專(zhuān)利名稱(chēng)：一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化蛋白質(zhì)的方法，具體地是涉及一種使用鹽析和透析法分 離純化貽貝粘蛋白的方法。
背景技術(shù)：
貽貝粘蛋白(Mussel adhesive protein, MAP)，也叫紫貽貝足絲蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)來(lái)自海洋貝類(lèi)紫貽貝，M;^7^e^to，它有在近海耐受波浪影響的 能力，它在特殊腺體內(nèi)生成和儲(chǔ)存一種蛋白膠，通過(guò)足絲釋放到巖石一類(lèi)的固體表面 上，形成抗水的結(jié)合，從而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，蛋白膠形成了斑，從 斑延伸開(kāi)，有很強(qiáng)的抗張強(qiáng)度(106-10、ewtoirmetef2)，而斑內(nèi)物質(zhì)包含了貽貝粘蛋 白MAP。
貽貝粘蛋白含有L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶對(duì)酪氮酸殘基 的作用形成。L-DOPA殘基由于氧化反應(yīng)而相互交聯(lián)，交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致了貽貝和特殊表 面纖維內(nèi)強(qiáng)而持久的膠接，其生物粘附的機(jī)理很有趣。貽貝粘蛋白粘附對(duì)人沒(méi)有毒性 和免疫原性，結(jié)合能力和壽命不受水的影響，作為醫(yī)用手術(shù)尤其是眼科手術(shù)膠己經(jīng)引 起注意。
全世界每年進(jìn)行1100萬(wàn)例白內(nèi)障手術(shù)，我國(guó)白內(nèi)障的發(fā)病率非常高，50歲以上 人群中白內(nèi)障發(fā)病率29.64%， 70歲以上人群發(fā)病率高達(dá)60%。隨著社會(huì)老齡化的加 劇，這一數(shù)字還會(huì)i:升。目前醫(yī)生可以用兩種閉和方式結(jié)束眼科手術(shù)讓傷口自行愈 合或是用尼龍線(xiàn)縫合切口，每種閉合方法都各有缺點(diǎn)自愈有感染和眼內(nèi)液體泄露的 危險(xiǎn)；縫合會(huì)有感染發(fā)炎及血管發(fā)育異常的危險(xiǎn)。而貽貝粘蛋白貽貝粘蛋白能在低濃 度下交聯(lián)，并形成可注射到不規(guī)則形狀部位的低粘性液體，這種溶液可凝固而填充到 指定空間，在幾分鐘內(nèi)可封閉切口，少于縫合所需時(shí)間。貽貝粘蛋白還形成了一個(gè)不 可破壞的封條，在大于正常人眼壓12倍的壓力下不會(huì)使眼內(nèi)液體發(fā)生泄露。貽貝粘蛋 白具有和眼角膜近似的折射率，不會(huì)干擾光線(xiàn)到達(dá)視網(wǎng)膜。另外，貽貝粘蛋白的生物降解性質(zhì)使其對(duì)環(huán)境很友好，也可用于其他領(lǐng)域，如通 用的生化粘接試劑、醫(yī)用組織粘接及密封劑，醫(yī)用愈傷基質(zhì)，牙醫(yī)粘接和密封劑，醫(yī) 用設(shè)備表面涂層試劑，水下作業(yè)設(shè)備涂層等。
鹽析和透析是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，以非色譜的方法進(jìn)行純化，設(shè)備成本 低、實(shí)驗(yàn)材料成本低、耗時(shí)少、獲得的目標(biāo)產(chǎn)品濃度高勿需濃縮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服色譜方法純化貽貝粘蛋白設(shè)備和材料成本高的問(wèn)題，采用 鹽析和透析的方法，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的使用鹽析和透析為核心的分離純化貽貝粘蛋白的方法，包括如下步
驟
1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻 懸浮于提取溶劑中；
2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 pm濾膜過(guò)濾去除殘?jiān)?，保留?br> 清；
3) 用1-6倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C F鹽析1-6 h;
4) 4°C， 10000-15000 rpm下離心3-10 min，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶解;
5) 4。C， 10000-15000 rpm離心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶
解；
6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4 。C保存；
7) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)標(biāo)記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基
乙酸溶液(pH10)， 10-25 。C染色1-3 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；
9) 用C8反相鍵合相硅膠色譜柱或Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以 乙腈-水為流動(dòng)相等度洗脫，280 nm檢測(cè)。本發(fā)明提供的使用以鹽析和透析為核心的分離純化貽貝粘蛋白的方法，提供了一 種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、以高氯酸提取、鹽析和透析分離貽貝粘蛋白
1) 以0.5%高氯酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300 ml提取溶劑，25°C浸提10 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻懸浮于提取溶劑中；
2) 以10000 r/min離心30 min去除殘?jiān)?，保留上清?br> 3) 用2倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C下鹽析1-6 h;
4) 4'C， 10000rpm下離心3min，收集沉淀，用2%的乙酸溶解；
5) 4°C，10000 rpm離心3 min去除其中不溶成分用2%的乙酸再次溶解；
6) 用2。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 5 h， 4。C保存；
7) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用15%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，25。C染色2h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo) 記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白采用15%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色-,
9) 用C8反相鍵合相硅膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度C8色譜柱4.6x250 mm， 5pm， 300A，以乙腈-水(10-90)為流動(dòng)相等度洗脫，280nm檢測(cè)。
實(shí)施例2、以乙酸提取、鹽析和透析分離貽貝粘蛋白
1) 以10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加1000 ml提取溶劑，25°C浸提，20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻懸浮于提取溶劑中；
2) 以45pm濾膜過(guò)濾去除殘?jiān)?，保留上清?br> 3) 用3倍體積的10 M的氯化鈉在25 。C下鹽析6 h;
4) 4'C， 15000rpm下離心3 min，收集沉淀，用3%的乙酸溶解；
5) 4'C， 15000 rpm離心3 min去除其中不溶成分用3%的乙酸再次溶解；
6) 用3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 10 h， 4。C保存；7) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用12%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),硝酸銀染色，25。C染色2h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo) 記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白采用12%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；
9) Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以乙腈-水(15-85)為流動(dòng)相等度洗 脫，280nm檢測(cè)。
權(quán)利要求
1、一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。
2、 如權(quán)利要求1所述的使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法，包括如下的 步驟1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min,使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻 懸浮于提取溶劑中；2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 pm濾膜過(guò)濾去除殘?jiān)Ａ羯锨澹?) 用1-6倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C下鹽析1-6 h;4) 4°C， 10000-15000 rpm下離心3-10 min，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶解；5) 4°C， 10000-15000 rpm離心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶解；6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4。C保存-，7) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)標(biāo)記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130 kD;8) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液(pH10)， 10-25。C染色l-3h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；9) 用C8反相鍵合相硅膠色譜柱或Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以 乙腈-水為流動(dòng)相等度洗脫，280 nm檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法。鹽析和透析是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，以非色譜的方法進(jìn)行純化，克服色譜方法純化貽貝粘蛋白設(shè)備和材料成本高的問(wèn)題，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。采用強(qiáng)酸提取，以鹽析和透析進(jìn)行純化，采用乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)四氮唑藍(lán)特異性顯色鑒別貽貝粘蛋白，以反相色譜定量純度。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101585874SQ20091008756
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者孟桂鳳, 邢思亮 申請(qǐng)人:北京康銘優(yōu)盛生化技術(shù)有限公司