它融合蛋白。因此，優(yōu)選的實(shí)施例是包括DNA序列的宿主細(xì) 胞，該DNA序列編碼抗胰腺癌MAb、共軛物、融合蛋白或其片段。使用包含Ad血清型5 (Ad5) ElA-和ElB-編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原發(fā)人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞，并在人 磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子的控制下產(chǎn)生PER. C6細(xì)胞(W0 97/00326) 0可使用其它哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括諸如SP2/0細(xì)胞和NSO細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞、 以及中國(guó)地鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞株和其它可用于表達(dá)抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞。如在2005年7月25日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/187，863 (現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利 No. 7，531，327)、2006年7月14日提交的11/487，215 (現(xiàn)在發(fā)布的美國(guó)專利No. 7，537，930) 和2007年10月M日提交的11/877，728中所描述，對(duì)表達(dá)mAb和其它融合蛋白也特別有 用的是Sp2/0細(xì)胞，該Sp2/0細(xì)胞用諸如Bcl-EEE基因的凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染，且適合在在無(wú)血 清條件下生長(zhǎng)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染。以上各專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。在某些情況 下，可通過(guò)將宿主細(xì)胞暴露于適當(dāng)濃度的甲氨蝶呤而擴(kuò)增凋亡抑制劑和/或待表達(dá)的結(jié)構(gòu) 基因。已經(jīng)報(bào)道轉(zhuǎn)染有Bcl-EEE并適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sp2/0細(xì)胞在培養(yǎng)物中表 現(xiàn)延長(zhǎng)的壽命、較高的細(xì)胞密度和顯著高的蛋白質(zhì)產(chǎn)生速率(美國(guó)專利No. 7，531，327、美 國(guó)專利No. 7，537，930,2007年10月24日提交的美國(guó)專利序列號(hào)11/877，728)。用于治療和診斷的抗體某些實(shí)施例涉及診斷或治療受試者惡性腫瘤的方法，包括向受試者施用抗胰腺癌 MAb、融合蛋白或其片段，其中MAb、融合蛋白或片段與至少一種診斷和/或治療劑結(jié)合。還 優(yōu)選的是診斷或治療癌癥的方法，包括向受試者施用多價(jià)多特異性抗體或其片段，其包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)PAM4抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合位點(diǎn)，等待足夠量的時(shí) 間使未結(jié)合的抗體從受試者血流中清除；然后向受試者施用包括診斷劑、治療劑或它們的 組合的載體分子，其與所局部抗體的半抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，癌癥是非 內(nèi)分泌胰腺癌。已知MAb用于體外診斷。參見(jiàn)，例如Carlsson等，Bio/Technology7 (6) 567(1989)。例如，可用MAb從活檢樣本中檢測(cè)組織中與腫瘤相關(guān)抗原的存在有否。通過(guò)使 用諸如放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和熒光免疫測(cè)定法的技術(shù)，MAb也可用于測(cè)量臨 床液體樣本中與腫瘤相關(guān)的抗原的量?？墒褂媚[瘤靶向MAb和毒素的共軛物在體內(nèi)選擇性地殺死癌細(xì)胞(Spalding， Bio/Technology 9 (8) :701 (1991)、Goldenberg, ScientificAmerican Science & Medicine 1(1) :64(1994))。例如，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的治療研究已經(jīng)證明了攜帶細(xì)胞 毒素放射性核素的抗體的抗腫瘤活性。(Goldenberg等，Cancer Res. 41 :4354(1981)、 Cheung 等，J. Nat ' ICancer Inst. 77 :739(1986)和 Senekowitsch 等，J. Nuc 1. Med. 30 531 (1989))。在優(yōu)選的實(shí)施例中，共軛物包括9°Y標(biāo)記的hPAM4抗體。該共軛物可任選地與 一種或多種其它治療劑結(jié)合施用。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將9°Y標(biāo)記的hPAM4和吉西他濱或 5-氟二氧嘧啶一起施用給患有胰腺癌的患者。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，9°Y與DOTA螯合 物共軛從而用于附著于hPAM4。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，90Y-DOTA-hPAM4與包括治療周期 的吉西他濱以分次劑量結(jié)合，諸如用多次量、更少和較小毒性的劑量的吉西他濱與更少和 分次劑量的9°Y-D0TA-hPAM4結(jié)合。根據(jù)耐藥性，示出了這種分次劑量療程的重復(fù)循環(huán)。以示例的方式，4周劑量 200mg/m2的吉西他濱和3周劑量8mg/m2的9°Y_D0TA_hPAM4結(jié)合，后者在吉西他濱施用的第 二周開(kāi)始，這構(gòu)成一個(gè)治療周期。由于兩種制劑的骨髓抑制效應(yīng)可以累積，各組分的更高或 更低的其它劑量可構(gòu)成分次劑量，其由評(píng)估造血毒性的常規(guī)方法確定?；诙喾N因素，包括 之前暴露于骨髓抑制治療劑，在這種治療干預(yù)中熟練的醫(yī)師會(huì)根據(jù)患者的骨髓狀態(tài)和一般 健康狀態(tài)對(duì)這些劑量進(jìn)行調(diào)整。這些原則也可以應(yīng)用于放射性標(biāo)記的hPAM4和其它治療劑 的組合，其它治療劑包括諸如5-氟二氧嘧啶和順鉬的放射增敏藥物。嵌合、人源化和人源抗體及其片段已經(jīng)用于體內(nèi)治療和診斷方法。因此考慮到向 目標(biāo)遞送診斷或治療劑或它們的組合的方法，包括(i)提供包括抗胰腺癌抗體或其片段的 組合物，諸如與至少一種診斷和/或治療劑共軛的嵌合、人源化和人源抗體，以及(ii)向受 試者施用診斷或治療劑抗體共軛物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗胰腺癌抗體及其片段是人源化 的或完全人源的。本文還描述了癌細(xì)胞靶向診斷或治療共軛物，包括例如與至少一種診斷劑或至少 一種治療劑結(jié)合的嵌合、人源化或人源PAM4MAb或其片段。優(yōu)選地，診斷共軛物是光敏診斷 劑、超聲檢測(cè)劑、MRI造影劑或諸如18F或68Ga的PET放射性核素。更優(yōu)選的是，診斷劑是能 量在20keV和4，OOOkeV之間的放射性核素。另一個(gè)實(shí)施例涉及用于治療惡性腫瘤的方法，包括單獨(dú)或與一種或多種其它治療 劑結(jié)合施用裸抗胰腺癌抗體、抗體片段或融合蛋白(諸如PAM4抗體)?？稍诳贵w的施用之 前、之中或之后添加其它治療劑。在優(yōu)選的實(shí)施例中，治療劑是吉西他濱，并在更優(yōu)選的實(shí) 施例中，按分次劑量療程將吉西他濱和hPAM4放射共軛物(radioconjugate) —起施用，所用劑量低于按周施用6周的常規(guī)800-1，000mg/m2的吉西他濱的劑量。例如，當(dāng)與分次治療 劑量的9°Y-PAM4結(jié)合時(shí)，以多分次劑量輸注旨在用作放射增敏劑的200-380mg/m2的吉西他 濱。熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本文所描述并要求保護(hù)的抗體、融合蛋白和/或其片段可以 和任何已知或描述的包括但不限于熱休克蛋白90(Hsp90)的治療劑一起施用。用于治療的組合物包含至少一種人源化或完全人源的抗胰腺癌抗體或其片段，其 為單獨(dú)的并非共軛的、或共軛的或非共軛的、并與諸如其它人源化或嵌合抗體、人源抗體、 治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑的其它抗體或其片段結(jié)合。對(duì)于相同或不同表位或抗原的裸或共軛抗 體也可以與一個(gè)或多個(gè)抗胰腺癌抗體或其片段結(jié)合。因此，本發(fā)明設(shè)想施用抗胰腺癌抗體及其片段，包括融合蛋白及其片段，作為裸抗 體或抗體片段單獨(dú)施用，或作為多模式療法而施用。優(yōu)選地，抗體是人源化或完全人源PAM4 抗體或其片段。多模式療法進(jìn)一步包括使用裸抗胰腺癌抗體補(bǔ)充施用其它抗體的免疫療 法，其它抗體的形式為裸抗體、融合蛋白或?yàn)槊庖吖曹椢?。例如，人源化或完全人源PAM4抗 體可以和其它裸抗體、或人源化PAM4或其它抗體相結(jié)合，其中其它抗體與同位素、一種或 多種化學(xué)治療劑、細(xì)胞因子、毒素或它們的組合共軛。例如，本發(fā)明考慮到裸或共軛PAM4抗 體或其片段的治療，其在其它與胰腺腫瘤相關(guān)的抗體的施用之前、之中或之后進(jìn)行，其中與 其它胰腺腫瘤相關(guān)的抗體為諸如CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、抗-Lea抗體、和 其它Lewis抗原(例如，Le (y))的抗體、以及抗癌胚抗原(CEA或CEACAM5)、CEACAM6、結(jié)腸特 異性抗原-P (CSAp)、MUC-I、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-fec、MUC-16、MUC-17、HLA-DR、CD40、 CD74、CD138、HER2/neu、EGFR、EGP-U EGP-2、血管生成因子(例如，VEGF, P1GF)、胰島素樣 生長(zhǎng)因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源生長(zhǎng)因子和IL-6、以及致癌基因產(chǎn)物(例如bcl-2、 Kras, p53), cMET以及用于腫瘤壞死物質(zhì)的抗體。這些實(shí)體腫瘤抗體可以是裸的或共軛至 尤其是藥物、毒素、同位素、放射性核素或免疫調(diào)節(jié)劑?？蓸?gòu)建許多不同的抗體組合，并且以 裸的或共軛的形式使用?；蛘?，可采用不同的裸抗體組合與其它諸如細(xì)胞毒素藥物的治療 劑或與輻射結(jié)合施用，連續(xù)、同時(shí)或相繼給藥。本文所述的抗體直接靶向PAM4陽(yáng)性腫瘤?？贵w選擇性地與胰腺癌或其它癌癥抗 原結(jié)合，并且隨著分子上結(jié)合位點(diǎn)的增加，對(duì)靶細(xì)胞的親和力增強(qiáng)，而且在所需位置觀察到 較長(zhǎng)的停留時(shí)間。此外，迅速?gòu)捏w內(nèi)清除非抗原結(jié)合分子，并且將正常組織的暴露降低到 最低限度。多特異性抗體用在AES系統(tǒng)中，其中抗-PAM4抗體預(yù)靶向陽(yáng)性腫瘤用于隨后特 異遞送診斷或治療劑。可由包含肽的組胺琥珀酰胺甘氨酸胺(HSG)攜帶制劑。由鼠源單 克隆抗體指定的679以高親和力與包含三肽HSG半抗原的分子結(jié)合(Morel等，Molecular Immunology，27，995-1000，1990)并且可用于與hPAM4形成雙特異性抗體；但甚至更優(yōu)選的 是使用人源化版本的679。還可以使用諸如h-DTPA或NOTA的替代半抗原。雙特異性抗體 選擇性地與靶抗原結(jié)合，使得在所需位置上具有增強(qiáng)的親和力和較長(zhǎng)的停留時(shí)間。而且，迅 速?gòu)捏w內(nèi)清除非抗原結(jié)合抗體，并且將正常組織的暴露降低到最低限度。PAM4和其它胰腺 癌抗體可用于診斷和/或治療哺乳動(dòng)物癌癥。診斷需要使用已知技術(shù)來(lái)檢測(cè)結(jié)合、標(biāo)記的 抗體或片段的進(jìn)一步的步驟。在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“診斷”或“檢測(cè)”可互換使用。然而診斷通常指的是 定義組織的特定組織學(xué)狀態(tài)，檢測(cè)識(shí)別和定位包含特定抗原的組織、病變或有機(jī)體?？贵w及其片段可通過(guò)以下方式進(jìn)行施用靜脈內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、胸膜內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、通過(guò)部位導(dǎo)管輸注、或直接病灶內(nèi)注射。當(dāng)通 過(guò)注射施用抗體時(shí)，可通過(guò)連續(xù)輸注或單次或多次團(tuán)注進(jìn)行施用。裸抗體療法裸抗胰腺癌抗體及其片段的功效可以通過(guò)用一種或多種其它裸抗體或用與一種 或多種治療劑(包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、寡核苷酸、激素拮抗劑、酶、酶抑制劑、 治療性放射性核素、血管生成抑制劑等)共軛的一種或多種免疫共軛物來(lái)補(bǔ)充這些裸抗體 而增強(qiáng)，這些是同時(shí)或依次或根據(jù)規(guī)定的用藥方案施用的?；蛘?，裸抗體可與沒(méi)有附著于其 它抗體的治療劑共同施用?？捎糜谘a(bǔ)充裸抗胰腺癌抗體的抗體可被導(dǎo)向同樣的癌細(xì)胞或?qū)?向可用來(lái)增強(qiáng)選擇的裸抗體的抗腫瘤功效的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如，CD40+細(xì)胞)。免疫共軛物、治療和診斷劑抗胰腺癌抗體及其片段可與至少一種用于治療或診斷的治療和/或診斷劑共軛。 對(duì)于免疫治療，目的是為了將細(xì)胞毒性劑量的輻射、毒素、抗體和/或藥物遞送至靶細(xì)胞， 同時(shí)最大限度地減少與非靶組織的接觸。優(yōu)選地，抗胰腺癌抗體用于診斷和/或治療胰腺 腫瘤。利用本領(lǐng)域中的各種技術(shù)可以將任何抗體、抗體片段和融合蛋白與一種或多種治 療或診斷劑共軛。一種或多種治療或診斷劑可附著于每個(gè)抗體、抗體片段或融合蛋白。如果 缺少Fc區(qū)(例如某些抗體片段)，可以將碳水化合物部分引入可附著治療或診斷劑的抗體 或抗體片段的輕鏈可變區(qū)。參見(jiàn)，例如Leung等，J Immunol. 154 =5919(1995) ；Hansen等， 美國(guó)專利No. 5，443，953 (1995)，Leung等，美國(guó)專利No. 6，254，868，每個(gè)專利的實(shí)例部分以 引用的方式并入本文。通過(guò)抗體碳水化合物部分使肽與抗體組分共軛的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。 參見(jiàn)例如，Shih 等，Int J Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等，Int J Cancer 46:1101(1990)； 和Siih等，美國(guó)專利No. 5，057，313，該專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。一般的方 法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗體組分與具有至少一個(gè)游離胺官能團(tuán)并載有多 種治療劑(如肽或藥物)的載體聚合物反應(yīng)。該反應(yīng)導(dǎo)致初始席夫堿(亞胺)鍵，其可以 通過(guò)還原到仲胺以形成最終共軛物而穩(wěn)定化。抗體融合蛋白或多特異性抗體包含兩個(gè)或多個(gè)抗體或其片段，每個(gè)抗體或其片段 都可附著于至少一種治療和/或診斷劑。因此，抗體融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗體或其片段 可具有不止一個(gè)附著的治療和/或診斷劑。此外，治療劑無(wú)需都一樣，而可以是不同的治療 劑，例如可以使藥物和放射性同位素附著于相同的融合蛋白。特別是，IgG可用131I來(lái)進(jìn)行 放射性標(biāo)記并附著于藥物上。mI可以結(jié)合到IgG的酪氨酸和附著于IgG賴氨酸的ε氨基 的藥物當(dāng)中。治療和診斷劑也都可附著于還原的SH基團(tuán)和抗體的碳水化合物側(cè)鏈上?；?者，雙特異性抗體可包含針對(duì)疾病抗原的一個(gè)抗體或其片段和針對(duì)附著于靶向性構(gòu)建體的 半抗原的另一抗體或其片段，用于如上所述的預(yù)靶向技術(shù)中。各種診斷和治療劑可同時(shí)或依次施用，或有利地與本發(fā)明的抗體共軛，例如藥物、 毒素、寡核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素拮抗劑、酶、酶抑制劑、放射性核素、血管生成抑制 劑等。這里所述的治療劑是那些也適用于與裸抗體分開(kāi)施用的藥劑。治療劑包括例如化 學(xué)治療藥物，如長(zhǎng)春花生物堿、蒽環(huán)霉素、吉西他濱、表鬼白毒素、紫杉烷、抗代謝物、烷化 劑、抗生素、SN-38、C0X-2抑制劑、抗有絲分裂物、抗血管生成和細(xì)胞凋亡劑(特別是阿霉素)、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜樹(shù)堿衍生物(camptothecans)、蛋白酶抑制劑、mTOR抑 制劑、HDAC抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑以及由這些及其它類抗癌制劑中提取的藥物等。其 它適用于同時(shí)或依次施用或用于制備免疫共軛物和抗體融合蛋白的癌化學(xué)治療藥物包括 氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、C0X-2抑制劑、抗代謝物、嘧啶類似物、嘌 呤類似物、鉬配位絡(luò)合物、mTOR抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、HDAC抑制劑、喜 樹(shù)堿、激素等。在 REMINGTON' SPHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)，和GOODMAN AND GILMAN' S THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)以及這些出版物的修訂版中描述了合適的化學(xué)治療 劑。其它合適的化學(xué)治療劑(如試驗(yàn)性藥物)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，喜樹(shù)堿和相關(guān)化合物的共軛物(如SN-38)可與hPAM4或其它 抗胰腺癌抗體共軛，例如2008年2月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 12/(^6，811和2006年 3月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/388，032中公開(kāi)的那樣，上述每個(gè)專利申請(qǐng)的實(shí)例部 分以引用的方式并入本文。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，hPAM抗體與吉西他濱共軛。在另一實(shí)施例中，在裸抗體或 共軛嵌合、人源化或人源PAM4抗體之前、之后或同時(shí)提供吉西他濱。優(yōu)選地，共軛的hPAM4 抗體或抗體片段與放射性核素共軛。毒素可來(lái)源于動(dòng)物、植物或微生物。毒素(如假單胞菌外毒素)也可與抗胰腺癌和 hPAM4抗體的免疫共軛物絡(luò)合，或者形成抗胰腺癌和hPAM4抗體的免疫共軛物的治療劑部 分。其它適合用于制備這種共軛物或其它融合蛋白的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖 核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素A、商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)素、白喉毒素、假單胞 菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。參見(jiàn)例如I^astan等，Cell 47 641 (1986), Goldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians44 :43 (1994), Sharkey 禾口 Goldenberg, CA—A Cancer Journal forClinicians 56:2沈0006)。適合使用的其它毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 公開(kāi)在美國(guó)專利No. 6，077，499中，該專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。免疫調(diào)節(jié)劑(如細(xì)胞因子)也可與免疫共軛物共軛或形成免疫共軛物的治療劑部 分，或可與抗體、抗體片段或融合蛋白施用，但不與它們共軛。融合蛋白可包含一個(gè)或多個(gè) 與不同抗原結(jié)合的抗體或其片段。例如，融合蛋白可與PAM4抗原以及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或因 子結(jié)合。或者，受試者可接受裸抗體、抗體片段或融合蛋白和單獨(dú)施用的細(xì)胞因子，所述單 獨(dú)施用的細(xì)胞因子可在施用裸抗體之前、同時(shí)或之后施用。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào) 節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、淋巴因子、單核因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激 因子(CSF)、干擾素(IFN)、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原、 促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體化激素(LH)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素、成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、催乳素、胎盤生乳素、OB蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、TGF-a ,TGF-β、胰 島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、 TNF-β、苗勒抑制物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、激活素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、整 聯(lián)蛋白、白細(xì)胞介素(IL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、Sl 因子、IL-1、IL-lcc, IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18、IL-21和IL-25、LIF、kit配體、FLT-3、血管抑素、血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮抑素和LT等。
或者，抗體和片段可以通過(guò)將抗體與酶連接而可檢測(cè)地標(biāo)記。當(dāng)在適當(dāng)?shù)孜锎嬖?的條件下培養(yǎng)抗體酶共軛物時(shí)，酶部分與底物發(fā)生反應(yīng)生成可以通過(guò)例如分光光度法、熒 光測(cè)定法或視覺(jué)方法檢測(cè)的化學(xué)部分。可用于可檢測(cè)地標(biāo)記抗體的酶的例子包括蘋(píng)果酸脫 氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-V型類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙 糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、α -半乳糖苷酶、核糖 核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、糖化酶和乙酰膽堿酯酶。治療或診斷劑可以通過(guò)二硫鍵的形成附著于還原抗體組分的鉸鏈區(qū)。作為另外的 選擇，可以采用異雙官能交聯(lián)劑(如N-琥珀酰基3-(2-吡啶二巰基)丙酸鹽(SPDP))將這 種試劑附著于抗體組分。Yu等ht. J. Cancer 56 :244(1994)。這種共軛的一般技術(shù)是本領(lǐng) 域中熟知的。參見(jiàn)例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING (CRC Press 1991) ；Upeslacis 等，M0N0CL0NALANTIB0DIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS 中 的〃 Modificationof Antibodies by Chemical Methods，" Birch 等(eds.)，第 187-230 頁(yè)(Wiley-Liss，Inc. 1995) ；Price, MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION 中的“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, " Ritter 等(編輯)，第 60-84 頁(yè)(Cambridge University ft~eSS19%)?；蛘撸委熁蛟\斷劑可以通過(guò)抗體的Fc區(qū)中的碳水化合物部分共軛。碳水化 合物基團(tuán)可用于提高與硫醇基結(jié)合的相同試劑的載量，或者碳水化合物部分可用于結(jié)合不 同的肽。免疫共軛物可以包含一種或多種適用于檢測(cè)病變組織的放射性同位素。特別有 用的診斷放射性核素包括但不限于=lic^K111IrKmLiu 18F,52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,
86v 90v 89v 94mT 94T 99mT 120T 123T 124T 125T 131T 154-158^ t 32n Iln 13λτ 15n 186D 188D
Y、 Y、 Zr> 1c、 1c、 1c、 丄、 丄、 丄、 丄、 丄、 Gd、 P、 C、 N、 0、 Re、 Re、
51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 或其它 Y -、β -或正電子發(fā)射體，優(yōu)選具有 20 至 4，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能，更優(yōu)選具有25至4，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能，甚至更優(yōu)選具 有25至1，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能，還更優(yōu)選具有70至700keV范圍內(nèi)的衰變能。有用的 正電子發(fā)射的放射性核素的總衰變能優(yōu)選< 2，OOOkeV，更優(yōu)選在1，OOOkeV以下，最優(yōu)選 < 700keV。利用Y-射線檢測(cè)作為診斷劑的有用的放射性核素包括但不限于51Cr、57Co、 58Co,59Fe,67Cu,67Ga,75Se, 97RU、99mTC、mh、114mIn、123I、125I、131I、169Yb、197Hg 和 2(I1T1。有用的 發(fā)射Y -射線的放射性核素的衰變能優(yōu)選為20-2，OOOkeV,更優(yōu)選為60-600keV，最優(yōu)選 100-300keVo免疫共軛物可以包含一種或多種適用于治療病變組織的放射性同位素。特別有 用的治療放射性核素包括但不限于mIn、177LU、212Bi、213Bi、211At、62CU、64Cu、67Cu、9°Y、125I、 131I、32P、33P、47Sc、mAg、67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re,212Pb, 223Ra^225Ac, 59Fe,75Se,77As,89Sr,"Mo,105Rh,109Pd,143Pr,149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au 和 211Pb0 治療放射性 核素優(yōu)選具有20至6，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能，對(duì)于俄歇發(fā)射體，優(yōu)選具有60至200keV范 圍內(nèi)的衰變能，對(duì)于β發(fā)射體，優(yōu)選具有100至2，500keV范圍內(nèi)的衰變能，對(duì)于α發(fā)射 體，優(yōu)選具有4，000至6，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能。有用的發(fā)射β-粒子的核素的最大衰 變能優(yōu)選為20至5，OOOkeV，更優(yōu)選為100-4，OOOkeV，最優(yōu)選為500_2500keV。還優(yōu)選的是 隨俄歇發(fā)射粒子充分衰變的放射性核素。例如Co-58、Ga-67, Br_80m、Tc_99m、Rh-103m,Pt-109、In-Ill、Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和 Ir-192。有用的發(fā)射 β-粒子的核 素的衰變能優(yōu)選< l，000keV，更優(yōu)選< IOOkeV,最優(yōu)選< 70keV。還優(yōu)選的是隨α -粒子 的生成充分衰變的放射性核素。這種放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi_212、 Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213 和 Fm-255。有用的發(fā)射 α粒子的放射性核素的衰變能優(yōu)選為2，000-10, OOOkeV,更優(yōu)選為3，000-8, OOOkeV,最優(yōu) 選為 4，000-7，OOOkeV0例如，67Cu由于其61. 5小時(shí)的半衰期和能充足地供應(yīng)β粒子和Y射線的原因而 被視為是更有希望用于放射免疫治療的放射性同位素之一，可以利用螯合劑、對(duì)溴乙酰氨 基芐基四乙胺四乙酸(TETA)使之與抗體共軛。Chase，見(jiàn)上文?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)二乙撐三胺 五乙酸(DTPA)或更優(yōu)選使用DOTA使發(fā)射高能β粒子的9°Υ與抗體、抗體片段或融合蛋白 偶聯(lián)。將9°Υ與抗體或靶向性構(gòu)建體共軛的方法是本領(lǐng)域中已知的，可以采用任何這種已知 的方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No. 7，259，Μ9，該專利的實(shí)例部分以引用的方式并入本文。還 參見(jiàn) Lindn 等，Clin Cancer Res. 11 :5215-22,2005 ；Sharkey 等，J Nucl Med. 46 :620-33, 2005 ；Sharkey 等，J Nucl Med. 44 :2000-18,2003.)。其它有潛力的治療放射性同位素包括llC、13N、150、75Br、198Au、224Ac、126I、 133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、 165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、 51Cr、59Fe、75k、201Tl、225Ac、76Br、169Yb 等。在另一實(shí)施例中，放射敏化劑可以與裸抗體或共軛抗體或抗體片段組合使用。例 如，放射敏化劑可以與放射標(biāo)記的抗體或抗體片段組合使用。與單獨(dú)用放射標(biāo)記抗體或抗 體片段進(jìn)行治療相比，添加放射敏化劑可增強(qiáng)療效。放射敏化劑在D. M. Goldenberg (編 輯)，CANCERTHERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995)中有所描述?？?用于這種技術(shù)的其它典型的放射敏化劑包括吉西他濱、5-氟尿嘧啶和順鉬，并已在包括胰 腺癌在內(nèi)的不同癌癥的治療中與體外照射組合使用。因此，我們已經(jīng)研究了吉西他濱以被 認(rèn)為是吉西他濱的放射敏化劑量(每周一次200mg/m2，四周)與分次劑量的90Y_hPAM4結(jié) 合的組合，并且已經(jīng)觀察到在單療程的這種組合之后胰腺癌有所減少的客觀證據(jù)，具證實(shí) 這種組合的耐受性良好(根據(jù)NCI-CTC v. 3標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有3-4級(jí)毒性)。具有用于熱中子活化治療的載有硼附加物的載體的抗體或其片段一般會(huì)以類似 的方式受到影響。然而，有利的是在進(jìn)行中子照射之前等待，直到非靶向免疫共軛物清除。 可以利用與抗胰腺癌抗體結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體加快清除。參見(jiàn)美國(guó)專利No. 4，624，846中 對(duì)這個(gè)一般原理的描述。例如，可以使硼附加物(如碳硼烷)附著于抗體?？梢灾苽涮寂?烷，使側(cè)鏈上帶有羧基官能團(tuán)，這在本領(lǐng)域中是熟知的?？梢酝ㄟ^(guò)活化碳硼烷的羧基并與載 體上的胺縮合來(lái)實(shí)現(xiàn)碳硼烷對(duì)載體(如氨基葡聚糖)的附著。然后中間共軛物與抗體共 軛。在施用抗體共軛物之后，硼附加物通過(guò)熱中子照射被活化并轉(zhuǎn)換為放射性原子，所述放 射性原子通過(guò)α -發(fā)射產(chǎn)生衰變，從而產(chǎn)生高毒性的短程影響?？梢酝ㄟ^(guò)施用診斷免疫共軛物并檢測(cè)附著于定位在癌或腫瘤處的免疫共軛物的 診斷標(biāo)記來(lái)完成在受試者中診斷癌癥的方法?？贵w、抗體片段和融合蛋白可與診斷劑共軛， 或者可以在預(yù)靶向技術(shù)中利用附著于診斷劑的靶向性構(gòu)建體施用之。上面討論了可作為診 斷劑使用的放射性試劑。合適的非放射性診斷劑是適用于磁共振成像、X射線、計(jì)算機(jī)斷層掃描或超聲波的造影劑。磁成像劑包括例如非放射性金屬(如錳、鐵和釓)，與包括2-芐 基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物的金屬-螯合物組合絡(luò)合。參見(jiàn)2001年10月10日 提交的U. S. Ser. No. 09/921，四0，其實(shí)例部分以引用的方式并入本文。也可以使用其它成像 劑，如PET掃描核苷酸，優(yōu)選18F。造影劑(如包括例如釓離子、鑭離子、鏑離子、鐵離子、錳離子或其它類似標(biāo)記 的MRI造影劑、CT造影劑和超聲波造影劑)可用作診斷劑。適合使用的順磁離子包括鉻 (III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、 釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)，特別優(yōu)選釓。在諸如X射線成像之類的其它情況中有用的離子包括但不限于鑭(III)、金 (III)、鉛(II)和鉍(III)。熒光標(biāo)記包括羅丹明、熒光素和腎造影劑。羅丹明和熒光素經(jīng) 常通過(guò)異硫氰酸酯中間體連接。金屬在診斷劑中也有用，包括那些用于磁共振成像技術(shù)的金屬。這些金屬包括但 不限于釓、錳、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥和釹。為了在抗體上加載放射性金屬或 順磁離子，可能需要使之與具有附著多個(gè)用于結(jié)合離子的螯合基團(tuán)的長(zhǎng)尾的試劑反應(yīng)。這 種尾可以是聚合物，如聚賴氨酸、多聚糖，或其它具有側(cè)基的衍生化或可衍生化鏈，所述側(cè) 基上可以結(jié)合螯合基團(tuán)，如已知適用于此目的的乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、二縮氨基硫脲、聚肟等。利用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)過(guò)程使螯合物偶合于抗體、融合蛋白或其片段。螯合物通常是通 過(guò)以能夠在免疫活性損失最小且聚集和/或內(nèi)部交聯(lián)最少的情況下與分子成鍵的基團(tuán)與 抗體連接。用于使螯合物與抗體共軛的其它更不常見(jiàn)的方法及試劑公開(kāi)在1989年4月25 日授予Hawthorne的題為"Antibody Conjugate”的美國(guó)專利No. 4，824，659中，該專利的 實(shí)例部分以引用的方式并入本文。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-芐基-DTPA及其 一甲基和環(huán)己基類似物，其在20至2，OOOkeV的一般能量范圍內(nèi)與診斷同位素一起使用。 當(dāng)與諸如錳、鐵和釓的非放射性金屬絡(luò)合時(shí)，相同的螯合物適用于MRI。諸如N0TA、D0TA和 TETA的大環(huán)螯合物可用于多種金屬及射電金屬，最特別是分別用于鎵、釔和銅的放射性核 素。通過(guò)對(duì)所關(guān)注的金屬定制環(huán)的大小可以使這種金屬-螯合物復(fù)合體非常穩(wěn)定?？捎?來(lái)穩(wěn)定地結(jié)合核素(如用于RAIT的223Ra)的其它環(huán)型螯合物(如大環(huán)聚醚)涵蓋在本發(fā) 明中。不透射線和造影材料用于增強(qiáng)X射線和計(jì)算機(jī)斷層掃描，包括碘化合物、鋇化合 物、鎵化合物、鉈化合物等。具體的化合物包括鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡明酸、 碘酸胺酸、碘達(dá)酸、膽影酸、碘沙酸、碘古酰胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法 酸、碘絲酸、碘砜葡胺、碘舒美酸、碘酞硫、碘替酸、異泛影酸、碘托西酸、碘克沙酸、羥泛影 酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影鈉、丙碘酮和氯化亞鉈。也可以用熒光化合物來(lái)標(biāo)記抗體、抗體片段和融合蛋白。熒光標(biāo)記的MAb的存在 是通過(guò)將抗體暴露在適當(dāng)波長(zhǎng)的光線下并檢測(cè)由此產(chǎn)生的熒光來(lái)確定的。熒光標(biāo)記化合物 包括 Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、B0DIPY-FL、 B0DIPY-R6G、BODIPY-TMR、B0DIPY-TRX、5-羧基-4' ,5' -二氯-2' ,7' - 二甲氧基熒光 素、5-羧基-2'，4'，5'，7'-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹 明、6-羧基四甲基氨基、瀑布藍(lán)(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、6_FAM、丹磺酰氯、熒光素、異硫氰酸熒光素、熒光胺、HEX、6-J0E、NBD (7-硝基苯-2-氧雜_1、3_ 二唑)、俄勒R綠488、 俄勒R綠500、俄勒R綠514、太平藍(lán)、鄰苯二甲酸、對(duì)苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲 酚藍(lán)紫、亮甲酚藍(lán)、對(duì)氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、酞醛、偶氮甲堿、青色素、黃嘌呤、琥珀熒光 素、稀土金屬穴合物、銪三聯(lián)啶二胺、銪穴合物或螯合物、二胺、雙菁、拉霍亞藍(lán)染料、別藻藍(lán) 素、allococyanin B、藻藍(lán)蛋白C、藻藍(lán)蛋白R(shí)、硫胺素、藻紅藍(lán)素、藻紅蛋白R(shí)、REG、羅丹明 綠、異硫氰酸羅丹明、羅丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基羅丹明isothiol)、四甲基羅 丹明和得克薩斯州紅。熒光標(biāo)記抗體對(duì)于流式細(xì)胞儀分析是特別有用的，但也可用于內(nèi)窺 鏡和血管內(nèi)的檢測(cè)方法?；蛘?，抗體、抗體片段和融合蛋白可以通過(guò)將抗體偶合于化學(xué)發(fā)光化合物而可被 檢測(cè)地標(biāo)記?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記的MAb的存在是通過(guò)檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)的發(fā)光的存在 來(lái)確定的?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子包括魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和
草酸酯。類似地，發(fā)光化合物可用于標(biāo)記抗體及其片段。生物發(fā)光是一種在生物系統(tǒng)中發(fā) 現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光，在所述生物系統(tǒng)中催化蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的 存在是通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在確定的。適用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物包括熒光素、熒光素酶 和水母發(fā)光蛋白。因此，描述了診斷受試者體內(nèi)的惡性腫瘤的方法，該方法包括使用包含抗胰腺癌 MAb、融合蛋白或其片段的組合物對(duì)來(lái)自受試者的樣本(流體、組織或細(xì)胞)進(jìn)行離體診斷 測(cè)定。免疫組織化學(xué)可用于通過(guò)結(jié)合抗體的存在來(lái)檢測(cè)PAM4抗原在細(xì)胞或組織中的存在。 更優(yōu)選地，所述癌是胰腺癌。此外，螯合劑(如DTPA、DOTA、TETA或ΝΟΤΑ)或合適的肽(其帶有可檢測(cè)的標(biāo)記， 如熒光分子)或細(xì)胞毒素劑(如重金屬或放射性核素)可以與目標(biāo)抗體共軛。例如，治療 上有用的免疫共軛物可以通過(guò)光敏劑或染料與抗體融合蛋白共軛來(lái)獲得。熒光組分(如熒 光色素)和其它色原或染料(如對(duì)可見(jiàn)光敏感的卟啉)已被用來(lái)通過(guò)將合適的光導(dǎo)向病灶 來(lái)檢測(cè)和治療病變。在治療中，這被稱為光輻射、光線療法或光動(dòng)力療法(Jori等(eds.) PH0T0DYNAMIC THERAPY 0FTUM0RS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985) ；van denBergh, Chem. Britain 22 :430(1986))。此外，為了實(shí)現(xiàn)光療，已經(jīng)將單克隆抗體與光活 化染料稱合。Mew 等，J. Immunol. 130 :1473(1983) ；idem.，Cancer Res. 45 :4380(1985)； Oseroff 等，Proc Natl. Acad. Sci. USA83 :8744(1986) ；idem. ， Photochem. Photobiol. 46 83(1987) ；Hasan 等，Prog. Clin. Biol. Res. 288 471 (1989) ；Tatsuta 等，Lasers Surg. Med. 9 :422(1989) ；Pelegrin 等，Cancer 67 :2529(1991) 為了獲得治療的目的，按照治療有效量對(duì)患者施用抗胰腺癌抗體及其片段。如果 施用的量在生理上來(lái)講是顯著的，則被認(rèn)為是按照“治療有效量”來(lái)施用抗體。如果試劑的 存在導(dǎo)致在接受患者的生理上產(chǎn)生可檢測(cè)的變化，則在生理上來(lái)講其是顯著的。診斷劑是可與抗體、抗體片段或融合蛋白或靶向性構(gòu)建體共軛施用的分子或原 子，其適用于通過(guò)定位含疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞而進(jìn)行診斷/檢測(cè)。有用的診斷劑包括但不 限于放射性同位素、染料(如用生物素-鏈親和素復(fù)合物)、不透射線材料(例如碘、鋇、鎵 和鉈化合物等)、造影劑、熒光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(例如，順磁 離子)。U. S. Pat. No. 6，331，175描述了 MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑共軛的抗體的制備。優(yōu)選地，診斷試劑選自用于核成像、內(nèi)窺鏡檢測(cè)和血管內(nèi)檢測(cè)的放射性同位素、用于磁共振成像 或超聲檢查的增強(qiáng)劑、用于X射線和計(jì)算機(jī)斷層掃描的不透射線和造影劑以及用于螢光檢 查(包括內(nèi)窺鏡螢光檢查)的熒光化合物。與抗體共軛或用于雙特異性預(yù)靶向方法中的熒 光劑和放射性試劑特別適用于與諸如惡性腫瘤的病變組織或細(xì)胞群相關(guān)的靶抗原的內(nèi)視 鏡檢測(cè)、術(shù)中檢測(cè)或血管內(nèi)檢測(cè)，如Goldenberg的美國(guó)專利5，716，595,6, 096，289和美國(guó) 專利申請(qǐng)No. 09/348,818中所公開(kāi)的那樣，上述每個(gè)的實(shí)例部分以引用的方式并入本文， 特別是有Y-、和正電子的發(fā)射體的實(shí)例部分。當(dāng)有向允許內(nèi)窺鏡的組織(如結(jié)腸)伸 展時(shí)，可以使用內(nèi)窺鏡。對(duì)正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)有用的放射性核素包括但不限于F-18、 Mn-51、Mn-52m、Fe_52、Co_55、Cu_62、Cu_64、Ga_68、As_72、Br_75、Br_76、Rb_82m、Sr_83、 Y-86、Zr-89, Tc-94m, In-110, 1-120和1-124。有用的正電子發(fā)射放射性核素的總衰變能 優(yōu)選< 2，OOOkeV，更優(yōu)選在1，OOOkeV以下，最優(yōu)選< 700keV。作為利用Y -射線檢測(cè)的診 斷劑有用的放射性核素包括但不限于Cr_51、Co-57、Co_58、Fe-59, Cu_67、Ga-67, Se-75, Ru-97、Tc-99m、In-Ill、In-114m, 1-123、1-125、1-131、Yb-169、Hg-197 和 Tl-201。有用 的Y -射線發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選為20-2，OOOkeV,更優(yōu)選為60-600keV，最優(yōu)選為 100-300keVo離體診斷本發(fā)明設(shè)想使用抗胰腺癌抗體來(lái)離體篩選生物樣本以確定PAM4抗原的存在。在 這種免疫測(cè)定中，抗體、抗體片段或融合蛋白可用于液相或與固相載體結(jié)合，如下所述。為 了離體診斷的目的，由于沒(méi)有考慮宿主免疫反應(yīng)，所以可以采用任何類型的抗體，如鼠源、 嵌合、人源化或人源抗體。用于確定生物樣本是否含PAM4抗原的篩選方法的一個(gè)實(shí)例是放射免疫測(cè)定法 (RIA)。例如，在RIA的一種形式中，在放射性PAM4抗原存在的情況下使被測(cè)物質(zhì)與PAM4MAb 混合。在此方法中，測(cè)試物質(zhì)的濃度與結(jié)合于MAb的標(biāo)記PAM4抗原量成反比，并直接與游 離的標(biāo)記PAM4抗原量相關(guān)。其它合適的篩選方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的?；蛘?，可以進(jìn)行離體測(cè)定，其中抗胰腺癌抗體、抗體片段或融合蛋白與固相載體結(jié) 合。例如，MAb可附著于聚合物(如氨基葡聚糖)，以便使Mab連接于不溶性載體(聚合物 涂層珠、板或管)。其它合適的離體測(cè)定對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。可改變可檢測(cè)的標(biāo)記 抗體和PAM4抗原的具體濃度、培養(yǎng)的溫度和時(shí)間以及其它測(cè)定條件，這取決于包括樣本中 的PAM4抗原的濃度、樣本的性質(zhì)等在內(nèi)的各種因素?？挂认侔┛贵w樣本的結(jié)合活性可根據(jù) 已知的方法來(lái)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)例行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定每次測(cè)定的有效和最佳測(cè)定條 件。PAM4抗原在生物樣本中的存在可用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)來(lái)確定(如， Gold等J Clin Oncol. 24 =252-58, 2006) 0在直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，純抗原制劑或半純抗原制 劑與在被測(cè)的流體或細(xì)胞提取物中不溶解的固體載體結(jié)合，添加一定量的可檢測(cè)的標(biāo)記可 溶性抗體以允許對(duì)在固相抗原和標(biāo)記抗體之間形成的二元復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。與此相反，“雙決定簇”ELISA法(也稱“雙位點(diǎn)ELISA法”或“夾心式測(cè)定法”)要 求少量的抗原，且測(cè)定不需要抗原的過(guò)度純化。因此，雙決定簇ELISA對(duì)用于檢測(cè)臨床樣本 中的抗原的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA是優(yōu)選的。參見(jiàn)例如，雙決定簇ELISA用于活檢標(biāo)本中的c-myc癌蛋白的定量，F(xiàn)ield 等，Oncogene 4:1463(1989) ；Spandidos 等，Anticancer Res. 9 821(1989)。在雙決定簇ELISA中，一定量的未標(biāo)記MAb或抗體片段(“捕獲抗體”)與固體載 體結(jié)合，使測(cè)試樣本與捕獲抗體接觸，添加一定量的可檢測(cè)的標(biāo)記可溶性抗體(或抗體片 段)以允許對(duì)在捕獲抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間形成的三元復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。 在這樣的情況下，抗體片段是與PAM4抗原的表位結(jié)合的抗胰腺癌Mab的一部分。雙決定簇 ELISA的實(shí)施方法是已知的。參見(jiàn)例如，F(xiàn)ield等，上文，Spandidos等，上文，以及Moore等， "Twin-Site ELISAs for fos and mycOncoproteins Using the AMPAK System" (METHODS INMOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10，pages 273-281，The Humana Press, Inc. 1992)。在雙決定簇ELISA中，可溶性抗體或抗體片段必須與不同于由捕獲抗體識(shí)別的表 位的PAM4表位結(jié)合?？蛇M(jìn)行雙決定簇ELISA以確定PAM4抗原是否存在于活檢樣本中。或 者，可進(jìn)行所述測(cè)定以對(duì)臨床體液樣本中存在的PAM4抗原的量進(jìn)行定量。定量測(cè)定的進(jìn)行 可包括稀釋純化的PAM4抗原?？挂认侔㎝ab、融合蛋白及其片段也適于制備測(cè)定試劑盒。這種試劑盒可包括間隔 化的承載裝置，用以在封閉的空間中接受一個(gè)或多個(gè)容器裝置(如小瓶、管等)，每個(gè)所述 容器裝置都包括獨(dú)立的免疫測(cè)定單元。目標(biāo)抗體、抗體片段和融合蛋白還可以用來(lái)檢測(cè)PAM4抗原在由組織標(biāo)本制備的 組織切片中的存在。這種原位檢測(cè)可用于確定PAM4抗原的存在和確定PAM4抗原在受檢 組織中的分布。原位檢測(cè)可以通過(guò)將可檢測(cè)的標(biāo)記抗體施用到冷凍組織切片上來(lái)完成。研 究表明，PAM4抗原在石蠟包埋的切片中是保守的。原位檢測(cè)的一般技術(shù)是普通技術(shù)人員已 知的° 參見(jiàn)，例如，Ponder, “ Cell Marking Techniques andTheir Application, " in MAMMALIAN DEVELOPMENT =APRACTICAL APPROACH 113_38Monk(ed·)(IRL Press 1987)和 Coligan(第 5. 8. 1-5. 8. 8 頁(yè))。抗體、抗體片段和融合蛋白可以用任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物部分可檢測(cè)地標(biāo)記，該標(biāo)記 物部分包括例如放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、染料、發(fā)色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記 或順磁標(biāo)記。標(biāo)記物部分可以是通過(guò)諸如使用Y射線計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的方法或通過(guò)自動(dòng) 射線照相術(shù)來(lái)檢測(cè)的放射性同位素。在優(yōu)選的實(shí)施例中，診斷共軛物是、-、或正電子 發(fā)射同位素。本說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)記物部分指在預(yù)定條件下產(chǎn)生信號(hào)的分子。標(biāo)記物部分的例 子包括放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和順磁標(biāo)記?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)完成標(biāo)記物部分與抗胰腺癌抗體的結(jié)合。在 這方面的典型方法描述在 Kennedy 等，Clin Chim Acta70 1 (1976)，Schurs 等，Clin. Chim. Acta 81 :1(1977), Shih 等，Int JCancer 46:1101(1990)中。上述的離體和原位檢測(cè)方法可用于幫助進(jìn)行病情的診斷或分期。例如，這種方法 可用于檢測(cè)表達(dá)PAM4抗原的腫瘤(如胰腺癌)。體內(nèi)診斷/檢測(cè)利用標(biāo)記MAb進(jìn)行體內(nèi)診斷成像的各種方法是已知的。在免疫閃爍法的技 術(shù)中，例如，用發(fā)射Y射線的放射性同位素來(lái)標(biāo)記抗體并引入患者體內(nèi)。伽馬照相機(jī) 用于檢測(cè)發(fā)射 射線的放射性同位素的位置和分布。參見(jiàn)，例如Srivastava(ed.)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAP Y(Plenum Press 1988)， REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,中的 Chase, “ MedicalApplications of Radioisotopes, " 18th Edition, Gennaro 等(eds.), pp.624-652(Mack Publishing Co.，1990)，和 BIOTECHNOLOGY ANDPHARMACY 227-49 中的 Brown，“ Clinical Use of MonocIonalAntibodies, " Pezzuto 等(eds. )(Chapman & Hall 1993)。關(guān)于診斷成像，放射性同位素可以直接或通過(guò)使用中間官能團(tuán)間接與抗體結(jié)合。 有用的中間官能團(tuán)包括諸如乙二胺四乙酸和二乙烯三胺五醋酸的螯合劑。例如參見(jiàn)，Shih 等，上文，和美國(guó)專利No. 5，057，313。通過(guò)選擇同位素而將遞送至患者的輻射劑量保持在盡可能低的水平，用以實(shí)現(xiàn)最 短半衰期、體內(nèi)最少保留量與最少同位素量的最佳組合，這樣可以進(jìn)行檢測(cè)和精確的測(cè)量。 可以與抗胰腺癌抗體結(jié)合并適合診斷成像的放射性同位素的例子包括99mTc、mh和18F。為了體內(nèi)診斷的目的，目標(biāo)抗體、抗體片段和融合蛋白也可以用順磁離子和各種 放射性造影劑來(lái)標(biāo)記。特別適用于磁共振成像的造影劑包括釓離子、錳離子、鏑離子、鑭離 子或鐵離子。另外的試劑包括鉻、銅、鈷、鎳、錸、銪、鋱、鈥或釹?？贵w或其片段也可以與超 聲造影劑/增強(qiáng)劑共軛。例如，一種超聲造影劑是脂質(zhì)體。還優(yōu)選的是，超聲造影劑為充氣 的脂質(zhì)體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，雙特異性抗體可以與造影劑共軛。例如，雙特異性抗體可包含 不止一種在超聲成像中使用的圖像增強(qiáng)劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，造影劑是脂質(zhì)體。優(yōu) 選地，脂質(zhì)體包含共價(jià)附著于脂質(zhì)體外表面的二價(jià)DTPA-肽。藥學(xué)上合適的輔料可采用另外的制藥方法控制抗胰腺癌抗體在治療應(yīng)用中作用的持續(xù)時(shí)間?？梢酝?過(guò)使用聚合物絡(luò)合或吸附抗體、抗體片段或融合蛋白來(lái)制備緩釋制劑。例如，生物相容性 聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體與癸二酸的聚酸酐共聚物基質(zhì)。 Sierwood等，Bio/Technology 10:1446(1992)?？贵w、抗體片段或融合蛋白從這種基質(zhì)中 的釋放速率取決于抗體、抗體片段或融合蛋白的分子量、基質(zhì)內(nèi)的抗體量和分散粒子的大 小。Saltzman 等，Biophys. J. 55 :163(1989) ；Sherwood 等，上文。其它固體劑型描述于 Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,5th Edition(Lea & Febiger 1990)，和 Gennaro (ed.)，REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition(MackPublishing Company 1990)，及其修訂版本。遞送至受試者的抗體、其片段和融合蛋白可包含一種或多種藥學(xué)上合適的輔料、 一種或多種其它成分或上述的某種組合?？梢愿鶕?jù)已知的方法配制抗體以制備藥學(xué)上有用 的組合物，據(jù)此使免疫共軛物或裸抗體與藥學(xué)上合適的輔料結(jié)合為混合物。無(wú)菌磷酸鹽緩 沖鹽水是藥學(xué)上合適的輔料的一個(gè)例子。其它合適的輔料是本領(lǐng)域中熟知的。參見(jiàn)例如， Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea & Febiger 1990)，和 Gennaro (ed.)，REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition (Mack Publishing Company 1990)，及其修訂版本?？梢耘渲仆ㄟ^(guò)例如團(tuán)注或連續(xù)輸注來(lái)進(jìn)行靜脈注射用的免疫共軛物或裸抗體。可 以單位劑型提供注射制劑，例如在安瓿或多劑量容器中，同時(shí)加有防腐劑。組合物的形式可 以為在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液，且可以包含諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配制劑?；蛘撸谑褂们?，活性成分可以為與合適的載體(例如，無(wú)菌無(wú)熱原水)配 合的粉末形式。也可以通過(guò)皮下或其它非腸道途徑對(duì)哺乳動(dòng)物施用免疫共軛物、裸抗體、其片段 或融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施例中，以每劑20至2000毫克蛋白的劑量來(lái)施用抗體或其片段。 此外，施用可以是連續(xù)輸注或單次或多次團(tuán)注。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)人施用的免疫共軛物、融合蛋 白或裸抗體的劑量會(huì)因諸如患者的年齡、體重、身高、性別、一般健康狀況和以前的病史等 因素而變化。通常情況下，雖然根據(jù)實(shí)際情況可能會(huì)施用較低或較高的劑量，但是希望為接 受者提供單次靜脈注射或輸注的劑量范圍在約lmg/kg至20mg/kg的免疫共軛物、抗體融合 蛋白或裸抗體。此劑量可根據(jù)需要重復(fù)，例如，每周一次，持續(xù)四到十周；優(yōu)選為每周一次， 持續(xù)八周；更優(yōu)選地，每周一次，持續(xù)四周。施用頻率也可以更低，如隔一周一次，持續(xù)數(shù)月， 或更頻繁，如一周兩次或三次。劑量可通過(guò)各種非腸道途徑來(lái)施用，其中劑量和施用時(shí)間可 以適當(dāng)調(diào)整。試劑盒各種實(shí)施例可涉及包含適合治療或診斷患者的病變組織的組分的試劑盒。示例性 試劑盒可包含至少一種本文所述的抗體、抗原結(jié)合片段或融合蛋白。如果含施用組分的組 合物沒(méi)有配制成通過(guò)消化道來(lái)遞送(如通過(guò)口服)，則可以包括能夠通過(guò)一些其它途徑來(lái) 遞送試劑盒組分的裝置。用于諸如非腸道遞送應(yīng)用的一類裝置是用于將組合物注入受試者 體內(nèi)的注射器。也可以使用吸入裝置。在某些實(shí)施例中，抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段 可以通過(guò)含有抗體的無(wú)菌液體制劑或凍干制劑的預(yù)裝注射器或自動(dòng)注射筆的形式來(lái)提供 (例如，Kivitz 等，Clin. Ther. 2006,28 :1619-29)。試劑盒組分可以包裝在一起，或分裝在兩個(gè)或多個(gè)容器中。在一些實(shí)施例中，容器 可以是含有適合進(jìn)行重組的組合物的無(wú)菌凍干制劑的小瓶。試劑盒還可包含一種或多種適 合進(jìn)行重組和/或?qū)ζ渌噭┻M(jìn)行稀釋的緩沖液。其它可使用的容器包括但不限于小袋、 托盤、箱、管等。試劑盒組分可以無(wú)菌地包裝和保持在容器內(nèi)?？梢园ǖ牧硗庥性噭┖械?使用說(shuō)明。實(shí)例以下實(shí)例是對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的說(shuō)明，不是對(duì)權(quán)利要求范圍的限制。所討論的實(shí)例 采用示例性抗胰腺癌單克隆抗體(PAM4)進(jìn)行研究。使用PAM4MAb的臨床研究已經(jīng)表明大 多數(shù)胰腺癌病在患者中已定位，并且沒(méi)有在正常組織中吸收的跡象。劑量測(cè)定表明有可能 對(duì)腫瘤遞送10至20cGy/mCi，腫瘤與紅骨髓劑量比為3 1至10 1。數(shù)據(jù)顯示PAM4適 用于治療胰腺癌。實(shí)例1人源化PAM4Mab在優(yōu)選的實(shí)施例中，請(qǐng)求保護(hù)的方法和組合物利用抗體hPAM4，其是針對(duì)胰腺癌 粘蛋白培養(yǎng)的鼠源PAM4MAb的人源IgG。利用鼠源PAM4序列的人源化來(lái)減少人抗鼠抗體 (HAMA)反應(yīng)。為產(chǎn)生人源化PAM4，將鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)從小鼠免疫球蛋白的重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移到人框架區(qū)(FR)的抗體序列，接下來(lái)是用其鼠源配對(duì)物替換一些人FR 殘基。人源化單克隆抗體適合用于離體和體內(nèi)診斷和治療方法。鼠源PAM4MAb的可變區(qū)框架序列(圖IA和1B)與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知人源抗 體的比較顯示，PAM4VK和VH的FR分別對(duì)人源抗體Walker Vk和Wil2VH的FR表現(xiàn)出最高程度的序列同源性。因此，選擇Walker Vk和Wil2VH的FR為PAM4VK和VH的鼠源⑶R分別 移植到其中的人框架(圖3)。然而，人源抗體NEWM的FR4序列被用來(lái)替換Wil2FR4序列， 用于PAM4重鏈的人源化(圖:3B)。PAM4FR中側(cè)面環(huán)繞假定的CDR的幾個(gè)氨基酸殘基被保 留在hPAM4中，這是基于這些殘基比其它FR殘基對(duì)Ag結(jié)合的影響更大的考慮。這些殘基 是 Vk 的 21M、47W、59P、60A、85S、87F 和 100G 以及 VH 的 27Y、30P、38K、48I、66K、67A 和 69L。 hPAM4VK(SEQ ID NO :16)禾口 VH(SEQ ID NO :19)的 DNA 和氨基酸序列分別示于圖 3A 和!3B。由Leung等描述的改進(jìn)策略(Leung等，1994)被用來(lái)采用長(zhǎng)寡核苷酸合成 與PCR的組合為hPAM4構(gòu)建設(shè)計(jì)的VH基因(圖4)。 為構(gòu)建hPAM4VH域，在DNA 自動(dòng)合成器(Applied Biosystem)上合成兩條長(zhǎng)寡核苷酸，hPAM4VHA (173-mer)和 hPAM4VHB(173-mer)。hPAM4VHA 代表 hPAM4VH 域的 nt 17 至 189。5' -AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGGCCTCAGTGAA GGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACACATTCCCTAGCTAT GTTTTGCACT GGGTGAAGCA GGCCCCTGGACAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAAT CCTTACAATGATGGTACTCA GTACAATGAG AAG-3‘ (SEQ ID NO 20)hPAM4VHB代表與ntl69至341互補(bǔ)的hPAM4VH域的負(fù)鏈。5' -AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCGTAGCTACCAC CGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCGTGTCGTCAGA TCTCAGCCTG CTCAGCTCCA TGTAGGCTGTGTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGC CTTGCCTTTGAACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC-3‘ (SEQ ID NO 21)hPAM4VHA的3 ‘-末端序列(2 Int殘基)和VHB彼此互補(bǔ)。在規(guī)定的PCR條件下， hPAM4VHA和VHB的3 ‘-端退火形成兩側(cè)由長(zhǎng)寡核苷酸的其余部分環(huán)繞的短雙鏈DNA。每 個(gè)退火端都充當(dāng)單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，產(chǎn)生由hPAM4VH的nt 17至341組成的雙鏈DNA。在 兩個(gè)短寡核苷酸、hPAM4VHBACK和hPAM4VHF0R存在的情況下，該DNA被進(jìn)一步擴(kuò)增，形成全 長(zhǎng)hPAM4VH。下劃線的部分是圖4B所示的亞克隆的限制位點(diǎn)。hPAM4VHBACK 5' -CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGGGCT GAG GTG A~3' (SEQ ID NO 22)hPAM4VHF0R 5' -TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCCCTG GCC CCA-3' (SEQ ID NO 23)在10 μ L 的 IOX PCR 緩沖液(500mM KCl，IOOmM Tris HCl 緩沖液，pH 8. 3，15mM MgCl2)、2 μ mol 的 hPAM4VHBACK和 hPAM4VKF0R和 2. 5 單位的 iTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn.)存在的情況下，將最少量的hPAM4VHA和VHB (由經(jīng)驗(yàn)確定)擴(kuò)增。 這一反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)三個(gè)由在94°C變性1分鐘、45°C退火1分鐘和72°C聚合1. 5分鐘構(gòu)成 的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)循環(huán)。緊隨這個(gè)步驟的是進(jìn)行27個(gè)由在94°C變性1分鐘、55°C退火 1分鐘和72°C聚合1分鐘構(gòu)成的PCR反應(yīng)循環(huán)。hPAM4VH的雙鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被凝膠純化、 以I^stI和BstEII限制位點(diǎn)進(jìn)行限制性消化并克隆到重鏈分期載體VHpBS2的互補(bǔ)PstI/ BstEII限制位點(diǎn)，其中VH序列用編碼翻譯起始密碼子的DNA序列完全裝配，分泌信號(hào)肽符 合讀框地配接在5'端，而內(nèi)含子序列符合讀框地配接在3'端。VHpBS2是VHpBS的修飾的 分期載體(Leung等，Hybrid0ma，13 469,1994), XhoI限制位點(diǎn)在翻譯起始密碼子上游十六 堿基處引入其中，以便于進(jìn)行下一個(gè)亞克隆步驟。裝配的VH基因作為B10I-BamHI限制片 段亞克隆到表達(dá)載體pdHL2，該表達(dá)載體含有處于IgH增強(qiáng)子和MTl啟動(dòng)子控制之下的IgG重鏈和輕鏈的表達(dá)盒以及小鼠d/fr基因作為選擇和擴(kuò)增的標(biāo)記。由于pdHL2的重鏈區(qū)缺 乏BamHI限制位點(diǎn)，因此該配接需要使用連接子以在可變鏈的BamHI位點(diǎn)與pdHL2載體中 存在的HindIII位點(diǎn)之間提供橋接。所得表達(dá)載體表示為hPAM4VHpdHL2。為構(gòu)建人源化Vk序列的全長(zhǎng)DNA，如上所述地合成hPAM4VKA (157-MER)和 hPAM4VKB (156-mer)。如上所述，通過(guò)兩個(gè)短寡核苷酸hPAM4VKBACK和hPAM4VKF0R來(lái)擴(kuò)增 hPAM4VKA 禾口 VKB0hPAM4VKA 代表 hPAM4VK 域的 ntl6 至 172。5' -CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTA GGAGACAGAGTCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTG TAAGTTCCAGCTACTTGTAC TGGTACCAAC AGAAACCAGG GAAAGCCCCCAAACTCTGGA TTTATAGCAC ATCCAACCTG GCTTCTG-3‘ (SEQID NO 24)hPAM4VKB 代表與 nt 153 至 308 互補(bǔ)的 hPAM4VK 域的負(fù)鏈。5 ‘ -GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTA TTCCACTGATGGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTT GCAGACTGCTGATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCAGATCC ACTGCCACTGAAGCGAGCAG GGACTCCAGA AGCCAGGTTG GATGTG-3' (SEQID NO 25)hPAM4VKA和VKB的3 ‘-末端序列(20nt殘基)彼此互補(bǔ)。在規(guī)定的PCR條件下， hPAM4VKA和VKB的3 ‘-端退火，形成兩側(cè)由長(zhǎng)寡核苷酸的其余部分環(huán)繞的短雙鏈DNA。每 個(gè)退火端都充當(dāng)單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，產(chǎn)生由hPAM4VK的nt 16至308組成的雙鏈DNA。在 兩個(gè)短寡核苷酸、hPAM4VKBACK和hPAM4VKF0R存在的情況下，該DNA被進(jìn)一步擴(kuò)增，形成全 長(zhǎng)hPAM4VK。下劃線的部分是如下所述的亞克隆的限制位點(diǎn)。hPAM4VKBACK 5' -GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCCTCC CTG-3‘ (SEQ ID NO 26)hPAM4VKF0R 5' -TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCC GAA CGT-3‘ (SEQ ID NO 27)以PvuII和BgIII限制性消化hPAM4VK的凝膠純化的PCR產(chǎn)物并克隆到輕鏈分 期載體VKpBR2的互補(bǔ)PvuII/BclI位點(diǎn)。VKpBR2是VKpBR的修飾的分期載體(Leung等， Hybridoma, 13 :469，1994),Xbal限制位點(diǎn)在翻譯起始密碼子上游十六堿基處引入其中。裝 配的Vk基因作為^CbaI-BamHI限制片段亞克隆到含VH序列、hPAM4VHpdHL2的表達(dá)載體。所 得表達(dá)載體表示為hPAM4pdHL2。大約30g的hPAM4pdHL2通過(guò)用Mil消化而線性化，并通過(guò)在450V和25 μ F下的 電穿孔轉(zhuǎn)染到Sp2/0-Agl4細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到96孔板中，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 兩天，然后進(jìn)行MTX抗性選擇。在兩至三周開(kāi)始選擇存活的菌落，并通過(guò)ELISA測(cè)定篩選人 源抗體分泌。簡(jiǎn)言之，向用山羊抗人IgG F(ab' )2片段特異性Ab預(yù)涂布的ELISA微孔板 的孔中加入來(lái)自存活菌落的上清液( lOOul)。板在室溫下培養(yǎng)一小時(shí)。通過(guò)用洗滌緩沖 液(含0.05%的Tween-20的PBS)洗滌三次除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。向孔中加入辣根過(guò)氧化 物酶共軛的山羊抗人Fc片段特異性Ab。經(jīng)培養(yǎng)一小時(shí)，洗滌后向孔中加入在PBS中含4mM 鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)和0. 04% H2O2的底物溶液(100 μ L/孔)，允許在黑暗中顯色30 分鐘，通過(guò)加入50 μ L的4Ν H2SO4溶液使反應(yīng)停止。通過(guò)在ELISA讀板器上讀取490nm的 吸光度來(lái)測(cè)定結(jié)合的人IgG。擴(kuò)增陽(yáng)性細(xì)胞克隆，通過(guò)在蛋白質(zhì)A柱上進(jìn)行親和色譜法從細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液中純化出hPAM4。
在涂以胰腺癌細(xì)胞提取物的微量滴定板中通過(guò)ELISA測(cè)定證實(shí)hPAM4的Ag-結(jié) 合活性。開(kāi)發(fā)使用涂PAM4抗原的板進(jìn)行的ELISA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定以評(píng)價(jià)hPAM4的Ag結(jié)合親 和力，并將其與由鼠V和人C域組成的嵌合PAM4的所述親和力進(jìn)行比較。將與不同濃度的 cPAM4或hPAM4混合的定量的HRP共軛cPAM4添加到經(jīng)涂布的孔中并在常溫下培養(yǎng)1_2小 時(shí)。在加入含4mM的鄰苯二胺二鹽酸鹽和0. 04%的H2A的底物溶液之后，通過(guò)讀取490nm 的吸光度來(lái)顯示與CaPanlAg結(jié)合的HRP共軛cPAM4的量。如圖4中的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定所示，hPAM4 和CPAM4抗體顯示出類似的結(jié)合活性。實(shí)例2免疫組織化學(xué)染色研究在正常成人組織上的進(jìn)行的免疫組織化學(xué)表明，PAM4活性表位被限制于染色弱但 仍呈陽(yáng)性的胃腸道(表1)。包括導(dǎo)管、小管、腺泡和島細(xì)胞在內(nèi)的正常胰腺組織的染色呈陰 性。以組織均質(zhì)物為抗原的基于PAM4的酶免疫測(cè)定一般支持免疫組織數(shù)據(jù)(表幻。PAM4 表位不在正常胰腺組織及其它非胃腸道組織中存在。在腫瘤組織中，PAM4可與25個(gè)胰腺 癌中的21個(gè)(85% )(表3和表4)和沈個(gè)結(jié)腸癌中的10個(gè)反應(yīng)，但與胃肺、乳腺、卵巢、前 列腺、肝或腎的腫瘤的反應(yīng)性有限(表4)。PAM4反應(yīng)性似乎與腫瘤分化的階段有關(guān)，在分 化良好的胰腺癌中觀察到的染色比在中度分化或分化差的腫瘤中觀察到的染色比例更高。 一般來(lái)說(shuō)，分化差的腫瘤占所有胰腺癌的不到10%。這些研究已經(jīng)表明，PAM4反應(yīng)性和組織分布(正常和癌)與所報(bào)道的CA19. 9、 DUPAN2、SPANU Nd2和B72. 3抗體以及針對(duì)Lewis抗原的抗體不同。所述數(shù)據(jù)連同用這些 MAb中的一些進(jìn)行的交叉阻斷研究表明，PAM4MAb識(shí)別獨(dú)特的新型表位。當(dāng)與由CA19.9抗 體、DUPAN2抗體和抗Lea抗體識(shí)別的抗原相比時(shí)，PAM4抗原似乎更受限于其組織分布，且可 與更大比例的胰腺腫瘤反應(yīng)。此外，在濃度相當(dāng)?shù)那闆r下，其給出更高的總反應(yīng)強(qiáng)度，且可 與更高比例的胰腺腫瘤內(nèi)細(xì)胞反應(yīng)。最后，發(fā)現(xiàn)PAM4僅可與十二個(gè)慢性胰腺炎樣本中的三 個(gè)微弱反應(yīng)，而CA19. 9和DUPAN2則可與所有十二個(gè)樣本強(qiáng)烈反應(yīng)。雖然人們認(rèn)識(shí)到特異 性部分取決于所采用的測(cè)定類型和受檢組織的范圍及數(shù)量，但PAM4區(qū)別正常與腫瘤胰腺 組織的能力、其與大比例癌樣本反應(yīng)的能力、反應(yīng)的高強(qiáng)度以及區(qū)別早期胰腺癌與良性病 癥(如胰腺炎)的能力都是這種示例性抗胰腺癌抗體的重要特征。表1用MAb PAM4對(duì)正常成人組織進(jìn)行的免疫過(guò)氧化物酶染色
組織染色反應(yīng)胰腺(22)°-導(dǎo)管-腺泡-胰島-頷下腺( -食道⑵-胃⑶+粘液分泌細(xì)胞十二指腸(3)+杯狀細(xì)胞空腸⑶+杯狀細(xì)胞
回腸⑶+杯狀細(xì)胞結(jié)腸⑶+杯狀細(xì)胞
權(quán)利要求
1.一種抗體構(gòu)建體，包含至少一種與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合而不與正常的胰腺組織或胰腺炎 或良性的胰腺組織結(jié)合的抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體構(gòu)建體，其中所述抗胰腺癌抗體與PanIN-lA、PanIN-lB、 PanIN-2、侵襲性胰腺癌、胰腺癌、粘液性囊性腫瘤(MCN)、胰內(nèi)粘液性腫瘤(IPMN)和導(dǎo)管內(nèi) 乳頭狀粘液性腫瘤結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是包含附著于一個(gè)679抗體片 段部分的拷貝的兩個(gè)PAM4抗體片段部分的拷貝的三聚DNL (對(duì)接和鎖定)構(gòu)建體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體構(gòu)建體，其中每個(gè)PAM4抗體片段部分包含PAM4Fab片段 和679抗體片段部分，所述PAM4Fab片段附著于DDD2(SEQ ID NO :34)序列，所述679抗體 片段部分包含附著于AD2 (SEQ ID NO 36)序列的679Fab片段，且所述DDD2序列的二聚體 與所述AD2序列結(jié)合，從而形成三聚構(gòu)建體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體構(gòu)建體，其中所述PAM4抗體片段是hPAM4Fab片段，所述 679抗體片段是h679Fab片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體構(gòu)建體，其中所述PAM4抗體片段部分包含輕鏈可 變區(qū) CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY，(SEQ IDNO 1) ；CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO 2)；和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO 3)；以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ IDNO 4)； CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO 5)和 CDR3(GFGGSYGFAY, SEQ ID NO 6)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體構(gòu)建體，其中所述PAM4抗體片段部分包含鼠源、嵌合、人 源化或人源抗體PAM4片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體構(gòu)建體，其中所述抗胰腺癌抗體或其片段與PAM4抗原結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體構(gòu)建體，其中所述抗胰腺癌抗體或其片段與嵌合 PAM4(cPAM4)抗體競(jìng)爭(zhēng)與人胰腺癌粘蛋白的結(jié)合，其中所述cPAM4抗體包含輕鏈可變 區(qū) CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, (SEQ ID NO :1) ；CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO :2)；和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO :3)；以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID NO :4)； CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQID NO :5)和 CDR3(GFGGSYGFAY, SEQ ID NO :6)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體構(gòu)建體，其中所述抗胰腺癌抗體或其片段與包含氨基 酸序列WTWNITKAYPLP (SEQ ID NO 29)的線狀肽或與包含氨基酸序列ACPEffffGTTC (SEQ ID NO 30)的環(huán)狀肽結(jié)合。
11.一種治療胰腺癌的方法，包括對(duì)患有胰腺癌的個(gè)體施用抗體構(gòu)建體，所述抗體構(gòu)建 體包含至少一種與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合而不與正常的胰腺組織或胰腺炎或良性的胰腺組織結(jié) 合的抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與80%或 更多的人侵襲性胰腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤、PanIN-lA、PanIN-IB和PanIN-2結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與 PanIN-lA, PanIN-IB和PanIN-2結(jié)合，但不與胰腺炎結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段是裸抗體 或其片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，還包括對(duì)所述個(gè)體施用至少一種治療劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一 種治療劑共軛。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述治療劑選自放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、激 素、激素拮抗劑、酶、反義寡核苷酸、siRNA、酶抑制劑、光敏治療劑、細(xì)胞毒素劑、藥物、毒素、 血管生成抑制劑和促凋亡劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述藥物選自氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺 酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類 似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、 甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素拮抗劑、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、喜樹(shù)堿、SN-38、阿霉素 及其類似物、抗代謝物、烷化劑、抗有絲分裂物、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑 制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC抑制劑、促凋亡劑、甲氨喋呤和 CPT-I1。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述毒素選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、 皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)素、白喉 毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、粒細(xì)胞-集落刺激因子 (G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y和 定名為“SL因子”的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自人體生長(zhǎng)激素、N-蛋氨酰人 體生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原、 糖蛋白促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體化激素(LH)、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)、 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、催乳素、胎盤生乳素、OB蛋白、腫瘤壞死 因子-α、腫瘤壞死因子-β、苗勒氏抑制物、小鼠促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、激活素、血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、整合素、促血小板生成素(TPO)、NGF-β血小板生長(zhǎng)因子、TGF-α、TGF-β、 胰島素樣生長(zhǎng)因子-I、胰島素樣生長(zhǎng)因子-II、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、骨誘導(dǎo)因子、干擾 素-α、干擾素-β、干擾素-Y、巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18、IL-21、11^-25、1^正、？1^-3、血管抑素、血小板反應(yīng)素、內(nèi)皮抑素3順-0和LT。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述放射性核素選自111^KmLiu212BiJuBL 211At、62CU、67CU、9°Y、125I、131I、32P、33P、47SC、mAg、67Ga、142ft~、153Sm、161Tb、M2Dy、166Dy、161H0、166H0、 186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225AC、59Fe、75Se、77AS、89Sr、99M0、1(l5Rh ^9PcU143PiN149PmJ69EiN ,Γ、19、、19、、21^、58。。、·^、99^、1·^ ,Ptji9Sbj89mOii92In2i9I^215Pi221FiN217Al 255Fm、uC、13N、150、75Br、224AC、126I、133I、77Br、113mIn、95RU J7Riuic13RiKic15Riu1c17HgJc13HgJ21mTh 122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、143Pr、57C0、51Cr、 e、2(llTl、76Br 和 169Yb0
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括對(duì)所述個(gè)體施用不與所述抗胰腺癌抗體或抗 原結(jié)合片段共軛的第二治療劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與放射性核素共軛，且所述第二治療劑是在施用所述抗胰腺癌抗體或片段之前對(duì)所述個(gè)體施用的放 射敏化劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抗體構(gòu)建體是包含至少一個(gè)PAM4抗體或其 抗原結(jié)合片段和至少一個(gè)與靶向性構(gòu)建體上的半抗原結(jié)合的抗體或片段的雙特異性或多 特異性抗體，且所述方法還包括施用附著于至少一種治療劑的靶向性構(gòu)建體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體構(gòu)建體是包含附著于一個(gè)679抗體片 段部分的拷貝的兩個(gè)PAM4抗體片段部分的拷貝的三聚DNL (對(duì)接和鎖定)構(gòu)建體，且所述 靶向性構(gòu)建體包含至少一種HSG半抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗體構(gòu)建體包含與腫瘤相關(guān)抗原(TAA)結(jié) 合的第二抗體或其抗原結(jié)合片段。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述第二抗體選自CA19.9、DUPAN2、SPANl、Nd2、 B72. 3、CC49、抗Lea抗體、抗諸如Le (y)之類的其它Lewis抗原的抗體、針對(duì)癌胚抗原(CEA) 的抗體、CEACAM6、結(jié)腸特異性抗原-p (CSAp)、MUC-l、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-fec、MUC_16、 MUC-17, HLA-DR、CD40、CD74、CD-80、CD138、HER2/neu、EGFR、EGP-1、EGP-2、血管生成因子、 VEGF, P1GF、胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)、碳酸酐酶IX、腱生蛋白、血小板源生長(zhǎng)因子、IL-6、 癌基因產(chǎn)物、bcl-2、Kras, p53、HER2/neu、cMET和針對(duì)腫瘤壞死物質(zhì)的抗體。
29.一種檢測(cè)或診斷胰腺癌的方法，包括a)對(duì)個(gè)體施用抗體構(gòu)建體，所述抗體構(gòu)建體包含至少一種與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合而不與正 常的胰腺組織或胰腺炎或良性的胰腺組織結(jié)合的抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段；和b)檢測(cè)與胰腺癌細(xì)胞結(jié)合的抗體構(gòu)建體。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體與PanlN-lA、PanlN-lB、 PanIN-2、侵襲性胰腺癌、胰腺癌、粘液性囊性腫瘤(MCN)、胰內(nèi)粘液性腫瘤(IPMN)和導(dǎo)管內(nèi) 乳頭狀粘液性腫瘤結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與80%或 更多的人侵襲性胰腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤、PanlN-lA、PanIN-IB和PanIN-2結(jié)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與 PanlN-lA, PanIN-IB和PanIN-2結(jié)合，但不與胰腺炎結(jié)合。
33.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一 種診斷劑共軛。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述診斷劑選自放射性核素、造影劑、熒光齊IJ、 化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑、順磁離子、酶和光敏診斷劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述診斷劑是選自以下的放射性核素=lltlIru “1^、177^!、1^、52!^、62^!、64^!、67^!、6^!、 ^、8’、9’、8 、94"^、94!^、99"^、1 、12”、1、、12”、 ⑶工嚴(yán)…8Gd、32p、llc、13N、15o、186Re、188Re、5lMn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82fflRb、83Sr 或其它 γ_、 β-或正電子-發(fā)射體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述放射性核素是18F,且所述方法還包括PET 成像。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述順磁離子選自鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、 鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述診斷劑是選自異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻 紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺的螢光標(biāo)記化合物或選自魯米諾、異魯 米諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物或選自瑩光素、螢光素酶 和水母發(fā)光蛋白的生物發(fā)光化合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述方法用于外科手術(shù)中、內(nèi)窺鏡檢查中或血 管內(nèi)的程序。
40.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述抗體構(gòu)建體是包含附著于一個(gè)679抗體片 段部分的拷貝的兩個(gè)PAM4抗體片段部分的拷貝的三聚DNL (對(duì)接和鎖定)構(gòu)建體，且所述 方法還包括對(duì)所述個(gè)體施用包含至少一種HSG半抗原的靶向性構(gòu)建體，其中所述靶向性構(gòu) 建體與至少一種診斷劑共軛。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述診斷劑是18F，且所述方法還包括PET成像。
42.一種診斷胰腺癌的方法，包括a)獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是用至少一種診斷劑標(biāo)記的，或者 所述抗體是與用至少一種診斷劑標(biāo)記的靶向性構(gòu)建體結(jié)合的雙特異性抗體的一部分；b)使所述抗體接觸到疑似含胰腺癌細(xì)胞的樣本；和c)檢測(cè)與所述樣本中的胰腺癌細(xì)胞結(jié)合的抗體的存在與否，其中抗體與所述樣本的結(jié) 合表明胰腺癌的存在。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中抗體與所述樣本的結(jié)合將所述樣本中胰腺癌的 存在與正常或良性的胰腺組織區(qū)別開(kāi)來(lái)。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中抗體與所述樣本的結(jié)合將所述樣本中胰腺癌的 存在與胰腺炎區(qū)別開(kāi)來(lái)。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中抗體與所述樣本的結(jié)合是所述樣本中存在早期 胰腺癌的診斷。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中使所述抗體接觸到體內(nèi)或體外的所述樣本。
47.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述樣本是血清樣本，且所述方法還包括在使 所述樣本接觸到所述抗體之前對(duì)所述血清樣本進(jìn)行有機(jī)相萃取。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述有機(jī)相是丁醇。
49.一種DNL構(gòu)建體，包含第一融合蛋白與第二融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包含 附著于DDD肽或AD肽的hPAM4抗體或其抗原結(jié)合片段，當(dāng)所述第一融合蛋白包含DDD肽時(shí)， 所述第二融合蛋白包含AD肽，或者當(dāng)所述第一融合蛋白包含AD肽時(shí)，所述第二融合蛋白包 含DDD肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的DNL構(gòu)建體，其中所述DDD肽是DDD2肽(SEQID NO 34)， 所述 AD 肽是 AD2 肽(SEQ ID NO 36)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第二融合蛋白與聚乙二醇(PEG)部 分共軛。
52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第二融合蛋白包含細(xì)胞因子部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的DNL構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞因子部分是干擾素-α2b。
54.根據(jù)權(quán)利要求49所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第二融合蛋白包含h679抗體或其抗 原結(jié)合片段。
55.根據(jù)權(quán)利要求49所述的DNL構(gòu)建體在生產(chǎn)用于治療、檢測(cè)或診斷胰腺癌的藥物方 面的用途。
全文摘要
本文描述的是組合物和使用抗胰腺癌抗體或其片段(如鼠源、嵌合、人源化或人源PAM4抗體)的方法。所述抗體顯示出許多新穎和實(shí)用的治療特性，如與胰腺癌及其它癌的結(jié)合具有高特異性，但與正?；蛄夹缘囊认俳M織的結(jié)合則不然，且與大比例的早期胰腺癌結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述抗體與胰腺癌粘蛋白結(jié)合。所述抗體及片段可用于檢測(cè)、診斷和/或治療癌(如胰腺癌)。同與Lewis抗原結(jié)合的諸如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3和Leaa及Le(y)抗體之類的其它已知抗體相比，所述抗體(如與PAM4抗原結(jié)合的PAM4抗體)顯示出獨(dú)特的細(xì)胞及組織分布。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102137681SQ200980134258
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者C-H·張, D·M·戈登伯格, D·V·戈?duì)柕? H·J·漢森 申請(qǐng)人:埃姆諾醫(yī)藥有限公司