專利名稱：用于蛋白性分子的標(biāo)記和親和力選擇的化合物和方法
用于蛋白性分子的標(biāo)記和親和力選擇的化合物和方法發(fā)明主題本發(fā)明涉及用于通過(guò)使蛋白性分子的同位素和同量異位素雙重標(biāo)記與其借助于 同時(shí)充當(dāng)同位素標(biāo)記組分的親和標(biāo)記物的后續(xù)親和純化偶聯(lián)，從復(fù)雜樣品分離和后續(xù)分析 蛋白性分子的化合物、和優(yōu)選地包括此類化合物的試劑盒以及方法。
背景技術(shù)：
從復(fù)雜樣品鑒定、分離和分析特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞組對(duì)于揭示生物過(guò)程如何在 分子水平上發(fā)生或蛋白質(zhì)在各種細(xì)胞類型中或在生理學(xué)狀態(tài)之間不同至何種程度是極有 價(jià)值的?，F(xiàn)代生物學(xué)中的主要挑戰(zhàn)涉及由生物編碼的完整蛋白質(zhì)組的表達(dá)、功能和調(diào)節(jié)的 理解，即，通常稱為蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。然而，因?yàn)椴淮嬖跀U(kuò)增蛋白質(zhì)的可能性，所以這 個(gè)領(lǐng)域中的研究一般是相當(dāng)繁重的，因?yàn)榧词瓜鄬?duì)簡(jiǎn)單的原核生物的細(xì)胞提取物也包含包 括巨大濃度范圍的許多蛋白質(zhì)。因此，此類任務(wù)超出了任何目前簡(jiǎn)單分析法的能力。因此，由于方法約束，蛋白質(zhì)組分析不僅依賴于鑒定且定量蛋白質(zhì)的方法，還在相 當(dāng)大的程度上也依賴于根據(jù)其結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)允許其精確和可靠分離的方法，其中這 些亞組隨后更容易用于進(jìn)一步分析。蛋白質(zhì)組具有動(dòng)態(tài)性質(zhì)，其響應(yīng)外部刺激或細(xì)胞環(huán)境中的改變而在蛋白質(zhì)合成、 激活和/或翻譯后修飾中有改變。因此，蛋白質(zhì)組的固有復(fù)雜性超過(guò)基因組或轉(zhuǎn)錄組(細(xì) 胞的mRNA互補(bǔ)序列)的復(fù)雜性。由于在此類蛋白質(zhì)組學(xué)研究中待處理的超乎尋常的數(shù)據(jù)量，蛋白質(zhì)/肽鑒定過(guò) 程需要極大的分辨能力。通常用于分辨此類高度復(fù)雜混合物的兩種方法是二維凝膠電泳 (2D-GE ；參照例如，0 ‘ Farrell, P. H. (1975) J. Biol. Chem. 250，4007-4021)和(二維) 液相色譜((2D)-LC ；參照例如，Lipton, M.S.等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 11049-11054)。通過(guò)2D-GE或2D-LC分離的肽和蛋白質(zhì)通常通過(guò)質(zhì)譜法或通過(guò)測(cè)定氨基酸 組成和/或氨基酸序列進(jìn)行鑒定。然而，盡管對(duì)于許多應(yīng)用有用，但這些鑒定技術(shù)就待研究高度復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì) 組學(xué)研究而言具有較大缺點(diǎn)。例如，疏水膜蛋白質(zhì)、高堿性或酸性蛋白質(zhì)、極大或極小蛋白 質(zhì)經(jīng)由2D-GE通常弱分辨。此外，這些方法的檢測(cè)(靈敏度)限制以及標(biāo)記技術(shù)中的不足 不允許多個(gè)樣品的平行可靠分析，例如比較不同疾病組之間、疾病的不同進(jìn)展階段和疾病 狀態(tài)與健康對(duì)照之間的相對(duì)蛋白質(zhì)水平，或用于執(zhí)行高通量篩選分析例如蛋白質(zhì)表達(dá)概況 分析或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的鑒定。目前，存在使得能夠鑒定和表征給定樣品中的特定蛋白質(zhì)的幾種可用技術(shù)，例如 質(zhì)譜法。然而，總體蛋白質(zhì)組研究一般由于檢測(cè)的有限靈敏度而被妨礙。因此，需要可能干 擾進(jìn)一步分析的另外分級(jí)分離、富集或選擇步驟(例如，通過(guò)親和純化)，以便減少樣品的 復(fù)雜性。決定統(tǒng)計(jì)上顯著的測(cè)定結(jié)果中的另一個(gè)問(wèn)題是多個(gè)樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異的 相對(duì)定量。因此，高度希望開發(fā)克服上述局限性且使得能夠平行處理多個(gè)重復(fù)雜樣品的方 法，以便減少不同的單個(gè)樣品之間的方法學(xué)變異性，并且因此增加所獲得的測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。近來(lái)，已開發(fā)了用于蛋白質(zhì)標(biāo)記的兩種不同方法以便解決這個(gè)目標(biāo)。第一種技術(shù)被稱為同位素編碼的親和標(biāo)記物(Isotope-Coded Affinity Tag) (ICAT)技術(shù)，且允許基于關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)混合物的差異同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組分析(參照 Gygi等人(1999)Nat. Biotechnol. 17，994-999)。即，這種標(biāo)記方法采用一組標(biāo)記，其具有 相同化學(xué)式，但在一種或多種原子中存在的同位素?cái)?shù)目和/或類型方面彼此不同，導(dǎo)致質(zhì) 量差異。所述的ICAT試劑使用3種功能元件用于選擇性標(biāo)記被還原的半胱氨酸殘基的硫 醇反應(yīng)基團(tuán)、允許選擇性分離半胱氨酸標(biāo)記的肽的生物素親和標(biāo)記物、和以兩種同位素形 式——“輕”(非同位素)或“重”(利用咕或13C)形式合成的同位素標(biāo)記物。因?yàn)榻o定樣 品中僅相對(duì)中等數(shù)目的蛋白質(zhì)在其一級(jí)序列中包含半胱氨酸殘基，所以導(dǎo)致樣品的復(fù)雜性 降低，這隨后促進(jìn)后續(xù)樣品處理的可靠性?？商娲椒ɡ帽环Q為用于相對(duì)和絕對(duì)定量的同量異位素標(biāo)記物(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) (iTRAQRoss, P. L. ^A (2004)Mol. Cell. Proteomics 3,1154-1169)的同量異位素標(biāo)記的試劑。這種方法采用4種不同試劑， 其各自包含報(bào)道基團(tuán)、平衡基團(tuán)和與伯胺基團(tuán)反應(yīng)的肽反應(yīng)基團(tuán)。報(bào)道基團(tuán)具有114、115、 116或117Da的質(zhì)量，這取決于每種試劑中12C/"C和160/180的差異同位素組合。平衡基團(tuán) 的質(zhì)量從31到^Da不等，以確保報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合質(zhì)量對(duì)于4種試劑保持恒定 (145Da)。因此，用這些試劑各自標(biāo)記相同肽得到同量異位且因此可用色譜法彼此區(qū)分的肽 (即，所有促成在MS分析中觀察到且用于CID的一個(gè)離子種類)。然而，在MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜 法過(guò)程中，至少各自的報(bào)道基團(tuán)在碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)后釋放，顯示114-117Da的獨(dú)特質(zhì) 量。這些片段的強(qiáng)度可以用于在單次實(shí)驗(yàn)中定量單個(gè)蛋白質(zhì)和/或肽。這導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度增 加，且因此正確鑒定肽特別是低豐度肽的可能性增加。上述ICAT和iTRAQ技術(shù)允許兩種(ICAT)或最高達(dá)4種(iTRAQ)單個(gè)樣品的多路 技術(shù)且允許使其同時(shí)處理，從而使技術(shù)變異性降到最低。然而，這兩種方法都具有明顯局限 性。ICAT方法即使允許快速篩選蛋白質(zhì)表達(dá)差異，但局限于僅兩種樣品例如兩個(gè)疾病 組的研究，其通常不代表疾病相關(guān)組(例如，疾病的不同進(jìn)展階段)的完全譜。因此，具有 允許研究超過(guò)兩個(gè)組的可用技術(shù)將是有利的。另一方面，iTRAQ技術(shù)盡管允許多樣品分析，但具有明確缺點(diǎn)它需要對(duì)每種MS信 號(hào)(對(duì)于未標(biāo)記和標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或肽)執(zhí)行MS/MS掃描用于信號(hào)的相對(duì)定量。在實(shí)踐 中，當(dāng)原材料具有高度復(fù)雜性例如在人血清或其他體液中時(shí)，這是不可行的，因?yàn)榉治鰧⑹?非常費(fèi)時(shí)的。因此，仍需要用于蛋白性分子的改良標(biāo)記試劑和包括此類標(biāo)記試劑的試劑盒，以 及克服上述局限性且使得能夠平行處理多個(gè)復(fù)雜樣品的相應(yīng)標(biāo)記方法。特別地，希望提供 同時(shí)允許標(biāo)記的蛋白性分子的后續(xù)選擇性純化和分析的標(biāo)記方法。發(fā)明目的和簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供用于對(duì)來(lái)自復(fù)雜樣品的蛋白性分子進(jìn)行標(biāo)記以及后續(xù)分離 和分析的新化合物和相應(yīng)方法。更具體而言，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于平行執(zhí)行多個(gè) 此類分析的方法。
通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)從下述描述顯而易見(jiàn)的這個(gè)目的以及其他目的。本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案由從屬權(quán)利要求的主題限定。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于標(biāo)記蛋白性分子的標(biāo)記試劑，其包括(a)同量異位素標(biāo)記組分；(b)同位素標(biāo)記組分；和(C)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由各部分組成的試劑盒(kit-of-parts)，其 包括用于標(biāo)記蛋白性分子的η ·πι種組合的多種標(biāo)記試劑(a combinatorial plurality of η · m labeling reagents)，每禾中標(biāo)記試齊抱括(a)同量異位素標(biāo)記組分；(b)同位素標(biāo)記組分，其同時(shí)是親和標(biāo)記物；和(c)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中整數(shù)η彡2，并且代表差異標(biāo)記的同量異位素標(biāo)記組分的數(shù)目，并且其中整數(shù)m > 2，并且代表差異標(biāo)記的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物的數(shù)目。特 別優(yōu)選地，整數(shù)η > 2，并且整數(shù)m > 2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物 選自(His)6S記物、(His)4 標(biāo)記物、(His)3S記物、(His)2S記物、(Leu)4 標(biāo)記物、(Leu)3 標(biāo)記物、(Leu) 2標(biāo)記物、c-Myc標(biāo)記物、HA標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物、VSV-G標(biāo)記物、HSV標(biāo)記物、 V5標(biāo)記物、生物素及其衍生物、碳水化合物和聚糖，其中由(His)6S記物、(His)4S記物、 (His)3S記物、(His)2S記物、(Leu)4S記物、(Leu)3S記物和(Leu)2標(biāo)記物組成的組是 特別優(yōu)選的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑具有這樣的構(gòu)型其中同位素標(biāo)記組分/親 和標(biāo)記物排列在同量異位素標(biāo)記組分和反應(yīng)基團(tuán)之間。在一個(gè)進(jìn)一步的可替代實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑具有這樣的構(gòu)型其中同量異位素 標(biāo)記組分排列在同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和反應(yīng)基團(tuán)之間。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)選自氨基反應(yīng)基團(tuán)、巰基反應(yīng)基團(tuán)和 羧基反應(yīng)基團(tuán)。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于分析一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種蛋白性分子 的方法，其包括(a)提供如本文定義的由各部分組成的試劑盒，所述由各部分組成的試劑盒包括 η · m種組合的多種標(biāo)記試劑；(b)通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)樣品各自與η · m種標(biāo)記試劑中的另一種單個(gè)接觸，標(biāo)記一 個(gè)或多個(gè)樣品中包括的至少一個(gè)蛋白性分子亞組；(c)使一個(gè)或多個(gè)樣品組合；(d)經(jīng)由標(biāo)記中包括的親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化分離標(biāo)記的至少一個(gè)蛋白性分 子亞組；和(e)分析分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法用M · N個(gè)樣品執(zhí)行，其中整數(shù)M代表樣品組的數(shù) 目，并且整數(shù)N代表每個(gè)樣品組的單個(gè)成員的數(shù)目，并且其中N = η且M = m。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(C)前，將蛋白性分子切割成 肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(f)前，將分離的至少一個(gè) 蛋白性分子亞組分級(jí)分離。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組的分析通 過(guò)質(zhì)譜法執(zhí)行。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括比較一個(gè)或多個(gè)樣品各自在步驟 (f)中獲得的分析結(jié)果。特別優(yōu)選地，該方法以高通量形式執(zhí)行。在最后一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如本文定義的由各部分組成的試劑盒用于執(zhí)行蛋白 質(zhì)表達(dá)概況分析或用于執(zhí)行蛋白質(zhì)組分析的用途。本發(fā)明的其他實(shí)施方案從下文的詳述將是顯而易見(jiàn)的。


圖1描述本發(fā)明的標(biāo)記試劑的兩種代表構(gòu)型的示意性舉例說(shuō)明，其優(yōu)選包括在本 文定義的由各部分組成的試劑盒中。在構(gòu)型(a)中，同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物排列在 同量異位素標(biāo)記組分和反應(yīng)基團(tuán)之間。在構(gòu)型(b)中，同量異位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物 排列在同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和反應(yīng)基團(tuán)之間。圖2描述本發(fā)明的方法用于分析兩個(gè)不同樣品組(例如，代表疾病階段和健康對(duì) 照)的應(yīng)用的示意性舉例說(shuō)明，每個(gè)組包括4個(gè)成員(例如，分別代表不同患者和健康受試 者)。8個(gè)單個(gè)樣品指定為S1-S8 (S1-S4代表第一個(gè)樣品組，并且S5-S8代表第二個(gè)樣品 組)。在樣品處理(例如，高度豐富蛋白質(zhì)的消除和/或蛋白水解切割)后，每個(gè)樣品用本 發(fā)明的不同標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于第一個(gè)樣品組，使用同位素標(biāo)記1( “IT1”)，而對(duì)于第 二個(gè)樣品組，使用同位素標(biāo)記2( “IT2”)。重要的是，ITl和IT2同時(shí)是親和標(biāo)記物。兩個(gè) 樣品組因此可以通過(guò)質(zhì)譜(MQ分析中的特征性質(zhì)量差異加以區(qū)分。在樣品組內(nèi)的單個(gè)成 員分別用不同的同量異位素標(biāo)記(指定為“IB1”- “IB4”)進(jìn)行標(biāo)記。因此，每個(gè)樣品組的 4個(gè)成員可以在串聯(lián)MS/MS分析中加以區(qū)分。隨后，使單個(gè)樣品組合，并且經(jīng)由標(biāo)記中包括 的親和標(biāo)記物(即，ITl和II^，通過(guò)親和色譜純化標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或肽。使純化的蛋白 質(zhì)和/或肽分離，任選分級(jí)分離且通過(guò)質(zhì)譜法分析。通過(guò)比較兩個(gè)樣品組的結(jié)果，可以測(cè)定 蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。圖3描述在本發(fā)明的標(biāo)記試劑和優(yōu)選地在本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒中待 用作同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物的代表性寡組氨酸(His)化合物。圖3A顯示(His)2(7)、 (His)3 和(His)4(9)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其可以使用一種或多種原子中的不同同位素進(jìn) 行合成。圖3B顯示作為合成途徑起始步驟的組氨酸側(cè)鏈甲基化(參照Recueil Trav. Chim. Pays-Bas (1978) 97, 281)。最后，圖3C示意性舉例說(shuō)明圖3A中顯示的3種化合物的合成途 徑。圖4描述在本發(fā)明的標(biāo)記試劑和優(yōu)選地在本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒中待 用作同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物的代表性寡亮氨酸(Leu)化合物。圖4A顯示(Leu)j24)、 (Leu)3(25)和(Leu)j26)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其可以使用一種或多種原子中的不同同位素 進(jìn)行合成。圖4B示意性舉例說(shuō)明圖4A中顯示的3種化合物的合成途徑。
圖5描述圖4A中顯示的(Leu)3化合物的化學(xué)合成的詳細(xì)反應(yīng)步驟。合成方案在 實(shí)施例1中概述。圖6描述使用如圖5中合成的(Leu)3化合物來(lái)標(biāo)記牛血清白蛋白(BSA)的預(yù)試 驗(yàn)。圖6A示意性舉例說(shuō)明包括同量異位素標(biāo)記組分的報(bào)道離子和平衡基團(tuán)以及作為反應(yīng) 基團(tuán)的NHS-酯的(Leu)3K合物。BSA的標(biāo)記和胰蛋白酶消化根據(jù)實(shí)施例2執(zhí)行。作為質(zhì) 量對(duì)照，通過(guò)MALDI MS/MS分析來(lái)分析標(biāo)記的片段釋放(圖6B)。對(duì)于肽鑒定，使用反相液 相色譜-電噴射離子陷阱質(zhì)譜法分級(jí)分離的(分選的)消化的BSA肽(LC-MS ；參照?qǐng)D6C， 上圖)。使用MS進(jìn)一步分析代表性LC-MS峰(圖6C，中圖)。隨后對(duì)相應(yīng)于標(biāo)記的肽的 代表性MS峰實(shí)施MS/MS分析(圖6C，下圖)。隨后將所得到的MS/MS譜轉(zhuǎn)變成mgf-文件 (Mascot Generic format)，其使用Mascot軟件針對(duì)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。最后，分 析的肽的氨基酸序列(單字母編碼)測(cè)定為CCTKPESER(圖6D)。發(fā)明詳述本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)標(biāo)記試劑和優(yōu)選地，包括此類標(biāo)記試劑的由各部分 組成的試劑盒的使用，允許蛋白質(zhì)和/或肽的簡(jiǎn)單一步標(biāo)記方案，隨后允許從復(fù)雜樣品選 擇性親和純化標(biāo)記的蛋白性分子，其中每種標(biāo)記試劑組合了同量異位素標(biāo)記組分和同位素 標(biāo)記組分，同位素標(biāo)記組分同時(shí)充當(dāng)親和標(biāo)記物。本文使用的標(biāo)記試劑的特別設(shè)計(jì)，即具有共有同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物組分的標(biāo) 記試劑，導(dǎo)致產(chǎn)生具有簡(jiǎn)化化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子，和與其包括親和標(biāo)記物作為獨(dú)立的另外實(shí)體 的各自對(duì)應(yīng)物比較小得多的分子量。此外，這種設(shè)計(jì)還允許省略可切割接頭，以便在蛋白質(zhì) /肽純化后切掉親和標(biāo)記物，且最終還導(dǎo)致較不復(fù)雜的節(jié)約的標(biāo)記試劑合成。在下文中舉例說(shuō)明性描述的本發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何 一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)踐。本發(fā)明將針對(duì)具體實(shí)施方案并參照特定附圖進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不限于其而僅 受權(quán)利要求限制。所述附圖僅是示意性的且不是限制性的。在附圖中，出于舉例說(shuō)明目的， 某些元件的大小可能放大且未按比例描繪。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“包括”在本說(shuō)明書和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他元件或步驟。為了
本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“由......組成”被視為術(shù)語(yǔ)“包括”的優(yōu)選實(shí)施方案。如果在下文中，
組被定義為包括至少特定數(shù)目的實(shí)施方案，那么這也應(yīng)理解為公開了優(yōu)選僅由這些實(shí)施方 案組成的組。當(dāng)提及單數(shù)名詞時(shí)使用不定冠詞或定冠詞，例如“一個(gè)”或“一種”、“該”的情況下， 這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非特別指出并非如此。在本發(fā)明的上下文中的術(shù)語(yǔ)“約”指本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解為仍確保所討論的 特征的技術(shù)效果的精確度區(qū)間。該術(shù)語(yǔ)一般指示與所指出的數(shù)值士 10%，優(yōu)選士5%的偏差。此外，在說(shuō)明書和權(quán)利要求中的術(shù)語(yǔ)第一、第二、第三等用于區(qū)分相似元件，并且 不一定用于描述順次或時(shí)間發(fā)生次序。應(yīng)當(dāng)理解如此使用的術(shù)語(yǔ)在合適情況下可互換，并 且本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠以除本文描述或舉例說(shuō)明外的其他順序操作。進(jìn)一步的術(shù)語(yǔ)定義將在下文中使用術(shù)語(yǔ)的上下文中給出。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于標(biāo)記蛋白性分子的標(biāo)記試劑，其包括
(a)同量異位素標(biāo)記組分；(b)同位素標(biāo)記組分；和(c)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由各部分組成的試劑盒，其包括用于標(biāo)記蛋 白性分子的η · m種組合的多種標(biāo)記試劑，每種標(biāo)記試劑包括(a)同量異位素標(biāo)記組分；(b)同位素標(biāo)記組分，其同時(shí)是親和標(biāo)記物；和(c)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中整數(shù)η > 2，并且代表差異標(biāo)記的同量異位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物的數(shù)目， 并且其中整數(shù)m彡2，并且代表差異標(biāo)記的同位素標(biāo)記組分的數(shù)目。特別優(yōu)選地，由各部分組成的試劑盒包括η ·πι種組合的多種標(biāo)記試劑，其中 整數(shù)η彡4，并且其中整數(shù)m>2。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白性分子(proteinaceous molecule)”指包括經(jīng)由肽鍵連接的多個(gè)天然或經(jīng)修飾的氨基酸的任何天然存在或合成的 (例如，通過(guò)化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的)大分子。此類蛋白性分子的長(zhǎng)度可以從2到 數(shù)千個(gè)氨基酸不等(該術(shù)語(yǔ)因此不僅包括一般被稱為肽和蛋白質(zhì)的物質(zhì)，還包括一般被稱 為寡肽的物質(zhì))。一般地，術(shù)語(yǔ)“蛋白性分子”指長(zhǎng)度超過(guò)20個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中待分析的“蛋白質(zhì)”可以具有約30-約2500個(gè)氨基酸、約50-約1000 個(gè)氨基酸或約100-約1000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“肽”指在一個(gè)或多個(gè)肽鍵斷裂后獲得的上述“蛋白性分子” 的任何片段。如本發(fā)明中使用的肽就其大小或性質(zhì)而言不以任何方式受限制。一般地，在 本發(fā)明中待分析的肽可以具有約2-約20個(gè)氨基酸、約3-約18個(gè)氨基酸或約5-約15個(gè) 氨基酸的長(zhǎng)度。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記(labeling) ”是指將“標(biāo)記(label) ” (即，可檢測(cè)標(biāo) 記)(化學(xué))附著或摻入本發(fā)明中使用的蛋白性分子內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指任何包括一種或多種合適的化學(xué)物質(zhì)或酶(其在 本文中指示“標(biāo)記組分”)的部分，其在化學(xué)、物理或酶促反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)化合 物或信號(hào)。如果至少兩種標(biāo)記組分存在于給定標(biāo)記中，那么基于其特定性質(zhì)，每種標(biāo)記組分 可以是可區(qū)分檢測(cè)的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”應(yīng)理解為指與蛋白性分子結(jié)合的部 分。在與蛋白性分子結(jié)合前的部分在本文中稱作“標(biāo)記試劑”。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑，優(yōu)選地，在本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒中使用的標(biāo)記 可以經(jīng)由共價(jià)或非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)和/或肽的氨基酸殘基連接。一般地，鍵是共價(jià)鍵。根 據(jù)本發(fā)明，這種鍵經(jīng)由“反應(yīng)基團(tuán)”來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述“反應(yīng)基團(tuán)”是在標(biāo)記試劑中包括的能夠與 蛋白性分子反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)選自氨基反應(yīng)基團(tuán)(即，與 NH2氨基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán))、巰基反應(yīng)基團(tuán)(即，與SH巰基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán))和羧基反應(yīng)基 團(tuán)(即，與COOH羧基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán))。本發(fā)明的標(biāo)記/標(biāo)記試劑，優(yōu)選地，本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒一般分別包 括兩種標(biāo)記組分(即，是“雙重標(biāo)記的”)，即同量異位素標(biāo)記組分和同位素標(biāo)記組分，其中同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。然而，所使用的標(biāo)記/標(biāo)記試劑包括一種或多種另外 標(biāo)記組分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些一種或多種另外標(biāo)記組分也可以是同量異位素標(biāo)記組 分和/或同位素標(biāo)記組分，或可以是本領(lǐng)域已知的任何其他標(biāo)記組分，包括酶標(biāo)記、有色標(biāo) 記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、半抗原、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體
巫寸寸。在一種或多種此類另外的標(biāo)記組分存在于本發(fā)明中使用的標(biāo)記試劑中的情況下， 所述標(biāo)記試劑可以進(jìn)一步包括可切割部分，用于在對(duì)標(biāo)記的蛋白性分子實(shí)施進(jìn)一步分析前 特異性切掉/去除一種或多種另外的標(biāo)記組分?？汕懈畈糠挚梢赃x自酸不穩(wěn)定部分、堿不 穩(wěn)定部分、可通過(guò)UV輻射切割的部分、可通過(guò)微波輻射切割的部分、可通過(guò)改變電位切割 的部分、可通過(guò)氧化切割的部分、可通過(guò)還原切割的部分、可以通過(guò)鏈烴復(fù)分解改變的部 分、和可以通過(guò)二硫化物交換改變的部分(即，二硫化物部分)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可切割 部分選自二硫化物部分和酸不穩(wěn)定部分。本發(fā)明基于使同位素標(biāo)記組分和同量異位素標(biāo)記組分組合的標(biāo)記試劑的使用，以 便使得多路蛋白質(zhì)分析成為可能，其用于平行執(zhí)行多個(gè)分析，例如4、8、16個(gè)或更多個(gè)平行 樣品，或甚至高通量測(cè)定。如上概述，僅使用同位素標(biāo)記將只允許平行處理兩個(gè)樣品。特別 地，采用同位素和同量異位素標(biāo)記組分的此類組合的標(biāo)記策略也提供不同樣品之間的相對(duì) 蛋白質(zhì)水平的比較。因此，僅需要對(duì)觀察到差異表達(dá)水平的那些蛋白質(zhì)和/或肽進(jìn)行特異 性分析，例如通過(guò)串聯(lián)MS/MS分析進(jìn)行特異性分析，因此導(dǎo)致更快和更不復(fù)雜的樣品分析。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“同量異位素標(biāo)記組分”(也稱為“同量異位素標(biāo)記物”) 指具有相同結(jié)構(gòu)和相同質(zhì)量的一組可檢測(cè)部分，由于同位素在同量異位素標(biāo)記內(nèi)的差異分 布，同量異位素標(biāo)記在斷裂后釋放具有相同結(jié)構(gòu)但質(zhì)量不同的特定片段。同量異位素標(biāo)記 一般包括報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)，其在斷裂后分離且顯示同位素的差異分布。在質(zhì)譜分析中， 報(bào)道基團(tuán)在碰撞誘導(dǎo)的解離(CID，即片段釋放)后產(chǎn)生強(qiáng)特征離子。由于一種或多種同位 素(例如，12C/13C、14N/15N、160/180)的差異存在，在一組同量異位素標(biāo)記組分內(nèi)，特征離子單 個(gè)地質(zhì)量不同。平衡基團(tuán)包括特定補(bǔ)償數(shù)目的同位素，以便確保報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組 合質(zhì)量對(duì)于不同同量異位素標(biāo)記是恒定的。平衡基團(tuán)可以在CID后從標(biāo)記中釋放或不釋 放。本發(fā)明的同量異位素標(biāo)記組分的分子量是20Da-2500Da、優(yōu)選50Da-2000Da、且最優(yōu)選 100Da-1500Da。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的同量異位素標(biāo)記組分包括用于相對(duì)和絕對(duì)定量的同量 異位素標(biāo)記物(iTRAQ)標(biāo)記組分等等(參照Ross，P. L.等人(2004)Mol. Cell. Proteomics 3，1巧4-1169)。這種標(biāo)記方法采用4種不同iTRAQ試劑，各自包含報(bào)道基團(tuán)、平衡基團(tuán)和 與伯胺基團(tuán)(例如，賴氨酸氨基酸殘基的ε氨基基團(tuán))反應(yīng)的肽反應(yīng)基團(tuán)。報(bào)道基團(tuán)具有 114、115、116或117Da的質(zhì)量，這依賴于每種試劑中12C/13C和16O廣8O的差異同位素組合。 平衡基團(tuán)的質(zhì)量從觀到31Da不等，以確保報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合質(zhì)量對(duì)于4種試劑 保持恒定(145Da)。因此，用這些試劑各自標(biāo)記相同肽，得到這樣的肽其是同量異位的，并 且因此例如在液相色譜中共洗脫且因此可通過(guò)色譜彼此區(qū)分。然而，在質(zhì)譜法過(guò)程中，至少 各自的報(bào)道基團(tuán)在CID后釋放，顯示114-117Da的不同質(zhì)量。這些片段的強(qiáng)度可以用于單 次定量單個(gè)蛋白質(zhì)和/或肽。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“同位素標(biāo)記組分”(也稱為“同量異位素標(biāo)記物”)指一組可檢測(cè)部分，其具有相同化學(xué)式但在一種或多種原子存在的同位素的數(shù)目和/或類型方面 彼此不同，導(dǎo)致可以例如經(jīng)由質(zhì)譜法檢測(cè)的標(biāo)記的蛋白性分子質(zhì)量的差異。換言之，用不同 同位素標(biāo)記(例如，12C/13C、14N/15N、16O/18O)標(biāo)記的在其他方面等同的蛋白質(zhì)和/或肽因此可 以基于質(zhì)量的差異加以區(qū)分。盡管同量異位素標(biāo)記(參見(jiàn)上文)原則上構(gòu)成特定類型的同 位素標(biāo)記，但在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)同位素標(biāo)記將用于指并非同量異位但可以像這樣 基于其分子量加以區(qū)分的標(biāo)記。在本發(fā)明內(nèi)，同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“親和標(biāo) 記物”指示這樣的任何化學(xué)部分由于其對(duì)于特定基質(zhì)(例如，固相支持體、色譜樹脂、基 質(zhì)或抗體)的(可逆)結(jié)合親和力，允許借助于親和純化法分離與其附著的分子(參見(jiàn)下 文)。因此，換言之，本發(fā)明的同位素標(biāo)記組分是在一種或多種原子處包括不同同位素的親 和標(biāo)記物。因此，在本發(fā)明中使用的同位素標(biāo)記組分例如不同于已知的同位素編碼的親和 標(biāo)記物(ICAT)標(biāo)記(參照 Gygi，S. P.等人(1999)Nat. Biotechnol. 17，994-999)，因?yàn)樗?們不包括親和標(biāo)記物作為獨(dú)立的另外實(shí)體。一般地，在本發(fā)明中使用的同位素標(biāo)記組分以兩種同位素形式，即“輕”形式(利 用例如12c、14N或16O)和“重”形式(利用例如13CN或合成。本發(fā)明的同位素標(biāo)記組 分的分子量是 100Da-3000Da，優(yōu)選 100Da_1500Da。任何親和標(biāo)記物可以用于合成在本發(fā)明中使用的同位素標(biāo)記組分。此類親和標(biāo)記 物的例子包括小化合物(例如生物素及其衍生物)和短氨基酸序列，一般長(zhǎng)度2-20個(gè)氨基 酸，且優(yōu)選長(zhǎng)度4-1兩個(gè)氨基酸(例如(His) 6標(biāo)記物、(Leu) 3標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物或c_Myc 標(biāo)記物)等等。所有這些親和標(biāo)記物是本領(lǐng)域充分建立和商購(gòu)可得的。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑和優(yōu)選地，本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案 中，親和標(biāo)記物選自(His)6S記物、(His)4S記物、(His)3S記物、(His)2S記物、(Leu)4 標(biāo)記物、(Leu) 3標(biāo)記物、(Leu) 2標(biāo)記物、c_Myc標(biāo)記物、HA標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物、VSV-G標(biāo)記 物、HSV標(biāo)記物、V5標(biāo)記物、生物素及其衍生物、碳水化合物和聚糖。本發(fā)明特別優(yōu)選的親和 標(biāo)記物選自(Hi s) 6標(biāo)記物、(Hi s) 4標(biāo)記物、(Hi s) 3標(biāo)記物、(Hi s) 2標(biāo)記物、(Leu) 4標(biāo)記物、 (Leu) 3標(biāo)記物禾口(Leu) 2標(biāo)記物。為了產(chǎn)生在質(zhì)量方面具有等同差異的相同分子結(jié)構(gòu)的幾種同位素變體，可能必須 在具有潛在不同的官能團(tuán)和反應(yīng)機(jī)制、同位素交換的不同純度或可變?cè)痈患暮铣赏緩?中使用不同構(gòu)件。這需要許多不同反應(yīng)步驟，使得此類標(biāo)記組分的合成費(fèi)力、費(fèi)時(shí)而且相當(dāng)
曰蟲 印貝。因此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，采用同位素標(biāo)記組分，其已通過(guò)重復(fù)相同反應(yīng) 方案數(shù)次從用作前體的共同構(gòu)件開始合成，這依賴于標(biāo)記組分的所需長(zhǎng)度大小。此類構(gòu)件 的例子包括以高純度以及以具有高原子富集的不同同位素變體形式商購(gòu)可得的氨基酸和 糖分子等等。當(dāng)采用此類構(gòu)件作為前體時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的一組同位素標(biāo)記組分的合成導(dǎo)致 簡(jiǎn)化得多且因此更快速和節(jié)約成本的反應(yīng)方案?？梢砸源祟惙绞街苽涞谋景l(fā)明的優(yōu)選同位 素標(biāo)記組分是(His)6S記物。類似地，本發(fā)明的同量異位素標(biāo)記組分也可以通過(guò)采用共有構(gòu)件合成。報(bào)道基團(tuán) 可以例如基于N-甲基哌嗪，而平衡基團(tuán)可以基于例如氨基酸或糖分子。本發(fā)明的標(biāo)記試劑和優(yōu)選地，本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒的不同組分可以以任何允許反應(yīng)基團(tuán)與蛋白性分子結(jié)合的構(gòu)型排列。各個(gè)組分(即，同量異位素標(biāo)記組分、同 位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物、和反應(yīng)基團(tuán))可以彼此直接連接或通過(guò)接頭序列分開。它們 可以以線性方式排列，如通過(guò)圖1中示意性舉例說(shuō)明的兩個(gè)實(shí)施方案例示的，或以分支形 式排列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記試劑具有(線性)構(gòu)型，其中同位素標(biāo)記組分/親和 標(biāo)記物排列在同量異位素標(biāo)記組分和反應(yīng)基團(tuán)之間(參照?qǐng)D1(a))。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，標(biāo)記試劑具有(線性)構(gòu)型，其中同量異位素標(biāo)記組分排列在同位素標(biāo)記組分/親和 標(biāo)記物和反應(yīng)基團(tuán)之間(參照?qǐng)D1(b))。本發(fā)明的標(biāo)記試劑和優(yōu)選地，本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒的分支構(gòu)型的一個(gè) 例子是這樣的排列其中同量異位素標(biāo)記組分經(jīng)由接頭序列與反應(yīng)基團(tuán)連接，同位素標(biāo)記 組分/親和標(biāo)記物與所述接頭序列附著。此類分支構(gòu)型的另一個(gè)例子是相反排列，其中同 量異位素標(biāo)記組分與接頭序列附著，所述接頭序列使同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和反應(yīng) 基團(tuán)連接。此類分支構(gòu)型的第三個(gè)例子是這樣的排列其中同量異位素標(biāo)記組分經(jīng)由接頭 序列與同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物連接，反應(yīng)基團(tuán)與所述接頭序列附著。本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒包括如本文定義的η ·πι種組合的多種標(biāo)記試劑， 其中整數(shù)11 > 2，并且代表差異標(biāo)記的同量異位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物的數(shù)目，并且其中 整數(shù)m > 2，并且代表差異標(biāo)記的同位素標(biāo)記組分的數(shù)目。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“組合的多種(combinatorial plurality) ”指所述多種標(biāo) 記試劑包括可以通過(guò)使η種不同的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和m種不同的同量異位素 標(biāo)記組分組合來(lái)達(dá)到的最高數(shù)目排列。例如，當(dāng)使4種不同的同量異位素標(biāo)記組分IB1、IB2、IB3和IB(即η = 4)與兩 種不同的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物ITl和ΙΤ2(即m =幻組合時(shí)，如本文所定義的，組 合的多種包括 4 · 2 = 8 種不同組合 JT1/IBU IT1/IB2、IT1/IB3、IT1/IB4、IT2/IB1、IT2/ IB2、IT2/IB3 和 IT2/IB4。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，η ·πι種組合的多種標(biāo)記試劑包括至少4種不同 的同量異位素標(biāo)記組分(即η > 4)和至少兩種不同的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物(即
幻。因此，本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒可以例如包括通過(guò)使4、8、12或16種不同 的同量異位素標(biāo)記組分與2、3、4或6種不同的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物組合而達(dá)到的 組合的多種。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于分析一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種蛋白 性分子的方法，其包括(a)提供如本文定義的由各部分組成的試劑盒，所述由各部分組成的試劑盒包括 η · m種組合的多種標(biāo)記試劑；(b)通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)樣品各自與η · m種標(biāo)記試劑中的另一種單個(gè)接觸，標(biāo)記一 個(gè)或多個(gè)樣品中包括的至少一個(gè)蛋白性分子亞組；(c)使一個(gè)或多個(gè)樣品組合；(d)經(jīng)由標(biāo)記中包括的親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化分離標(biāo)記的至少一個(gè)蛋白性分 子亞組；和(e)分析分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組。
根據(jù)本發(fā)明的方法用于分析兩個(gè)不同樣品組(例如，代表疾病階段和健康對(duì)照) 的應(yīng)用的示意性舉例說(shuō)明顯示于圖2中，每個(gè)組包括4個(gè)成員(例如，分別代表不同患者和 健康受試者)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“樣品”不意欲必須包括或排除在執(zhí)行本發(fā)明的方法前的任 何處理步驟。樣品可以是未處理的(“粗的”)樣品、提取的蛋白質(zhì)/肽級(jí)分、純化的蛋白質(zhì) /肽級(jí)分等。例如，所采用的樣品可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)(高度)豐富蛋白質(zhì)亞組的免疫耗 竭進(jìn)行預(yù)處理。合適的樣品包括原核生物(例如，細(xì)菌、病毒樣品)或真核生物來(lái)源的樣品 (例如，真菌、酵母、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和特別地，人樣品)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“復(fù)雜樣品”指使用本發(fā)明的方法分析的樣品一般包括以不 同濃度存在的許多不同蛋白質(zhì)和/或肽(或此類蛋白質(zhì)和/或肽的不同變體)的事實(shí)。例 如，在本發(fā)明內(nèi)的復(fù)雜樣品可以包括至少約500、至少約1000、至少約5000或至少約10000 種蛋白質(zhì)和/或肽。在本發(fā)明中使用的一般復(fù)雜樣品尤其包括原核生物或真核生物來(lái)源的 細(xì)胞提取物或裂解物，以及人或非人體液例如全血、血清、血漿樣品等。該方法可以用單一樣品執(zhí)行，但一般平行處理兩個(gè)或更多個(gè)樣品。在某些實(shí)施方 案中，該方法用M ·Ν個(gè)樣品執(zhí)行，其中整數(shù)M代表樣品組的數(shù)目(例如，疾病階段和健康對(duì) 照或疾病的不同進(jìn)展階段)，并且整數(shù)N代表每個(gè)樣品組的單個(gè)成員數(shù)目(例如，來(lái)自不同 患者或健康受試者的樣品)，并且其中N = η并且M = m(參見(jiàn)上文)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在對(duì)蛋白性分子實(shí)施標(biāo)記方案前(即 在執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(b)前)，將其切割成肽。此類蛋白質(zhì)切割可以用化學(xué)方法 達(dá)到(例如，經(jīng)由酸或堿處理，所述處理采用化學(xué)物質(zhì)例如溴化氰、2-(2'-硝基苯基磺酰 基)-3-甲基-3-溴-假吲哚(BNPQ、甲酸、羥胺、碘苯甲酸和2-硝基-5-氰硫基苯甲酸) 或經(jīng)由蛋白酶(包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶K等等)酶促達(dá) 到，兩種操作都是本領(lǐng)域眾所周知的。待分析的單個(gè)樣品通過(guò)使每個(gè)樣品與在本發(fā)明的由各部分組成的試劑盒中包括 的本發(fā)明的不同標(biāo)記試劑分開接觸進(jìn)行標(biāo)記，以確保每個(gè)樣品的特異性標(biāo)記。標(biāo)記經(jīng)由標(biāo) 記試劑中包括的反應(yīng)基團(tuán)與一個(gè)或多個(gè)樣品中包括的至少一個(gè)蛋白性分子亞組附著。隨 后，使一個(gè)或多個(gè)樣品組合用于進(jìn)一步分析。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)蛋白性分子亞組”應(yīng)以這樣的方式加以理解依 賴于樣品處理，特別是標(biāo)記方案等，它可能涉及給定樣品或其特定部分中存在的蛋白性分 子的全體。然后，經(jīng)由與蛋白性分子附著的標(biāo)記中包括的親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化分離在 組合的樣品中包括的標(biāo)記的至少一個(gè)蛋白性分子亞組。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“親和純化” 指用于分離樣品(移動(dòng)相)中的蛋白性分子的、任何基于與基質(zhì)的結(jié)合相互作用差異的純 化方法(例如，親和柱色譜或相應(yīng)批設(shè)置)，所述基質(zhì)固定于靜止的材料(固相)。蛋白性 分子與基質(zhì)的選擇性結(jié)合一般經(jīng)由標(biāo)記(即親和標(biāo)記物)完成，所述標(biāo)記顯示對(duì)于基質(zhì)的 特異性結(jié)合活性。一般地，待用作親和基質(zhì)的材料在發(fā)現(xiàn)靶分子的系統(tǒng)中是不可溶的。合 適基質(zhì)的例子包括親和素或鏈霉親和素(在生物素用作親和標(biāo)記物的情況下)，Ni2+-螯合 的NTA(在(His)6用作親和標(biāo)記物的情況下)、或可以與支持物偶聯(lián)的抗標(biāo)記物抗體(例如， 抗FLAG抗體、抗(His)抗體、抗(Leu)抗體)(即免疫親和色譜)等等。所有這些親和基質(zhì)(即樹脂和/或抗標(biāo)記物抗體)是本領(lǐng)域充分建立和商購(gòu)可得的。最后，對(duì)分離的標(biāo)記的蛋白性分子實(shí)施進(jìn)一步定性和/或定量分析(即蛋白質(zhì)/ 肽鑒定和測(cè)定其在待分析的一個(gè)或多個(gè)樣品中的絕對(duì)和/或相對(duì)濃度)。在某些實(shí)施方案中，在進(jìn)一步分析前(即在執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(e) 前)，分離的(標(biāo)記)至少一個(gè)蛋白性分子亞組進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)分離。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分級(jí)分離”指任何以下類型處理步驟其中根據(jù)蛋白質(zhì)和 /或肽的物理化學(xué)性質(zhì)例如分子量、其大小及其總體凈電荷的任何差異，以特定量存在于樣 品中的蛋白質(zhì)和/或肽以許多較小量(即級(jí)分)分開(即分選)。分級(jí)分離中的常見(jiàn)性狀 是需要發(fā)現(xiàn)在收集的級(jí)分量和每種級(jí)分中的所需純度之間的最適條件。分級(jí)分離使得能夠 在單次運(yùn)行中分離混合物中的超過(guò)兩種組分。這種性質(zhì)使它與其他分離技術(shù)分開。存在本領(lǐng)域充分建立的用于分級(jí)分離蛋白質(zhì)和/或肽的幾種方法，包括經(jīng)典SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、二維凝膠電泳、大小排阻色譜、(二維)液相色譜和等電 點(diǎn)聚焦，其中后面一種是特別優(yōu)選的。用于在分級(jí)分離已發(fā)生后分析特別是顯現(xiàn)蛋白性分 子的方法是本領(lǐng)域充分建立的。也可以考慮其他分級(jí)分離方法及其組合。因此，分級(jí)分離/ 再分級(jí)分離可能依賴于離子交換色譜、大小排阻色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜和/或 親和色譜。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)用超過(guò)一種樣品執(zhí)行分析時(shí)，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括比 較對(duì)于一個(gè)或多個(gè)樣品中的每一個(gè)樣品獲得的分析結(jié)果，以便測(cè)定單個(gè)樣品之間的相對(duì) (蛋白質(zhì)表達(dá))差異。在優(yōu)選實(shí)施方案，分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組的分析借助于質(zhì)譜法，即用于 測(cè)量離子的質(zhì)荷比的分析技術(shù)執(zhí)行。所應(yīng)用的具體質(zhì)譜分析可能依賴于在不同樣品中測(cè)定 的蛋白質(zhì)和/或肽表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法以高通量形式執(zhí)行。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文描述的標(biāo)記試劑、由各部分組成 的試劑盒和/或方法用于執(zhí)行蛋白質(zhì)表達(dá)概況分析或用于執(zhí)行蛋白質(zhì)組分析的用途。盡管上述發(fā)明已就某些其優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但這決不限制本發(fā)明的范圍。 技術(shù)人員明確知道關(guān)于先前所述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案和改變，這仍在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例I-(Leu)3標(biāo)記化合物的合成圖4A和6A中顯示的(Leu) 3標(biāo)記化合物根據(jù)下述方案進(jìn)行化學(xué)合成。各個(gè)合成 步驟與圖5中所述的反應(yīng)方案對(duì)應(yīng)。步驟(1):使原料(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酸、(S)-甲基-2-氨 基-4-甲基戊酸酯鹽酸鹽、1_(雙(二甲氨基)亞甲基)-1Η-[1，2，3]三唑并W，5-b]吡 啶-1-鋪-3-氧化物六氟磷酸鹽(V)、和N-乙基-N-二異丙-2-胺溶解于二氯甲烷(150ml) 中，加入2. Oml DMF，并且使混合物攪拌2小時(shí)，這之后受Boc保護(hù)的胺已消失(TLC洗脫劑 KOAc/庚烷1:1)。加入150ml飽和氯化銨，并且用二氯甲烷(8x 30ml)萃取粗產(chǎn)物。使有 機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并且在減壓下濃縮。使用溶于庚烷中的40% EtOAc作為洗脫劑，使粗 產(chǎn)物在具有硅膠的玻璃濾器上純化。這得到1.96g(84%)純產(chǎn)物(S)-甲基-2-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(甲基戊酰氨基)-4-甲基戊酸酯。步驟O)使步驟(1)中受Boc保護(hù)的二肽溶解于DCM/TFAG4 Ilml)中，并且 攪拌1. 5小時(shí)。在逐步引起反應(yīng)后，具有飽和NaHCO3TLC的小樣品顯示反應(yīng)完全。使反應(yīng) 混合物在減壓下濃縮，得到2. 58g微黃色油。屯NMR顯示產(chǎn)物還必須包含與產(chǎn)物一起存在 的某些游離三氟乙酸，通過(guò)蒸餾去除游離三氟乙酸的嘗試失敗，并且因此無(wú)需進(jìn)一步純化 而使用粗產(chǎn)物( -甲基-2- ((S) -2-氨基-4-甲基戊酰氨基)-4-甲基戊酸酯2，2，2-三氟 乙酸鹽。步驟(3)使步驟O)的氨基三氟乙酸鹽溶解于二氯甲烷(150ml)中。在0°C下， 加入DIPEA，隨后加入HATU和Boc-Leu-OH。使混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。根據(jù)TLC，反應(yīng) 是完全的。用飽和氯化銨猝滅混合物，并且用二氯甲烷(8x 50ml)萃取水層。使合并的有 機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并且在減壓下濃縮。使用溶于庚烷中的KOAc (4 6)作為洗脫劑， 使粗產(chǎn)物在硅膠上純化。所得到的三肽(65，95，12幻-甲基-6，9-二異丁基-2，2-14-三 甲基-4，7，10-三氧代-3-氧雜_5，8，11-三氮雜十五烷-12-甲酸酯以1. 78g(3. 77mmol ； 50% )的產(chǎn)率獲得。步驟(4)使步驟(3)的受Boc保護(hù)的三肽溶解于DCM/TFAG4 Ilml)中，并且 攪拌1. 5小時(shí)。在逐步引起反應(yīng)后，具有飽和NaHCO3TLC的小樣品顯示反應(yīng)完全(產(chǎn)物不用 溶于庚烷中的50% EtOAc運(yùn)行)。使反應(yīng)混合物在減壓下濃縮并且用二氯甲烷剝離一次。 將二乙醚OOml)加入產(chǎn)物中用于研磨，在5分鐘后，加入IOml庚烷，并且過(guò)濾掉固體，在40 分鐘后得到l，480g白色粉末(( -甲基-2-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰氨基)-4-甲基戊 酰氨基)-4-甲基戊酸酯2，2，2-三氟乙酸鹽)。步驟(5)向步驟(4)的三肽-TFA鹽、N-甲基-哌嗪基乙酸、EDC和HOAt在甲苯 (50ml，考慮它是二氯甲烷)的混合物中，加入DIPEA，并且使混合物攪拌1小時(shí)，在這個(gè)過(guò)程 中在燒瓶的底部上形成黃色固體。用飽和碳酸氫鈉(70ml)猝滅混合物。使兩個(gè)相分離，并 且用二氯甲烷Gx50ml)萃取水相。使合并的有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并且在減壓下濃縮， 得到0. 203g粗材料，這包含所需產(chǎn)物以及原料(根據(jù)LC-MS和1H NMR)。粗材料在2小時(shí) 過(guò)程中用溶于二氯甲烷05ml)中的EDC、HOAt和DIPEA再處理一次。在逐步引起反應(yīng)后 (類似于上述操作)，獲得0.231g粗材料。根據(jù)LC-MS，反應(yīng)是完全的。在硅膠上使用溶于 二氯甲烷中的MeOH中的5-10% 0. 5M NH3梯度的純化得到作為結(jié)晶白色固體的0. 158g產(chǎn) 物((S)-甲基-4-甲基-2- ((S) -4-甲基-2- ((S) -4-甲基-2- (2- (4-甲基哌嗪基)乙 酰氨基)戊酰氨基)-戊酰氨基)戊酸酯)。步驟(6)使步驟(5)的原料溶解于Tesser' s堿(二D惡烷/MeOH/含水4N NaOH 15 4 1)中，并且使混合物在室溫下攪拌。在攪拌一夜后，使溶液濃縮，得到粗產(chǎn)物 (S) -4-甲基-2- ((S) -4-甲基-2- ((S) -4-甲基-2- (2- (4-甲基哌嗪基)乙酰氨基)戊 酰氨基)戊酰氨基)戊酸鈉。這種化合物無(wú)需進(jìn)一步純化在下一個(gè)步驟中使用，執(zhí)行Na分 析。步驟(7)在0°C下向溶于二氯甲烷(5ml)中的步驟(6)的粗產(chǎn)物懸浮液中，順次 加入NHS和EDC，并且使混合物在0°C下攪拌3小時(shí)。使混合物濃縮，得到粘性固體。使粘 性固體再溶解于二氯甲烷(7ml)中。隨后，加入二乙醚(7ml)，并且使溶劑蒸發(fā)直至一半體 積。添加二乙醚，隨后部分蒸發(fā)，重復(fù)2次，這之后過(guò)濾沉淀物(乙基(N，N-二甲基氨基)丙基-ureum和氯化鈉)。使濾液濃縮，得到52mg粘稠油。當(dāng)察看 NMR譜時(shí)，看起來(lái)這 個(gè)級(jí)分可能包含所需琥珀酸酯(⑶-2，5-二氧代吡咯烷-1-基-4-甲基-2-((S)-4-甲 基-2-((S)-4-甲基-2-(2- -甲基哌嗪-1-基)乙酰氨基)_戊酰氨基)戊酰氨基)戊 酸酯)，其被乙基二異丙基ureum等污染。過(guò)濾的沉淀物(3;3mg)可能包含所需產(chǎn)物(在 2. 65ppm處的單峰，琥珀酸酯質(zhì)子)。步驟(8)使步驟(6)的原料溶解于Tesser' s堿(二D惡烷/MeOH/含水4N NaOH 15 4 1)中，并且使混合物在室溫下攪拌。通過(guò)LC-MS (酸性模式)監(jiān)控反應(yīng)。在攪拌 2小時(shí)后，使溶液濃縮，得到粗產(chǎn)物。這種化合物無(wú)需進(jìn)一步純化在下一個(gè)步驟中使用。未 測(cè)定產(chǎn)率。步驟(9)在室溫下向溶于二卩惡烷(無(wú)水的)和二氯甲烷((2. 0ml，無(wú)水的)的 1 1混合物中的步驟(8)的粗產(chǎn)物溶液中，順次加入NHS,DIPEA (26 μ 1)和EDC (18. 9mg)， 并且使混合物在室溫下攪拌5小時(shí)。加入6-氨基己酸和2ml 二D惡烷(無(wú)水的)。使混合物 攪拌過(guò)夜。在第二天時(shí)，加入更多EDC(19mg)，以產(chǎn)生活化的琥珀酰亞胺酯。使混合物再次攪 拌過(guò)夜。在第二天時(shí)，從反應(yīng)混合物中取出樣品，將正丁胺加入樣品中，并且使所得到的混 合物攪拌10分鐘。使溶液在減壓下濃縮，并且通過(guò)LC-MS分析粗產(chǎn)物由來(lái)自己酸加合物的 預(yù)期丁酰胺(在m/z處的[M+H]+ = 666. 4)、己酸加成產(chǎn)物([M+H] +在m/z = 611. 4)、來(lái)自 原料的琥珀酰亞胺酯([M+H] +在m/z = 553. 4)及其相應(yīng)甲酯([M+H] +在m/z = 512. 4)組 成。反應(yīng)混合物在飽和碳酸氫鈉05ml)中猝滅，并且加入水(5ml)。用二氯甲烷(5x 20ml) 萃取水相，并且在硫酸鈉上干燥合并的有機(jī)層，并且在減壓下濃縮。這得到41mg固體。用 LC-MS5分析固體，以揭示它是化合物的混合物。獲得樣品以用丁胺執(zhí)行測(cè)試反應(yīng)(參見(jiàn)上 文)。用LC-MS5分析來(lái)自這個(gè)測(cè)試反應(yīng)的產(chǎn)物。它包含預(yù)期丁酰胺，但它的豐度看起來(lái)低 于第一個(gè)測(cè)試反應(yīng)中的豐度。由于混合物的復(fù)雜性和關(guān)于產(chǎn)物組成的不確定連同其潛在不 穩(wěn)定性，決定不運(yùn)送這種產(chǎn)物。步驟(10)借助于制備型HPLC純化步驟(9)的產(chǎn)物。這得到8mg游離酸步驟(11)向溶于DMF中的步驟(10)的原料溶液中，加入EDC和N-羥基琥珀酰 亞胺(MB)，并且使混合物在隊(duì)氣氛下攪拌過(guò)夜。在第二天時(shí)，加入更多NHS (^ig)，并且使 混合物再次攪拌5小時(shí)。獲得測(cè)試樣品，并且使其與過(guò)量N-丁胺反應(yīng)用于分析。這種樣品 的LC-MS顯示形成產(chǎn)物(m/z = 667的丁酰胺)。使混合物在減壓下濃縮且再溶解于二氯甲 烷QOml)中。用飽和NaHCO3 QOml)猝滅這種溶液。用飽和NaCl洗滌有機(jī)層，并且在硫酸 鈉上干燥。獲得測(cè)試樣品用于分析加入過(guò)量丁胺，并且使混合物攪拌15分鐘。使溶液在 減壓下濃縮且通過(guò)LC-MS分析。這種分析顯示產(chǎn)物具有良好品質(zhì)。使溶液濃縮以得到7mg 所需(Leu)3產(chǎn)物。實(shí)施例2-使用(Leu) 3標(biāo)記試劑標(biāo)記肽在預(yù)試驗(yàn)中，圖6A中顯示的(Leu)3化合物用作標(biāo)記試劑，用于標(biāo)記牛血清白蛋白 (BSA)。圖6A示意性舉例說(shuō)明包括同量異位素標(biāo)記組分的報(bào)道離子和平衡基團(tuán)以及作為反 應(yīng)基團(tuán)的NHS-酯的(Leu)3K合物。串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)中的斷裂位點(diǎn)由箭頭指示。為了標(biāo)記，使50mg牛血清白蛋白還原(5mM TCEP，在56°C下溫育15分鐘)，并且 烷基化(IOmM碘乙酰胺，在室溫下在黑暗中溫育30分鐘)；使一批MC標(biāo)記(400mg)溶解于 80ml乙醇中(取3ml用于標(biāo)記的分離質(zhì)譜分析，參照?qǐng)D6B)，并且隨后加入還原且烷基化的BSA中。使這種混合物在室溫下溫育2小時(shí)。在標(biāo)記后，使用漲MWCO(分子量截止)超濾濾器，將反應(yīng)混合物的緩沖液更換成 IOOmM碳酸氫銨，pH 8。以1 25比值加入胰蛋白酶，并且使這種混合物在37°C下溫育過(guò) 夜。對(duì)于肽鑒定，使用反相液相色譜-電噴射離子阱質(zhì)譜法分級(jí)分離(分選)消化的 BSA肽(LC-MS ；參照?qǐng)D6C，上圖)。使用MS進(jìn)一步分析代表性LC-MS峰(圖6C，中圖)。隨 后對(duì)與標(biāo)記的肽相應(yīng)的代表性MS峰實(shí)施MS/MS分析(圖6C，下圖)。隨后將所得到的MS/ MS 譜轉(zhuǎn)化成 mgf-文件(Mascot Generic Format)，其使用 Mascot 軟件針對(duì) SwissProt 數(shù) 據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。緊接著甲硫氨酸氧化和半胱氨酸脲基甲基化(carbamidomethylation)后， 考慮賴氨酸MC-L3作為可能修飾。最后，待分析的肽的氨基酸序列(單字母編碼)測(cè)定為 CCTKPESER(圖6D)。在另一個(gè)實(shí)施方案中(數(shù)據(jù)未顯示)，使用(Leu) 3標(biāo)記試劑可以成功 地鑒定具有氨基酸序列CASIQKFGER的第二種BSA肽。實(shí)施例3-前列腺癌中的生物標(biāo)記鑒定前列腺癌(PCa)是歐洲男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在2002年，在約225000個(gè)男 性中新近診斷PCa，并且約83000個(gè)男性死于這種疾病。PCa通過(guò)前列腺組織的組織學(xué)檢查 進(jìn)行診斷，所述組織學(xué)檢查通過(guò)超聲引導(dǎo)的經(jīng)直腸活組織檢查獲得?；罱M織檢查的適應(yīng)癥 主要是增加的血清前列腺特異性抗原(PSA)和/或異常直腸指檢。PSA是標(biāo)準(zhǔn)診斷和預(yù)后 PCa標(biāo)記。PCa知曉導(dǎo)致PSA測(cè)試的廣泛使用，已導(dǎo)致在診斷時(shí)更低的腫瘤分期和級(jí)別。然而，PSA的使用與特定缺點(diǎn)相關(guān)。首先，PSA的增加可以反映良性以及惡性前列 腺疾病，即PSA不是癌癥特異性的，導(dǎo)致70-80%的陰性活組織檢查率。因此，大量患者不必 要地經(jīng)歷前列腺活組織檢查。此類增加的檢測(cè)導(dǎo)致臨床上無(wú)關(guān)腫瘤的診斷和潛在地治療過(guò) 度。此外，還存在患者具有臨床上局限性疾病的問(wèn)題，所述患者具有未被檢出的微小轉(zhuǎn)移， 導(dǎo)致在期限內(nèi)的有癥狀癌癥。目前，這些患者是不可治愈的。最后，未通過(guò)放射治療治愈的 許多PCa患者將最終發(fā)展激素非依賴性和治療抗性。借助于在腫瘤進(jìn)展的早期階段時(shí)的次 級(jí)治療，雄激素非依賴性的早期識(shí)別可能是全身療法的適應(yīng)癥。然而，目前無(wú)法在早期階段 時(shí)預(yù)測(cè)對(duì)治療的抗性。因此，需要其應(yīng)用導(dǎo)致診斷特異性增加的PCa標(biāo)記，使得能夠區(qū)分無(wú)害和侵入性 腫瘤，并且允許在早期疾病階段時(shí)鑒定朝向雄激素非依賴性的進(jìn)展。血清和尿包含良性和惡性細(xì)胞的降解產(chǎn)物及其分泌產(chǎn)物。這些體液中的生物標(biāo)記 測(cè)定具有超過(guò)使用組織標(biāo)記的特定優(yōu)點(diǎn)。盡管PCa相關(guān)蛋白質(zhì)和/或肽釋放到血清和尿不 完全反映腫瘤代謝，但這些體液可以容易地獲得。相比之下，前列腺組織取樣需要介入性操 作(即，經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)的活組織檢查)。實(shí)施例4-潛在可治療的腫瘤的鑒定血清前列腺特異性抗原(PSA)測(cè)試以及隨后經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)穿刺活組織檢查允 許檢測(cè)某些男性中的前列腺癌，所述男性可能獲益于基本干預(yù)(在50到70歲之間)。前列 腺癌可以在 2% (Frankel，S.等人(2003) Lancet 361，1122-28)到 40% (Thompson, I. Μ.等 人(2003) New Engl. J. Med. 349,215-24)的病例中檢測(cè)出，這依賴于篩選努力的強(qiáng)度(例 如，執(zhí)行的PSA測(cè)試數(shù)目、PSA截止值水平、所獲得的活組織檢查數(shù)目和頻率)。因?yàn)镻SA不 是前列腺癌特異性的，所以大量假陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生(癌癥在經(jīng)歷活組織檢查PSA水平升高的約70%男性中未發(fā)現(xiàn))。這種簡(jiǎn)單PSA血液測(cè)試是安全和可接受的，但活組織檢查可以是不 舒服或疼痛的，并且?guī)в谐鲅透腥镜奈ｋU(xiǎn)。此外，將存在不可預(yù)知的假陰性數(shù)目，其隨后 在‘正?！?PSA測(cè)試的存在下發(fā)展前列腺癌在歐洲隨機(jī)化篩選試驗(yàn)(European Randomized Screening Trial) (ERSPC)具有低于^g/ml的PSA水平的男性中鑒定出36. 5%可檢測(cè)腫 瘤(Schroder5F. H.等人(2000) J. Urology 163,806-812)。明確的是需要用于前列腺癌的改良診斷測(cè)試。PSA已成為有用工具，以“觸發(fā)”活 組織檢查并且監(jiān)控具有已知癌癥的男性，但對(duì)于篩選無(wú)效。在男性已進(jìn)行數(shù)次活組織檢查 的前列腺癌預(yù)防試驗(yàn)(Prostate Cancer Prevention iTrial)中，不管PSA水平，前列腺癌的 發(fā)病率顯示是低的(Thompson, I. Μ.等人(2004)，同上)具有0. 5的PSA水平時(shí)是6. 6%， 具有0. 6到1. 0的PSA水平時(shí)是10. 1 %，具有1. 1到2. 0的PSA水平時(shí)是17. 0 %，具有2. 1 到3.0的PSA水平時(shí)是23. 9%，并且具有3. 1到4. 0的PSA水平時(shí)是沈.9%。即使在診斷有局限性前列腺癌的那些患者中，也存在進(jìn)一步不確定。腫瘤進(jìn)展 的可能性和速度目前無(wú)法預(yù)測(cè)。具有高Gleason級(jí)別的腫瘤比具有低級(jí)別的那些更可能 進(jìn)展。然而，在診斷15年內(nèi)死亡的危險(xiǎn)從患有具有8-10最高得分的腫瘤的那些患者的 60-80%，到患有具有2-4得分的腫瘤的那些患者的4-7%，和患有具有最常見(jiàn)篩選檢測(cè)得 分 6 的腫瘤的那些患者的 18-30% (Albertsen, P. C.等人(1998) JAMA280,975-80) 目前篩選技術(shù)因此使得能夠鑒定腫瘤，但因?yàn)槟壳盁o(wú)法區(qū)分發(fā)展緩慢和威脅生命 的病變，存在相當(dāng)大的過(guò)度治療無(wú)意義疾病的可能性。實(shí)施例5-用于生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的患者樣品的平行篩選為了測(cè)定不同樣品之間的臨床上相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，根據(jù)本發(fā)明使用如圖2 中舉例說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使得在各自的“輕”和“重”同位素標(biāo)記組分之間的質(zhì)譜法(MS)水 平上出現(xiàn)的任何表達(dá)差異都反映來(lái)自健康/對(duì)照供體或在局部或晚期疾病中的良性疾病 與受影響癌癥患者的樣品之間的潛在相關(guān)的區(qū)別特征。借助于采用同量異位素標(biāo)記組分的 串聯(lián)MS/MS獲得的MS信號(hào)的進(jìn)一步分析得到關(guān)于研究組之間在蛋白質(zhì)表達(dá)方面的差異的 更詳細(xì)答案。在解決不同臨床疑問(wèn)的情況下，必須相應(yīng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。例如，如果目的是鑒定用 于前列腺癌分期的標(biāo)記，那么實(shí)驗(yàn)策略設(shè)計(jì)可以是下述-樣品組1良性供體或上皮內(nèi)贅生物(PIN)-樣品組2局部PCa疾病-樣品組3局部晚期的PCa疾病-樣品組4迅速發(fā)展的、激素難治性PCa疾病在使用如本文定義的標(biāo)記試劑單個(gè)標(biāo)記待分析的樣品的蛋白性分子后，使樣品組 合，并且經(jīng)由標(biāo)記中包括的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物，借助于親和純化分離標(biāo)記的蛋 白性分子。分離的標(biāo)記的蛋白性分子通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及1.用于標(biāo)記蛋白性分子的標(biāo)記試劑，其包括(a)同量異位素標(biāo)記組分；
(b)同位素標(biāo)記組分；和(c)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。2.如1中限定的標(biāo)記試劑，其具有這樣的構(gòu)型其中同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記 物排列在同量異位素標(biāo)記組分和反應(yīng)基團(tuán)之間。3.如1中限定的標(biāo)記試劑，其具有這樣的構(gòu)型其中同量異位素標(biāo)記組分排列在 同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和反應(yīng)基團(tuán)之間。4.如1-3中任一項(xiàng)中限定的標(biāo)記試劑，其中親和標(biāo)記物選自(His)6S記物、(His)4 標(biāo)記物、(His) 3標(biāo)記物、(His) 2標(biāo)記物、(Leu) 4標(biāo)記物、(Leu) 3標(biāo)記物、(Leu) 2標(biāo)記物、c_Myc 標(biāo)記物、HA標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物、VSV-G標(biāo)記物、HSV標(biāo)記物、V5標(biāo)記物、生物素及其衍生物、 碳水化合物和聚糖。5.如1-4中任一項(xiàng)中限定的標(biāo)記試劑，其中反應(yīng)基團(tuán)選自氨基反應(yīng)基團(tuán)、巰基反 應(yīng)基團(tuán)和羧基反應(yīng)基團(tuán)。6.由各部分組成的試劑盒，其包括η · m種組合的多種1_5中任一項(xiàng)中限定的標(biāo) 記試劑，其中整數(shù)η > 2，并且代表差異標(biāo)記的同量異位素標(biāo)記組分的數(shù)目，并且其中整數(shù)
并且代表差異標(biāo)記的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物的數(shù)目。7.如6中限定的試劑盒，其中整數(shù)η彡4，并且整數(shù)m彡2。8.用于分析一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種蛋白性分子的方法，其包括(a)提供如5-7中任一項(xiàng)限定的由各部分組成的試劑盒，所述由各部分組成的試 劑盒包括η · m種組合的多種標(biāo)記試劑；(b)通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)樣品各自與η · m種標(biāo)記試劑中的另一種單個(gè)接觸，標(biāo)記一 個(gè)或多個(gè)樣品中包括的至少一個(gè)蛋白性分子亞組；(c)使所述一個(gè)或多個(gè)樣品組合；(d)經(jīng)由標(biāo)記中包括的親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化分離標(biāo)記的至少一個(gè)蛋白性分 子亞組；和(e)分析分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組。9.如8中限定的方法，其用Μ·Ν個(gè)樣品執(zhí)行，其中整數(shù)M代表樣品組的數(shù)目，并且 整數(shù)N代表每個(gè)樣品組的單個(gè)成員的數(shù)目，并且其中N = η且M = m。10.如8或9中限定的方法，其進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(b)前，將蛋白性分子切 割成肽。11.如8-10中任一項(xiàng)中限定的方法，其進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(e)前，將分離的 至少一個(gè)蛋白性分子亞組分級(jí)分離。12.如8-11中任一項(xiàng)中限定的方法，其中分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組的分析 借助于質(zhì)譜法執(zhí)行。13.如8-12中任一項(xiàng)中限定的方法，其進(jìn)一步包括比較一個(gè)或多個(gè)樣品各自在 步驟(e)中獲得的分析結(jié)果。14.如8-13中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述方法以高通量形式執(zhí)行。15.如1-5中任一項(xiàng)中限定的標(biāo)記試劑和/或如6或7中限定的由各部分組成的 試劑盒用于執(zhí)行蛋白質(zhì)表達(dá)概況分析或用于執(zhí)行蛋白質(zhì)組分析的用途。
權(quán)利要求
1.由各部分組成的試劑盒，其包括用于標(biāo)記蛋白性分子的η·πι種組合的多種標(biāo)記試 劑，每種標(biāo)記試劑包括(a)同量異位素標(biāo)記組分；(b)同位素標(biāo)記組分，其同時(shí)是親和標(biāo)記物；和(c)能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；其中所述整數(shù)η > 4，并且代表差異標(biāo)記的同量異位素標(biāo)記組分的數(shù)目；并且其中所述整數(shù)m > 2，并且代表差異標(biāo)記的同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物的數(shù)目。
2.權(quán)利要求1的由各部分組成的試劑盒，其中所述同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物選自 (His)6標(biāo)記物、(His)4S記物、(His)3標(biāo)記物、(His)2S記物、(Leu)4標(biāo)記物、(Leu)3標(biāo)記 物、(Leu) 2標(biāo)記物、c-Myc標(biāo)記物、HA標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物、VSV-G標(biāo)記物、HSV標(biāo)記物、V5標(biāo) 記物、生物素及其衍生物、碳水化合物和聚糖。
3.權(quán)利要求2的由各部分組成的試劑盒，其中所述同位素標(biāo)記/親和標(biāo)記物選自 (His)6標(biāo)記物、(His)4S記物、(His)3標(biāo)記物、(His)2S記物、(Leu)4標(biāo)記物、(Leu)3標(biāo)記 物和(Leu)2S記物。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的由各部分組成的試劑盒，其中所述標(biāo)記試劑具有這樣的構(gòu) 型其中所述同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物排列在所述同量異位素標(biāo)記組分和所述反應(yīng)基 團(tuán)之間。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的由各部分組成的試劑盒，其中所述標(biāo)記試劑具有這樣的構(gòu) 型其中所述同量異位素標(biāo)記組分排列在所述同位素標(biāo)記組分/親和標(biāo)記物和所述反應(yīng)基 團(tuán)之間。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的由各部分組成的試劑盒，其中所述反應(yīng)基團(tuán)選自氨基反應(yīng) 基團(tuán)、巰基反應(yīng)基團(tuán)和羧基反應(yīng)基團(tuán)。
7.用于分析一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種蛋白性分子的方法，其包括(a)提供如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)限定的由各部分組成的試劑盒，所述由各部分組成 的試劑盒包括η · m種組合的多種標(biāo)記試劑；(b)通過(guò)使所述一個(gè)或多個(gè)樣品各自與所述η· m種標(biāo)記試劑中的另一種單個(gè)接觸，標(biāo) 記所述一個(gè)或多個(gè)樣品中包括的至少一個(gè)蛋白性分子亞組；(c)使一個(gè)或多個(gè)樣品組合；(d)經(jīng)由所述標(biāo)記中包括的所述親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化分離所述標(biāo)記的至少一個(gè) 蛋白性分子亞組；和(e)分析所述分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組。
8.權(quán)利要求7的方法，其用M·Ν個(gè)樣品執(zhí)行，其中所述整數(shù)M代表樣品組的數(shù)目，并且 所述整數(shù)N代表每個(gè)樣品組的單個(gè)成員的數(shù)目，并且其中N = η且M = m。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(b)前，將所述蛋白性分子切割 成肽。
10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在執(zhí)行步驟(e)前，將所述分離的 至少一個(gè)蛋白性分子亞組分級(jí)分離。
11.權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的至少一個(gè)蛋白性分子亞組的分析 借助于質(zhì)譜法執(zhí)行。
12.權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括比較所述一個(gè)或多個(gè)樣品各自在 步驟(e)中獲得的分析結(jié)果。
13.權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法以高通量形式執(zhí)行。
14.權(quán)利要求1或6的任一項(xiàng)的由各部分組成的試劑盒用于執(zhí)行蛋白質(zhì)表達(dá)概況分析 或用于執(zhí)行蛋白質(zhì)組分析的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于蛋白性分子的同位素/同量異位素標(biāo)記以及后續(xù)親和選擇和分析的試劑盒和方法。特別地，本發(fā)明涉及包括用于標(biāo)記蛋白性分子的組合的多種標(biāo)記試劑的由各部分組成的試劑盒，每種標(biāo)記試劑包括同量異位素標(biāo)記組分、同位素標(biāo)記組分和能夠與蛋白性分子反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)，其中同位素標(biāo)記組分同時(shí)是親和標(biāo)記物。本發(fā)明還涉及用于分析蛋白性分子的相應(yīng)方法，其包括通過(guò)采用如本文定義的由各部分組成的試劑盒標(biāo)記存在的至少一個(gè)蛋白性分子亞組，和隨后經(jīng)由標(biāo)記中包括的親和標(biāo)記物，通過(guò)親和純化來(lái)分離標(biāo)記的分子。最后，本發(fā)明涉及此類方法用于蛋白質(zhì)表達(dá)概況分析或蛋白質(zhì)組分析的用途。
文檔編號(hào)C07K1/13GK102099685SQ200980111901
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者E·H·C·迪克森, E·P·羅米恩, R·霍夫曼 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司