專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)Notch途徑的單可變結(jié)構(gòu)域的制作方法
針對(duì)Notch途徑的單可變結(jié)構(gòu)域本發(fā)明涉及氨基酸序列(在本文中還稱(chēng)為“本發(fā)明的一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域”、 “本發(fā)明的納米抗體 ”或“本發(fā)明的多種納米抗體 ”、“本發(fā)明的一種或多種多肽”)，其 針對(duì)(如本文所定義的)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員諸如Notch受體的四個(gè)哺乳動(dòng)物成員 (Notch-Ι，Notch-2, Notch-3, Notch-4,以后也稱(chēng)為 “Notch 受體”)和 Notch 配體的 5 個(gè)哺 乳動(dòng)物成員(具有“0仏1”，“0仏3”，“01^4”的δ-樣家族，其中“DLL”代表δ-樣配體；具 有“Jagged-1”，"Jagged-2"的Jagged家族，以后也稱(chēng)為“Notch配體”)，以及包含一個(gè)或 多個(gè)所述一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由一個(gè)或多個(gè)所述一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域 (本文中也分別稱(chēng)為“本發(fā)明的構(gòu)建體”和“本發(fā)明的多個(gè)構(gòu)建體”，“本發(fā)明的納米抗體 ” 或“本發(fā)明的多種納米抗體 ”)組成的構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明涉及下調(diào)或上調(diào)Notch信 號(hào)傳導(dǎo)的干擾Notch途徑的單可變結(jié)構(gòu)域(本文也稱(chēng)為“Notch-拮抗劑”或“Notch-激動(dòng) 劑”)。本發(fā)明還涉及編碼所述單可變結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建體的核酸(本文中還稱(chēng)為“本發(fā)明的 多種核酸”，“本發(fā)明的核酸”，“本發(fā)明的核苷酸序列”或“本發(fā)明的多個(gè)核苷酸序列”)；用于 制備所述單可變結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建體的方法；表達(dá)或能夠表達(dá)所述單可變結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建體的宿 主細(xì)胞；包含所述單可變結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建體的組合物，且特別是藥物組合物；以及所述單可 變結(jié)構(gòu)域、構(gòu)建體、核酸、宿主細(xì)胞和/或組合物的應(yīng)用，特別是用于預(yù)防性、治療性或診斷 性目的的應(yīng)用，諸如在癌癥、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)變性疾病和特別是本文中所提及的預(yù)防性、治 療性或診斷性目的中的應(yīng)用。從本文進(jìn)一步的描述中本發(fā)明的其他方面、實(shí)施方案、優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用將變得清楚。Notch途徑已知控制許多組織在發(fā)育和分化期間的細(xì)胞命運(yùn)選擇。對(duì)于癌癥，大量 的觀(guān)察表明慢性主動(dòng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)與許多細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化表型有關(guān)。在幾種常見(jiàn)的上皮惡 性腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中觀(guān)察到明顯的全長(zhǎng)Notch受體和配體的過(guò)量表達(dá)。在其他情況下， 活化的Notch信號(hào)傳導(dǎo)是由產(chǎn)生組成性活性Notch受體的缺失所引起的(Miele等，見(jiàn)前)。 本發(fā)明的多肽在癌癥中可能適當(dāng)?shù)挠猛镜膶?shí)例主要是以Notch拮抗劑的形式并且為例如， 宮頸癌、宮頸上皮中的瘤前病變、子宮內(nèi)膜癌、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(T-ALL)、急性 早幼粒細(xì)胞白血病、紅白血病、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤至胸膜間 皮瘤(Miele等，見(jiàn)前)、具有過(guò)度血管發(fā)生的疾病(Thurston G.等，2007，Nature (自然)7， 327-331)。DLL4的阻斷通過(guò)促進(jìn)非生產(chǎn)性血管發(fā)生而抑制腫瘤生長(zhǎng)(W02007070671)。對(duì)于神經(jīng)變性疾病，許多年來(lái)已知Notch信號(hào)傳導(dǎo)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有 重要地位，并且近年來(lái)還已知在神經(jīng)病理學(xué)中具有重要地位。本發(fā)明的多肽在神經(jīng)變性疾 病中可能適當(dāng)?shù)挠猛镜膶?shí)例主要是以Notch激動(dòng)劑的形式并且為例如CADASIL、阿爾茨海 默病、家族性阿爾茨海默病、脫髓鞘疾病諸如多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)學(xué)病變諸如脊髓損傷、卒 中(Miele等，見(jiàn)前)。對(duì)于免疫調(diào)節(jié)，相當(dāng)多的證據(jù)指出Notch信號(hào)傳導(dǎo)在免疫系統(tǒng)中的多重作用。已 經(jīng)確定Notch信號(hào)傳導(dǎo)在T細(xì)胞成熟中具有一定作用，特別是通過(guò)抑制“分化”程序，該程 序是在T細(xì)胞活化后通過(guò)同種相互作用來(lái)觸發(fā)的。因此，Notch激動(dòng)劑可以用于免疫抑制性或致耐受性干預(yù)(用于移植/移植物抗宿主疾病)；Notch拮抗劑可能擴(kuò)大免疫反應(yīng)。本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域和構(gòu)建體通?？梢杂脕?lái)調(diào)節(jié)，且特別是抑制和/或防止 Notch配體與Notch受體的結(jié)合，并且因此用來(lái)調(diào)節(jié)，且特別是抑制或防止由Notch配體和 /或Notch受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)其中涉及Notch配體和/或Notch受體的生物學(xué) 途徑，和/或調(diào)節(jié)與所述信號(hào)傳導(dǎo)或這些途徑相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制、應(yīng)答和作用。同樣地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域和構(gòu)建體可以用于預(yù)防和治療(如本文所定義) 癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病。通常，癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病可以 被定義為可以通過(guò)適當(dāng)?shù)叵蛐枰涞氖茉囌?即，具有該疾病或紊亂或其至少一種癥狀和 /或處于誘發(fā)或發(fā)生該疾病或紊亂的危險(xiǎn))適當(dāng)?shù)厥┯帽景l(fā)明的任一種多肽或組合物(和 特別地，其藥物活性量)和/或針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑成員或其 中涉及Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的生物學(xué)途徑或機(jī)制的已知有效成分(和特別地，其藥 物活性量的)而分別地預(yù)防和/或治療的疾病和紊亂?；诒疚牡墓_(kāi)內(nèi)容所述癌癥、神 經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)疾病的實(shí)例對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是清楚的，并且例如包括下列的疾病 和紊亂阿爾茨海默病、宮頸癌、宮頸上皮中的瘤前病變、子宮內(nèi)膜癌、T細(xì)胞急性原淋巴細(xì) 胞性白血病(T-ALL)、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、紅白血病、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì) 胞瘤和髓母細(xì)胞瘤至胸膜間皮瘤(Miele等，見(jiàn)前)、具有過(guò)度血管發(fā)生的疾病(Thurston G.等，2007，Nature (自然)7，327-331)、CADASIL、阿爾茨海默病、家族性阿爾茨海默病、脫 髓鞘疾病諸如多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)學(xué)病變諸如脊髓損傷、卒中(Miele等，見(jiàn)前)、移植/移植 物抗宿主疾病。具體地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域和構(gòu)建體可以用于預(yù)防和治療癌癥、神經(jīng)變性疾 病和免疫調(diào)節(jié)性疾病，它們的特征在于由Notch信號(hào)途徑的成員或其中涉及Notch信號(hào)傳 導(dǎo)途徑的成員的一種或多重途徑所介導(dǎo)的過(guò)度的和/或不希望的信號(hào)傳導(dǎo)。基于本文的公 開(kāi)內(nèi)容，所述癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病的實(shí)例對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)仍然是清楚 的。因此，而非限制地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以例如用來(lái)預(yù)防和/或治療目前用 可以調(diào)節(jié)Notch途徑介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的有效成分預(yù)防或治療的所有疾病和紊亂，諸如上面 所引用的現(xiàn)有技術(shù)中所提到的那些。還設(shè)想本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以用來(lái)預(yù)防和/或治 療目前正在開(kāi)發(fā)的，已經(jīng)提出的，或未來(lái)將提出的或開(kāi)發(fā)的用所述有效成分治療的所有疾 病和紊亂。另外，設(shè)想因?yàn)槿绫疚倪M(jìn)一步所述的它們的有利的性質(zhì)，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域 可以用于預(yù)防和治療正在使用的或?qū)⒁岢龅幕蜷_(kāi)發(fā)的這些已知的有效成分以外的其他 疾病和紊亂；和/或本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以提供用于治療本文中所述的疾病和紊亂的 新方法和治療方案。從本文的進(jìn)一步公開(kāi)內(nèi)容中本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域的其他應(yīng)用和用途對(duì)于技術(shù)人員將變得清楚?？傮w上，本發(fā)明的目的是提供藥物活性劑，以及包含其的構(gòu)建體，它們可以用于診 斷、預(yù)防和/或治療癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病以及本文中提及的更多的疾病 和紊亂；和提供用于診斷、預(yù)防和/或治療所述疾病和紊亂的方法，該方法包括施用和/或 應(yīng)用所述藥劑和構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明的目的是提供所述藥物活性劑、構(gòu)建體和/或方法，它們與本領(lǐng)域中目前使用的和/或已知的藥劑、構(gòu)建體和/或方法相比具有某些優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)從下面 的進(jìn)一步描述中將變得清楚。更具體地，本發(fā)明的目的是提供可以用作用于診斷、預(yù)防和/或治療癌癥、神經(jīng)變 性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病以及本文中提及的更多的疾病和紊亂的藥物活性劑的治療性蛋 白，和包含其的構(gòu)建體；和提供用于診斷、預(yù)防和/或治療所述疾病和紊亂的方法，所述方 法包括施用和/或使用所述治療性蛋白和構(gòu)建體。因此，本發(fā)明的一個(gè)特殊目的是提供單可變結(jié)構(gòu)域，其針對(duì)(如本文所定義) Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，特別地針對(duì)來(lái)自溫血?jiǎng)游锏腘otch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，更特 別地針對(duì)來(lái)自哺乳動(dòng)物的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，且尤其針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 人類(lèi)成員；和提供包含至少一種所述氨基酸序列或基本上由至少一種所述氨基酸序列組成 的單可變結(jié)構(gòu)域。具體地，本發(fā)明的一個(gè)特殊目的是提供這樣的單可變結(jié)構(gòu)域，其適合于在溫血?jiǎng)?物，且特別地在哺乳動(dòng)物，和更特別地在人類(lèi)中的預(yù)防、治療和/或診斷用途。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)特殊目的是提供這樣的單可變結(jié)構(gòu)域，其可以用于在溫 血?jiǎng)游铩⑻貏e地在哺乳動(dòng)物和更特別地在人類(lèi)中預(yù)防、治療、緩解和/或診斷與Notch信號(hào) 傳導(dǎo)途徑的成員相關(guān)和/或由Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員介導(dǎo)的一種或多種疾病、紊亂或 病癥(諸如本文中提及的疾病、紊亂和病癥)。本發(fā)明還有一個(gè)特殊的目的是提供這樣的單可變結(jié)構(gòu)域，其可以用于制備用于在 溫血?jiǎng)游?、特別地在哺乳動(dòng)物和更特別地在人類(lèi)中預(yù)防和/或治療與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑 的成員相關(guān)和/或由Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員介導(dǎo)的一種或多種疾病、紊亂或病癥(諸 如本文中提及的疾病、紊亂和病癥)的藥用或獸醫(yī)用組合物。在本發(fā)明中，總體上，這些目的通過(guò)使用本文所述的氨基酸序列、蛋白、單可變結(jié) 構(gòu)域和構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)。總體上，本發(fā)明提供針對(duì)(如本文定義)和/或可以特異性結(jié)合(如本文定義) 于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié)構(gòu)域；以及包含至少一種所述氨基酸序列的化合 物和構(gòu)建體，和具體地蛋白和單可變結(jié)構(gòu)域。更具體地，本發(fā)明提供可以以如本發(fā)明所定義的親和力(適當(dāng)測(cè)量和/或表示為 Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選 地為IC5tl值，如本發(fā)明進(jìn)一步所述)與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的單可變結(jié)構(gòu)域；以 及包含至少一個(gè)所述氨基酸序列的化合物和構(gòu)建體、且特別是蛋白和單可變結(jié)構(gòu)域。特別地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是這樣的，以致它們-以10_5_10_12摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地和更優(yōu)選地10_8_10_12摩爾/升的解離 常數(shù)(Kd) ( S卩，以IO5-IO12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地IO7-IO12升/摩爾或更大、且更優(yōu)選 地IO8-IO12升/摩爾的締合常數(shù)(Ka))與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合；和/或這樣，以致它們-以IO2M-1S-1-約 IO7MW 優(yōu)選 ΙΟ^ΤΥ^ΙΟ 、-1，更優(yōu)選 ΙΟ Υ Ο'Μ 諸如 lO^s-i-lOfs—1的k。n-速率與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合；和/或這樣，以致它們-以Is—1(t1/2 = 0. 69s) -KTfV1 (假定具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復(fù)合體)，優(yōu)選ΙΟΥΚ1，更優(yōu)選lOY-lO、-1，諸如IO-4S-LlO-6S-1的k。ff速率與Notch信號(hào)傳導(dǎo) 途徑的成員結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價(jià)氨基酸序列(或包含僅一個(gè)本發(fā)明的氨基酸序列的多肽) 優(yōu)選是這樣，以致它將以小于500nM，優(yōu)選小于200nM，更優(yōu)選小于ΙΟηΜ，諸如小于500pM的 親和力與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合。對(duì)于單可變結(jié)構(gòu)域或本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合 的一些優(yōu)選的IC50值將從本發(fā)明的進(jìn)一步描述和實(shí)施例中變得清楚。對(duì)于與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，本發(fā)明的氨基酸序列通常將在其氨基酸 序列內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、或氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)序列(即，每個(gè)“序列”包 括彼此相鄰或彼此緊鄰的兩個(gè)(或多個(gè))氨基酸殘基，即，在該氨基酸序列的一級(jí)或三級(jí)結(jié) 構(gòu)上)，通過(guò)其本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，因此所述氨 基酸殘基或氨基酸殘基序列形成結(jié)合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的位點(diǎn)(本文還稱(chēng)為“抗 原結(jié)合位點(diǎn)”)。本發(fā)明提供的單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地基本上采用分離形式(如本文所定義)、或形 成本發(fā)明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定義)，其可以包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可 變結(jié)構(gòu)域或基本上由其組成，并且其可以任選地還包括一個(gè)或多個(gè)其它單可變結(jié)構(gòu)域(全 部任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^連接)。例如，并且不限于，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)單可 變結(jié)構(gòu)域可以用作在這樣的蛋白或多肽內(nèi)的結(jié)合單位，所述蛋白或多肽可以任選地包含可 以作為結(jié)合單位的一個(gè)或多個(gè)其它單可變結(jié)構(gòu)域(即，針對(duì)除Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員 外的一個(gè)或多個(gè)其它靶標(biāo))，以便分別提供單價(jià)、多價(jià)或多特異性的本發(fā)明的多肽，全如本 文所述。這樣的蛋白或多肽還可以采用基本上分離的形式(如本文所定義)。因此，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地基本上由不通過(guò)二硫鍵與任何其他的氨基酸 序列或鏈連接(但是其可以或可以不包含一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。例如，已知(如本文 所述的)納米抗體有時(shí)可以在CDR3和CDRl或FR2之間包含二硫鍵)的單一氨基酸鏈組 成。然而，應(yīng)該注意，一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以彼此連接和/或與其他單可 變結(jié)構(gòu)域連接(例如，通過(guò)二硫鍵)，以提供也可以用于本發(fā)明的肽構(gòu)建體(例如，F(xiàn)ab'片 段，F(xiàn)(ab’)2片段，ScFv構(gòu)建體，“雙抗體”和其他多特異性構(gòu)建體。例如，參考Holliger和 Hudson, Nat Biotechnol.(自然生物技術(shù))2005 年 9 月；23 (9) :11洸_36 的綜述)。一般地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列(或包括其的化合物、構(gòu)建體或多肽)意欲施用給 受試者時(shí)(例如，為了如本文所述的治療和/或診斷目的)，優(yōu)選在所述受試者內(nèi)不天然存 在的氨基酸序列；或當(dāng)它在所述受試者內(nèi)不天然存在時(shí)，采用基本上分離的形式(如本文 所定義)。熟練的技術(shù)人員還應(yīng)該清楚，對(duì)于藥物應(yīng)用，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域(以及包括 其的化合物、構(gòu)建體和單可變結(jié)構(gòu)域)優(yōu)選地針對(duì)人Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員；而對(duì)于獸 醫(yī)用目的，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地針對(duì)來(lái)自待治療的物種的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 成員，或至少與來(lái)自待治療的物種的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員交叉反應(yīng)。此外，本發(fā)明的氨基酸序列可以任選地，并且除了所述至少一個(gè)針對(duì)Notch信號(hào) 傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)之外，包含針對(duì)其它抗原、蛋白或靶標(biāo)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè) 其它結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域的功效、以及包含其的構(gòu)建體的功效可以使用任何適合的 體外測(cè)定、基于細(xì)胞的測(cè)定、體內(nèi)測(cè)定和/或本質(zhì)上已知的動(dòng)物模型、或它們的任何組合進(jìn) 行檢測(cè)，這取決于所涉及的具體的疾病或病癥。適當(dāng)?shù)臏y(cè)定和動(dòng)物模型對(duì)于熟練的技術(shù)人 員將是清楚的，并且例如，包括用于多種疾病的開(kāi)發(fā)的其中涉及Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員的小鼠模型(T. Gridley，Human Molecular Genetics (人類(lèi)分子遺傳學(xué))，2003，第12卷， 綜述刊1，R9-R13)，以及使在下述實(shí)驗(yàn)部分和在本發(fā)明引用的現(xiàn)有技術(shù)中所用的測(cè)定和動(dòng) 物模型。此外，按照本發(fā)明，針對(duì)來(lái)自第一溫血?jiǎng)游镂锓N的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的 單可變結(jié)構(gòu)域可以表現(xiàn)或可以不表現(xiàn)出與來(lái)自一種或多種其它溫血?jiǎng)游镂锓N的Notch信 號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的交叉反應(yīng)性。例如，針對(duì)人Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié) 構(gòu)域可以或可以不表現(xiàn)出與來(lái)自一種或多種其它靈長(zhǎng)類(lèi)物種(諸如，不限于，來(lái)自獼猴屬 (Macaca)的猴子(諸如，并且特別地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒 河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))的Notch信號(hào)傳 導(dǎo)途徑的成員的交叉反應(yīng)性，和/或與來(lái)自通常用于疾病動(dòng)物模型中的(例如小鼠、大鼠、 兔、豬或狗)、且特別是用于與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員相關(guān)的疾病和紊亂的動(dòng)物模型中 (諸如本文提及的物種和動(dòng)物模型)的一種或多種動(dòng)物物種的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員 的交叉反應(yīng)性。在這一方面，對(duì)于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，從藥物開(kāi)發(fā)觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，所述交 叉反應(yīng)性，當(dāng)存在時(shí)，可以具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗试S在所述疾病模型中檢測(cè)所述針對(duì)人Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié)構(gòu)域。更一般地，與來(lái)自多個(gè)哺乳動(dòng)物物種的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員交叉反應(yīng)的本 發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域?qū)⑼ǔＳ欣谟糜讷F醫(yī)應(yīng)用，原因在于它將允許在多種物種之間使用 相同的氨基酸序列或多肽。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括針對(duì)來(lái)自一個(gè)動(dòng)物物種的Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié)構(gòu)域(諸如針對(duì)人Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié) 構(gòu)域)可以用于治療另一個(gè)動(dòng)物物種，只要所述單可變結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用在待治療的物種中提 供所需要的作用。本發(fā)明在其最廣泛意義上還不特別限于或限定在本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域所針 對(duì)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的特異性抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象 (confirmation)(在適用時(shí))。例如，單可變結(jié)構(gòu)域可以針對(duì)或可以不針對(duì)“相互作用位 點(diǎn)”(如本文所定義)。然而，通常假定并且優(yōu)選本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地針對(duì)相互作 用位點(diǎn)(如本文所定義)，和特別地至少部分地針對(duì)配體-受體相互作用位點(diǎn)的配體位點(diǎn)或 受體位點(diǎn)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的方面，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域針對(duì)Notch配體 (見(jiàn)前)的配體-受體相互作用位點(diǎn)或/和針對(duì)Notch受體(見(jiàn)前)的配體-受體相互作 用位點(diǎn)，并且如本文進(jìn)一步所定義的。如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明的多肽可含有兩個(gè)或多個(gè)針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 成員的本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域。通常，所述單可變結(jié)構(gòu)域與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員 以高于本發(fā)明的單個(gè)氨基酸序列的抗體親抗原性結(jié)合。此類(lèi)多肽可以例如包括兩個(gè)針對(duì) Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的相同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(在適用 時(shí))(可以是或不是相互作用位點(diǎn))的本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域；或包括至少一個(gè)本發(fā)明的 “第一”氨基酸序列，其針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的第一相同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(在適用時(shí))(可以是或不是相互作用位點(diǎn))；以及至少一個(gè)本發(fā)明 的“第二”氨基酸序列，其針對(duì)與所述第一不同的第二抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基 或構(gòu)象(在適用時(shí))(并且同樣可以是或不是相互作用位點(diǎn))。優(yōu)選地，在本發(fā)明的所述“雙 互補(bǔ)位型”單可變結(jié)構(gòu)域中，至少一個(gè)本發(fā)明的氨基酸序列針對(duì)相互作用位點(diǎn)(如本文所定 義)，盡管本發(fā)明在其最廣泛的意義上不限于此。此外，當(dāng)所述靶標(biāo)為結(jié)合對(duì)(例如，受體-配體結(jié)合對(duì))的一部分時(shí)，所述單可變 結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，即，它們與同源的結(jié)合配偶體(例如，配體，受體或其他結(jié)合配偶體， 在適用時(shí))競(jìng)爭(zhēng)與所述靶標(biāo)的結(jié)合，和/或是這樣的，即，它們(完全地或部分地)中和所 述結(jié)合配偶體與所述靶標(biāo)的結(jié)合。在適用時(shí)，本發(fā)明的氨基酸序列可以結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的兩個(gè)以 上的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象，這也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在此情況下，與 本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu) 域或亞基可以基本上是相同的(例如，如果Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員包含重復(fù)的結(jié)構(gòu)基 序或以多聚體形式存在)，或可以是不同的(并且在后一種情況下，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域 可以以可能相同或不同的親和力和/或特異性結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的所述 不同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基)。此外，例如，當(dāng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員以活化構(gòu)象存在和以無(wú)活性構(gòu)象存在時(shí)，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合于這些構(gòu)象中 的任一種，或者可以結(jié)合于這兩種構(gòu)象(即，以可能是相同的或不同的親和力和/或特異 性)。此外，例如，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以這樣地結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的 構(gòu)象，即，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域與相關(guān)配體結(jié)合，可以這樣地結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑 的成員的構(gòu)象，即，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域不與相關(guān)配體結(jié)合，或者可以結(jié)合于所述兩種構(gòu) 象(同樣以可能是相同的或不同的親和力和/或特異性)。還期望本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域通常將結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的所有 天然存在的或合成的類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段；或至少結(jié)合于Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的那些類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段，它們包含與在 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員中(例如在野生型Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員中)與本發(fā)明的 單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合的(一個(gè)或多個(gè))抗原決定簇或(一個(gè)或多個(gè))表位基本上相同的一個(gè) 或多個(gè)抗原決定簇或表位。同樣地，在此情況下，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以以本發(fā)明的 單可變結(jié)構(gòu)域與(野生型)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的親和力和特異性相同或不同 (即，高于或低于其)的親和力和/或特異性結(jié)合于所述類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部 分和片段。本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合于Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的一些類(lèi)似物、變體、 突變體、等位基因、部分和片段而不結(jié)合于另一些，這也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員以單體形式存在和以一個(gè)或多個(gè)多聚體形式存在 時(shí)，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域只與單體形式的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，只與多聚體 形式的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，或均與單體和多聚體形式二者結(jié)合，在本發(fā)明的 范圍內(nèi)。同樣地，在這樣的情形中，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以以與本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域 與所述多聚體形式結(jié)合的親和力和特異性相同或不同(即，高于或低于其)的親和力和/ 或特異性與單體形式結(jié)合。此外，當(dāng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員可以與其他蛋白或單可變結(jié)構(gòu)域締合以形成蛋白復(fù)合體(例如，具有多個(gè)亞基)時(shí)，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域與處于其非締合狀態(tài)的 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，與處于其締合狀態(tài)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，或 與二者均結(jié)合，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在所有這些情形中，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以以與 本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域與處于其單體和非締合狀態(tài)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的 親和力和/或特異性可能是相同的或不同(即，高于或低于其)的親和力和/或特異性與 所述多聚體或締合蛋白復(fù)合體結(jié)合。此外，對(duì)于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，包含兩個(gè)或更多個(gè)針對(duì)Notch信號(hào)傳 導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或單可變結(jié)構(gòu)域可以以比相對(duì)應(yīng)的單體氨基酸序列 更高的抗體親抗原性與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合。例如，但不限于，包含兩個(gè)或更多 個(gè)針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的不同表位的單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或單可變結(jié)構(gòu)域可 以(并且通常將)以比不同單體的每一個(gè)更高的抗體親抗原性結(jié)合，并且包含兩個(gè)或更多 個(gè)針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或單可變結(jié)構(gòu)域還可以(并且通 常將)以更高的抗體親抗原性結(jié)合。一般地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域?qū)⒅辽俳Y(jié)合那些形式的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員(包括單體、多聚體和締合形式)，從生物學(xué)和/或治療觀(guān)點(diǎn)看來(lái)，其是最相關(guān)的，這對(duì)于 熟練的技術(shù)人員將是清楚的。使用本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域的部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或 衍生物，和/或使用包括一個(gè)或多個(gè)所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或 衍生物或基本上由其組成的蛋白或單可變結(jié)構(gòu)域，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些適用于 本發(fā)明考慮的應(yīng)用。所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物通常將 包含(至少部分的)針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)；并且 更優(yōu)選地將能夠特異性結(jié)合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，并且甚至更優(yōu)選地能夠以如本發(fā) 明所定義的親和力(適當(dāng)?shù)販y(cè)量和/或表示為Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的 或表觀(guān)的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選地作為IC5tl值，如本發(fā)明進(jìn)一步所述)結(jié)合 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員。所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因、衍生物、蛋白 和/或單可變結(jié)構(gòu)域的一些非限制性實(shí)例將通過(guò)本發(fā)明的進(jìn)一步描述變得清楚。還可以通 過(guò)適當(dāng)組合(即，通過(guò)連接或基因融合)一個(gè)或多個(gè)(更小的)本發(fā)明所述的部分或片段 而提供本發(fā)明的其他片段或單可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)具體而非限制性方面中，其將在本發(fā)明中進(jìn)一步描述，與它們衍 生而來(lái)的氨基酸序列相比，所述類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因、衍生物在血清中具有增加 的半衰期(如本發(fā)明進(jìn)一步所述)。例如，可以將本發(fā)明的氨基酸序列連接到(化學(xué)或其他 方式)一個(gè)或多個(gè)延長(zhǎng)半衰期的基團(tuán)或部分(諸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本 發(fā)明的氨基酸序列的衍生物。在一個(gè)具體而非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白 折疊的氨基酸序列，或可以是在適當(dāng)條件(諸如生理?xiàng)l件)下能夠形成免疫球蛋白折疊 (即，通過(guò)折疊)的氨基酸序列。其中特別參考Halaby等，J. (1999)蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.) 12，563-71的綜述。優(yōu)選地，當(dāng)正確折疊以形成免疫球蛋白折疊時(shí)，這樣的氨基酸序列 能夠特異性結(jié)合(如本發(fā)明所定義)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員；并且更優(yōu)選地能夠以如本 發(fā)明所定義的親和力(適當(dāng)?shù)販y(cè)量和/或表示為Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，k。n_速率和/或k。ff_速率，或備選地作為IC5tl值，如本發(fā)明進(jìn)一步所述)結(jié) 合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員。此外，所述單可變結(jié)構(gòu)域的部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變 體、等位基因和/或衍生物優(yōu)選是這樣的，以致它們包括免疫球蛋白折疊或者能夠在適當(dāng) 的條件下形成免疫球蛋白折疊。特別地，但不限于，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以是基本上由4個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為 FR1-FR4)和3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成的單可變結(jié)構(gòu)域；或所述氨基酸 序列的任何適當(dāng)?shù)钠?那么其通常將包含至少一些形成至少一個(gè)CDR的氨基酸殘基，如 本文進(jìn)一步所述)。本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以特別是免疫球蛋白序列或其適當(dāng)?shù)钠危⑶腋貏e 地是免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列或其適當(dāng)?shù)钠危T如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(例如，序 列)或其適當(dāng)?shù)钠?；或重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(例如，Vh-序列)或其適當(dāng)?shù)钠?。?dāng)本發(fā) 明的氨基酸序列是重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列時(shí)，它可以是來(lái)源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu) 域序列(諸如，不限于，來(lái)源于人抗體的Vh序列)，或是來(lái)源于所謂的“重鏈抗體”(如本文 所定義)的所謂的Vhh-序列(如本文所定義)。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明不限制本發(fā)明的氨基酸序列的來(lái)源(或用于表達(dá)其的 本發(fā)明的核苷酸序列的來(lái)源)，也不限制產(chǎn)生或獲得(或已經(jīng)產(chǎn)生或獲得)本發(fā)明的氨基酸 序列或核苷酸序列的方法。因此，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以是天然存在的單可變結(jié)構(gòu)域 (來(lái)自任何適當(dāng)?shù)奈锓N)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本發(fā)明的具體而非限制性方 面，所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(來(lái)自任何適當(dāng)?shù)奈锓N)或合成的或半 合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定義)免疫球蛋白序列(諸 如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特別是部分或完全人源化的Vra序 列或納米抗體)，“駱駝源化的(camelized)”(如本文所定義的)免疫球蛋白序列，以及已 經(jīng)通過(guò)下列技術(shù)獲得的免疫球蛋白序列諸如親和力成熟(例如，起始于合成的、隨機(jī)的或 天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，鑲蓋術(shù)(veneering)，組合來(lái)源于不同的免疫球蛋 白序列的片段，利用重疊的引物進(jìn)行的PCR裝配，以及熟練的技術(shù)人員公知的加工免疫球 蛋白序列的相似技術(shù)；或前述任一項(xiàng)的任何適當(dāng)?shù)慕M合。例如，參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，以及進(jìn)一步 描述和本文提及的現(xiàn)有技術(shù)。類(lèi)似地，本發(fā)明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的 序列，并且例如，可以是通過(guò)PCR從適當(dāng)?shù)奶烊淮嬖诘哪０?例如，從細(xì)胞分離的DNA或 RNA)分離的序列，已經(jīng)從文庫(kù)(并且特別是表達(dá)文庫(kù))分離的核苷酸序列，已經(jīng)通過(guò)向天然 存在的核苷酸序列中引入突變(利用任何適當(dāng)?shù)谋旧硪阎募夹g(shù)，諸如錯(cuò)配PCR)而制備的 核苷酸序列，已經(jīng)使用重疊的引物通過(guò)PCR制備的核苷酸序列，或已經(jīng)利用本身已知的DNA 合成技術(shù)制備的核苷酸序列。本發(fā)明的氨基酸序列可以特別是結(jié)構(gòu)域抗體(或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸 序列)，單結(jié)構(gòu)域抗體(或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列)，“dAb"(或適合用作 dAb的氨基酸序列)或納米抗體 (Nanobody )(如本文所定義，并且包括但不限于Vhh序 列)；其它單可變結(jié)構(gòu)域，或它們中任一種的任何適當(dāng)?shù)钠?。?duì)于(單)結(jié)構(gòu)域抗體的 概括描述，參考上文引用的現(xiàn)有技術(shù)，以及參考EP 0 368 684。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“dAb，s”，例如， 參考 Ward 等(自然(Nature) 1989 年 10 月 12 日；341 (6242) :544-6)，參考 Holt 等，生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotechnol.)，2003，21 (11) :484-490 ；以及例如參考 W006/030220，WO 06/003388與Domantis (Domantis Ltd.)有限公司的其它公布的專(zhuān)利申請(qǐng)。還應(yīng)該注意 到，盡管由于它們不是哺乳動(dòng)物來(lái)源的，在本發(fā)明的情形中較不優(yōu)選，但是單結(jié)構(gòu)域抗體或 單可變結(jié)構(gòu)域可以來(lái)源于某些鯊魚(yú)(shark)物種(例如，所謂的“IgNAR結(jié)構(gòu)域”，參見(jiàn)例如 W005/18629)。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列或一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域可以是納米抗體 (如本文所定義)或其適當(dāng)?shù)钠?。[注意納米抗體 (Nanobody⑧)，納米抗體 (Nanobodies) 和納米克隆 (Nanoclone )為埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N. V) 的注冊(cè)商標(biāo)。]所述針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的納米抗體在本文也稱(chēng)為“本發(fā)明的 納米抗體”。對(duì)于納米抗體的概括描述，參考下文的進(jìn)一步描述，以及參考本文所引用的現(xiàn)有 技術(shù)。在這一方面，然而，應(yīng)該注意到，本文描述和現(xiàn)有技術(shù)主要描述所謂“Vh3種類(lèi)”的納 米抗體(即，與VH3種類(lèi)的人種系序列如DP-47、DP-51或DP-四具有高度序列同源性的納 米抗體)，所述納米抗體形成本發(fā)明的優(yōu)選方面。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義 上通常涵蓋任何類(lèi)型的針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的納米抗體，并且例如，還涵蓋屬 于所謂的“Vh4種類(lèi)”的納米抗體(即，與Vh4種類(lèi)的人種系序列如DP-78具有高度序列同源 性的納米抗體)，例如，如在埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N. V.)于2006年4月14日 提交的題目為“DP-78樣納米抗體(DP-78-like Nanobodies) ”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/792，279 中描述(還參見(jiàn) PCT/EP2007/003259)。一般地，納米抗體(特別是Vhh序列和部分人源化的納米抗體)可以特別地特征 在于，在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架序列(同樣如本文進(jìn)一步所述)中存在一個(gè)或多個(gè)“標(biāo)志殘基 (hallmark residues) ” (如本文所述)。因此，通常，納米抗體可以定義為具有下述(通用)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補(bǔ)性決定區(qū) 1-3，并且其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志殘基如本文進(jìn)一步所定義。特別地，納米抗體可以是具有下述(通用)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補(bǔ)性決定區(qū) 1-3，并且其中所述構(gòu)架序列如本文進(jìn)一步所定義。更特別地，納米抗體可以是具有下述(通用)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補(bǔ)性決定區(qū) 1-3，并且其中i)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號(hào)的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的氨 基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)選自下表A-3中提及的標(biāo)志殘基；并且其中ii)所述氨基酸序列與SEQ ID NO，s :1-22中的至少一種單可變結(jié)構(gòu)域具有至少 80%的氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基(在序列SEQ ID NO，s 1-22中表示為X)。
在這些納米抗體中，所述⑶R序列通常如本文進(jìn)一步所定義。因此，本發(fā)明還涉及這樣的納米抗體，其可以結(jié)合(如本文定義)和/或針對(duì) Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，涉及其適當(dāng)?shù)钠?，以及涉及包括一種或多種所述納米抗體和 /或適當(dāng)?shù)钠位蚧旧嫌善浣M成的單可變結(jié)構(gòu)域。SEQ ID NO，s [255469]給出了已經(jīng)針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員產(chǎn)生的許多 VHH序列的單可變結(jié)構(gòu)域。特別地，在某些具體的方面，本發(fā)明提供-針對(duì)(如本文所定義)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員并且與SEQID N0' s [255-269](參見(jiàn)表A-IA參考序列，如果沒(méi)有給出表A-IA參考，對(duì)SEQ IDNO's [255-269] 的相同參考則適用于整個(gè)申請(qǐng))的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80 %，優(yōu)選至少85%， 諸如90%或95%或更大的序列同一性的單可變結(jié)構(gòu)域。這些單可變結(jié)構(gòu)域可以?xún)?yōu)選地是 這樣的，即，它們中和同源配體與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合；和/或競(jìng)爭(zhēng)同源配體 與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合；和/或針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員上的相互作 用位點(diǎn)(如本文所定義)(諸如配體結(jié)合位點(diǎn))；-交叉阻斷(如本文所定義)SEQID NO，s [255-269]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域 序列與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合和/或競(jìng)爭(zhēng)SEQ ID NO，s [255469]的至少一 個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合的單可變結(jié)構(gòu)域。同樣地，這些單可變 結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步是這樣的，即，它們中和同源配體與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合； 和/或競(jìng)爭(zhēng)同源配體與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合；和/或針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途 徑的成員上的相互作用位點(diǎn)(如本文所定義)(諸如配體結(jié)合位點(diǎn))；所述單可變結(jié)構(gòu)域可如本文進(jìn)一步所述(和可以例如是納米抗體)；以及提供本 發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域，其包括一個(gè)或多個(gè)所述單可變結(jié)構(gòu)域(其可以如本文進(jìn)一步所述， 并且可以例如是如本文所述的雙特異性和/或雙互補(bǔ)位型單可變結(jié)構(gòu)域)，和編碼所述單 可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列。所述單可變結(jié)構(gòu)域不包括任何天然存在的配體。在一些其他具體的方面，本發(fā)明提供-對(duì)FcgR3，F(xiàn)cgRl,FcgR2和plgR特異(如本文所定義)的本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu) 域；本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可如本文進(jìn)一步所述(和可以例如是納米抗體)；以及提 供本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域，其包括一個(gè)或多個(gè)所述單可變結(jié)構(gòu)域(其可以如本文進(jìn)一步所 述，并且可以例如是如本文所述的雙特異性和/或雙互補(bǔ)位型單可變結(jié)構(gòu)域)，和編碼所述 單可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列。所述單可變結(jié)構(gòu)域不包括任何天然存在的配體。因此，本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的納米抗體是這樣的納米抗體，所述納米抗體可結(jié) 合(如本文進(jìn)一步所定義)和/或針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，并且其i)與SEQ ID NO，s [255-269]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80 %氨基酸 同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，形成CDR序列的氨基酸殘基被忽略。就 此而言，還參考表A-IB (即使沒(méi)有給出表A-IB參考，對(duì)構(gòu)架的SEQ ID NO’ s的相同參考則 適用于整個(gè)申請(qǐng))，該表列舉了 SEQ ID NO，s [255-269]的納米抗體的構(gòu)架1序列(SEQ ID NO，s :[1洸-143])，構(gòu)架 2 序列(SEQ ID NO，s [162-179])，構(gòu)架 3 序列(SEQ IDN0，s [198-215])和構(gòu)架4序列(SEQ ID NO，s [234-251])(就構(gòu)架1序列的位置1-4和27-30 處的氨基酸殘基而言，還參考下面的評(píng)論。因此，為了確定氨基酸同一性程度，這些殘基優(yōu) 選地被忽略)；和其中ii)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號(hào)的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 處 的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)選自下表A-3中提及的標(biāo)志殘基(Hallmark residues) 0在這些納米抗體中，⑶R序列通常如本文進(jìn)一步所述。同樣地，所述納米抗體可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞将@得，并且來(lái)源于任何適當(dāng)?shù)膩?lái)源， 并且例如，可以是天然存在的Vhh序列(即，來(lái)自于適當(dāng)?shù)鸟橊?Camelid)物種)或合成的 或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定義)納米抗體，“駱駝源化 的”(如本文所定義)免疫球蛋白序列(并且特別是駱駝源化的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列)，以 及已經(jīng)通過(guò)下列技術(shù)獲得的納米抗體諸如親和力成熟(例如，起始于合成的、隨機(jī)的或天 然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，鑲蓋術(shù)，組合來(lái)源于不同的免疫球蛋白序列的片段， 利用重疊的引物進(jìn)行的PCR裝配，以及熟練的技術(shù)人員公知的加工免疫球蛋白序列的相似 技術(shù)；或前述任一項(xiàng)的任何適當(dāng)?shù)慕M合，這如本文進(jìn)一步描述。此外，當(dāng)納米抗體包括Vra序 列時(shí)，所述納米抗體可以適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿绫疚倪M(jìn)一步所述，以便提供一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明 的進(jìn)一步(部分或完全)人源化的納米抗體。類(lèi)似地，當(dāng)納米抗體包括合成的或半合成的 序列(諸如部分人源化的序列)時(shí)，所述納米抗體可以任選地進(jìn)一步適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿?，同?如本文所述，同樣以便提供一個(gè)或多個(gè)其他本發(fā)明的(部分或完全)人源化的納米抗體。特別地，人源化的納米抗體可以是如前述段落中關(guān)于納米抗體概括定義的單可 變結(jié)構(gòu)域，但是其中存在至少一個(gè)這樣的氨基酸殘基(并且特別地，在至少一個(gè)構(gòu)架殘基 中)，所述氨基酸殘基是和/或?qū)?yīng)人源化的取代(如本文所定義)。基于本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi) 容，對(duì)于熟練的技術(shù)人員，一些優(yōu)選的、而非限制性的人源化取代(及其適當(dāng)?shù)慕M合)將變 得清楚。另外，或者備選地，通過(guò)比較天然存在的Vhh序列的構(gòu)架區(qū)序列與一個(gè)或多個(gè)緊密 相關(guān)的人Vh序列的相對(duì)應(yīng)的構(gòu)架序列，可以確定其它潛在有用的人源化取代，此后，可以將 由此確定的一個(gè)或多個(gè)潛在有用的人源化取代(或其組合)引入到所述Vhh序列中(以本 身已知的任何方式，如本文進(jìn)一步所述)，并且可以檢測(cè)所得到的人源化的Vhh序列對(duì)靶標(biāo) 的親和力、穩(wěn)定性、表達(dá)的容易性和水平、和/或其它需要的特性。在這種方式中，通過(guò)利用 有限的試驗(yàn)和誤差程度，熟練的技術(shù)人員基于本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容可以確定其它適當(dāng)?shù)娜嗽?化取代(或其適當(dāng)?shù)慕M合)。此外，基于前述內(nèi)容，納米抗體(的構(gòu)架區(qū))可以是部分人源 化的或完全人源化的。本發(fā)明一些特別優(yōu)選的人源化的納米抗體是SEQ ID NO，s [255469]的納米抗 體的人源化變體。因此，本發(fā)明一些其它優(yōu)選的納米抗體是這樣的納米抗體，其可以結(jié)合(如本文 進(jìn)一步所述)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，并且其i)是SEQ ID NO，s [255-269]的單可變結(jié)構(gòu)域之一的人源化變體；和/或ii)與SEQ ID NO，s [255-269]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基 酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基；并且其中
i)優(yōu)選地，在依據(jù) Kabat 編號(hào)的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基選自下表A-3中提及的標(biāo)志殘基。按照本發(fā)明的另一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供許多特別適合結(jié)合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途 徑的成員的氨基酸殘基的序列(streches)(即，小肽)。這些氨基酸殘基的序列可以存在 于，和/或可以結(jié)合在本發(fā)明的氨基酸序列中，特別以它們形成本發(fā)明的氨基酸序列的(部 分)抗原結(jié)合位點(diǎn)的方式存在和/或結(jié)合。由于這些氨基酸殘基序列最初作為針對(duì)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員產(chǎn)生的重鏈抗體或Vhh序列的CDR序列產(chǎn)生(或可以基于和/或來(lái)源 于所述CDR序列，如本發(fā)明進(jìn)一步所述)，在本發(fā)明中它們還將通常被稱(chēng)為“CDR序列”(即， 分別稱(chēng)為⑶R1，⑶R2和⑶R3)。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義上不限于這些氨 基酸殘基序列可能在本發(fā)明的氨基酸序列中具有的特有的結(jié)構(gòu)作用或功能，只要這些氨基 酸殘基序列允許本發(fā)明的氨基酸序列與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合。因此，一般地，本 發(fā)明在其最廣泛意義上包括任何這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列能夠與Notch信號(hào)傳 導(dǎo)途徑的成員結(jié)合，并且包括一個(gè)或多個(gè)本文所述的CDR序列，并且特別地兩個(gè)或更多個(gè) 所述CDR序列的適當(dāng)組合，其通過(guò)一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸序列彼此適當(dāng)連接，以致整個(gè)氨 基酸序列形成能夠結(jié)合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合單位。然而，還 應(yīng)該注意到，在本發(fā)明的氨基酸序列中僅存在一個(gè)所述CDR序列可以本身已經(jīng)足以提供能 夠結(jié)合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的本發(fā)明的氨基酸序列；例如，同樣參考WO 03/050531 中描述的所謂的“派遣片段(Expeditefragments) ”。因此，在另一個(gè)具體而非限制性的方面，本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的氨基 酸序列，所述氨基酸序列包括選自由本文在表A-IB中所述的CDR1、CDR2和CDR3 (即使沒(méi)有 給出表A-IB參考，對(duì)⑶R的SEQ ID NO’ s的相同參考則適用于整個(gè)申請(qǐng))組成的組的至少 一個(gè)氨基酸序列。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的氨基 酸序列，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包括選自由本文所述的CDR1、CDR2和CDR3(或它們的任何 適當(dāng)?shù)慕M合)組成的組的至少一個(gè)氨基酸序列。一般地，在本發(fā)明的這一方面中，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括至少一個(gè)氨基 酸殘基序列的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸殘基序列具有與本文所述的至少一個(gè)CDR 序列的序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。這樣的氨基酸序列可以或可以不包括免疫球蛋白折疊。 例如，并且不限于，這樣的氨基酸序列可以是適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍仔蛄衅危銎伟ㄖ?少一個(gè)所述CDR序列，但是其不夠大，不足以形成(完整)的免疫球蛋白折疊(例如，同樣參 考WO 03/050531中所述的“派遣片段”)。備選地，這樣的氨基酸序列可以是適當(dāng)?shù)摹暗鞍字?架”，所述蛋白支架包括與這樣的⑶R序列相對(duì)應(yīng)(即，作為其抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分)的至 少一個(gè)氨基酸殘基序列。用于呈遞單可變結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)?shù)闹Ъ軐?duì)于熟練的技術(shù)人員將是清 楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或來(lái)源于免疫球蛋白的結(jié)合支架(即，除了本發(fā)明已 經(jīng)描述的免疫球蛋白序列之外)，來(lái)源于蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域的蛋白支架(諸如Affibodies )， 淀粉酶抑肽(tendamistat)，纖連蛋白，脂籠蛋白，CTLA-4，T-細(xì)胞受體，設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù) 序列，avimers和PDZ結(jié)構(gòu)域(Binz等，自然生物技術(shù)(Nat. Biotech) 2005，卷23 :1257)，和 基于DNA或RNA的結(jié)合部分，包括但不限于DNA或RNA適體(Ulrich等，組合化學(xué)高通量篩 選(Comb Chem High Throughput Screen)20069 (8) :619-32)。同樣地，包括一個(gè)或多個(gè)這些CDR序列的任何本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選是這樣的，以致其可以特異性結(jié)合(如本文所定義)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員，并且更特別地是 這樣的，以致其可以以如本發(fā)明所限定的親和力(適當(dāng)測(cè)量和/或表示為Kd-值(實(shí)際的 或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，k。n_速率和/或k。ff_速率，或備選地作為IC5tl值， 如本文進(jìn)一步所述)與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員結(jié)合。更特別地，本發(fā)明該方面所述的單可變結(jié)構(gòu)域可以是包括至少一個(gè)抗原結(jié)合位 點(diǎn)的任何氨基酸序列，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包括選自由本發(fā)明所述的CDR1、本發(fā)明所述 的CDR2和本發(fā)明所述的CDR3組成的組的至少兩個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，以致(i)當(dāng)?shù)谝话被?序列選自本發(fā)明所述的CDRl時(shí)，第二氨基酸序列選自本發(fā)明所述的CDR2或本發(fā)明所述的 CDR3 ;(ii)當(dāng)?shù)谝话被嵝蛄羞x自本發(fā)明所述的CDR2時(shí)，第二氨基酸序列選自本發(fā)明所述 的CDRl或本發(fā)明所述的CDR3;或(iii)當(dāng)?shù)谝话被嵝蛄羞x自本發(fā)明所述的CDR2時(shí)，第 二氨基酸序列選自本發(fā)明所述的CDRl或本發(fā)明所述的CDR3。甚至更特別地，本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以是包括至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單可 變結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包括選自由本發(fā)明所述的CDR1、本發(fā)明所述的CDR2和本 發(fā)明所述的⑶R3組成的組的至少三個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，以致第一氨基酸序列選自本發(fā)明所 述的CDR1，第二氨基酸序列選自本發(fā)明所述的CDR2，并且第三氨基酸序列選自本發(fā)明所述 的⑶R3。優(yōu)選的⑶R1、⑶R2和⑶R3的組合將通過(guò)本發(fā)明的進(jìn)一步描述變得清楚。對(duì)于 熟練的技術(shù)人員將是清楚的，這樣的氨基酸序列優(yōu)選是免疫球蛋白序列(如本發(fā)明進(jìn)一步 所述)，但是例如，它也可以是包括呈遞所述CDR序列的適當(dāng)?shù)闹Ъ艿娜魏纹渌?的氨基酸序 列。因此，在一個(gè)具體而非限制性方面中，本發(fā)明涉及針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員的氨基酸序列，其包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基序列a) SEQ ID NO，s [144-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；b)與SEQ ID NO，s [144-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；c)與SEQ ID NO，s [144-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；d) SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；e)與 SEQ ID NO，s [180-197]的 至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；f)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；g) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；h)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；i)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；或它們的任何適當(dāng)?shù)慕M合。當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含b)和/或C)所述的一個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域時(shí)i)與a)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，在b)和/或C)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸置換優(yōu)選是保守氨基酸置換，(如本文所定義)；16
禾P/或ii)與a)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，b)和/或C)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸置換，并且沒(méi)有氨基酸刪除或插入；和/或iii)利用一種或多種本身已知的親和力成熟技術(shù)通過(guò)親和力成熟的方式，b)和/ 或c)所述的氨基酸序列可以是來(lái)源于a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。類(lèi)似地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含e)和/或f)所述的一個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu) 域時(shí)i)與d)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸置換優(yōu)選是保守氨基酸置換，(如本文所定義)；禾P/或ii)與d)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸置換，并且沒(méi)有氨基酸刪除或插入；禾口/ 或iii)利用一種或多種本身已知的親和力成熟技術(shù)通過(guò)親和力成熟的方式，e)和/ 或f)所述的氨基酸序列可以是來(lái)源于d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。此外，類(lèi)似地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含h)和/或i)所述的一個(gè)或多個(gè)單可變 結(jié)構(gòu)域時(shí)i)與g)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸置換優(yōu)選是保守氨基酸置換，(如本文所定義)；禾口/ 或ii)與g)所述的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸置換，并且沒(méi)有氨基酸刪除或插入；禾口/ 或iii)利用一種或多種本身已知的親和力成熟技術(shù)通過(guò)親和力成熟的方式，h)和/ 或i)所述的氨基酸序列可以是來(lái)源于g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。應(yīng)該理解，前述的最后段落通常也適用于分別包括幻^)^)，^，!!)或i)所述的 一個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的任何單可變結(jié)構(gòu)域。在該具體方面中，所述氨基酸序列優(yōu)選地包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的一個(gè)或 多個(gè)氨基酸殘基序列i)SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；ii)SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；禾口iii) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；或它們的任何適當(dāng)組合。此外，優(yōu)選地，在這樣的氨基酸序列中，至少一個(gè)所述氨基酸殘基序列形成結(jié)合 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。在一個(gè)更具體而同樣非限制性方面中，本發(fā)明涉及針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員的氨基酸序列，其包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基序列a) SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；
b)與SEQ ID NO，s [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；c)與SEQ ID NO's [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；d) SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；e)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；f)與SEQ ID NO's [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；g) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；h)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；i)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；以致(i)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?duì)應(yīng)于a)，b)或C)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一時(shí)， 第二氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一 ；(ii)當(dāng)?shù)?一氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于d)，e)或f)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一時(shí)，第二氨基酸殘基序列對(duì) 應(yīng)于幻』)^)^)，!!)或i)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一；或(iii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?duì) 應(yīng)于g)，h)或i)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一時(shí)，第二氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于a)，b)，c)，d)， e)或f)所述的單可變結(jié)構(gòu)域之一。在該具體方面中，所述氨基酸序列優(yōu)選地包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的兩個(gè)以 上的氨基酸殘基序列i)SEQ ID NO，s [144-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；ii)SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；和iii) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；以致，(i)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?duì)應(yīng)于SEQ ID NO，s [144-161]的單可變結(jié)構(gòu) 域之一時(shí)，第二氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO，s [180-197]或SEQID N0's [216-233] 的單可變結(jié)構(gòu)域之一；(ii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?duì)應(yīng)于SEQ ID NO's [180-197]的單可 變結(jié)構(gòu)域之一時(shí)，第二氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO，s [144-161]或SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域之一；或(iii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?duì)應(yīng)于SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域之一時(shí)，第二氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0' s [144-161] 或SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域之一。
此外，在這樣的氨基酸序列中，所述至少兩個(gè)氨基酸殘基序列同樣優(yōu)選地形成結(jié) 合Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。在甚至更具體而非限制性的方面中，本發(fā)明涉及針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員 的氨基酸序列，其包括三個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基序列，其中第一氨基酸殘基序列選自由下 列各項(xiàng)組成的組a) SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；b)與SEQ ID NO，s [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；c)與SEQ ID NO's [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；第二氨基酸殘基序列選自由下列各項(xiàng)組成的組d) SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；e)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；f)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；并且第三氨基酸殘基序列選自由下列各項(xiàng)組成的組g) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；h)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；i)與SEQ ID N0's [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸差異的單可變結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，在該具體方面中，第一氨基酸殘基序列選自由SEQ ID N0's [141-161]的 單可變結(jié)構(gòu)域組成的組；第二氨基酸殘基序列選自由SEQ IDNO' s [180-197]的單可變結(jié) 構(gòu)域組成的組；并且第三氨基酸殘基序列選自由SEQ ID NO's [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域 組成的組。同樣地，優(yōu)選地，在這樣的氨基酸序列中，所述至少三個(gè)氨基酸殘基序列形成結(jié)合 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。所述單可變結(jié)構(gòu)域的序列的優(yōu)選組合將通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容變得清楚。優(yōu)選地，在所述單可變結(jié)構(gòu)域中，所述⑶R序列與SEQ ID NO，s [255-269]的至少 一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90 %的氨基酸同一性，諸如95 %的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上 100%的氨基酸同一性。此氨基酸同一性的程度可以例如通過(guò)確定(以本文中所述的方式) 所述氨基酸序列和SEQ ID NO，s [255469]的一個(gè)或多個(gè)序列之間的氨基酸同一性的程 度來(lái)確定，其中忽略形成構(gòu)架區(qū)的氨基酸殘基。此外，本發(fā)明的所述單可變結(jié)構(gòu)域可以如本 文進(jìn)一步所述。此外，所述單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是這樣的，以致它們可以特異性結(jié)合(如本文所定 義)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員；并且更特別地以如本發(fā)明所定義的親和力結(jié)合Notch信號(hào) 傳導(dǎo)途徑的成員(適當(dāng)測(cè)量和/或表示為Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的或表 觀(guān)的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選地為IC5tl值，如本文進(jìn)一步所述)。當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列基本上由4個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個(gè)互補(bǔ)性決 定區(qū)(分別為CDRl-CDR； )組成時(shí)，本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選地是這樣的，以致-⑶Rl選自由下列各項(xiàng)組成的組a) SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；b)與SEQ ID NO，s [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；
c)與SEQ ID NO's [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；和/ 或-⑶R2選自由下列各項(xiàng)組成的組d) SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；e)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；f)與SEQ ID NO's [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；和/ 或-⑶R3選自由下列各項(xiàng)組成的組g) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；h)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；i)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸差異的單可變結(jié)構(gòu)域。特別地，這樣的本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的，以致⑶Rl選自由SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域組成的組；和/或CDR2選自由SEQ ID NO，s [180-197] 的單可變結(jié)構(gòu)域組成的組；和/或⑶R3選自由SEQ ID NO’ s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域 組成的組。特別地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列基本上由4個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個(gè)互 補(bǔ)性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成時(shí)，本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選地是這樣，以致-⑶Rl選自由下列各項(xiàng)組成的組a) SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域；b)與SEQ ID NO，s [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；c)與SEQ ID N0' s [141-161]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；和-⑶R2選自由下列各項(xiàng)組成的組d) SEQ ID NO，s [180-197]的單可變結(jié)構(gòu)域；e)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸 同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；f)與SEQ ID NO，s [180-197]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；和-⑶R3選自由下列各項(xiàng)組成的組g) SEQ ID NO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域；h)與SEQ ID NO，s [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的氨基酸同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；i)與SEQ ID NO's [216-233]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域具有3，2，或1個(gè)氨基酸 差異的單可變結(jié)構(gòu)域；或所述氨基酸序列的任何合適的片段。特別地，這樣的本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的，以致⑶Rl選自由SEQ ID NO，s [141-161]的單可變結(jié)構(gòu)域組成的組；和CDR2選自由SEQID NO，s [180-197]的單 可變結(jié)構(gòu)域組成的組；和⑶R3選自由SEQ IDNO，s [216-233]的單可變結(jié)構(gòu)域組成的組。同樣地，優(yōu)選的⑶R序列的組合將通過(guò)本發(fā)明的進(jìn)一步描述而變得清楚。此外，所述單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是這樣的，以致它們可以特異性結(jié)合(如本發(fā)明所 定義)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員；并且更特別地以如本發(fā)明所定義的親和力結(jié)合Notch信 號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員(適當(dāng)測(cè)量和/或表示為Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)，Ka-值(實(shí)際的或 表觀(guān)的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選地作為IC5tl值，如本發(fā)明進(jìn)一步所述)。在一個(gè)優(yōu)選而非限制性方面中，本發(fā)明涉及基本上由4個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為 FR1-FR4)和3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(分別為CDR1-CDR3)組成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序 列的⑶R序列與SEQ ID NO，s [255-269]的至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R序列具有至少 70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性， 諸如95%的氨基酸同一性或更多，或者甚至基本上100%的氨基酸同一性。例如，這種氨基 酸同一性的程度可以通過(guò)確定在所述氨基酸序列和SEQ ID NO，s [255469]的一個(gè)或多 個(gè)序列之間的氨基酸同一性程度(以本發(fā)明所述的方式)而確定，其中忽略形成所述構(gòu)架 區(qū)的氨基酸殘基。本發(fā)明的所述單可變結(jié)構(gòu)域可以如本文進(jìn)一步所述。在這樣的本發(fā)明的氨基酸序列中，所述構(gòu)架序列可以是任何適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列，并 且例如，基于標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)和進(jìn)一步公開(kāi)的內(nèi)容以及本發(fā)明引用的現(xiàn)有技術(shù)，適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列 的實(shí)例對(duì)于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。所述構(gòu)架序列優(yōu)選是免疫球蛋白構(gòu)架序列或已經(jīng)來(lái)源于免疫球蛋白構(gòu)架序列 (例如，通過(guò)人源化或駱駝源化)的構(gòu)架序列(的適當(dāng)組合)。例如，所述構(gòu)架序列可以是 來(lái)源于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，Vf序列)和/或來(lái)源于重鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，Vh-序列) 的構(gòu)架序列。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面中，所述構(gòu)架序列是已經(jīng)來(lái)源于Vhh-序列的構(gòu)架序列 (其中所述構(gòu)架序列可以任選地已經(jīng)被部分或完全人源化)或是已經(jīng)駱駝源化(如本文所 定義)的常規(guī)Vh序列。所述構(gòu)架序列優(yōu)選地是這樣的，以致本發(fā)明的氨基酸序列是結(jié)構(gòu)域抗體(或適合 用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列)；是單結(jié)構(gòu)域抗體(或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序 列)；是"dAb"(或適合用作dAb的氨基酸序列)；或是納米抗體 (包括但不限于Vhh序 列)。同樣地，例如，基于標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)和進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容以及本文所提及的現(xiàn)有技術(shù)，適當(dāng)?shù)?構(gòu)架序列對(duì)于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。特別地，在本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域中存在的所述構(gòu)架序列可以包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo) 志殘基(如本文所定義)，以致本發(fā)明的氨基酸序列是納米抗體 。所述構(gòu)架序列(的適當(dāng) 的組合)的一些優(yōu)選的、而非限制性的實(shí)例將通過(guò)本文進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容變得清楚。同樣地，如本文關(guān)于本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域概括所述，還可以使用前述任一種的 適當(dāng)?shù)钠?或片段組合)，諸如包含適當(dāng)與一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架序列側(cè)連和/或通過(guò)一個(gè)或多 個(gè)構(gòu)架序列連接的一個(gè)或多個(gè)⑶R序列的片段(例如，以如這些⑶R相同的順序，并且構(gòu)架序列可以以所述片段所來(lái)源的完全大小的免疫球蛋白序列存在)。所述片段還可以也是這 樣的，以致它們包括或可以形成免疫球蛋白折疊，或者備選地是這樣的，以致它們不包括或 不能形成免疫球蛋白折疊。在一個(gè)具體的方面中，這樣的片段包括如本文所述的單CDR序列(并且特別是 ⑶R3序列)，其在每一邊側(cè)連構(gòu)架序列(的一部分)(并且特別地，在所述片段所來(lái)源的免 疫球蛋白序列中與所述CDR序列相鄰的構(gòu)架序列的一部分。例如，CDR3序列可以在FR3序 列(的一部分)之后并且在FR4序列(的一部分)之前)。這樣的片段還可以包含二硫 鍵，并且特別是連接分別在所述⑶R序列之前和之后的兩個(gè)構(gòu)架區(qū)的二硫鍵(為了形成這 樣的二硫鍵的目的，可以使用在所述構(gòu)架區(qū)中天然存在的半胱氨酸殘基，或備選地，半胱氨 酸殘基可以合成添加或引入到所述構(gòu)架區(qū))。對(duì)于這些“派遣片段”的進(jìn)一步描述，同樣參 考TO 03/050531)，以及埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N. V.)于2006年12月5日提交 的題目為“能夠結(jié)合血清蛋白的肽(P印tides capable of binding to serum proteins)” 的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)(發(fā)明人:Revets, Hilde Adi Pierrette ；Kolkman, Joost Alexander ；和 Hoogenboom, Hendricus Renerus Jacobus Mattheus)，(還見(jiàn) PCT/EP2007/063348)。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種化合物或構(gòu)建體，并且特別是一種蛋白或多肽 (在本文中還分別稱(chēng)為“本發(fā)明的化合物”或“本發(fā)明的多肽”)，其包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明 的單可變結(jié)構(gòu)域(或其適當(dāng)?shù)钠?或基本上由其組成，并且任選地還包括一個(gè)或多個(gè)其 它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位。如通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)于熟練的技術(shù)人員將 變得清楚的，所述其它基團(tuán)、殘基、部分、結(jié)合單位或單可變結(jié)構(gòu)域可以或可以不為本發(fā)明 的氨基酸序列(和/或?yàn)槠浯嬖谟谄渲械幕衔锘驑?gòu)建體)提供其它的官能性，并且可以 或可以不修飾本發(fā)明的氨基酸序列的特性。例如，所述其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位可以是一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸序 列，以致所述化合物或構(gòu)建體是一種(融合)蛋白或(融合)多肽。在一個(gè)優(yōu)選而非限制 性的方面中，所述一個(gè)或多個(gè)其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位是免疫球蛋白序列。甚至更 優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位選自由下列各項(xiàng)組成的組結(jié)構(gòu) 域抗體、適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的單可變結(jié)構(gòu)域、單結(jié)構(gòu)域抗體、適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的單 可變結(jié)構(gòu)域、“dAb”、適合用作dAb的單可變結(jié)構(gòu)域、或納米抗體。備選地，例如，所述基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位可以是化學(xué)基團(tuán)、殘基、部分，其自 身可以是或可以不是生物學(xué)和/或藥理學(xué)活性的。例如，并且不限于，所述基團(tuán)可以連接到 一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域上，以提供本發(fā)明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如 本文進(jìn)一步所述。也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是這樣的化合物或構(gòu)建體，其包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的 衍生物或基本上由其組成，并且任選地還包括任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)接頭連接的一個(gè)或多 個(gè)其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合 單位是氨基酸序列。在上述化合物或構(gòu)建體中，所述一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域以及所述一個(gè) 或多個(gè)基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位可以彼此直接連接和/或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^ 或間隔臂連接。例如，當(dāng)所述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位是氨基酸序列時(shí)，所述 接頭也可以是氨基酸序列，以致所得到的化合物或構(gòu)建體是融合(蛋白)或融合(多肽)。
如從上面和本文的進(jìn)一步描述中將清楚的是，這意味著本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可 用作“構(gòu)件”以形成本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域，即，通過(guò)將它們與其他基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合 單位適當(dāng)?shù)亟M合以便形成如本文所述的化合物或構(gòu)建體(諸如，非限制地，本文所述的本 發(fā)明的雙互補(bǔ)位型，雙/多價(jià)和雙/多特異性單可變結(jié)構(gòu)域)，其在一個(gè)分子內(nèi)組合一種或 多種所需的特性或生物學(xué)功能。本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域通常可以通過(guò)這樣的方法制備，所述方法包括將 所述一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^適當(dāng)?shù)剡B接到 所述一個(gè)或多個(gè)其它基團(tuán)、殘基、部分或結(jié)合單位上的至少一個(gè)步驟，以提供本發(fā)明的化合 物或多肽。本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域還可以通過(guò)這樣的方法制備，所述方法通常至少包括下 述步驟提供編碼本發(fā)明的多肽的核酸，以適當(dāng)方式表達(dá)所述核酸，和回收所表達(dá)的本發(fā)明 的多肽。這樣的方法可以以本身已知的方式進(jìn)行，例如，基于本發(fā)明進(jìn)一步所述的方法和技 術(shù)，其對(duì)于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。由本發(fā)明的氨基酸序列起始，設(shè)計(jì)/選擇和/或制備本發(fā)明的化合物或多肽的方 法在本發(fā)明中還稱(chēng)為“格式化”所述的本發(fā)明的氨基酸序列；并且組成本發(fā)明的化合物或多 肽的一部分的本發(fā)明的氨基酸被認(rèn)為是“格式化的”或采用所述的本發(fā)明的化合物或多肽 的“格式”?；诒景l(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的氨基酸序列可以被格 式化的方法實(shí)例以及所述格式的實(shí)例；并且所述格式化的單可變結(jié)構(gòu)域形成本發(fā)明的另一 個(gè)方面。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面中，與相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列相比，本發(fā)明的化 合物或本發(fā)明的多肽可以具有增加的半衰期?；诒景l(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容，所述化合物 和單可變結(jié)構(gòu)域的一些優(yōu)選而非限制性實(shí)例對(duì)于熟練的技術(shù)人員將變得清楚，并且例如包 括下列各項(xiàng)已經(jīng)被化學(xué)修飾以增加其半衰期(例如，通過(guò)聚乙二醇化方式)的單可變結(jié) 構(gòu)域或本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域；包括至少一個(gè)用于結(jié)合血清蛋白(諸如血清白蛋白)的另 外的結(jié)合位點(diǎn)的本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域；或包括至少一個(gè)與增加本發(fā)明的氨基酸序列的半 衰期的至少一個(gè)部分(并且特別是至少一個(gè)氨基酸序列)連接的本發(fā)明的氨基酸序列的本 發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域?；诒景l(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容，包括所述半衰期延長(zhǎng)部分或單可變 結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域的實(shí)例對(duì)于熟練的技術(shù)人員將變得清楚；并且例如，包括， 但不限于，這樣的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域適當(dāng)?shù)剡B接 一個(gè)或多個(gè)血清蛋白或其片段(諸如(人)血清白蛋白或其適當(dāng)?shù)钠?或連接一個(gè)或多 個(gè)可以結(jié)合血清蛋白的結(jié)合單位(諸如，例如，結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的單可變 結(jié)構(gòu)域，單結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的單可變結(jié)構(gòu)域，“dAb”’，適合用作dAb的 單可變結(jié)構(gòu)域，或可以結(jié)合血清蛋白如血清白蛋白(諸如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白 如IgG、或運(yùn)鐵蛋白的納米抗體；參考進(jìn)一步的描述和本發(fā)明提及的參考文獻(xiàn))；這樣的單 可變結(jié)構(gòu)域，其中本發(fā)明的氨基酸序列連接Fc部分(諸如人Fe)或其適當(dāng)?shù)牟糠只蚱危?或這樣的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域適當(dāng)連接一個(gè)或多個(gè) 可以結(jié)合血清蛋白的小蛋白或肽(諸如，但不限于，記述在WO 91/01743，WO 01/45746，WO 02/076489中的蛋白和肽，以及埃博靈克斯股份有限公司(AblynxN. V.)于2006年12月5 日提交的題目為“能夠結(jié)合血清蛋白的肽”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)(還見(jiàn)PCT/EP2007/063348)。通常，具有增加的半衰期的本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地具有是相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1. 5倍、優(yōu)選地至少2倍，如至少5倍，例如至 少10倍或超過(guò)20倍的半衰期。例如，與相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列本身相比，具有增加 的半衰期的本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域可以具有增加超過(guò)1小時(shí)，優(yōu)選超過(guò)2小時(shí)，更 優(yōu)選超過(guò)6小時(shí)，諸如超過(guò)12小時(shí)，或甚至超過(guò)M、48或72小時(shí)的半衰期。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選而非限制性方面中，與相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列本身相 比，所述本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域具有增加超過(guò)1小時(shí)，優(yōu)選超過(guò)2小時(shí)，更優(yōu)選超 過(guò)6小時(shí)，諸如超過(guò)12小時(shí)，或甚至超過(guò)M、48或72小時(shí)的血清半衰期。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選而非限制性方面中，所述本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域 在人中表現(xiàn)出至少約12小時(shí)、優(yōu)選至少M(fèi)小時(shí)、更優(yōu)選至少48小時(shí)、甚至更優(yōu)選至少72 小時(shí)或更多的血清半衰期。例如，本發(fā)明的化合物或單可變結(jié)構(gòu)域可以具有至少5天(諸 如約5-10天)、優(yōu)選至少9天(諸如約9-14天)、更優(yōu)選至少約10天(諸如約10-15天)、 或至少約11天(諸如約11-16天)、更優(yōu)選至少約12天(諸如約12-18天或更多)、或超 過(guò)14天(諸如約14-19天)的半衰期。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的氨基酸序列或本發(fā)明的多肽(或其適 當(dāng)?shù)钠?的核酸。這樣的核酸在本發(fā)明中還稱(chēng)為“本發(fā)明的核酸”，并且例如，可以采用基 因構(gòu)建體的形式，如本文進(jìn)一步所述。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表達(dá)(或在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下能夠表達(dá))本發(fā)明的氨基 酸序列和/或本發(fā)明的多肽的宿主或宿主細(xì)胞，和/或包含本發(fā)明的核酸的宿主或宿主細(xì) 胞。通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的描述，所述宿主或宿主細(xì)胞的一些優(yōu)選而非限制性的實(shí)例將變得清楚。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)品或組合物，所述產(chǎn)品或組合物包含或包括至少一種本發(fā)明 的氨基酸序列、至少一種本發(fā)明的多肽(或其適當(dāng)?shù)钠?和/或至少一種本發(fā)明的核酸、 以及任選地本身已知的所述構(gòu)建體的一種或多種其它成分，即，取決于所述組合物的目的 用途。例如，這樣的產(chǎn)品或組合物可以是藥物組合物(如本文所述)、獸醫(yī)用組合物或用于 診斷用途的產(chǎn)品或組合物(同樣如本文所述)。通過(guò)本文進(jìn)一步的描述，所述產(chǎn)品或構(gòu)建體 的一些優(yōu)選而非限制性的實(shí)例將變得清楚。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽、或包括其的組合物在體外 (例如，在體外或細(xì)胞測(cè)定法中)或體內(nèi)(例如，在單細(xì)胞或在多細(xì)胞生物體中，且特別是在 哺乳動(dòng)物中，且更特別是在人類(lèi)中，諸如在處于癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病的危 險(xiǎn)中或患有這些疾病的人中)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員(的方法或構(gòu)建體)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及在體外(例如，在體外或細(xì)胞測(cè)定法中)或體內(nèi)(例如，在單細(xì)胞或 多細(xì)胞生物體中，且特別是在哺乳動(dòng)物中，且更特別是在人類(lèi)中，諸如在處于癌癥、神經(jīng)變 性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病的危險(xiǎn)中或患有這些疾病的人中)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成 員的方法，所述方法至少包括使Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員與至少一種本發(fā)明的氨基酸序 列、納米抗體或多肽、或與包括其的組合物以適于調(diào)節(jié)所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員與 本發(fā)明的至少一種氨基酸序列、納米抗體或多肽的方式和量相接觸的步驟。本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽在制備用于在體外(例 如，在體外或細(xì)胞測(cè)定法中)或在體內(nèi)(例如，在單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體中，且特別是在哺乳動(dòng)物中，且更特別是在人類(lèi)中，諸如在處于癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病的危險(xiǎn) 中或患有這些疾病的人中)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的組合物(諸如，但不限于如 本文進(jìn)一步所述的藥物組合物或制劑)中的應(yīng)用。因此，在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)(modulating) ”或“以調(diào)節(jié)(tomodulate) ”通常 意指減少或抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的活性，或備選地增加其活性，如使用適當(dāng)?shù)?體外、細(xì)胞或體內(nèi)測(cè)定(諸如本文提及的那些)測(cè)量的。具體地，“調(diào)節(jié)(modulating)”或 “以調(diào)節(jié)(to modulate)”可以意指減少或抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的活性，或備選 地增加其活性，如使用適當(dāng)?shù)捏w外、細(xì)胞或體內(nèi)測(cè)定(諸如本發(fā)明提及的那些)測(cè)量的，與 在相同條件但不存在本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的在相同測(cè)定中的Notch信號(hào) 傳導(dǎo)途徑的成員的活性相比較，達(dá)至少1 %，優(yōu)選至少5 %，諸如至少10 %或至少25 %，例如 至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，“調(diào)節(jié)”還可以包括與相同條件但不存在本發(fā)明的氨基酸 序列、納米抗體或多肽相比較，實(shí)現(xiàn)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員對(duì)其靶標(biāo)、配體或底物中的 一種或多種的親和力、抗體親抗原性、特異性和/或選擇性的改變(其可以是增加或減少)； 和/或?qū)崿F(xiàn)所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員對(duì)于在所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員存在于 其中的介質(zhì)或環(huán)境的一種或多種條件(諸如PH、離子強(qiáng)度、輔因子的存在、等等)的敏感性 的改變(其可以是增加或減少)。專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，這同樣可以以適當(dāng)?shù)姆绞胶?或 使用本身已知的任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定法來(lái)確定，諸如本文或本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所述的測(cè)定 法。“調(diào)節(jié)”還可以意指對(duì)所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員所涉及的(或其(多個(gè))底 物、(多個(gè))配體、或(多個(gè))途徑所涉及的，如其信號(hào)傳導(dǎo)途徑或代謝途徑以及它們相關(guān)的 生物學(xué)或生理學(xué)作用)的一種或多種生物學(xué)或生理學(xué)機(jī)制、作用、反應(yīng)、功能、途徑或活性 實(shí)現(xiàn)改變(即，分別作為激動(dòng)劑或作為拮抗劑的活性)。同樣，專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，這樣 的作為激動(dòng)劑或拮抗劑的作用可以以任何適當(dāng)方式和/或使用本身已知的任何適當(dāng)?shù)?體 外且通常是細(xì)胞或體內(nèi)測(cè)定法)測(cè)定法確定，諸如本文或本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所述的測(cè) 定法。特別地，作為激動(dòng)劑或拮抗劑的作用可以是這樣的，以致與在相同條件下但不存在本 發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的相同測(cè)定法中的生物學(xué)或生理學(xué)活性相比，分別將 目的生物學(xué)或生理學(xué)活性增加或減少至少1%，優(yōu)選至少5%，諸如至少10%或至少25%， 例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。例如，調(diào)節(jié)可以包括減少或抑制所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員與其底物或配體 之一的結(jié)合和/或與天然配體、底物競(jìng)爭(zhēng)與所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的結(jié)合。調(diào)節(jié) 還可以包括激活所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員或所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員參與其 中的機(jī)制或途徑。調(diào)節(jié)可以是可逆的或不可逆的，但是對(duì)于藥學(xué)和藥理學(xué)目的，通常應(yīng)該是 以可逆的方式。本發(fā)明還涉及用于制備或產(chǎn)生本文所述的氨基酸序列、單可變結(jié)構(gòu)域、核酸、宿主 細(xì)胞、產(chǎn)品和構(gòu)建體的方法。通過(guò)本文進(jìn)一步的描述，所述方法的一些優(yōu)選而非限制性實(shí)例 將變得清楚。一般地，這些方法可以包括下列步驟a)提供氨基酸序列的組、集合或文庫(kù)；和
b)從所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)中篩選可以結(jié)合和/或具有針對(duì)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的親和性的單可變結(jié)構(gòu)域；和c)分離所述可以結(jié)合和/或具有針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的親和性的(多 個(gè))氨基酸序列。在這樣的方法中，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是任何適當(dāng)?shù)陌被?序列的組、集合或文庫(kù)。例如，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是免疫球蛋白序列 的組、集合或文庫(kù)(如本文所述)，諸如免疫球蛋白序列的首次用于實(shí)驗(yàn)的組、集合或文庫(kù)； 免疫球蛋白序列的合成的或半合成的組、集合或文庫(kù)；和/或已經(jīng)進(jìn)行了親和力成熟的免 疫球蛋白序列的組、集合或文庫(kù)。此外，在這樣的方法中，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是重鏈可變結(jié)構(gòu) 域(諸如Vh結(jié)構(gòu)域或Vhh結(jié)構(gòu)域)或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)。例如，所述單可變 結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體的組、集合或文庫(kù)，或可以是能 夠作為結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體行使功能的單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)。在本方法的優(yōu)選方面中，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是免疫球蛋白 序列的免疫組、集合或文庫(kù)，例如，來(lái)自已經(jīng)用Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員適當(dāng)免疫的、或 用基于其或來(lái)源于其的適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇(諸如其抗原部分、片段、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其 它表位)適當(dāng)免疫的哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白序列的組、集合或文庫(kù)。在一個(gè)特別的方面中， 所述抗原決定簇可以是細(xì)胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它細(xì)胞外表位。在上述方法中，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以被展示在噬菌體、噬菌 粒、核糖體、或適當(dāng)?shù)奈⑸?諸如酵母)上，以諸如促進(jìn)篩選。用于展示和篩選單可變結(jié) 構(gòu)域(的組、集合或文庫(kù))的適當(dāng)?shù)姆椒?、技術(shù)和宿主生物體對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員 將是清楚的，例如，基于本發(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容。同樣參考Hoogenboom在自然生物技術(shù) (NatureBiotechnology), 23,9,1105-1116(2005)中的綜述。在另一個(gè)方面中，用于產(chǎn)生單可變結(jié)構(gòu)域的方法包括至少下列步驟a)提供表達(dá)氨基酸序列的細(xì)胞的集合或樣品；b)從所述細(xì)胞的集合或樣品中篩選表達(dá)可以結(jié)合和/或具有針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo) 途徑的成員的親和性的氨基酸序列的細(xì)胞；禾口c) (i)分離所述氨基酸序列；或(ii)從所述細(xì)胞分離編碼所述氨基酸序列的核酸 序列，然后表達(dá)所述氨基酸序列。例如，當(dāng)所需要的氨基酸序列是免疫球蛋白序列時(shí)，所述細(xì)胞的集合或樣品可以 是，例如，B細(xì)胞的集合或樣品。此外，在該方法中，細(xì)胞樣品可以來(lái)源于已經(jīng)用Notch信號(hào) 傳導(dǎo)途徑的成員適當(dāng)免疫的、或用基于其或來(lái)源于其的適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇(諸如其抗原部 分、片段、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它表位)適當(dāng)免疫的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)特別的方面中，所述 抗原決定簇可以是細(xì)胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它細(xì)胞外表位。上述方法可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行，這對(duì)于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。例如， 參考 EP O 542 810，WO 05/19824，WO 04/051268 和 W004/106377。步驟 b)的篩選優(yōu)選地 使用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)諸如FACS進(jìn)行。對(duì)于此，例如，參考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No. 12,3820(2001)。在另一個(gè)方面中，用于產(chǎn)生針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的氨基酸序列的方法 可以包括至少下列步驟a)提供編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫(kù)；b)從所述核酸序列的組、集合或文庫(kù)中篩選編碼可以結(jié)合和/或具有針對(duì)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員的親和性的氨基酸序列的核酸序列；禾口c)分離所述核酸序列，然后表達(dá)所述氨基酸序列。在這樣的方法中，所述編碼單可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的組、集合或文庫(kù)可以是，例 如，編碼免疫球蛋白序列的首次用于實(shí)驗(yàn)的組、集合或文庫(kù)的核酸序列的組、集合或文庫(kù)； 編碼免疫球蛋白序列的合成的或半合成的組、集合或文庫(kù)的核酸序列的組、集合或文庫(kù)；和 /或編碼已經(jīng)進(jìn)行了親和力成熟的免疫球蛋白序列的組、集合或文庫(kù)的核酸序列的組、集合 或文庫(kù)。此外，在這樣的方法中，所述核酸序列的組、集合或文庫(kù)可以編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域 (諸如Vh結(jié)構(gòu)域或Vhh結(jié)構(gòu)域)或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)。例如，所述核酸序列 的組、集合或文庫(kù)可以編碼結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體的組、集合或文庫(kù)，或能夠作為結(jié)構(gòu) 域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體行使功能的單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)。在該方法的優(yōu)選方面中，所述單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)可以是核酸序列的 免疫的組、集合或文庫(kù)，例如，所述核酸序列來(lái)源于已經(jīng)用Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員適當(dāng) 免疫的、或用基于其或來(lái)源于其的適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇(諸如其抗原部分、片段、區(qū)域、結(jié)構(gòu) 域、環(huán)或其它表位)適當(dāng)免疫的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)特別的方面中，所述抗原決定簇可以是細(xì) 胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它細(xì)胞外表位。例如，所述核酸序列的組、集合或文庫(kù)可以編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域的免疫的組、集合或文庫(kù)。在一個(gè)具體的方面中，所述核苷酸序列的組、集合或文庫(kù)可以 編碼255469的組、集合或文庫(kù)。在上述方法中，所述核苷酸序列的組、集合或文庫(kù)可以被展示在噬菌體、噬菌粒、 核糖體或適當(dāng)?shù)奈⑸?諸如酵母)上，以諸如促進(jìn)篩選。用于展示和篩選編碼單可變結(jié) 構(gòu)域的核苷酸序列(的組、集合或文庫(kù))的適當(dāng)?shù)姆椒?、技術(shù)和宿主生物體對(duì)于本領(lǐng)域熟練 的技術(shù)人員將是清楚的，例如，基于本發(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容。同樣參考Hoogenboom在自 然生物技術(shù)(Nature Biotechnology), 23,9,1105-1116(2005)中的綜述。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述方法或備選地通過(guò)包括上述方法之一以及至少下列步驟 的方法而獲得的單可變結(jié)構(gòu)域，所述步驟為確定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨 基酸序列；并且以本身已知的方式表達(dá)或合成所述氨基酸序列，諸如通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì) 胞或宿主生物體內(nèi)表達(dá)，或通過(guò)化學(xué)合成。此外，在上述步驟后，一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的單可變結(jié)構(gòu)域可以適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿?(或備選地，被駱駝源化)；和/或可以將這樣獲得的氨基酸序列彼此連接，或連接一個(gè)或 多個(gè)其它適當(dāng)?shù)膯慰勺兘Y(jié)構(gòu)域(任選地，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^)，以提供本發(fā)明的多 肽。此外，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸序列可以被適當(dāng)?shù)厝嗽椿?或備選地，被駱駝源 化)并且適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)；和/或編碼本發(fā)明的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)核酸序列可以彼此連接，或連接編碼其它適當(dāng)?shù)膯慰勺兘Y(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)核酸序列(任選地通過(guò)編碼一個(gè)或 多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^的核苷酸序列)，然后，這樣獲得的核苷酸序列可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)，以提 供本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、單可變結(jié)構(gòu)域、核酸、宿主 細(xì)胞、產(chǎn)品和構(gòu)建體的應(yīng)用和用途，以及涉及用于預(yù)防和/或治療與Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 成員相關(guān)的疾病和病癥的方法。通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的描述，一些優(yōu)選的但非限制性的應(yīng)用 和用途將變得清楚。本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、單可變結(jié)構(gòu)域、核酸、宿主 細(xì)胞、產(chǎn)品和組合物在治療中的用途。具體地，本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、單可變結(jié)構(gòu)域、核 酸、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品和組合物，其用于治療可以通過(guò)向需要該治療的受試者施用(藥學(xué)有效 量的)如本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體或多肽預(yù)防或治療的疾病或病癥。更具體地，本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、單可變結(jié)構(gòu)域、 核酸、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品和組合物，其用于治療癌癥、神經(jīng)變性疾病和免疫調(diào)節(jié)性疾病。通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的其它方面、實(shí)施方案、優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用也將變得清 楚，其中本發(fā)明將更詳細(xì)地描述和討論本發(fā)明的納米抗體以及包括其的本發(fā)明的單可變結(jié) 構(gòu)域，其形成本發(fā)明的一些優(yōu)選方面。如通過(guò)本發(fā)明進(jìn)一步的描述將變得清楚，與“dAb”或相似的(單)結(jié)構(gòu)域抗體或免 疫球蛋白序列相比，納米抗體通常提供某些優(yōu)點(diǎn)(本發(fā)明所述的)，本發(fā)明的納米抗體也提 供所述優(yōu)點(diǎn)。然而，熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，下述教導(dǎo)的更通用的方面也可以適用于(直 接或類(lèi)似地)本發(fā)明的其它單可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的詳述在本發(fā)明、實(shí)施例和權(quán)利要求中a)除非另外指明或限定，所用的所有術(shù)語(yǔ)具有它們?cè)诒绢I(lǐng)域內(nèi)的通用意思，其 對(duì)于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。例如，參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，如Sambrook等，"分子克隆 實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning =A LaboratoryManual)“(第 2 版)，卷 1-3，冷泉港實(shí) 驗(yàn)室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press) (1989) ；F. Ausubel 等，編，“現(xiàn)代 分子生物學(xué)方法(Currentprotocols in molecular biology) “ , Green Publishing 禾口 Wiley Interscience，紐約(1987) ；Lewin, "Genes II”，John Wiley & Sons, New York，紐 約，(1985) ；Old 等，“基因操作原理基因工程導(dǎo)言(Principles of Gene Manipulation AnIntroduction to Genetic Engineering) ”，第 2版，加利福尼亞大學(xué)出版社(University of California Press)，伯克利，CA(1981) ；Roitt 等，“免疫學(xué)(Immunology)"(第 6版)， Mosby/Elsevier, Edinburgh(2001) ；Roitt 等，Roitt 基石出免疫學(xué)(Roitt' s Essential Immunology)，第 10 版.Blackwell Publishing，英國(guó) Q001)；和 Janeway 等，“免疫生物學(xué) (Immunobiology)，，(第 6 版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,紐 約(2005)，以及本發(fā)明所引用的公知背景技術(shù)；b)除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白序列”~不管其在本文中用來(lái)指重鏈抗體或 常規(guī)的4-鏈抗體——用作一般術(shù)語(yǔ)，包括完整大小的抗體、其單獨(dú)的鏈、以及其所有部分、 結(jié)構(gòu)域或片段(包括但不限于抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，分別諸如Vffl結(jié)構(gòu)域或VH/\結(jié)構(gòu)域)。另外，術(shù)語(yǔ)“序列”用于本文時(shí)(例如在類(lèi)似“免疫球蛋白序列”、“抗體序列”、“可變結(jié) 構(gòu)域序列”、"Vra序列”或“蛋白序列”的術(shù)語(yǔ)中)通常應(yīng)該理解為包括相關(guān)的氨基酸序列、 以及編碼所述氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更狹義的解釋。此外，如本 文所使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列，，還包含具有所述核苷酸序列的核酸分子，因此術(shù)語(yǔ)“核苷酸 序列”和“核酸”應(yīng)該被認(rèn)為是相等的并且在本文中互換使用；c)除非另外指明，所有沒(méi)有具體詳細(xì)描述的方法、步驟、技術(shù)和操作可以以本身 已知的方式進(jìn)行并且已經(jīng)進(jìn)行，這對(duì)于熟練的技術(shù)人員是清楚的。例如，仍舊參考標(biāo)準(zhǔn)手 冊(cè)，參考本發(fā)明所提及的公知背景技術(shù)，和參考其中所引用的其它參考文獻(xiàn)；以及例如下列 的綜述Presta，先進(jìn)藥物遞送評(píng)論(Adv. Drug Deliv. Rev.) 2006, 58 (5-6) :640-56 ；Levin m Weiss,分子生物系統(tǒng)(Mol.Biosyst. )2006,2(1) :49-57 ；Irving 等，免疫學(xué)方法雜志 (J. Immunol. Methods)，2001,248 (1-2)，31-45 ；Schmitz 等，胎盤(pán)(Placenta)，2000, 21 增刊 A，S106-12，Gonzales等，腫瘤生物學(xué)(Tumour Biol.)，2005，洸(1)，31-43，它們描述了蛋白 工程的技術(shù)，諸如親和力成熟和其他用于改善蛋白諸如免疫球蛋白的特異性和其他所需特 性的技術(shù)d)氨基酸殘基按照標(biāo)準(zhǔn)的三字母或一字母的氨基酸密碼顯示，如在表A-2提及 的；表A-2 —字母和三字母氨基酸密碼
權(quán)利要求
1.一種與Notch途徑的至少一個(gè)成員特異性結(jié)合的單可變結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由所述 Notch途徑的人成員組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由Notch受 體和Notch配體組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由人Notch 受體和人Notch配體組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由 Jagged-I、Jagged-2、DLL1、DLL3、DLL4、Notch-1、Notch-2、Notch-3 和 Notch-4 組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由人 Jagged-I、人 Jagged-2、人 DLLl、人 DLL3、人 DLL4、人 Notch-I、人 Notch-2、人 Notch-3 和人 Notch-4組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述Notch途徑的成員選自由人 Jagged-Ι、人 DLL4、人 Notch-I 和人 Notch-2 組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域另外地阻斷所述 Notch配體的至少一個(gè)成員和所述Notch受體的至少一個(gè)其他成員之間的相互作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域另外地阻斷由Notch 配體和Notch受體組成的組的至少一個(gè)成員與含具有SEQID NO =329-364的序列的至少一 個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)與選自由含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域組成的組的至少一個(gè)序列具有80%序列同一性的 單可變結(jié)構(gòu)域。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)含具有SEQ ID NO 329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域，其中至多10個(gè)氨基酸殘基被天然存在的氨基酸替換，并 且其中所述替換的氨基酸位于構(gòu)架區(qū)內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)含具有SEQ ID NO 329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域，其中至多8個(gè)氨基酸殘基被天然存在的氨基酸替換，并且 其中所述替換的氨基酸位于構(gòu)架區(qū)內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)含具有SEQ ID NO 329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域，其中至多5個(gè)氨基酸殘基被天然存在的氨基酸替換，并且 其中所述替換的氨基酸位于構(gòu)架區(qū)內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO =329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)含具有SEQ ID NO 329-364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域，其中至多3個(gè)氨基酸殘基被天然存在的氨基酸替換，并且 其中所述替換的氨基酸位于構(gòu)架區(qū)內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域選自由下列各項(xiàng)組 成的組a)含具有SEQ ID NO :3四_364的序列的單可變結(jié)構(gòu)域；和b)與選自由具有SEQ ID NO =329-364的序列組成的組的至少一個(gè)序列具有80%序列同一性的單可變結(jié)構(gòu)域；并且 其中從組a)和b)中選擇的所述單可變結(jié)構(gòu)域與所述Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的至少一個(gè)成員 以10_7-10_12摩爾/升以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及氨基酸序列(在本文中還稱(chēng)為“本發(fā)明的一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域”、“本發(fā)明的納米抗體TM”或“本發(fā)明的多種納米抗體TM”、“本發(fā)明的一種或多種多肽”)，其針對(duì)(如本文所定義的)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員諸如Notch受體的四個(gè)哺乳動(dòng)物成員(Notch-1，Notch-2，Notch-3，Notch-4，以后也稱(chēng)為“Notch受體”)和Notch配體的5個(gè)哺乳動(dòng)物成員(具有“DLL1”，“DLL3”，“DLL4”的δ-樣家族，其中“DLL”代表δ-樣配體；具有“Jagged-1”，“Jagged-2”的Jagged家族，以后也稱(chēng)為“Notch配體”)，以及包含一個(gè)或多個(gè)所述一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由一個(gè)或多個(gè)所述一種或多種單可變結(jié)構(gòu)域(本文中也分別稱(chēng)為“本發(fā)明的構(gòu)建體”和“本發(fā)明的多個(gè)構(gòu)建體”，“本發(fā)明的納米抗體TM”或“本發(fā)明的多種納米抗體TM”)組成的構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明涉及下調(diào)或上調(diào)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的干擾Notch途徑的單可變結(jié)構(gòu)域(本文也稱(chēng)為“Notch-拮抗劑”或“Notch-激動(dòng)劑”)。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102056945SQ200980121062
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者勒妮·德布魯因, 彼得·萬(wàn)蘭德舒特, 愛(ài)德華·多爾克, 約翰內(nèi)斯·約瑟夫·威廉姆斯·德哈德, 邁克爾·約翰·斯科特·桑德斯 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司