專利名稱：兩根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Lys與一根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物、它們的合成及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽-脂肪醇偶聯(lián)物，尤其涉及飽和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8, 10，12)與Arg-Gly-ASp-Val-LyS(Arg-Gly-ASp-Val)的羧端偶聯(lián)而得的偶聯(lián)物，本發(fā)明還 涉及該偶聯(lián)物的合成方法以及該偶聯(lián)物作為抗血栓劑、藥物載體或藥物制劑材料的應(yīng)用， 屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在未來(lái)的5年到10年基因治療會(huì)有可把基因傳送至細(xì)胞的理想載體。從生物制 劑的立場(chǎng)看，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)就是藥物釋放系統(tǒng)(DDS)。有多種化學(xué)合成的小分子構(gòu)建的基因 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)受到關(guān)注，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是關(guān)注熱點(diǎn)。陽(yáng)離子脂質(zhì)在藥學(xué) 領(lǐng)域遍用于構(gòu)建脂質(zhì)體運(yùn)載小分子(包括多肽)藥物。與在DDS中一樣，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 中陽(yáng)離子脂質(zhì)體有明顯好處，例如可通過(guò)電荷吸附與DNA形成復(fù)合物并有效避免被細(xì)胞內(nèi) 溶酶體降解、可將DNA高效導(dǎo)入細(xì)胞、對(duì)DNA的尺寸沒(méi)有限制、操作簡(jiǎn)便等。陽(yáng)離子脂質(zhì)的
基本構(gòu)造如下，包括高級(jí)脂肪鏈構(gòu)成的疏水臂和親水的陽(yáng)離子頭。 陽(yáng)離子脂質(zhì)的基本構(gòu)造細(xì)胞黏附在細(xì)胞黏附性疾病(癌轉(zhuǎn)移、血栓形成、化學(xué)致炎和骨質(zhì)疏松)的發(fā)展過(guò) 程中起關(guān)鍵作用。調(diào)節(jié)性糖蛋無(wú)例如RGD肽與整合素受體有很強(qiáng)的結(jié)合能力，可參與細(xì)胞 黏附過(guò)程。例如RGD肽與血小板、腫瘤細(xì)胞及骨基表面的GP Ilb/IIIa受體特異性結(jié)合可 干預(yù)血栓、癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的發(fā)展過(guò)程。RGD肽的這種作用賦予了含RGD序列的化合物一 種重要性質(zhì)，即含RGD序列的化合物可以向血栓、癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的患病部位富集。在這 樣一個(gè)前提下，把RGD肽與高級(jí)脂肪鏈偶聯(lián)，便可以獲得我們期待的偶聯(lián)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一類多肽_脂肪醇偶聯(lián)物。本發(fā)明目的之二是提供一種合成上述多肽_脂肪醇偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的兩根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Lys與一根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物的通式為 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)nCH3,其中 η = 6，8，10 或 12。一種上述多肽-脂肪醇偶聯(lián)物的方法，包括
(1)合成 Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Arg-Gly-Asp-Val)；(2)將 CH3 (CH2)nCH2OH 分別與保護(hù)基保護(hù)的 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)的羧端偶聯(lián)，脫去保護(hù)基，即得；其中，η = 6,8,10或12。本發(fā)明結(jié)合了下述認(rèn)識(shí)或依據(jù)完成了上述技術(shù)方案把基因傳送至細(xì)胞的理想載 體(基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng))是基因治療的關(guān)鍵任務(wù)之一；從生物制劑的立場(chǎng)看基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與藥 物釋放系統(tǒng)(DDS)具有等同性；雖然有多種化學(xué)合成的小分子構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)都受到 關(guān)注但是陽(yáng)離子脂質(zhì)構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)應(yīng)格外給予關(guān)注；陽(yáng)離子脂質(zhì)體可通過(guò)電荷吸附 與DNA形成復(fù)合物并有效避免被細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解；陽(yáng)離子脂質(zhì)體可將DNA高效導(dǎo)入細(xì)胞、 陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)DNA的尺寸沒(méi)有限制；血小板、炎癥組織、癌細(xì)胞和骨基質(zhì)表明富含可識(shí)別 RGD序列的細(xì)胞黏附受體，含RGD序列的化合物可以向血栓、炎癥、癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的患 病部位富集。本發(fā)明人基于上述認(rèn)識(shí)，把飽和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8,10，12)，與Arg-G Iy-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)肽的羧端偶聯(lián)，使制得的分子獲得四種性能，即依賴于 飽和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8,10，12)烷基鏈的疏水性、依賴于RGD的胍基和α -氨 基質(zhì)子化形成的陽(yáng)離子性質(zhì)和親水性和依賴于RGD肽對(duì)GP Ilb/IIIa受體特異親和作用獲 得的靶向性。這樣一來(lái)，RGD肽與飽和脂肪醇CH3 (CH2)nCH2OH(η = 6,8,10,12)偶聯(lián)制得的 分子便成為我們所期待的偶聯(lián)物。在大鼠血栓形成模型上的評(píng)價(jià)表明，本發(fā)明偶聯(lián)物具有優(yōu)秀的口服抗血栓活性， 可作為抗血栓劑應(yīng)用；在水相檢測(cè)了本發(fā)明偶聯(lián)物自組裝成為納米顆粒的性能，試驗(yàn)結(jié)果 表明，本發(fā)明偶聯(lián)物具有優(yōu)秀的自組裝性能，可作為制備微乳、脂質(zhì)體等的制劑材料。由于 本發(fā)明偶聯(lián)物的抗血栓活性來(lái)自R⑶肽對(duì)GP Ilb/IIIa受體特異親和作用，所以這種抗血 栓活性又表征了本發(fā)明偶聯(lián)物的靶向性，所以本發(fā)明偶聯(lián)物可作為靶向制劑材料。本發(fā)明的又一目的是提供一種含有本發(fā)明偶聯(lián)物的藥物組合物，該藥物組合物由 治療上有效劑量的本發(fā)明偶聯(lián)物與藥學(xué)上可接受的賦型劑或者輔加劑組成；即將有效量 的本發(fā)明偶聯(lián)物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制 備成任意一種適宜的藥物組合物。通常該組合物適合于口服給藥和注射給藥，也適合其他 的給藥方法。該組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、栓劑，或口服液等液體制劑 形式。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以含有0. -99%重量，優(yōu)選10-60%重 量的本發(fā)明偶聯(lián)物。


圖1本發(fā)明偶聯(lián)物的合成路線圖；i)DCC、HOBt, NMM ；ii)氯化氫/乙酸乙酯溶液 (4N) ；iii)5%鈀碳和氫氣。圖2由透射電鏡描述的本發(fā)明代表性化合物在水相組裝的納米球。圖3由掃描電鏡描述的本發(fā)明代表性化合物組裝的納米球。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例 IArg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 12CH3 (9a)的制備l)Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備將1. 674g(5. 25mmol) Boc-Arg (NO2)溶于 IOml 無(wú)水 DMF，加入適量 THF，力口 入
0.675g(5mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，使其完全溶解。冰浴下加入1. 071g (6mmol) 二 環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，直至有無(wú)色D⑶析出，得到反應(yīng)液(I)，待用。稱取0. 86g(5. Ommol) Gly-OBzl，WA IOml無(wú)水DMF溶解，用N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)pH 8-9，得到反應(yīng)液(II)，待 用。將反應(yīng)液(II)加入反應(yīng)液(I)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?2h，TLC(氯仿/甲 醇，10 1)顯示Boc-Arg(NO2)消失。濾除二環(huán)己基脲(D⑶)，吹干DMF。殘留物用乙酸乙 酯溶解，依次用5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液 洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到1.956g(80% )目標(biāo)化 合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 489 [M+Na] +。2) Boc-Arg (NO2) -Gly 的制備將0. 466g(l. Ommol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 溶于 IOml 甲醇，冰浴下用 2N NaOH水 溶液調(diào)約PH12，攪2h，TLC (氯仿/甲醇，1 1)顯示B0c-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反應(yīng) 液用飽和KHSO4水溶液調(diào)pH7，減壓濃縮除甲醇。反應(yīng)液用飽和KHSO4水溶液調(diào)pH2 3，用 乙酸乙酯萃取(30ml X 3)。合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗至中性，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò) 濾，濾液減壓濃縮至干，得0.3g(80%)目標(biāo)化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 375 [M-H]+。 [a]o=-2.16(c=l, CH3OH) ο3) Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)12CH3 (la)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
1.07g(5mmol)CH3(CH2)12CH2OH 制得 2. 71g(100% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI_MS(m/ z)543[M+H]+。[a]o=-16.73(c=l, CH3OH)οMp 29. 8-31. 6°C .4) Lys-OCH2-(CH2)12CH3 (2a)的制備將0. 542g (Immol) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 13CH3 溶解在 IOml 4mol/L 氯化氫-乙 酸乙酯溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC (氯仿/甲醇，20/1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮抽干， 殘留物反復(fù)加乙酸乙酯和乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后得到0.415g(99%)目 標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 343 [M+H] +5) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (3a)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
2.075g(5. Ommol)Lys-OCH2-(CH2)12CH3 制得 3. 700g(99 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。 ESI-MS(m/z)763[M+Na]+6) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (4a)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法，從 0. 740g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0.613g (99% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。ESI-MS (m/z) 541 [M+H] +7) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 12CH3 (5a)的制備按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 226g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)12CH3 制得 1. 610(70% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS(m/z) 1173[M+Na]+。[c^0=-26.00(c=l, CH3OH)0Mp :136· 1 137. 7°C ·8) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 12CH3 (6a)的制備
按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制備方法，從 1. 15g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl)-Val-Lys[Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 91g(89% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/z)951[M+H]+9) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)12CH3 (7a)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(N02)-Gly 禾口 1. 023g(l. Ommol)Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 666g(40 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) 1689[M+Na]+。二-18.73(c=l， CH3OH), Mp :130. 8 131. 4°C。10) (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (8a)的 制備0. 333g(0. 2mmol) Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Vall-OCH2-(CH2)12CH3用甲醇溶解，加入Pd/C適量，反應(yīng)體系保持密閉，通入氫氣反 復(fù)置換反應(yīng)體系中的空氣，保持氫氣室溫?cái)嚢?。反?yīng)不再吸氫后TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng) 完畢后，常壓過(guò)濾去除Pd/C，濾液減壓濃縮旋干，并用乙醚反復(fù)研磨得得0. 270g(97% )標(biāo) 題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/z) 1397 [M+H] +11) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 12CH3 (9a)的制備按照Lys-OCH2- (CH2) 12CH3 的制備方法，從 0. 279g (2. Ommol) (Boc-Arg-Gly-Asp-Va 1)-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 239g(99% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固
體。[ ]d=.23.53(c=1, ch30h)0 esi-ms (m/z) 1197 [m+h]mp :208 209°c。實(shí)施例2Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 (9b)的制備l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (lb)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
0.93g(5mmol)CH3(CH2)ltlCH2OH 制得 2. 570g(99% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI_MS(m/ ζ) 537 [M+Na]+。[α^=-9.20(c=l, CH3OH)2) Lys-OCH2-(CH2)10CH3 (2b)的制備按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制備方法從 0. 5 14g (Immo 1) Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)ltlCH3制得0. 387g(99% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下 一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 315 [M+H] +3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (3b)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
1.935g(5. Ommol)Lys-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 3. 560g(99 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。 ESI-MS(m/z)735[M+Na]+4) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (4b)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法,從 0. 712g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 0. 585g (99% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。ESI-MS (m/z) 513 [M+H] +5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 10CH3 (5b)的制備按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和
61. 170g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 1. 683(75% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS(m/z)l 144[M+Na]+。[a]^= -34.83(c=l, CH3OH)。Mp 140 142°C6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2 (CH2) 10CH3 (6b)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法，從 1. 122g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl) -Val -Lys[Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2(CH2)ltlCH3 制得 0. 990g(99% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/z)923[M+H]+7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)10CH3 (7b)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(N02)-Gly 禾口 0. 995g(l. Ommol) Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)10CH3 制得 0. 737g(45 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) 1661 [M+Na]+。[a]g=-34.56(c=l’ CH3OH)。Mp 132 134°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (8b)的制 備按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 的制 備方法由 O. 328g(0. 2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys (Boc-Arg(NO2)-Gly-As ρ (OBzl) -Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 制得 0. 260g(95% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/ ζ)1367[Μ-Η]+ 9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 (9b)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法，從 0. 274g(0. 2mmol)Boc-Arg-Gly-Asp-Va I-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 制得 0. 220g(94% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS (m/z) 1168 [M+H]+。[c^0=-22.20(c=l，CH3OH)。Mp :209 211°C。實(shí)施例3Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 (9c)的制備l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)8CH3 (Ic)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
0.79g(5mmol)CH3(CH2)6CH2OH 制得 2. 430g(100% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/ ζ) 509 [M+Na]+。[a]^0=-12.33(c=l, CH3OH)2) Lys-OCH2-(CH2)8CH3 (2c)的制備按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制備方法由 0. 486 g (Immo 1) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 8CH3制得0359g (99 % )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下一 步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 287 [M+H] +3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (3c)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
1.795g(5. Ommol) Lys-OCH2-(CH2)8CH3 制得 3. 420g(99 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。 ESI-MS(m/z)685[M+H]+4) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (4c)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法,從 0. 684g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 557g(100% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。ESI-MS (m/z) 585 [M+H] +5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -Val]-OCH2- (CH2) 8CH3 (5c)的制備
按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 114g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)8CH3 制得 1. 706(78% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS(m/z) 1116[M+Na]+0 [a]^0=-30.43(c=l, CH3OH)οMp 118 119°C ·6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 8CH3 (6c)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法，從 1. 094g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl) -Val -Lys [Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 87g(90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/z)895[M+H]+7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)8CH3 (7c)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(NO2)-Gly 和 0. 967g(l. OmmoDAsp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl) -Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 837g(52% ) 標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/z) 1632 [M+Na] + D=-26.57(c=l, CH3OH)οMp :128 130°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (8c)的制 備按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 的制 備方法由 0. 322g(0. 2mmol) Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Arg (NO2)-Gly-A sp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0.260g(97% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/ ζ)1339[Μ-Η]+9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 (9c)的制備按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制備方法，從 0. 268g(0. 2mmol) Boc-Arg-Gly-Asp-Val -Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 制得 0. 22g(96% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS (m/z) 1141 [M+H]+。[a]^°=-24.70(c=l, CH3OH)。Mp :203 205°C。實(shí)施例4Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3 (9d)的制備l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)6CH3 (Id)的制備按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制備方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和 0. 65g(5mmol) CH3(CH2)6CH2OH 制得 2. 290g(99% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS (m/ z)459[M+Na]+。[α]^=-12.33(c=l，CH3OH).2) Lys-OCH2- (CH2) 6CH3 (2d)的制備按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制備方法由 0. 459 g (Immo 1) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 6CH3制得0359g(99% )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下 一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 260 [M+H]+.3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)6CH3 (3d)的制備按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法，以 1. 085g (5mmol) Boc-Val 和 0. 794g(2. 4mmol) Lys-OCH2-(CH2)6CH3為原料，得到 1. 36g(86. 4% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固 體。ESI-MS(m/z)658[Μ+Η]+。[α] =-17.48 (c=0.9,CHC13)o4) Val-Lys (Val) -OCH2 (CH2) 6CH3 (4d)的制備按照制備Lys-OCH2- (CH2) 12CH3 的制備方法，以 0. 657g (1. Ommol) Boc-Val-Lys (Boc -VaD-OCH2-(CH2)6CH3 為原料，得到標(biāo)題化合物。ESI-MS (m/z) 458 [M+H] +
5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -Val]-OCH2- (CH2) 6CH3 (5d)的制備按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法，以 1. 615g (5mmol) Boc-Asp (OBzl)和
1.27g(2. 4mmol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)6CH3 為原料，得到 2. 12g(82. 8% )目標(biāo)化合物 ESI-MS (m/z) 1090 [M+Na]+。-31.58(c=1.05，,CHCl3)ο Mp :130_131°C ·6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -Val] -OCH2 (CH2) 6CH3 (6d)的制備按照制備Lys-OCH2-(CH2)12CH3 方法，以 1. 066g(l. Ommol Boc-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)6CH3 為原料，得到標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/z) 1067[M+H] +7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2) 6CH3(7d)的制備按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制備方法，以 1. 88g (5謹(jǐn)ol) Boc-Arg (NO2)-Gly 和
2.558(2. 4mmol)Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl) -Val]-OCH2-(CH2)6CH3 為原料，得到標(biāo)題化 合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) 1313[M+H] +。[af°= -19.42(c=l.l,CH3OH)。Mp :137_138°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2) 6CH3(8d)的制 備按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)6CH3 的制 備方法，以 0. 131g(0. lmmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBz 1)-Val-Lys [Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)6CH3 為原料，得到 0. 104g(0. lmmol)標(biāo)題化合物，無(wú)色固體。 ESI-MS (m/z) 1041 [M-H]+·9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3 (9d)的制備按照Lys-O-CH2-(CH2)12CH3 的制備方法，以 0. 104g(0. lmmol)Boc-Arg-Gly-Asp-V al-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3為原料，得到目標(biāo)化合物，無(wú)色固體粉末。 ESI-MS (m/z) 914 [M+H]+。[af°= -23.29(c=0.75, CH3OH)ο Μ. ρ 150_151°C。試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物口服給藥的抗血栓活性試驗(yàn)1)大鼠手術(shù)與器械wistar大鼠(雄性，190 210g)，按lnmol .kg—1劑量口服本發(fā)明的化合物，30min 后按UOOmg-kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動(dòng) 脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的手術(shù)線于皮毛用止血 鉗夾緊，準(zhǔn)備在遠(yuǎn)心端插管。2)插管插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60. Omm,內(nèi)徑
3.5mm ；兩端為相同的聚乙烯管，管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑1. Omm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為1.0mm。將編好號(hào)的5mLEP管中分別裝入6cm長(zhǎng)的 黑色手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。打開(kāi)大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾，用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液 (50IU · kg—1)，然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠 體內(nèi)。3)給藥溶液藥品生理鹽水(3ml .kg—1，口服給予)、阿斯匹林(劑量為劑量為60mg/15mL，3Ml/ kg, 口服給予)的生理鹽水溶液、本發(fā)明化合物(劑量為lnmol/kg，口服給予)的生理鹽水溶液。4)血栓稱重計(jì)時(shí)開(kāi)始15分鐘后，剪斷動(dòng)靜脈插管，停止循環(huán)，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙 上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的5mLEP管中，精確稱重并記錄。計(jì)算出血栓的濕重。每 個(gè)藥品重復(fù)12次給藥。統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重(〒士SD)，并做t檢驗(yàn)。5)結(jié)果經(jīng)口服給藥，本發(fā)明的化合物都具有很好的抗栓活性。結(jié)果列入表1。表1本發(fā)明化合物經(jīng)靜脈給藥的抗血栓活性
化合物(lnmol/kg)血栓濕重(I±SDmg)
NS32.74士 2.83
Aspirin14.28 士 2.90a η = 10 ;NS =生理鹽水 a.與 NS 相比，P < 0· 01。b 與 aspirin 相比，ρ < 0· 05，試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物9a 口服給藥的量效關(guān)系1)大鼠手術(shù)與器械wistar 大鼠(雄性，190 210g)，按 lnmol .kg-1，?！?lnmol .kg-1 禾口 0. Olnmol .kg-1 劑量口服9a，30min后按UOOmg-kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位 固定，分離右頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的 手術(shù)線于皮毛用止血鉗夾緊，準(zhǔn)備在遠(yuǎn)心端插管。2)插管插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60. Omm,內(nèi)徑 3. 5mm ；兩端為相同的聚乙烯管，管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑1. Omm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為1.0mm。將編好號(hào)的5mLEP管中分別裝入6cm長(zhǎng)的 黑色手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。打開(kāi)大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾，用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液 (50IU · kg—1)，然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠 體內(nèi)。3)給藥溶液藥品將9a 按 Inmol · kg-1，?！?lnmol · kg"1 和 0. Olnmol · kg"1 劑量配置生理鹽水 溶液，供口服給藥。4)血栓稱重計(jì)時(shí)開(kāi)始15分鐘后，剪斷動(dòng)靜脈插管，停止循環(huán)，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙 上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的5mLEP管中，精確稱重并記錄。計(jì)算出血栓的濕重。每個(gè)藥品重復(fù)11次給藥。統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重(JT 士SD)，并做t檢驗(yàn)。5)結(jié)果經(jīng)口服給藥，在Inmol · kg^O. Inmol · kg"1 和 0. Olnmol · kg"1 劑量下，9a 劑量依 賴地發(fā)揮抗血栓作用。結(jié)果列入表2。表2. 口服給予9a的量效關(guān)系
NS =生理鹽水；a與NS相比，ρ < 0. 05 ；試驗(yàn)例3本發(fā)明化合物在水相中組裝成為納米球試驗(yàn)1)本發(fā)明4種偶聯(lián)物按照10_3mOl/l的濃度配置成為水溶液，在激光納米粒度儀 (Nano-ZS90)上連續(xù)測(cè)定8天，觀察粒徑大小及其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。得到的數(shù)據(jù)表明，這 4種偶聯(lián)物在水相中可以自組裝成為穩(wěn)定的納米球，因而是優(yōu)秀的微乳和脂質(zhì)體藥物的制 備材料。表3本發(fā)明的4種偶聯(lián)物在水中自組裝成為納米球的粒徑穩(wěn)定性 2)按照透射電鏡的測(cè)定要求，配置4種偶聯(lián)物的水溶液，置于銅網(wǎng)上揮發(fā)干后測(cè) 定本發(fā)明的化合物在水相組裝性質(zhì)。結(jié)果表明，由這4種偶聯(lián)物組裝的納米球在透射電鏡 下主要呈球狀。這里給出的是代表性化合物9a的透射電鏡圖(圖2)3)按照掃描電鏡的測(cè)定要求，配置4種偶聯(lián)物的水溶液，冷凍干燥后測(cè)定本發(fā)明 的化合物的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑。結(jié)果表明，由這4種偶聯(lián)物組裝的納米球在掃描電鏡下可以 看到不同的形態(tài)。這里給出的是代表性化合物9a的掃描電鏡圖(圖3)
權(quán)利要求
兩根Arg Gly Asp Val鏈通過(guò)Lys與一根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物的通式為Arg Gly Asp Val Lys(Arg Gly Asp Val) OCH2 (CH2)nCH3，其中n＝6，8，10或12。
2.一種合成權(quán)利要求1所述偶聯(lián)物的方法，包括(1)合成保護(hù)基保護(hù)的Arg-Gly-ASp-Val-LyS(Arg-Gly-ASp-Val)；(2)將CH3 (CH2)nCH2OH 分別與保護(hù)基保護(hù)的 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) 的羧端偶聯(lián)，脫去保護(hù)基，即得；其中，η = 6,8,10或12。
3.—種抗血栓藥物組合物，其特征在于由治療或預(yù)防上有效量的權(quán)利要求1所述的 偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體或輔料所組成。
4.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物在制備抗血栓藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物在制備微乳或脂質(zhì)體藥物載體的制劑材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了兩根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Lys與一根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物、它們的合成及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明偶聯(lián)物的通式為Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)nCH3，其中n＝6，8，10或12。本發(fā)明偶聯(lián)物除具有優(yōu)秀的口服抗血栓活性外，還具有優(yōu)秀的自組裝性能，可作為制備微乳、脂質(zhì)體等藥物載體的制劑材料。
文檔編號(hào)C07K7/06GK101906145SQ20091008519
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者張琴, 彭師奇, 趙明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)