專利名稱：：一種三聚氰胺快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于膠體金檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種三聚氰胺快速檢測試劑盒及其方法。
背景技術(shù)：
：三聚氰胺(化學(xué)式C3H6N6)，俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為"l，3，5-三嗪-2,4,6-三氨基"，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水(3.1g/L常溫)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺遇強酸或強堿水溶液水解，氨基逐步被羥基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，進一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。三聚氰胺本身為低毒性，一般成年人身體會排出大部分的三聚氰胺，不過如果與三聚氰酸并用，會形成無法溶解的氰尿酸三聚氰胺，造成嚴(yán)重的腎結(jié)石。三聚氰胺對老鼠的半數(shù)致死量為每公斤3248毫克。對于兔子半數(shù)致死量則超過每公斤1000毫克。一項毒物學(xué)研究也證實回收的受污染寵物飼料中，三聚氰酸與三聚氰胺并用，是造成貓嚴(yán)重腎衰竭的主因。長期攝取三聚氰胺可能造成生殖能力損害、膀胱或腎結(jié)石、膀胱癌等。1983年的美國針對三聚氰胺進行動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)用三聚氰胺高劑量(4500ppmor263mg/kgbw/day)和持續(xù)(兩年)地喂食雄鼠會造成其膀胱結(jié)石，并增加其膀胱、尿道出現(xiàn)惡性腫瘤的風(fēng)險。常用的三聚氰胺檢測技術(shù)主要有三種1)液一質(zhì)聯(lián)用和氣一質(zhì)聯(lián)用確證檢測方法，該法對牛奶樣品的平均處理一檢測時間約為2小時，費用約1000元/樣，需要價值數(shù)百萬元的液一質(zhì)聯(lián)用儀和氣一質(zhì)聯(lián)用儀，以及樣品純化設(shè)備，且該法不適合于多個樣品的檢測；2)HPLC篩選檢測方法，該法對牛奶樣品的平均—檢測處理時間約為1小時，費用約400元/樣，需要高效液相色譜儀和樣品純化設(shè)備，該法同樣不適合于多個樣品的檢測；3)ELISA初篩方法。主要針對奶粉和牛奶的初篩，檢測時間34小時，費用大于100元/樣，需要酶標(biāo)儀和洗板機等儀器設(shè)備，不適合現(xiàn)場快速檢測。目前市面上對三聚氰胺的檢測方法均需要昂貴的儀器設(shè)備、大量的耗時、極高的成本，且需要專業(yè)人員操作，不簡便，通常只有在專業(yè)檢測機構(gòu)或?qū)嶒炇也拍苓M行。針對目前市場上屢屢爆發(fā)三聚氰胺食品中毒事件的現(xiàn)狀，急需一種能讓普通百姓和商家現(xiàn)場進行對食品快速檢測的一種簡便快捷、價廉且能現(xiàn)場進行的檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容.本發(fā)明的目的在于提供一種三聚氰胺快速檢測試劑盒，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用如下技術(shù)方案一種三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是包括(a)三聚氰胺快速檢測試紙條，所述的試紙條包括底板，依次布置于底板的樣品墊、膠體金墊、轉(zhuǎn)移膜和吸水紙，所述的膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性^C體，所述的轉(zhuǎn)移膜依次布置有檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)布置有三聚氰胺或三聚氰胺衍生物抗原，控制區(qū)布置有抗抗體(即二抗)；(b)膠體金溶液；'(C)抗原稀釋液；(d)抗抗體工作液；(e)三聚氰胺樣品溶解液。優(yōu)選的方案是所述的三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺或三聚氰胺衍生物多克隆抗體或單克隆抗體，該多克隆抗體或單克隆抗體的免疫原為三聚氰胺或三聚氰胺衍生物與帶有羧基基團載體蛋白的偶聯(lián)物通過碳化二亞胺(EDC)法偶聯(lián)得到；該多克隆抗體或者單克隆抗體為為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。.更為優(yōu)選的方案是所述的三聚氰胺為改性三聚氰胺，其分子式為改性的三聚氰胺對基團進行修飾(如分子式所示)，這樣改變了三聚氰胺不溶于水的特性，大大有利于后續(xù)與載體偶聯(lián)。通過三聚氰胺修飾基團上的-NH2與載體蛋白的羧基基團通過EDC偶聯(lián)合成免疫原，并免疫小鼠獲得抗體。'更為優(yōu)選的方案是所述的底板為PVC基材底板，所述的轉(zhuǎn)移膜為NC(Nitrocellulose)膜或PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜，所述的抗抗體為抗鼠或抗兔抗抗體。更為優(yōu)選的方案是所述的抗抗體為羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG抗抗體。更為優(yōu)選的方案是..所述的包被抗原為三聚氰胺、三聚氰胺衍生物、三聚氰胺或三聚氰胺衍生物與卵清蛋白、牛血清白蛋白或其它蛋白的偶聯(lián)物。更為優(yōu)選的方案是所述的三聚氰胺檢測試紙條的工作原理為競爭免疫層析分析方法。更為優(yōu)選的方案是所述的三聚氰胺樣品溶解液中含有甲醇、NaCl、KCl、KH2P04、Na2HP04等溶液。更為優(yōu)選的方案是所述檢測區(qū)的檢測線(T線)包被抗原為乙二胺三聚氰胺與牛血清白蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)得到的。本發(fā)明的另一目的在于提供一種三聚氰胺快速檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明才有如下技術(shù)方案一種三聚氰胺快速檢測方法，包括以下步驟步驟l)樣品前處理；步驟2)用前一發(fā)明目的任一方案所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒進行檢步驟3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明所述三聚氰胺檢測試劑盒及其方法，通過快速檢測試紙條檢測三聚氰胺，克服了原有技術(shù)的成本高、耗時長、操作繁瑣等幾大主要缺點，為廣大商家和老百姓提供了一種簡便快捷，價格低廉，易于操作的三聚氰胺檢測方法，適用于家庭、商場等現(xiàn)場檢測。通過讓三聚氰胺檢測從實驗室走向家庭、商場等，提出了家庭食品把關(guān)的新概念，滿足了廣大老百姓和商家的非常急切的需求。本發(fā)明所述ii劑盒主要以工作液形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點，可以廣泛用于各種食品中三聚氰胺的檢測。圖1為本發(fā)明快速檢測試紙條示意圖2為本發(fā)明快速檢測原理示意圖3為本發(fā)明檢測試劑盒制造工藝示意圖。圖中1為PVC底板，2為樣品墊，3為膠體金墊，4為NC轉(zhuǎn)移膜，5為吸水紙，6為待檢測樣品；T線為檢測線，C線為控制線；Yl為膠體金標(biāo)記的抗體，Y2為與大分子蛋白偶聯(lián)的抗原，Y3為二抗(鼠抗)。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明如圖1、圖2所示，本發(fā)明所述快速檢測試紙條包括PVC底板1，依次布置于底板上的樣品墊2、膠體金墊3、NC轉(zhuǎn)移膜4和吸水紙5，膠體金墊3包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體，轉(zhuǎn)移膜4依次布置有檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)布置有三聚'氰胺或三聚氰胺衍生物抗原，控制區(qū)布置有抗抗體。PVC底板l主要起到支持作用；樣品墊2、膠體金墊3、NC膜4和吸水紙5全都粘附在PVC底板1上。樣品墊2則是用于滴加樣品，膠體金墊3則是金標(biāo)記物的支撐物，我們事先把膠體金標(biāo)記的多克隆抗體或單克隆抗體噴在此處。在NC膜上有兩個反應(yīng)區(qū)，一個是T線區(qū)41，一個是C線區(qū)42，我們稱T線為檢測線，事先在T線處包被一定量的抗原并固定于該處，該處固定的抗原會與膠體金上的抗體反應(yīng)；而C線為控制線，則包被了羊抗鼠的二抗，并固定在C線區(qū)，它也會膠體金標(biāo)記上的三聚氰胺抗體發(fā)生反應(yīng)。第五部分則是吸水紙墊5，它的作用起到吸水的作用，，從而使得水份從樣品墊處往吸水墊處流動，同時也就帶動了溶于水中的一些成份也從樣品墊處往吸水墊處流動。PVC底板1下的箭頭為層析方向，如果待測樣品6中含有過量的抗原，便會與膠體金上的抗體(一抗，Yl).反生反應(yīng)，這樣就會占據(jù)了部分或全部膠體金標(biāo)記的抗體上與T線包被的抗原相結(jié)合的位點，從而使膠體金標(biāo)上的抗體減少或不能與T線處的抗原(Y2)結(jié)合，使得該處條帶顯色減弱或者消失；如果沒有過量抗原，抗體反應(yīng)時沒有完全被抗原結(jié)合，沒有被結(jié)合的膠體金標(biāo)記的抗體通過T線時便與T線上的抗原結(jié)合，從而被固定在T線上。這時，由于膠體金的作用，我們便會在T線處看到明顯的紅色條帶。當(dāng)樣品流經(jīng)二抗(Y3)時，二抗會與膠體金上的一抗(此時相當(dāng)于抗原)發(fā)生反應(yīng)，從而形成一條紅色的條帶；這里的二抗條帶是起系統(tǒng)的控制驗證作用，它顯色表明本次檢測正常，結(jié)果可信。實施例1抗原及抗體的制備免疫原的制備加入45mgBSA蛋白(預(yù)先溶于5.5mlH20)和15mg乙二胺三聚氰胺溶于1.5ml0.1MMES，0.15MNaClPH4.7的Buffer中，然后加入llmgEDC室溫攪拌反應(yīng)一個半小時。再加入llmgEDC，繼續(xù)反應(yīng)3.5h。最后反應(yīng)物對PBS緩沖液透析兩天。透析后的產(chǎn)物即為制備好的三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物。放于-20。C的低溫冰箱內(nèi)，備用'。單克隆抗體的制斧將上述制備好的三聚氰胺跟牛血清白蛋白的偶聯(lián)物稀釋成2mg/mL，與福氏佐劑按照1:1(v/v)的比例乳化，每只小鼠皮下注射100uL，第一次用福氏完全佐劑，以后用福氏不完全佐劑。每隔三周加強免疫一次，共免疫五次。取滴度高、競爭力好的鼠，融合前三天尾靜脈注射50ug免疫原，取脾跟骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過融合、ELISA篩選、有限稀釋法克隆，得到了八株單克隆細胞株。取10只母Balb/c鼠，每只注射降值烷0.5mL，一到兩周后注射單克隆細胞0.5mL，含2xl()S個細胞，一周后適當(dāng)時候處死小鼠，抽取腹水，離心去脂后一2(TC凍存。抗體用SPA—Sepharose純化，按說明書進行。包被抗原的制備加入30mg卵清蛋白(預(yù)先溶于5.5mlH20)和15mg乙二胺三聚氰胺溶于1.5ml0.1MMES，0.15MNaClPH4.7的Buffer中，然后加入llmgEDC室溫攪拌反應(yīng)一個半小時。再加入llmgEDC，繼續(xù)反應(yīng)3.5h。最后反應(yīng)物對PBS緩沖液透析兩天。透析后的產(chǎn)物即為制備好的三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物?？箍贵w的制備以鼠源抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠二抗。實施例2試劑盒的制備如圖3所示,'三聚氰胺膠體金試紙主要組分的生產(chǎn)，包括膠體金標(biāo)記抗體的制備、各種工作溶液的配制、噴C線、T線，包被、檢測、分裝，穩(wěn)定性測試及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來完成，最后得到質(zhì)量合格的成品。膠體金溶液制備工藝要點在100ml去離子水中加入1%檸檬酸三鈉lml，煮沸后迅速加入1%氯金酸lml，繼續(xù)煮沸10min，冷卻后，4"C下保存?zhèn)溆?，取已制備好的膠體金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入抗氯霉素MAM.5mg，攪拌20min，再逐滴加入2ml25mg/ml聚乙二醇20000(PEG20000)，攪拌15min。20000r/min離心15min，棄上清液，加入10mlpH7.4PBS緩沖液(含0.4mg/mlPEG),清洗2次。將沉淀用5ml含2%BSA的PBS緩沖液(pH7.4)溶解，用0.22um無菌過濾器過濾后，4"C保存?zhèn)溆谩Ｄz體金結(jié)合墊的制備工藝要點將一定量的膠體金抗體溶液，用點膜機固定在NC膜上。在37°C烘箱干燥8h。C、T線的制備工藝要點將抗原稀釋到lOOug/ml,將第二抗體(羊抗鼠抗體)稀釋到50ug/ml。干燥工序工藝要點用'點膜機把適當(dāng)濃度的抗原及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測線T和控制線C。37"C烘箱干燥8h。組裝'試紙條組成為一個PVC背板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用帶MARK膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、體金結(jié)合墊及吸水墊上。用切割機將貼好的板切割成3mm寬，放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。實施例3工作液的配制三聚氰胺膠體金試紙生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括膠體金溶液、抗原稀釋液、第二抗體工作液。配制方法<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第二抗體工作液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例4樣品的前處理溶液的配制三聚氰氨樣品溶解液1XPBS+6%甲醇1XPBS配方'8gNaCl,0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa風(fēng)，加入60ml甲醇，定容至IL。樣品的前處理1.液態(tài)奶用附在包裝試紙條的包裝中的滴管直接從牛奶中取適量牛奶，點樣即可。2.奶粉取5g奶粉加入已裝有15ml三聚氰胺樣品溶解液的試管中，搖勻，取樣后點樣。三聚氰胺膠體金試紙條的使用方法1.使用前將該試紙條和待測樣本恢復(fù)至室溫10分鐘左右；2.從原包裝中取出試劑，打開后平放在桌面上，請在1小時內(nèi)盡快使用；3.用滴管吸取上述制備好的樣品，緩慢滴加3滴于加樣孔中，加樣后開始計時；4.結(jié)果應(yīng)該在10分鐘左右讀取，超過20分鐘判讀無效。結(jié)果判斷陰性位置C顯示出紅色線條，位置T同時顯示出紅色線條，且T線條顏色接近C線或者深于C線時，判為陰性。陽性位置C顯示出紅色線條，而位置T不顯色；或者位置C顯色出紅色線條，位置T顯示線條的顏色較為模糊，判為陽性。無效位置C不顯示出紅色線條，則無論位置T顯示紅色線條與否，該檢測結(jié)果判為無效。.以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1、一種三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是包括(a)三聚氰胺快速檢測試紙條，所述的試紙條包括底板，依次布置于底板的樣品墊、膠體金墊、轉(zhuǎn)移膜和吸水紙，所述的膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體，所述的轉(zhuǎn)移膜依次布置有檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)布置有三聚氰胺或三聚氰胺衍生物抗原，控制區(qū)布置有抗抗體；(b)膠體金溶液；(c)抗原稀釋液；(d)抗抗體工作液；(e)三聚氰胺樣品溶解液。2、如權(quán)利要求1所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺或三聚氰胺衍生物的多克隆抗體或單克隆抗體，該多克隆抗體或單克隆抗體的免疫原為三聚氰胺或三聚氰胺衍生物與帶有羧基基團載體蛋白的偶聯(lián)物通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到；該多克隆抗體或者單克隆抗體為鼠源、馬源、'羊源、兔源或豚鼠源抗體。3、如權(quán)利要求2所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的三聚氰胺為改性三聚氰胺，其分子式為4、如權(quán)利要求3所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的底板為PVC基材底板，所述的轉(zhuǎn)移膜為NC膜或PVDF膜，所述的抗抗體為抗鼠或抗兔抗抗體。5、如權(quán)利要求4所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的抗抗體為羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG抗抗體。6、如權(quán)利要求5所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的包被抗原為三聚氰胺、三聚氰胺衍生物、三聚氰胺或三聚氰胺衍生物與卵清蛋白、牛血清白蛋白或其它蛋白的偶聯(lián)物。7、如權(quán)利要求6所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的三聚氰胺檢測試紙條為競爭免疫層析分析方法檢測。8、如權(quán)利要求7所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的三聚氰胺樣品溶解液中含有甲醇、NaCl、KC1、KH2P04、Na2HP04。9、如權(quán)利要求8所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特征是所述的撿測區(qū)的檢測線包被抗原為乙二胺三聚氰胺與牛血清白蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)得到的。10、一種三聚氰胺快速檢測方法，包括以下步驟-步驟l)樣品前處理；步驟2)用權(quán)利要求l-9任一所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒進行檢測；全文摘要本發(fā)明公開了一種三聚氰胺快速檢測試劑盒，屬于膠體金檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
；包括(a)三聚氰胺快速檢測試紙條，所述的試紙條包括底板，依次布置于底板的樣品墊、膠體金墊、轉(zhuǎn)移膜和吸水紙，所述的膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體，所述的轉(zhuǎn)移膜依次布置有檢測區(qū)和控制區(qū)；(b)膠體金溶液；(c)抗原稀釋液；(d)抗抗體工作液；(e)三聚氰胺樣品溶解液。本發(fā)明還公開了一種三聚氰胺快速檢測方法，包括樣品前處理、用三聚氰胺快速檢測試劑盒進行檢測、分析檢測結(jié)果幾個步驟。本發(fā)明所述試劑盒及其方法通過試紙條進行檢測，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點，可以廣泛用于各種食品中三聚氰胺的檢測。文檔編號C07D251/00GK101566627SQ20091010754公開日2009年10月28日申請日期2009年5月27日優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日發(fā)明者吳新宇,湯凌霄申請人:湯凌霄;吳新宇