專利名稱：肽及其衍生物、其制備及其在制備治療性和/或預防性的活性藥物組合物中的用途的制作方法
肽及其衍生物、其制備及其在制備治療性和/或預防性的 活性藥物組合物中的用途本發(fā)明涉及肽及其衍生物、其制備及其在制備治療性和/或預防性的活性藥物中 的用途、以及這樣的藥學藥物。EP1586586描述了具有抗炎效應的來自纖維蛋白序列的肽的用途。所述效應可以基于以下事實纖維蛋白和在纖維蛋白分解過程中產(chǎn)生的纖維蛋 白片段通過Ββ-鏈的新的N末端與內皮細胞結合，并且通過Aa-鏈的序列與血流中的 細胞結合，從而導致這些細胞向組織中的粘附和遷移。纖維蛋白和纖維蛋白片段與內皮 細胞的結合伴侶是蛋白“血管內皮(VE)鈣粘蛋白”，其在鄰近的內皮細胞之間的粘合連接 (adherens junction)專有地表達。根據(jù)本發(fā)明的肽阻斷該相互作用，從而抵制血細胞的遷 移。但是，血液中的白細胞抵抗感染的天然防御并不受到有害影響。因此，其成分，例如粒 細胞、淋巴細胞和單核細胞，保持不受影響，從而天然防御過程仍然維持。纖維蛋白原在肝臟中產(chǎn)生，這種形式的纖維蛋白原是無生物學活性的，在血液中 其濃度通常是約3g/l。酶原凝血酶原的蛋白水解切割引起凝血酶的形成，凝血酶將纖維蛋 白肽A和B從纖維蛋白原上切割下來。通過這種方式，纖維蛋白原被轉化為其生物學活性 形式。產(chǎn)生了纖維蛋白和纖維蛋白切割產(chǎn)物。每當血液凝固被激活時，即由于組織損傷、炎癥、外傷或發(fā)生退化，凝血酶即形成。 凝血酶介導的纖維蛋白的形成本質上是保護性過程，其旨在使血管系統(tǒng)造成的任何破損迅 速封閉。但是，纖維蛋白的形成也是病理過程。纖維蛋白血栓的出現(xiàn)(其為心臟梗塞的激 發(fā)起因)是人類醫(yī)藥中的最突出的問題之一。一方面，纖維蛋白在炎性細胞脫離血流進入組織的過程中發(fā)揮的作用是抵御組織 中的致病微生物或腫瘤細胞的想要的過程，但另一方面，其自身是誘導或延長對組織造成 的損傷的過程，目前尚未對其進行任何檢查或進行了足夠程度的檢查。纖維蛋白通過Ββ 的序列經(jīng)由Ββ的新的N末端與內皮細胞結合，并且通過Aa的序列與血流中的細胞結合， 從而導致細胞向組織中的粘附和遷移。通過以上描述的機理，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白可以阻止細胞從血流向血管壁的內 皮細胞的粘附和/或它們隨后從血液向組織的遷移。與急性炎性疾病相關的主要異常之一是內皮屏障功能的喪失。內皮的結構和功 能上的完整性對于維持屏障功能是必需的，如果其中任一項被破壞，溶解物和多余的血漿 液體將穿過單層泄漏，導致組織水腫和炎性細胞的遷移。很多試劑通過激發(fā)內皮細胞形狀 的改變(例如收縮或縮回)而增加單層的通透性，導致細胞間間隙的形成(Lum & Malik， Am. J. Physiol. 267 :L223-L241,1994)。這些試劑包括例如凝血酶、緩激肽和血管內皮生長 因子(VEGF)。血管壁的高通透性允許多余的液體的泄漏并允許蛋白進入間隙空間。這種急性炎 性事件經(jīng)常伴隨著組織缺血和急性器官功能失常。由于在鄰近的EC之間形成大的細胞旁 洞(paracellular hole)，所以在激活的內皮細胞(EC)的位點形成的凝血酶啟動該微血管 屏障功能失常(Carbajal 等人，Am J Physiol Cell Physiol 279 :C195_C204，2000)。這個過程的特征在于由于肌球蛋白輕鏈磷酸化(MLCP)(其啟動F-肌動蛋白依賴性的細胞骨架 收縮緊張的產(chǎn)生)造成的EC形狀的改變(Garcia等人，J Cell Physiol. 1995 ； 163 :510_522 Lum & Malik，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 273(5) :Η2442_Η2451· 1997)。凝血酶誘導的內皮高通透性還可以由細胞-細胞粘附的變化所介導(Dejana J.Clin. Invest. 98 1949-1953，1996)。內皮細胞-細胞粘附主要由血管內皮(VE)鈣粘蛋 白(鈣粘蛋白5)的功能決定，所述蛋白是形成粘合連接的鈣依賴性的細胞-細胞粘附分 子。通過與輔助蛋白b-連接素、盤狀球蛋白(g_連接素)和pl20(這些蛋白繼而與a-連 接素(與粘著斑蛋白同源)連接)以及F-肌動蛋白細胞骨架的結合而從細胞質一側調節(jié) 鈣粘蛋白5的功能。VE鈣粘蛋白作為粘附分子出現(xiàn)，其在微血管通透性和與血管生成相關的形態(tài)發(fā) 生和增殖事件中發(fā)揮基礎性作用(Vincent等人，Am J Physiol Cell Physiol, 286 (5) C987-C997，2004)。與其它鈣粘蛋白一樣，VE-鈣粘蛋白介導鈣依賴性的、親同種粘附并作 為細胞骨架的細胞膜粘附位點發(fā)揮作用。但是，VE-鈣粘蛋白整合進入對于血管內皮至關 重要的信號傳導途經(jīng)和細胞系統(tǒng)。最近內皮細胞生物學和生理學的進展揭示了 VE-鈣粘蛋 白的特征，其在粘附分子的鈣粘蛋白家族成員中可能是獨特的。由于這些原因，VE-鈣粘蛋 白代表了既是鈣粘蛋白家族的典型又具有獨特的功能和生理相關性的鈣粘蛋白。很多優(yōu)秀 的綜述文章討論了 VE-鈣粘蛋白對血管屏障功能、血管生成和心血管生理學的貢獻。越來越多的證據(jù)表明VE_鈣粘蛋白介導的細胞_細胞粘附由連接蛋白(包括鈣 粘蛋白和連接素)的磷酸化和去磷酸化之間的動態(tài)平衡控制。b-連接素的酪氨酸磷酸化 的增加引起連接素從鈣粘蛋白以及從細胞骨架的分離，從而導致弱的粘合連接(AJ)。類似 地，在松散的AJ發(fā)生的VE-鈣粘蛋白和b-連接素的酪氨酸磷酸化在緊密匯合的單層中顯 著減少(Tinsley 等人，J Biol Chem，274，24930-24934，1999)。此外，粘合連接中的VE-鈣粘蛋白單體的正確成簇對于VE-鈣粘蛋白的正確信號 傳導活性是不可缺少的，因為攜帶嵌合突變體(IL2-VE)(其含有全長VE-鈣粘蛋白細胞 質尾巴)的細胞不能引起正確的信號傳導，雖然其具有與連接素和P120結合的能力 (Lampugnani 等人，Mol. Biol, of the Cell, 13，1175-1189，2002)。Rho GTPase是對于細胞的肌動蛋白細胞骨架具有顯著作用的小的GTPase家族。 關于血管系統(tǒng)的功能，它們參與細胞形狀、細胞收縮、細胞能動性和細胞粘附的調節(jié)。Rho GTPase家族的三個最重要的成員是RhoA、Rac和cdc42。RhoA的激活誘導細胞中的f_肌 動蛋白應激纖維的形成，而Rac和cdc42通過分別誘導膜褶皺和微棘而影響肌動蛋白細胞 骨架(Hall, Science, 279 :509_514. 1998)。盡管Rac和cdc42能夠通過蛋白PAK的激活而 在有限程度上影響 MLCK 活性(Goeckeler 等人 J. Biol. Chem.，275，24，18366-18374，2000)， 但RhoA通過其使MLC的磷酸化狀態(tài)穩(wěn)定的能力而對肌動蛋白-肌球蛋白相互作用具有顯 著的刺激效應(Katoh 等人，Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 280，C1669-C1679，2001)。這通 過Rho激酶的激活發(fā)生，Rho激酶的激活繼而抑制磷酸酶PPlM(其水解磷酸化的MLC)。此 外，Rho激酶抑制絲切蛋白(cofilin)的肌動蛋白切斷作用，并因此使f_激動蛋白纖維穩(wěn)定 (Toshima等人，Mol. Biol, of the Cell. 12，1131-1145，2001)。此外，Rho激酶還可以參與肌 動蛋白細胞骨架向細胞膜中的蛋白的錨定，因此可以潛在地作用于連接蛋白(junctional protein)和肌動蛋白細胞骨架之間的相互作用(Fukata等人.Cell Biol 145:347-361，1999)凝血酶能夠通過G α 12/13和所謂的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活 RhoA (Seasholtz 等人；Mol =Pharmacol. 55，949-956，1999)。GEF 將與 RhoA 結合的 GDP 交換 為GTP，從而RhoA變成有活性的。通過這種激活，RhoA轉位到膜，在那里它通過它的親脂性 香葉基-香葉基-錨定而發(fā)生結合。RhoA可以被許多有血管活性的試劑激活，包括溶血磷脂酸、凝血酶和內皮素。通過 鳥嘌呤分離抑制劑(GDI)的作用，或者在GTPase激活蛋白(GAP)的作用之后，與膜結合的 RhoA從膜上分離下來。鳥嘌呤分離抑制劑(GDI)是與RhoA的羧基端結合的調節(jié)蛋白。⑶I通過保持⑶P的分離并使活性RhoA與細胞膜分離而抑制RhoA的活性。凝血 酶直接激活人類內皮細胞中的RhoA并誘導RhoA轉位至細胞膜。在相同的條件下，相關的 GTPase Rac不被激活。來自肉毒桿菌的C3轉移酶對RhoA的特異性抑制減少了凝血酶誘導 的內皮MLC的磷酸化和通透性的增加，但是不影響瞬間組氨酸依賴性的通透性的增加(van Nieuw Amerongen 等人 Circ Res. 1998 ;83 :1115_11231，1998)。RhoA 的效應似乎是通過 Rho激酶介導的，因為特異性的Rho激酶抑制劑Y27632類似地也減少凝血酶誘導的內皮通 透性。Racl和RhoA對于內皮屏障功能具有拮抗效應。急性缺氧抑制Racl并激活正常 成人肺動脈內皮細胞(PAEC)中的RhoA，這導致屏障功能的破壞(Wojciak-Stothard and Ridley, Vascul Pharmacol.，39 187-99，2002)。來自于具有慢性缺氧的小豬的 PAEC 誘 導的肺部高血壓具有穩(wěn)定的異常表型，其中Racl持續(xù)降低并且RhoA的活性升高。這些 活動與內皮細胞骨架、粘合連接和通透性的變化相關聯(lián)。Racl的激活以及RhoA的抑制使 異常表型和通透性恢復至正常(Wojciak-Stothard等人，Am. J. Physiol, Lung Cell Mol. Physiol. 290，L1173-L1182，2006)。因此可以預期，將Racl激活至并將RhoA的活性減少至在正常和穩(wěn)定條件下的內 皮細胞中觀察到的水平的那些物質會降低內皮的高通透性并對多種疾病具有有益的治療 效應。優(yōu)選地，這種效應由粘合連接中的VE-鈣粘蛋白的成簇的穩(wěn)定化引起。與VE-鈣粘蛋 白連接的細胞內蛋白復合物的主要組分是fyn，其為一種激酶，是src酪氨酸激酶的成員。 作為本發(fā)明的主題的化合物與VE-鈣粘蛋白的結合引起fyn與VE-鈣粘蛋白的分離，繼而 引起凝血酶誘導的活性RhoA的失活。W09216221描述了與長鏈聚合物例如甲氧基聚乙二醇(PEG)共價連接的多肽。多 肽與這類聚合物的結合通常引起這些多肽的生物學半衰期的延長并延遲它們的腎臟排泄。 這些多月太的總結見 Davis 等人，Polymeric Materials Pharmaceuticals for Biomedical Use,pp. 441-451(1980)。PEG基團的加入通過與PEG化的肽的分子量成比例的方式發(fā)揮這 種效應，因為，直至分子的一定大小，腎小球濾過率與分子量成反比。W02004/101600也描述了新的聚(乙二醇)_修飾的化合物及其用途，尤其重點在 于修飾的肽激活紅細胞生成素受體。肽和蛋白PEG殘基的共價修飾的其它例子有白細胞介素(Knauf等人，J.Biol Chem.1988，263，15064 ；Tsutumi 等人，J. Controlled Release 1995，33，447)、干擾素 (Kita 等人，Drug Delivery Res. 1990，6157)、過氧化氫酶(Abuchowski 等人，J. Biol. Chem. 1997，252，3582)?，F(xiàn)有技術的綜述見 Reddy，Ann. of Pharmacotherapy，2000，34，915。
延長的生物學半衰期對于肽的各種治療應用是有利的。在慢性疾病(其中建議在 延長的時間段內給予活性試劑)的情況下尤其是這樣。通過這樣的建議，其可以改善患者 的依從性，因為每日一次地使用活性試劑將比例如連續(xù)輸注更容易被人接受。除了通過共 價修飾增加分子量之外，還可以通過防止其被水解酶(例如外切或內切蛋白酶或肽酶)降 解的方式對其進行修飾從而獲得多肽的持續(xù)性的延長。已經(jīng)通過使用不同的實例顯示了有必要對每種肽進行個性化的合適修飾從而 防止對于藥代動力學效應的顯著影響(與未經(jīng)修飾的肽相比)。在本文上下文中可能提 及下列物質降鈣素(Lee等人Pharm. Res. 1999，16，813)、生長激素釋放激素(Esposito 等人，Advanced Drug Delivery Reviews，2003，55，1279)、胰高血糖素樣肽 1 (Lee 等人， Bioconjugate Res. 2005，16，377)、以及生長激素-受體拮抗劑培維索孟(Ross等人， J. Clin. Endocrin. Metab.2001,86,1716)ο Caliceti 禾口 Veronese (Adv. Drug Deliv. Rev. 2003,55 1261)以及 Harris 和 Chess 的綜述(Nature Rev. Drug Discovery 2003，2， 214)討論了在設計肽-或蛋白-PEG-綴合物時有必要考慮最初物質的結構、肽和聚合物的 分子量、綴合的聚合物鏈的數(shù)目以及接頭化學，從而獲得有效的肽-PEG-綴合物。令人驚奇的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)衍生自Ββ (15-42)纖維蛋白片段鏈的肽(其在 C-末端短了一個、兩個或三個氨基酸)，以及在該肽序列的C末端修飾的衍生物，也具有強 烈的抗炎和內皮穩(wěn)定化效應。這一點適用于肽及其衍生物(其修飾會防止蛋白酶或肽酶對 它們的破壞)，也適用于通常衍生自Ββ (15-42)纖維蛋白片段的基礎序列但缺少氨基酸6 至11的-PEG-綴合物和肽-PEG-綴合物。因此本發(fā)明涉及肽和修飾的肽，其衍生自Ββ (15-42)纖維蛋白片段的鏈，其中除 去了纖維蛋白序列的40、41和42位代表的三個氨基酸中的一個或多個。它們可以游離肽 或以C-末端衍生物和/或與聚乙二醇(PEG)-聚合物連接的形式存在，并具有抗炎和/或 內皮穩(wěn)定化效應。例如可以考慮酯或酰胺作為C-末端衍生物。本發(fā)明的化合物相對于待處理的溫血動物的纖維蛋白的天然序列可以在一個或 數(shù)個位置具有保守性氨基酸替換。保守性替換定義為各個氨基酸的側鏈被具有相似化學結 構和極性的側鏈替換，所述側鏈衍生自遺傳編碼的或非遺傳編碼的氨基酸。這種具有相似 側鏈的氨基酸的家族是本領域已知的。它們包括例如具有堿性側鏈(賴氨酸、精氨酸、組 氨酸)、酸性側鏈(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支的側鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側 鏈(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。側鏈的這種保守性替換可以優(yōu)選在非 必需位置進行。在本文上下文中，序列中的必需位置是指相關氨基酸的側鏈對于其生物學 效應具有重要意義。本發(fā)明特別考慮到下列通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽=H2N-GHRP X1X2X3X4X5X6X7X8PX9XiciX11PX12PPPX13X14X15X16B ⑴ B ⑵ B (3) -X17 (I)，其中B (1)代表化學鍵或氨基酸G ；B (2)代表化學鍵或氨基酸Y ；
B (3)代表化學鍵或氨基酸R ； X1-X16代表20種遺傳編碼的氨基酸中的一種，
X17 代表 OR1，R1 =氫或(C1-C10-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫、(C1-C10)-烷基，或殘基-PEG5_6(1K，其中PEG-殘 基通過間隔子與N原子連接，或殘基NH-Y-Z-PEG5_6(IK，其中Y代表化學鍵或選自S、C、K或R 的遺傳編碼的氨基酸，Z代表間隔子，通過該間隔子可連接聚乙二醇(PEG)-殘基。本發(fā)明的優(yōu)選主題是通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽，其中Ba)、B (2)和B (3)具有如上所述的含義，X1、X9> X10> X14 代表 L、I、S、M 或 A，X2、X6、X7代表E或D，X3、X4、X5、Xn 代表 R 或 K，X8、X12 代表 A、G、S 或 LX13代表I、L或V，并且其中X15、X16和X17具有如上文定義的相同的含義。本發(fā)明的特別優(yōu)選的主題為通式(II)的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽，H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGG-B(I)-B(2)-B(3)-X17(II)，其中 X17 具 有如通式I中定義的相同的含義。本發(fā)明最高度優(yōu)選的主題是通式II的化合物，及其生理上可接受的鹽，其中X17代表NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫或(C1-Cltl)-烷基，或殘基 C (NR2R3) - (S-琥珀酰亞胺)-(PEG5_4CIK)，琥珀酰亞胺殘基通過C原子3與半胱氨酸殘基中的 硫原子連接。在以上通式I和II中，下列字母代表根據(jù)蛋白和肽的一般命名法的氨基酸殘基 苯丙氨酸是F，亮氨酸是L，異亮氨酸是I，蛋氨酸是M,纈氨酸是V，絲氨酸是S,脯氨酸是P， 蘇氨酸是T，丙氨酸是A，酪氨酸是Y，組氨酸是H，谷氨酰胺是Q，天冬酰胺是N，賴氨酸是K， 天冬氨酸是D，谷氨酸是E，半胱氨酸是C，色氨酸是W，精氨酸是R，甘氨酸是G。通式I的化合物中的氨基酸殘基可以以其D或其L構型存在。術語肽是指這些氨基酸的聚合物，其通過酰胺鍵連接?！吧砩峡山邮艿摹币馑际桥c酸或堿形成的鹽，當用于人類時，所述酸或堿的加入 不產(chǎn)生不想要的效應。優(yōu)選的是與酸或堿形成的這樣的鹽在美國藥典或任何其它普遍接 受的藥典中將其列為用于溫血動物，尤其是人類。PEG代表聚乙二醇殘基，其具有5000至60000道爾頓的分子量，該分子量是分子量 分布的最大值，從而混合物中的單個組分具有更高或更低的分子量。本發(fā)明還涉及通式I的肽和肽衍生物的生產(chǎn)方法，其特征在于下列任一項(A)將各序列的C末端的第一個氨基酸通過合適的可切割的間隔子連接至聚合物 樹脂，隨后的氨基酸(任選含有合適的官能團保護基)通過本領域已知的方法逐步連接，根 據(jù)本領域已知的合適的方法將完成的肽從聚合物樹脂上切割下來，如果存在保護基，則通 過合適的方法將其切除，根據(jù)合適的方法純化肽或肽衍生物，或(B)將具有想要的分子量的PEG基團通過合適的間隔子連接至聚合物樹脂，使用 合適的方法將肽的N末端的第一個氨基酸連接，其余的步驟與(A)中的描述相同，或(C)使用合適的方法將在ε _氨基上含有合適的保護基的賴氨酸殘基連接至合適的聚合物樹脂，如(A)中的描述合成肽鏈，然后從聚合物樹脂上切除并純化，如果必要，使 用合適的方法切除氨基上的保護基，使用適當激活的試劑將具有想要的分子量的PEG 基團連接至ε “氨基，切除任選地剩余的保護基，使用合適的方法純化最終的產(chǎn)物，或(D)將含有半胱氨酸殘基的肽與PEG-馬來酰亞胺反應以形成式II的化合物。(A)、⑶或(C)之后的適當?shù)奶幚聿襟E以及適當?shù)脑噭┰诶缥墨IWO 2004/101600中有描述。各個處理步驟的實施方式本身不是新的，對于有機合成領域有經(jīng)驗的技術人員是 清楚的。將PEG-殘基連接至肽鏈的方法對技術人員而言是已知的。例如，半胱氨酸(C)殘 基可以與PEG-馬來酰亞胺反應，產(chǎn)生琥珀酰亞胺殘基作為殘基Z的間隔子。另一個可能性 是任選被激活的C末端羧基殘基與氨基烷基_取代的PEG殘基反應。另一個可能性是通過 醛取代的PEG殘基與賴氨酸殘基的ε-氨基官能的反應而引入PEG殘基。具有適當?shù)拈g隔 子和反應性基團的激活的PEG試劑可以從例如NOF Corporation (Tokyo, Japan)獲得。根據(jù)本發(fā)明的物質和根據(jù)本發(fā)明的物質用于生產(chǎn)藥學藥物的用途對于生產(chǎn)用于 治療疾病的藥學藥物具有特別重要的意義，所述疾病由白細胞的組織損傷效應引起，或所 述疾病中沿(lining)血管的內皮細胞層的完整性和完全(full)生理完整性被損害。屬于該類別的疾病是與自身免疫相關的(in context with)那些疾病，例如膠原 病、風濕病、炎性腸道疾病(例如Morbus Crohn或潰瘍性結腸炎)、牛皮癬和牛皮癬性類風 濕性關節(jié)炎，和感染后/類感染(parainfectious)疾病以及由移植物對宿主的反應引起的 疾病。隨著該藥物阻斷白細胞向組織的遷移而發(fā)生復原效應。因此，白細胞保留在血流中， 不能引起對組織有害的自身反應性效應。本發(fā)明的物質的這種效應對于治療休克病癥也具 有重要意義，特別是在下列情況下由革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌病原體感染以及病毒 感染引發(fā)的敗血性休克，以及嚴重損傷或細菌或病毒感染導致的嚴重失血引起的出血性休 克。本發(fā)明的物質一般可用于分別由下列術語描述的情況全身性炎性反應綜合征 (SIRS)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和器官或多器官衰竭。用于治療和/或預防器官移植的排斥反應的藥學藥物具有復原效應，因為該藥學 藥物阻止白細胞從血流遷移進入供體器官，因此，供體器官能夠不被破壞，例如不被自身反 應性淋巴細胞破壞。用于治療和/或預防動脈硬化的藥學藥物具有復原和/或預防效應，因為該藥學 藥物阻斷淋巴細胞和單核細胞遷移進入組織壁，因此，阻斷組織壁的細胞的激活。因此，動 脈硬化的進程被最小化或被停止，由此導致的動脈硬化斑的進展被抑制，從而引起動脈硬 化減退。用于治療和/或預防手術或藥物誘導的血液再供(re-supply with blood)之后 (例如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、中風、血管手術、心臟搭橋手術和器官移植之后)的再灌注 損傷的藥學藥物具有復原和/或預防效應，因為該藥學藥物抑制淋巴細胞、嗜中性粒細胞 和單核細胞遷移進入血管壁。再灌注損傷是血液向血管再供過程中血管細胞的缺氧/酸中 毒(從而引起它們的激活和/或損傷)引起的。因此，淋巴細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞 粘附至血管壁并遷移至其中。阻斷淋巴細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞在血管壁中的粘附和遷移會使缺氧/酸中毒誘導的損傷降低，而沒有隨后的引起血管的永久性損傷的炎性反 應。本發(fā)明的化合物的內皮穩(wěn)定化效應還阻止水腫的形成以及對于經(jīng)各自的血管供血的器 官的進一步損傷。用于治療和/或預防由代謝疾病或衰老過程造成的動脈硬化的藥學藥物具有復 原和/或預防效應，因為該藥學藥物抑制淋巴細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞遷移進入血 管壁，從而抑制由其造成的動脈硬化斑的進展(progredience)。根據(jù)本發(fā)明的藥學藥物還可用于運輸另一種藥物。本發(fā)明的藥物特異性地結合內 皮細胞上的表面分子。因此，與其連接的藥物可以以高濃度被輸送到內皮細胞，而它們沒有 在其它位點具有副作用的任何危險。在此可以例舉的一個實例是使用抑制細胞分裂的物質 (其被特異性帶至內皮細胞)可能具有抗血管生成效應。這會在腫瘤患者中帶來復原效應， 因為腫瘤生長通過阻止內皮細胞的增殖并從而阻止血管新生而被阻斷。本發(fā)明的化合物自 身還可以產(chǎn)生抗血管生成效應，因為，由于它們的內皮穩(wěn)定化效應，它們阻止內皮細胞改變 為增殖表型，并因此阻止新的毛細血管的形成。因此，它們自身適合于治療所有種類的腫瘤 疾病以及用于預防和/或治療腫瘤轉移。本發(fā)明的式(I)的化合物以及藥學佐劑和添加劑可以配制進入藥物制劑，其也是 本發(fā)明的主題。為了制備這樣的制劑，將治療上有效劑量的肽或肽衍生物與藥學上可接受 的稀釋劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、乳化輔助劑、佐劑或載體混合，并制成合適的治療形式。這樣的 制劑例如包含不同PH和離子強度的各種緩沖劑(例如This-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、去污劑 和增溶劑(例如吐溫80、聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸)和填充劑(例如乳酸、 甘露醇)的稀釋物。這些制劑可以影響活性試劑的生物可用性和代謝行為。根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑可以通過口服、非腸道(肌內、腹膜內、靜脈內或皮 下)、透皮或以適當?shù)纳锟山到獾木酆衔?例如聚乳酸(polylactate)或聚乙醇酸 (polyglycolate))的可蝕性植入物來給藥。根據(jù)本發(fā)明的化合物的關于阻止RhoA激活并繼而阻止內皮細胞的細胞骨架結構 改變的有效性可以例如通過包括下列步驟的方法來證明a.在至少一種測試化合物存在的情況下，將培養(yǎng)的內皮細胞的匯合層與凝血酶接 觸；b.以裂解緩沖液將內皮細胞裂解；c.通過具體的測定法，優(yōu)選通過所謂的“下拉(pull down)測定”來測定RhoA的活性?？梢允褂美鐕X類中的急性肺炎模型證明體內有效性。急性肺炎是例如在小鼠 中通過氣管內灌輸細菌脂多糖(LPS)而引起的。通過測定肺部灌洗液中的注射進入動物的 埃文斯藍的量或者通過測定肺部灌洗液中溢出的白細胞的數(shù)目來測定活性物質的效應。本 發(fā)明的化合物在0. OOlmg/kg體重至500mg/kg體重的劑量，優(yōu)選在0. lmg/kg至50mg/kg的 劑量顯示出有效。另一種證明體內生物學效應的可能方式是減少或完全抑制由于溶血性病毒或細 菌感染引起的死亡率。為此目的，使用例如一劑登革熱病毒感染小鼠，其中50%的動物在感 染后5-20天的時間內死亡。在0. 001至500mg/kg體重的劑量，優(yōu)選在0. 1至50mg/g體重 的劑量，本發(fā)明的化合物引起該死亡率的降低。
以下實施例為了解釋本發(fā)明而不是將其限制到實施例。根據(jù)本發(fā)明的肽的一般性制備和純化上述肽衍生物的制備和純化一般通過FMOC-策略使用商業(yè)可獲得的批肽合成器 (在文獻中也有描述，例如“solid phase peptide synthesi s-A pracncal approach “， Ε. Atherton, R. C. Sheppard, Oxford University press 1989)在酸不穩(wěn)定的樹脂載體上進 行。N-α-FMOC-保護的衍生物(通過酸敏感的保護基保護其官能側鏈)用作氨基酸組分。 除非另有指明，否則使用水/乙腈梯度和0. 1 %的TFA作為離子配對劑通過RP-層析法進行 純化。實施例1Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-OH將IOOmg Tentagel (Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè)可獲得 的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料(frit)而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF, 2458. 2m/z (m. i.)。實施例2Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-NH2將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile, FMOC-Leu、FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF, 2457. lm/z (m. i.)。實施例3Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-Gly-OH將IOOmg Tentagel (Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè)可獲得 的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu、FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF，2715. lm/z (m. i.)。實施例4Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-Gly-NH2將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。
應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu、FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF，2714. 2m/z (m. i.)。實施例5Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-OH將IOOmg Tentagel (Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè)可獲得 的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)禾口 FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF, 2878. 4m/z (m. i.)。實施例6Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-NH2將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二-異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。
通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His (Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 和 FMOC-Ser (tBu)。當合成完畢時，將肽樹脂干燥。然后通過在室溫以三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積 比為95 2 2 1)處理2個小時切除肽酰胺。通過過濾、濃縮溶液并通過加入冰冷的 二乙醚進行沉淀而獲得固體粗產(chǎn)物(75mg)。通過RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分鐘內，以12ml/分鐘的流速純化肽，并在215nm通過UV檢測器評價洗出 液。通過分析型RP-HPLC和質譜法確定單個組份的純度。將純化的組份合并并凍干后，獲 得 48mg 純產(chǎn)物，Maldi-TOF, 2877. 5m/z (m. i.)。實施例7Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺 _PEG2(ik) -OH按照實施例1合成單體肽，使用Tentagel (Rapp Polymere)作為樹脂載體，以 FMOC-Cys (Trt)作為第一個氨基酸。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2cik進行反應?；?收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。實施例8Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG2qk)-酰胺將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)禾口 FMOC-Cys(Trt)(Orpegen)。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2cik進行反應。回 收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。實施例9Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG·) -OH按照實施例1合成單體肽，使用Tentagel (Rapp Polymere)作為樹脂載體，以 FMOC-Cys (Trt)作為第一個氨基酸。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2cik進行反應?；?收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。
實施例10Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG·)-酰胺將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu、FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2cik進行反應?；?收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。實施例11Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG·) -OH按照實施例1合成單體肽，使用Tentagel (Rapp Polymere)作為樹脂載體，以 FMOC-Cys (Trt)作為第一個氨基酸。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2qk進行反應。回 收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。實施例12Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-A Ia-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Cys-(S-琥珀酰亞胺-PEG2cik)-酰胺將IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的裝載量轉移至商業(yè) 可獲得的肽合成裝置(PSMM(Shimadzu))，其中根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法逐步構建肽序列。通過加入5倍等摩爾過量的二 _異丙基_碳二亞胺(DIC)、二 -異丙基-乙胺 (DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)將FMOC-氨基酸衍生物預激活，將它們轉移進入反應管之 后，與樹脂載體混合30分鐘。通過加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分鐘而進行洗滌步 驟。通過加入3χ 900 μ 1處于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分鐘而進行切割步驟。通過迫使溶液通過反應管的底部玻璃料而除去各個反應液和洗滌液。應用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC) , FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu), FMOC-Cys (Trt)和 FMOC-Tyr (tBu) (Orpegen)。在切割和純化肽之后，以2-至8-倍摩爾過量的馬來酰亞胺-PEG2cik進行反應。回 收之后，在Kromasi 1 RP-18上進行純化，通過分析型RP-HPLC和MALDI-MS確認產(chǎn)物的特性。實施例13在人類臍帶靜脈血內皮細胞(HUVEC)培養(yǎng)物中凝血酶誘導的RhoA激活模型中證明了化合物的生物學效應。在標準條件下使HUVEC生長至匯合。在誘導Rho活性之前，使用不含生長因子和 血清補充物的IMDM(Gibco)使HUVEC饑餓4個小時。饑餓期之后，向饑餓培養(yǎng)基中加入 5U/ml凝血酶(Calbiochem)或5U凝血酶+50 μ g/ml測試化合物，持續(xù)1、5和10分鐘。根 據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用來自Upstate的Rho測試試劑分離活性RhoA。將分離物在15% 的聚丙稀酰胺凝膠上分開并點印到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)上。使用來自Upstate的 抗-Rho (-A、-B、-C)克隆 55 (1 500)檢測 RhoA。與未經(jīng)刺激的對照相比，相對RhoA刺激是對照肽1分鐘1對照肽5分鐘1對照肽10分鐘1凝血酶5分鐘3.8 凝血酶+實施例1的化合物(10分鐘) 0. 85
1權利要求
1.下列通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽^#-6!!!^ ^)^ ^^ X11PX12PPPX13X14X15X16B ⑴ B ⑵ B (3) -X17 (I)，其中B(I)代表化學鍵或氨基酸G ；B (2)代表化學鍵或氨基酸Y;B (3)代表化學鍵或氨基酸R ；X1-Xie代表20種遺傳編碼的氨基酸中的一種，X17代表OR1, R1 =氫或(C1-C10-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫、(C1-Cltl)-烷基，或殘基-PEG5.，其中PEG-殘基 通過間隔子與N原子連接，或殘基NH-Y-Z-PEG5_6(IK，其中Y代表化學鍵或選自S、C、K或R的 遺傳編碼的氨基酸，和Z代表間隔子，通過該間隔子可連接聚乙二醇(PEG)-殘基。
2.通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽，其中 B(l), B (2)和B (3)具有如權利要求1中所述的含義，X1^ X9> X10^X14 ^L, 1、5、] 或八，X2、X6、X7 代表 E 或 D，Χ3、) 4、Χ5、Χη 代表 R 或 K，父8、父12代表六、6、3或1^X13代表I、L或V，并且其中X15、X16和X17具有如上定義的相同的含義。
3.通式II的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的鹽，H2N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGG-B (1) -B (2) -B (3) -X17(II)其中 X17 具有如上通式 I 中 定義的相同的含義。本發(fā)明最高度優(yōu)選的主題是通式(II)的化合物，及其生理上可接受的鹽， 其中X17代表NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫或(C1-Cltl)-烷基，或殘基C (NR2R3) - (S-琥 珀酰亞胺)-(PEG5_4CIK)，琥珀酰亞胺殘基通過C原子3與半胱氨酸殘基中的硫原子連接。
4.通式(I)的化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于下列任一項(E)將各序列的C末端的第一個氨基酸通過合適的可切割的間隔子連接至聚合物樹 脂，隨后的氨基酸，任選含有合適的官能團保護基，通過本領域已知的方法逐步連接，根據(jù) 本領域已知的合適的方法將完成的肽從聚合物樹脂上切割下來，如果存在保護基，則通過 合適的方法將其切除，根據(jù)合適的方法純化肽或肽衍生物，或(F)將具有想要的分子量的PEG基團通過合適的間隔子連接至聚合物樹脂，使用合適 的方法將肽的N末端的第一個氨基酸連接，其余的步驟與(A)中的描述相同，或(G)使用合適的方法將在氨基上含有合適的保護基的賴氨酸殘基連接至合適的聚 合物樹脂，如(A)中的描述合成肽鏈，然后從聚合物樹脂上切除并純化，如果需要，使用合 適的方法切除氨基上的保護基，使用適當激活的試劑將具有想要的分子量的PEG基團 連接至ε -氨基，切除任選地剩余的保護基，使用合適的方法純化最終的產(chǎn)物，或(H)將含有半胱氨酸殘基的肽與PEG-馬來酰亞胺反應以形成式(II)的化合物。
5.藥物組合物，其含有通式(I)的化合物。
6.通式(I)的化合物的醫(yī)藥用途。
全文摘要
下列通式I的肽和肽衍生物及其生理上可接受的鹽H2N-GHRPX1X2X3X4X5X6X7X8PX9X10X11PX12PPPX13X14X15X16GYR-X17，其中X1-X16代表20種遺傳編碼的氨基酸中的一種，X17代表OR1，R1＝氫或(C1-C10-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫、(C1-C10)-烷基，或殘基-PEG5-60K，其中PEG-殘基通過間隔子與N原子連接，或殘基NH-Y-Z-PEG5-60K，其中Y代表化學鍵或選自S、C、K或R的遺傳編碼的氨基酸，Z代表間隔子，通過該間隔子可連接聚乙二醇(PEG)-殘基；或其中X15或X16代表選自C或K的氨基酸，其通過側鏈中的雜原子連接至殘基Z-PEG5-60K，并且其中X17代表OR1，R1＝氫或(C1-C10-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氫或(C1-C10)-烷基。
文檔編號C07K14/75GK102124026SQ200980118374
公開日2011年7月13日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權日2008年5月15日
發(fā)明者P·佩策爾鮑爾, R·亨寧, S·賴因格魯貝爾, W·帕斯特納 申請人:菲布雷克斯醫(yī)療研究及開發(fā)有限責任公司