專利名稱:用“高聚物、鹽、水”兩相系統(tǒng)純化酶制劑的制作方法
本發(fā)明屬酶制劑的提純方法。
隨著酶制劑發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展，發(fā)酵產(chǎn)品的分離純化技術(shù)日顯迫切需要，將發(fā)酵所得酶制劑應(yīng)用于食品加工業(yè)之前，必須先將粗酶制品中所含的不符合衛(wèi)生要求、有使人不愉快氣味和色澤的種種雜質(zhì)除去，方可應(yīng)用。1977年前后，西德學(xué)者M(jìn).-R.Kula等人將水兩相系統(tǒng)應(yīng)用于酶制劑工業(yè)生產(chǎn)過程。他們采用葡聚糖、聚乙二醇、水所構(gòu)成的兩相系統(tǒng)，分離純化了克雷伯氏肺炎菌(Klebsie-lla pneumoniae)產(chǎn)生的異淀粉酶(普魯蘭酶)和1，4葡聚糖磷酸化酶，以及由大腸桿菌產(chǎn)生的三種氨基酰tRNA合成酶，并獲得專利權(quán)〔西德專利DE2616584(1977)〕，采用葡聚糖、聚乙二醇、水兩相系統(tǒng)，雖可對細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子或顆粒進(jìn)行分離純化，但由于葡聚糖的價(jià)格十分昂貴，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)上使用。
本發(fā)明的任務(wù)是給酶制劑大規(guī)模生產(chǎn)過程提供一種成本低廉、操作簡單、效率高而且安全的分離純化技術(shù)，使經(jīng)過純化的產(chǎn)品可供食品加工業(yè)及其它方面應(yīng)用。
本發(fā)明采用了價(jià)格低廉的、對人畜安全的高聚物、鹽、水構(gòu)成的兩相系統(tǒng)，對酶制劑進(jìn)行分離提純。具體做法是用聚乙二醇(簡稱PEG)、鹽、水構(gòu)成的兩相系統(tǒng)，通過液、液萃取操作方法(見具體操作方法)，純化發(fā)酵生產(chǎn)的枯草桿菌α-淀粉酶，以及其它酶制劑(包括蛋白酶、脂肪酶等發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑)，使之能適用于食品加工工業(yè)。
枯草桿菌α-淀粉酶是工業(yè)發(fā)酵液噴干粉，它內(nèi)部含有大量雜質(zhì)(包括培養(yǎng)基附隨物、細(xì)菌菌體、色素等)，并帶有不愉快的氣味。利用α-淀粉酶、雜質(zhì)在水兩相系統(tǒng)中有不同的分配行為，可以將它們分離。首先令粗酶混懸液于〔10～30%(最好是20.5%)PEG/10～20%(最好是13.7%)(NH4)2SO4〕兩相系統(tǒng)中進(jìn)行分相，分相后，90%以上的α-淀粉酶存在于上層相(PEG相)中;不溶性物質(zhì)(如菌體、培養(yǎng)基附隨物)聚集于兩相界面;親水性色素則分布于下層相(硫酸銨相)。去除下層相后，加入適量磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)緩沖液，構(gòu)成10～30%(最好是13.7%)PEG/10～30%(最好是10%)磷酸鹽兩相系統(tǒng)，此時(shí)α-淀粉酶轉(zhuǎn)入新的下層相里(即磷酸鹽相)，而其它雜質(zhì)、色素則存留于上層PEG相中。去除上層相后，就可以獲α-淀粉酶溶于磷酸緩沖液中的液態(tài)制劑。這種液態(tài)α-淀粉酶制劑無色、無味。經(jīng)透析除鹽、凍干，便可制成粉狀制劑，可用于食品加工業(yè)，或供進(jìn)一步精制的中間原料。
提純α-淀粉酶所用試劑有下列幾種
1.50%(每一百克溶液含PEG50克。以下均同)聚乙二醇(PEG6000)膠態(tài)溶液。
2.50%(每一百毫升溶液含硫酸銨50克。以下均同)硫酸銨(NH4)2SO4溶液。
3.25%(每一百毫升溶液含磷酸鹽25克，以下同)磷酸鹽〔Na2HPO4-NaH2PO4〕緩沖液，PH值為6.0。
4.12.5%(每一百毫升溶液中含酶制品12.5克)枯草桿菌α-淀粉酶粗酶混懸液。
具體操作方法如下1.取容積為125毫升帶刻度的液漏斗，稱重加入50%PEG溶液10～30克(最好是20.5克)，終濃度為10～30%(最佳為20.5%)，用移液管加入50%(NH4)2SO4溶液10～20毫升(最好是13.7毫升)，終濃度為10～20%，(最好為13.7%)，12.5%粗酶液16.0毫升。系統(tǒng)總體積為50毫升(以上重量、體積均可按比例放大或縮小)。充分搖蕩均勻，靜置待分層清晰后，記錄上下相體積，各取出1毫升，進(jìn)行酶活力及蛋白質(zhì)濃度測定。
2.從分液漏斗放出下層相。上層相仍留在分液漏斗中，再加入25%磷酸鹽緩沖液35毫升，蒸餾水25毫升(以上重量、體積均可按比例放大，縮小)。充分搖勻，靜置分層記錄兩相體積。各取出1毫升，按Bernfeld法測α-淀粉酶活力及蛋白質(zhì)濃度。在581-G型比色計(jì)中使用綠色濾光片追蹤黃色色素的分布動向。
3.分出下層相得α-淀粉酶精制品濃液中透析除鹽，凍干即得成品。
在本項(xiàng)發(fā)明“高聚物、鹽、水”兩相系統(tǒng)中，所用高聚物聚乙二醇完全無毒，對人畜安全，是合格的食品填充劑。由于構(gòu)成兩相系統(tǒng)的主要成份是水，因而有利于酶蛋白的穩(wěn)定性;使用本系統(tǒng)所需設(shè)備簡單，操作方便，分離迅速，效率高，操作規(guī)?？梢愿鶕?jù)生產(chǎn)情況準(zhǔn)確放大和縮小。且原材料成本低廉，適宜于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)過程的使用。
權(quán)利要求
1.一種酶制劑的提純方法，其特征是采用“高聚物、鹽、水”所構(gòu)成的兩相系統(tǒng)對酶制劑進(jìn)行分離提純。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的酶制劑提純方法，其特征是可采用“聚乙二醇、鹽、水”兩相系統(tǒng)對枯草桿菌α-淀粉酶制劑進(jìn)行分離提純。
3.一種如權(quán)利要求
1、2所述的酶制劑提純方法，其特征是采用如下具體做法a.取50%的聚乙二醇溶液(每一百克溶液含聚乙二醇50克，以下同)10～30克，(終濃度為10～30%)，置于分液漏斗中，加入50%硫酸銨(NH4)2SO4溶液(每一百毫升溶液含硫酸銨50克，以下同)10～20毫升，(終濃度為10～20%)、12.5%枯草桿菌α-淀粉粗酶液(每一百毫升溶液含酶制品12.5克，下同)16.0毫升，(以上重量、體積均可按比例放大、縮小)充分搖蕩均勻，靜置分層;b.從分液漏斗放出下層相，上層相仍留在分液漏斗中，另外加入25%磷酸鹽緩沖液(每一百毫升溶液含磷酸鹽25克)20～40毫升，蒸餾水25毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分蕩勻，靜置分層;c.分出下層相得α-淀粉酶精制品溶液，透析除鹽凍干即得成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的酶制劑提純方法，其特征是最佳做法如下a.取50%的聚乙二醇溶液20.5克，(終濃度為20.5%)，置于分液漏斗中，再加入50%硫酸銨(NH4)2SO4溶液13.7毫升，(終濃度13.7%)，12.5%枯草桿菌α-淀粉粗酶液16毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分搖蕩均勻，靜置分層;b.從分液漏斗放出下層相，上層仍留在分液漏斗中，另外加入25%磷酸鹽緩沖液35毫升，蒸餾水25毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分搖勻，靜置分層;c.分出下層得α-淀粉酶精制品溶液，透析除鹽，凍干即得成品。
專利摘要
本發(fā)明屬酶制劑的提純方法。
文檔編號C12N9/28GK86103207SQ86103207
公開日1987年11月18日 申請日期1986年5月5日
發(fā)明者林哲甫, 張維欽, 李玉玲 申請人:中山大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan