專利名稱：從馬比木中提取喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥用植物馬比木的深加工領(lǐng)域，尤其涉及一種利用微生物發(fā)酵與 溶劑提取結(jié)合技術(shù)從馬比木中提取高純度喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的喜樹堿(Camptothecin)生產(chǎn)是從中國特有的珙桐科植物喜樹中提取出來 的。然而喜樹堿在喜樹中含量低，根皮中含量為萬分之四，果實(shí)中含量為萬分之七，枝葉中 含量極少，9-甲氧基喜樹堿在喜樹中含量更少，天然提取時(shí)其生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低，且植物 資源有限。因此，尋找替代資源以及對其綜合利用，是解決喜樹堿資源瓶頸的關(guān)鍵。馬比木，學(xué)名:Nothapadytes foetida (Wight) Sleum 茶萊英科 Icacinaceae，小灌 木。原產(chǎn)地臺(tái)灣蘭嶼。在印度有少量分布?，F(xiàn)經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該物種在武陵山區(qū)有大面積生 長。在此之前，國外有文獻(xiàn)(phytochemry，1972，11)介紹印度產(chǎn)一種鐵青樹科(即丁 皮木科OLacaceae)馬比木屬植物Mappa foetida Mlers (譯為臭花馬比木)中含喜樹堿， 其含量比喜樹要高，但在中國尚未發(fā)現(xiàn)此種植物。意大利因迪納有限公司的發(fā)明人E ·鮑姆 巴德利和L ·威羅塔發(fā)明專利“從馬比木分離的喜樹堿骨架化合物及其作為新藥物及治療 劑的合成子的途徑”〔申請?zhí)?7194492. X〕說明了馬比木分離的喜樹堿骨架化合物，但未敘 述喜樹堿的提取工藝。中國發(fā)明專利〔申請?zhí)?91012184〕，發(fā)明人張憲德公開了從假柴龍 樹中提取喜樹堿的新方法。該方法是以假柴龍樹植物為原料，將其粉碎后用常規(guī)方法提取 或萃取，再反復(fù)精制得到喜樹堿；母液經(jīng)回收處理、分離還獲得另一種抗腫瘤藥物有效成分 甲氧基喜樹堿。但該發(fā)明采用的傳統(tǒng)的方法，未說明提取得率，也無具體實(shí)施方案，而且所 述工藝過程簡單，無數(shù)據(jù)說服力，未獲批準(zhǔn)。本發(fā)明以馬比木為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行高純度喜樹堿和9-甲氧基喜 樹堿生產(chǎn)方法的研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，馬比木植物中喜樹堿的含量只有根皮含量較高，其根皮 中喜樹堿的含量是喜樹果的2倍以上，枝莖葉中喜樹堿的含量并不比喜樹果高，而且隨季 節(jié)的變化其含量變化很大；研究還發(fā)現(xiàn)馬比木植物中9-甲氧基喜樹堿含量很是豐富，很有 工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，馬比木中的部分喜樹堿是以苷類形式存在，傳統(tǒng)的喜樹堿提取 工藝會(huì)造成此類物質(zhì)的丟失，通過微生物發(fā)酵技術(shù)，可以使苷類轉(zhuǎn)化成喜樹堿，使喜樹堿的 平均含量達(dá)喜樹果的3. 6倍以上，從而提高喜樹堿的得率，達(dá)到了節(jié)約植物資源，降低成本 的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)從馬比木中提取高純度喜樹堿 和9-甲氧基喜樹堿的方法。本發(fā)明一種從馬比木中提取喜樹堿的方法，其步驟包括(1)預(yù)處理及發(fā)酵步驟將馬比木材料破碎，按原料酶液比為1 廣2(w/w)投入4發(fā)酵罐或發(fā)酵池，在溫度為20 50°C，發(fā)酵1 5天，所述的酶為安琪高糖干酵母或發(fā)利干 酵母，其在水溶液中的量為廣10%。(w/w)；(2)溶劑提取步驟將上述步驟(1)中得到的發(fā)酵混合物投入提取罐，使用冷滲 法、溫浸法或回流法中的一種方法提取1-12小時(shí)，每次溶劑的加入量為初始原料的6 10倍 (w/v)，溶劑提取1 3次，過濾，合并提取液；所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與 水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt% ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含 量占 O-IOOwt % ；(3)濃縮步驟將步驟( 中得到的提取液加入抗氧化劑，濃縮，得濃縮浸膏，所述 的抗氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種或兩種，用量為提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步驟將提取物濃縮液用酸調(diào)PH值至1 6，然后加入廣3倍量有機(jī)溶劑 (ν/ν)，萃取，靜置，收集有機(jī)相，萃余項(xiàng)重復(fù)萃取2 3次，合并有機(jī)相，濃縮，回收溶劑，得 粗提物浸膏，所述的酸為醋酸、甲酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī) 溶劑為乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分離步驟(a)將粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，攪拌均勻，靜置12 M小時(shí)，抽 濾，濾餅為含喜樹堿的粗品；(b)將上述(a)中喜樹堿的粗品加入脂肪醇或脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷 中一種混合物，混合物中脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種溶劑比例為(5-95%， v/v)，攪拌，靜置，抽濾，濾餅為含喜樹堿的粗品；(c)將上述(b)得到的濾餅使用不同pH的水溶液溶解，過濾，結(jié)晶，使用甲醇、丙 酮、乙酸乙酯、氯代甲烷、二甲基甲酰胺中混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶；(d)實(shí)施上述(c)操作步驟2-3次，即可得到高于98%的喜樹堿產(chǎn)品，干燥，粉碎， 裝袋，入庫。本發(fā)明從馬比木中提取喜樹堿的方法，提取步驟所述的溶劑為下述溶劑中的一 種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占30-100wt % ；B.乙醇與水的混合物，混合 物中乙醇的含量占30-100Wt% ；本發(fā)明從馬比木中提取喜樹堿的方法，濃縮步驟所述的抗氧化劑為二氧化硫和硫 酸亞鐵中的一種，用量為提取液的1 5%。(w/v)；本發(fā)明從馬比木中提取喜樹堿的方法，萃取步驟所用的酸為醋酸、硫酸、鹽酸或檸 檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；本發(fā)明從馬比木中提取喜樹堿的方法，分離步驟(e)所述的柱層析填料為大孔樹 脂、活性炭、硅藻土、硅膠、氧化鋁中的一種，洗脫劑可以為脂肪醇與水的混合物其中脂肪醇 在水中的含量為30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn) 行洗脫。本發(fā)明一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其步驟包括(1)預(yù)處理及發(fā)酵步驟將馬比木材料破碎，按原料酶液比為1 廣2(w/w)投入 發(fā)酵罐或發(fā)酵池，在溫度為20 50°C，發(fā)酵1 5天，所述的酶為安琪高糖干酵母或發(fā)利干 酵母，其在水溶液中的量為廣10%。(w/w)；(2)溶劑提取步驟將上述步驟(1)中得到的發(fā)酵混合物投入提取罐，使用冷滲法、溫浸法或回流法中的一種方法提取1-12小時(shí)，每次溶劑的加入量為初始原料的6 10倍 (w/v)，溶劑提取1 3次，過濾，合并提取液；所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與 水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt% ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含 量占 O-IOOwt % ；(3)濃縮步驟向步驟( 中得到的提取液加入抗氧化劑，濃縮，得濃縮浸膏，所述 的抗氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種或兩種，用量為提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步驟將提取物濃縮液用酸調(diào)PH值至1 6，然后加入廣3倍量有機(jī)溶劑 (ν/ν)，萃取，靜置，收集有機(jī)相，萃余項(xiàng)重復(fù)萃取2 3次，合并有機(jī)相，濃縮，回收溶劑，得 粗提物浸膏，所述的酸為醋酸、甲酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī) 溶劑為乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分離步驟(a)將粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，攪拌均勻，靜置12 M小時(shí)，抽 濾，濾餅為含喜樹堿的粗品，濾液回收溶劑后得含9-甲氧基喜樹堿粗品；(b)將上述(a)中喜樹堿的粗品加入脂肪醇或脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷 中一種混合物，混合物中脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種溶劑比例為(5-95%， v/v)，攪拌，靜置，抽濾，濾液回收溶劑得到含9-甲氧基喜樹堿粗品；(c)將步驟(a)、(b)得到的含9-甲氧基喜樹堿粗品進(jìn)行柱層析，使用脂肪醇與水 的混合物洗脫，或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn)行洗脫，分段收 集洗脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，裝袋，入庫；純度小于等于 90%的可重復(fù)柱層析，純度在90% -98%直接脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種 或幾種進(jìn)行重結(jié)晶，直至9-甲氧基喜樹堿純度大于等于98%，晶體干燥、粉碎，裝袋，入庫。本發(fā)明一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于提取步驟所述 的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占30-100wt%， B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt% ；本發(fā)明一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于濃縮步驟所述 的抗氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種，用量為提取液的1 5%。(w/v)；本發(fā)明一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于萃取步驟所用 的酸為醋酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、正丁 醇、二氯甲烷或氯仿；本發(fā)明一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于分離步驟(e) 所述的柱層析填料為大孔樹脂、活性炭、硅藻土、硅膠、氧化鋁中的一種，洗脫劑可以為脂肪 醇與水的混合物其中脂肪醇在水中的含量為30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、 氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn)行洗脫。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵預(yù)處理技術(shù)，使馬比木中喜樹堿苷和9-甲氧基喜樹堿苷 類轉(zhuǎn)化喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿，同時(shí)獲得兩種具有抗癌活性的藥物單體，其有效含量都 可高達(dá)98%以上，而且產(chǎn)品得率也大大提高，充分利用了有限的植物資源，適合于用馬比木 來大規(guī)模生產(chǎn)高純度的喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿產(chǎn)品。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施案例是對本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述，但其不意味著對本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1 將IKg馬比木原料粉碎成粉，均勻噴灑含有發(fā)利干酵母的水溶液^ig (酵母量為 20g)，放入IOL發(fā)酵罐中，保持溫度50°C，時(shí)間72h。然后將發(fā)酵過的原料投入多功能提取 罐，加入甲醇6L，回流提取Ih后放出提取液；再加甲醇6L，重復(fù)提取2次，合并提取液并 加入硫酸亞鐵180g ；減壓濃縮至濃縮液量為SOOmL時(shí)停止?jié)饪s；用稀硫酸調(diào)pH值至6，加 SOOmL氯仿進(jìn)行攪拌，靜置30min萃取，收集氯仿層，水層加氯仿重復(fù)萃取2次，合并萃取液， 減壓回收氯仿得粗提物浸膏，將浸膏投入200mL含量為10%的丙酮水溶液中，攪拌均勻，靜 置12h，過濾，沉淀為喜樹堿粗品a，濾液回收丙酮后得9-甲氧基喜樹堿粗品1(備用)；將 喜樹堿粗品a加入到甲醇氯仿混合液IOOmL中(甲醇氯仿=1 3)，攪拌30min，靜置， 過濾，沉淀為喜樹堿粗品b，濾液回收溶劑后與前述的9-甲氧基喜樹堿粗品1合并備用；將 喜樹堿粗品b溶解于1. 0 %的NaOH溶液中，過濾，濾液加稀硫酸調(diào)pH為4，靜置分層，抽濾， 得喜樹堿粗品c ；喜樹堿粗品c用氯仿結(jié)晶，過濾，得喜樹堿粗品d，喜樹堿粗品d用甲醇、丙 酮、乙酸乙酯(1 2 1)結(jié)晶，得喜樹堿產(chǎn)品；減壓干燥得喜樹堿產(chǎn)品0.83g，HPLC檢測含 量為98. 5%。將上述步驟得到的9-甲氧基喜樹堿粗品1進(jìn)行柱層析，柱填料為氧化鋁，使用甲 醇二氯甲烷(1 lv/v)進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組 分直接濃縮干燥，純度小于等于90%的可重復(fù)柱層析，純度在90% -98%直接用甲醇氯 仿=1 3的混合液進(jìn)行重結(jié)晶，最后得9-甲氧基喜樹堿0J65g，HPLC檢測含量為98%。實(shí)施例2 將500g馬比木原料粉均勻噴灑含有安琪高糖干酵母的水溶液700g(酵母量為 5g)，放入5L燒瓶中，密封，置于恒溫?fù)u床上(40°C )震搖Mh，加入75%乙醇5L繼續(xù)震搖， 1 后放出提取液；再加75%乙醇4L，重復(fù)提取2次，合并提取液并加入硫酸亞鐵30g ；減壓 濃縮至濃縮液量為200mL時(shí)停止?jié)饪s；用鹽酸調(diào)pH值至1，加200mL水飽和的正丁醇進(jìn)行 攪拌，靜置30min萃取，收集正丁醇層，水層加正丁醇重復(fù)萃取2次，合并萃取液，減壓回收 正丁醇得粗提物浸膏，將浸膏投入150mL含量為90%的丙酮水溶液中，攪拌均勻，靜置12h， 過濾，沉淀為喜樹堿粗品a，濾液回收丙酮后得9-甲氧基喜樹堿粗品1 (備用)；將喜樹堿粗 品a加入到甲醇丙酮混合液IOOmL中(甲醇丙酮=5 95)，攪拌30min，靜置，過濾，濾 餅為喜樹堿粗品b，濾液回收溶劑后與前述的9-甲氧基喜樹堿粗品1合并備用；將喜樹堿 粗品b溶于50%乙醇中，滴加1 % NaOH溶液調(diào)pH為11，靜置，過濾，濾液加鹽酸調(diào)pH為3， 靜置，抽濾，得喜樹堿粗品c ；喜樹堿粗品c使用IOOmL 二氯甲烷中結(jié)晶，過濾，得喜樹堿粗 品d，喜樹堿粗品d用甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(3 2 6)重結(jié)晶，得喜樹堿產(chǎn)品；減壓 干燥得喜樹堿產(chǎn)品0. 395g，HPLC檢測含量為98. 0%。將上述步驟得到的9-甲氧基喜樹堿粗品1進(jìn)行柱層析，柱填料為硅膠，使用丙 酮二氯甲烷(1 2v/v)進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組 分直接濃縮干燥，純度小于等于90%的可重復(fù)柱層析，純度在90% -98%直接用丙酮二 氯甲烷(3 7v/v)的混合液進(jìn)行重結(jié)晶，最后得9-甲氧基喜樹堿0. 118g，HPLC檢測含量 為 99. 0%。7
實(shí)施例3 將1. OKg馬比木原料粉均勻噴灑含有安琪高糖干酵母的水溶液2000g(酵母量為 15g)，放入保鮮袋中密封，20°C放置5天，然后裝入滲漉器，加入50 %乙醇IOL進(jìn)行滲漉提 取，提取12h，流速為13mL/min，滲漉液加入二氧化硫30g ；減壓濃縮至濃縮液量為400mL時(shí) 停止?jié)饪s；用醋酸調(diào)PH值至4，加400mL 二氯甲烷進(jìn)行攪拌，靜置30min萃取，收集二氯甲 烷層，水層加二氯甲烷重復(fù)萃取2次，合并萃取液，減壓回收二氯甲烷得粗提物浸膏，將浸 膏投入250mL丙酮中，攪拌均勻，靜置12h，過濾，濾餅為喜樹堿粗品a，濾液回收溶劑后得 9-甲氧基喜樹堿粗品1(備用)；將喜樹堿粗品a加入到乙酸乙酯氯仿混合液200mL中(乙 醇乙酸乙酯=95 5)，攪拌30min，靜置，過濾，濾餅為喜樹堿粗品b，濾液回收溶劑后與 前述的9-甲氧基喜樹堿粗品1合并備用；將喜樹堿粗品b溶于90%甲醇中，滴加NaOH 溶液調(diào)PH為10，過濾，濾液加鹽酸調(diào)pH為2，靜置，過濾，得喜樹堿粗品c ；喜樹堿粗品c使 用IOOmL乙酸乙酯結(jié)晶得喜樹堿粗品d，喜樹堿粗品d使用丙酮重結(jié)晶，得喜樹堿產(chǎn)品；減 壓干燥得喜樹堿產(chǎn)品0. 735g，HPLC檢測含量為98. 3%。將上述步驟得到的9-甲氧基喜樹堿粗品1進(jìn)行柱層析，柱填料為大孔樹脂，使用 乙醇水進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組分直接濃縮干燥，純 度小于等于90%的可重復(fù)柱層析，純度在90%-98%直接用乙酸乙酯氯仿=2 8的混 合液進(jìn)行重結(jié)晶，最后得9-甲氧基喜樹堿0. 282g，HPLC檢測含量為98. 2%。實(shí)施例4 將600Kg馬比木原料粉碎，均勻噴灑含有Ikg安琪高糖干酵母的水溶液lOOOKg， 放入密封完好的發(fā)酵池中，保持溫度30°C，時(shí)間48h。然后將發(fā)酵過的原料投入多功能提取 罐，加入含量為80%的甲醇5T，在50°C時(shí)提取(并攪拌)4h后放出提取液；再加入含量為 80%的甲醇4T，在50°C時(shí)提取(并攪拌)4小時(shí)后放出提取液；再重復(fù)1次，合并提取液；將 提取液泵入三效濃縮器，加入6. 5kg 二氧化硫進(jìn)行減壓濃縮，當(dāng)濃縮液總量為800 1000L 時(shí)轉(zhuǎn)入到單效濃縮器繼續(xù)濃縮至濃縮液量為200L左右時(shí)停止?jié)饪s；將上述濃縮液投入到 1000L萃取罐中，用鹽酸調(diào)pH值為2 3，加500L氯仿進(jìn)行攪拌，靜置30min萃取，收集氯 仿項(xiàng)，萃余項(xiàng)加氯仿重復(fù)萃取2次，合并萃取液，減壓回收氯仿得粗提物浸膏。向上述粗提 物浸膏加入35L含量為80 %的丙酮水溶液，攪拌均勻，靜置Mh，過濾，濾餅為喜樹堿粗品a， 濾液回收丙酮后得9-甲氧基喜樹堿粗品1 (備用)；向上述喜樹堿粗品a加入甲醇氯仿 (4 lv/v)混合液55L，攪拌均勻，靜置，抽濾，濾餅為喜樹堿粗品b，濾液回收溶劑后與前述 的9-甲氧基喜樹堿粗品1合并備用；將喜樹堿粗品b溶解于1. 5%的NaOH溶液中，過濾，濾 液加酸調(diào)PH為4，靜置分層，抽濾，得喜樹堿粗品c ；喜樹堿粗品c使用200L氯仿結(jié)晶得喜 樹堿粗品d，喜樹堿粗品d丙酮、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺進(jìn)行2次結(jié)晶，得喜樹堿產(chǎn)品412g HPLC檢測含量為98. 2%。將上述步驟得到的9-甲氧基喜樹堿粗品1進(jìn)行柱層析，柱填料為大孔樹脂，使用 甲醇、水、丙酮(1 2 1)進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組 分直接濃縮干燥，粉碎，裝袋，入庫；純度小于等于90%的可重復(fù)柱層析，純度在90% -98% 直接用甲醇氯仿(1 3v/v)的混合液進(jìn)行重結(jié)晶，直至9-甲氧基喜樹堿純度大于等于 98%，最后得純度大于等于98%的9-甲氧基喜樹堿132克晶體干燥、粉碎，裝袋，入庫。上述所得的喜樹堿、9-甲氧基喜樹堿，同時(shí)得到純度大于98% (高壓液相色譜儀8檢測)的兩種產(chǎn)品，產(chǎn)率收率高，成本低，充分利用資源，很適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種從馬比木中提取喜樹堿的方法，其步驟包括(1)預(yù)處理及發(fā)酵步驟將馬比木材料破碎，按原料酶液比為1廣2(w/w)投入發(fā)酵 罐或發(fā)酵池，在溫度為20 50°C，發(fā)酵1 5天，所述的酶為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵 母，其在水溶液中的量為廣10%。(w/w)；(2)溶劑提取步驟將上述步驟(1)中得到的發(fā)酵混合物投入提取罐，使用冷滲法、溫 浸法或回流法中的一種方法提取1-12小時(shí)，每次溶劑的加入量為初始原料的6 10倍(w/ ν)，溶劑提取1 3次，過濾，合并提取液；所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的 混合物，混合物中甲醇的含量占O-IOOwt % ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占 O-IOOwt % ；(3)濃縮步驟將步驟( 中得到的提取液加入抗氧化劑，濃縮，得濃縮浸膏，所述的抗 氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種或兩種，用量為提取液的0. 5 10%。(w/v)(4)萃取步驟將提取物濃縮液用酸調(diào)pH值至1 6，然后加入廣3倍量有機(jī)溶劑(ν/ ν)，萃取，靜置，收集有機(jī)相，萃余項(xiàng)重復(fù)萃取2 3次，合并有機(jī)相，濃縮，回收溶劑，得粗提 物浸膏，所述的酸為醋酸、甲酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑 為乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分離步驟(a)將粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，攪拌均勻，靜置12 M小時(shí)，抽濾，濾 餅為含喜樹堿的粗品；(b)將上述(a)中喜樹堿的粗品加入脂肪醇或脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中 一種混合物，混合物中脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種溶劑比例為(5-95%，ν/ ν)，攪拌，靜置，抽濾，濾餅為含喜樹堿的粗品；(c)將上述(b)得到的濾餅使用不同pH的水溶液溶解，過濾，結(jié)晶，使用甲醇、丙酮、乙 酸乙酯、氯代甲烷、二甲基甲酰胺中混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶；(d)實(shí)施上述(c)操作步驟2-3次，即可得到高于98%的喜樹堿產(chǎn)品，干燥，粉碎，裝 袋，入庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從馬比木中提取喜樹堿的方法，其特征在于提取 步驟所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占 30-100wt% ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物發(fā)酵與溶劑提取結(jié)合技術(shù)從馬比木中提取 分離高純度喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于濃縮步驟所述的抗氧化劑為二 氧化硫和硫酸亞鐵中的一種，用量為提取液的1 5%。(w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從馬比木中提取喜樹堿的方法，其特征在于萃取步驟 所用的酸為醋酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、 正丁醇、二氯甲烷或氯仿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從馬比木中提取喜樹堿的方法，其特征在于分離步驟 (e)所述的柱層析填料為大孔樹脂、活性炭、硅藻土、硅膠、氧化鋁中的一種，洗脫劑可以為 脂肪醇與水的混合物其中脂肪醇在水中的含量為30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙 酯、氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn)行洗脫。
6.一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其步驟包括(1)預(yù)處理及發(fā)酵步驟將馬比木材料破碎，按原料酶液比為1廣2(w/w)投入發(fā)酵 罐或發(fā)酵池，在溫度為20 50°C，發(fā)酵1 5天，所述的酶為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵 母，其在水溶液中的量為廣10%。(w/w)；(2)溶劑提取步驟將上述步驟(1)中得到的發(fā)酵混合物投入提取罐，使用冷滲法、溫 浸法或回流法中的一種方法提取1-12小時(shí)，每次溶劑的加入量為初始原料的6 10倍(w/ ν)，溶劑提取1 3次，過濾，合并提取液；所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的 混合物，混合物中甲醇的含量占O-IOOwt % ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占 O-IOOwt % ；(3)濃縮步驟向步驟( 中得到的提取液加入抗氧化劑，濃縮，得濃縮浸膏，所述的抗 氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種或兩種，用量為提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步驟將提取物濃縮液用酸調(diào)pH值至1 6，然后加入廣3倍量有機(jī)溶劑(ν/ ν)，萃取，靜置，收集有機(jī)相，萃余項(xiàng)重復(fù)萃取2 3次，合并有機(jī)相，濃縮，回收溶劑，得粗提 物浸膏，所述的酸為醋酸、甲酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑 為乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分離步驟(a)將粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，攪拌均勻，靜置12 M小時(shí)，抽濾，濾 餅為含喜樹堿的粗品，濾液回收溶劑后得含9-甲氧基喜樹堿粗品；(b)將上述(a)中喜樹堿的粗品加入脂肪醇或脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中一 種混合物，混合物中脂肪醇與丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種溶劑比例為(5-95%，ν/ ν)，攪拌，靜置，抽濾，濾液回收溶劑得到含9-甲氧基喜樹堿粗品；(c)將步驟(a)、(b)得到的含9-甲氧基喜樹堿粗品進(jìn)行柱層析，使用脂肪醇與水的混 合物洗脫，或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn)行洗脫，分段收集洗 脫液，HPLC檢測，純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，裝袋，入庫；純度小于等于90% 的可重復(fù)柱層析，純度在90% -98%直接脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種或幾 種進(jìn)行重結(jié)晶，直至9-甲氧基喜樹堿純度大于等于98%，晶體干燥、粉碎，裝袋，入庫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于 提取步驟所述的溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占 30-100wt% ；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于 濃縮步驟所述的抗氧化劑為二氧化硫和硫酸亞鐵中的一種，用量為提取液的1 5%。(w/ν) 。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于 萃取步驟所用的酸為醋酸、硫酸、鹽酸或檸檬酸中的一種或幾種；萃取所用的有機(jī)溶劑為乙 酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從馬比木中提取9-甲氧基喜樹堿的方法，其特征在于 分離步驟(e)所述的柱層析填料為大孔樹脂、活性炭、硅藻土、硅膠、氧化鋁中的一種，洗脫 劑可以為脂肪醇與水的混合物其中脂肪醇在水中的含量為30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙 酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一種或幾種進(jìn)行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥用植物馬比木的深加工領(lǐng)域，尤其涉及一種利用微生物發(fā)酵與溶劑提取結(jié)合技術(shù)從馬比木中提取高純度喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿的方法。本發(fā)明利用溶劑提取及微生物分解法提取馬比木中天然的喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿，再利用提取萃取、柱層析、結(jié)晶等分離技術(shù)獲得高純度喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿。本發(fā)明充分利用馬比木資源，分離步驟簡捷，產(chǎn)品純度高，收率高，同步提取兩種產(chǎn)品，大大降低生產(chǎn)成本，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D491/22GK102051393SQ20091027268
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者余龍江, 廖娜, 彭煒, 敖明章, 王晶, 甘國偉, 石永進(jìn) 申請人:華中科技大學(xué), 恩施市錦華生物工程有限責(zé)任公司