專利名稱：鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物和鏈霉素抗體的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種鏈霉素與載體蛋白偶 聯(lián)產(chǎn)物和鏈霉素抗體的制備方法及用途。
技術(shù)背景鏈霉素是氨基糖甙類抗生素，由美國(guó)瓦克斯曼研究所于1945年研制成功, 被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物疾病的治療人上鏈霉素用于結(jié)核、鼠疫及革蘭氏陰性 菌引起的疾病的治療；動(dòng)物上鏈霉素對(duì)雞、羊、牛、豬的多種疾病，如雞傳染性 鼻炎、豬急性支氣管炎、豬白痢、奶牛子宮內(nèi)膜炎、大腸桿菌病等有很好的療 效，因此經(jīng)常作為飼料添加劑使用。但鏈霉素具有許多副作用1)過(guò)敏反應(yīng)；2) 對(duì)第八對(duì)顱神經(jīng)損害；3)對(duì)骨髓的抑制；4)具有潛在的致癌作用。因此，最 近鏈霉素在人上的應(yīng)用逐漸被其它作用類似的抗生素替代。但我國(guó)由于獸醫(yī)用 藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使及相應(yīng)的檢測(cè)監(jiān)督體系不健 全，鏈霉素在畜牧業(yè)、養(yǎng)蜂業(yè)及魚(yú)業(yè)生產(chǎn)中的濫用現(xiàn)象十分普遍。按農(nóng)業(yè)部2001年發(fā)布實(shí)施的無(wú)公害食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中牛奶的衛(wèi)生要求，鏈霉素最高允許殘留標(biāo) 準(zhǔn)為200 ng/ml;鏈霉素在畜牧業(yè)中的濫用導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)藥物的滯留或蓄積，并 以殘留的方式進(jìn)入人體及生態(tài)系統(tǒng)。它對(duì)人體及環(huán)境的危害主要是慢性、遠(yuǎn)期 和累積性的，如致癌、對(duì)人生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響、破壞人們正常的免疫系統(tǒng)、使 人體內(nèi)的病原微生物產(chǎn)生耐藥性等。抗生素耐藥菌株的存在將嚴(yán)重威脅著人類 的健康，而且臨床亞治療水平的抗生素更容易促使抗性基因的轉(zhuǎn)移，比如對(duì)動(dòng) 物進(jìn)行低水平鏈霉素治療，其糞腸菌群由對(duì)鏈霉素敏感逐漸變成抗鏈霉素最后 發(fā)展成對(duì)其它藥物也產(chǎn)生抗性。在長(zhǎng)期的生活中，恰恰是人類和動(dòng)物腸道的正 常菌群成了耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)，并不斷的將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌，并在人和 動(dòng)物中交叉?zhèn)鞑?，尤其是釋放到環(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴(yán)重，可造成耐藥基 因的迅速轉(zhuǎn)移。隨著人們生活水平以及對(duì)濫用抗生素危害性認(rèn)識(shí)的提高，人們 非常重視食品中抗生素的殘留，喜歡食用無(wú)抗生素殘留的畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品。目前鏈霉素殘留的檢測(cè)主要有儀器分析和免疫分析兩種方法,其中儀器分析 法主要用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)，由于其存在儀器昂貴、操 作煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用高、不能大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題，也要求技術(shù)人員具 有一定的操作和分析技能，因而不能很好推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) 具有簡(jiǎn)便、快捷、能大規(guī)模檢測(cè)、靈敏和成本低廉及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),尤其適合在生產(chǎn)和流通過(guò)程中對(duì)畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品中鏈霉素等抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)。膠體 金免疫層析試紙條應(yīng)用廣泛，已有多種可檢測(cè)人、動(dòng)物、植物病原、癌癥抗原、 激素、藥物與農(nóng)藥殘留的試紙條，該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單、方便、快 速，幾乎人人都會(huì)使用；不需任何設(shè)備；結(jié)果準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高; 低成本高效益；保存方便等。因此免疫層析試紙條目前已成為多種物質(zhì)免疫學(xué) 檢測(cè)的發(fā)展方向之一。本專利應(yīng)用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗鏈霉素單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并制備具有高親和力、高特異性、高靈敏度的鏈霉素單抗， 以該單抗為核心開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、廉價(jià)的鏈霉素殘留檢測(cè)試劑盒及膠體 金免疫層析試紙條，為我國(guó)動(dòng)物源食品中鏈霉素殘留的快速檢測(cè)服務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn) 物和鏈霉素抗體的制備方法及用途。
鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的制備方法包括如下步驟
a) 將50-1600 mg鏈霉素和30-300 mg羧甲基羥胺溶于2-5 ml含5-20 mg乙酸鈉 的Milli-Q超純水或雙蒸水中，攪拌反應(yīng)15-30小時(shí)，合成鏈霉素-肟化合物；
b) 以體積比為50: 25: 25的甲醇/氯仿/17%氨水為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠薄層層 析分離鏈霉素-肟化合物，鏈霉素-肟化合物保留在加樣線附近，刮下加樣線處的 硅膠，用Milli-Q超純水或雙蒸水提取鏈霉素--肟化合物，提取物用濾紙過(guò)濾除硅 膠，用冷凍干燥儀干燥過(guò)濾液，獲得純化的鏈霉素-肟化合物；
c) 將IO-IOO mg鏈霉素-肟化合物和l-8 g碳化二亞胺溶于3-30 ml含20。/。乙醇 的Milli-Q超純水或雙蒸水中，加入I-IO ml含10-100 mg載體蛋白的Milli-Q超純水 或雙蒸水，調(diào)pH至5-6.5，在攪拌反應(yīng)10-36小時(shí)，合成鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn) 物；
d) 鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物放入透析袋中，用 117.2的磷酸鹽緩沖液在41: 透析l-3天；
e) 透析后的鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行紫外掃描，分析鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及 濃度測(cè)定，分裝后于-20'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 所述的載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種 球蛋白或卵清蛋白。
鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物用于鏈霉素抗體的制備、畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的 免疫學(xué)方法檢測(cè)分析。
抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法包括如下步驟1) 鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；2) 取免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇融合劑下融合， HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測(cè)分泌抗鏈霉素的細(xì)胞；3) 采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，獲得能穩(wěn) 定傳代并分泌抗鏈霉素特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；雜交瘤細(xì)胞注射入 BALB/C小鼠腹腔制備單抗腹水；4) 采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定抗鏈霉素單抗與鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡 那霉素、慶大霉素、青霉素G、安芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、蔗糖、葡萄糖 的交叉反應(yīng)率，選擇僅與鏈霉素、雙氫鏈霉素有特異性免疫反應(yīng)，且檢測(cè)靈敏 度達(dá)到0.5-3 ng/mL的單抗，可用于畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的檢測(cè)。所述的免疫原是鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物。免疫原的載體蛋白為匙孔血藍(lán) 蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種球蛋白或卵清蛋白。所述的免疫方法為用鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml抗原0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充 分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2-0.3 m/只，間隔3-4周，取與一免等量抗 原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3 ml/只，共進(jìn) 行4-6次加強(qiáng)免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾 細(xì)胞進(jìn)行融合。所述的單抗腹水制備方法為取6-10周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射 0.3-0.5 ml降植垸，7-10天后腹腔注入5-10xl()S個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天 可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液， 即為單克隆抗體腹水。鏈霉素單克隆抗體用于檢測(cè)畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的免疫學(xué)方法。所述的用 于檢測(cè)畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的免疫學(xué)方法為競(jìng)爭(zhēng)ELISA或免疫檢測(cè)試紙條。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)本發(fā)明提供一種能制備檢測(cè)食品中鏈霉素殘留的單克 隆抗體的鏈霉素免疫原偶聯(lián)方法，其操作簡(jiǎn)單方便；2)提供了一種能獲得檢測(cè) 鏈霉素殘留的特異、靈敏單克隆抗體的制備方法，其方法簡(jiǎn)單有效；3)利用本 發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的檢測(cè)。


圖1偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描結(jié)果。Str為鏈霉素水溶液；BSA為牛血清白蛋白 溶液；Str-BSA為鏈霉素與BSA偶聯(lián)產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種鏈霉素人工抗原合成、抗體制備及其在食品中殘留檢測(cè) 的免疫學(xué)方法。用制備的免疫原制備鏈霉素的特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、 能大量生產(chǎn)的單克隆抗體，并用這些單抗建立了檢測(cè)食品中鏈霉素殘留具有高
度特異性、靈敏性和正確性的快速診斷方法一競(jìng)爭(zhēng)ELISA及免疫層析試紙條， 可有效地用于畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的檢測(cè)，為我國(guó)的食品安全服務(wù)。 l.一種鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的制備方法包括如下步驟
a) 將50-1600 mg鏈霉素和30-300 mg羧甲基羥胺溶于2-5 ml含5-20 mg乙酸鈉 的Milli-Q超純水或雙蒸水中，攪拌反應(yīng)15-30小時(shí)，合成鏈霉素-肟化合物；
b) 以體積比為50: 25: 25的甲醇/氯仿/17%氨水為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠薄層層 析分離鏈霉素-肟化合物，鏈霉素-肟化合物保留在加樣線附近，刮下加樣線處的 硅膠，用Milli-Q超純水或雙蒸水提取鏈霉素-肟化合物，提取物用濾紙過(guò)濾除硅 膠，用冷凍干燥儀干燥過(guò)濾液，獲得純化的鏈霉素-肟化合物；
c) 將IO-IOO mg鏈霉素-肟化合物和l-8 g碳化二亞胺溶于3-30 ml含20。/。乙醇 的Milli-Q超純水或雙蒸水中，加入l-10ml含10-100mg載體蛋白即牛血清白蛋白
(BSA)的Milli-Q超純水或雙蒸水，調(diào)pH至5-6.5，在攪拌反應(yīng)10-36小時(shí)，合成 鏈霉素-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物；
d) 鏈霉素-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物放入透析袋中，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液在4X:透析 l國(guó)3天；
e) 透析后的鏈霉素-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物、鏈霉素、BSA溶液進(jìn)行紫外掃描，分析 鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及濃度測(cè)定，分析發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描圖形與BSA及鏈霉素 的掃描圖形明顯不同(如圖l)，說(shuō)明鏈霉素已與BSA偶聯(lián)成功，偶聯(lián)產(chǎn)物分裝 后于-2(TC冰箱保存，用于抗體制備及檢測(cè)食品中鏈霉素殘留的免疫學(xué)方法中的 鏈霉素人工抗原。
2.鏈霉素單克隆抗體的制備方法
1) 免疫動(dòng)物
用鏈霉素與BSA偶聯(lián)物免疫四周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml提取鏈霉素與BSA偶聯(lián)物0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分 乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2-0.3ml/只，間隔3-4周，取與一免等量抗原 和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.31111/只，共進(jìn)行 5次加強(qiáng)免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞 進(jìn)行融合。 ，
2) 細(xì)胞融合取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10: 1的比例，在 無(wú)血清的RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養(yǎng) 基，用50 % PEG(聚乙二醇，Sigma)作為融合齊l」，在37。C下水浴下加入0.5-0.7ml， 使其融合2 min，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500 rpm離心5 min， 沉淀用HAT篩選培養(yǎng)基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中， 37°C， 5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
3) 雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT篩選培養(yǎng)基換液一次，第10天用 HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，用鏈霉素偶聯(lián)卵清蛋白 (Str-OVA)作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲101多個(gè)對(duì)鏈 霉素有反應(yīng)的陽(yáng)性孔，陽(yáng)性率為10%。選擇6個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行 有限稀釋法克隆，獲得10A12株能分泌抗鏈霉素的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌 抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
4) 單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷(Sigma), 7-10 天后腹腔注入5-1(^105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大， 采取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取 1倍體積腹水加2倍體積0.06 M pH 4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸GO ul/ml腹水)， 室溫下邊加邊攪拌，4""C澄清1小時(shí)，12000 rpm離心20 min，收集上清，再用 50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4X:放置2小時(shí)，3000-5000 rpm離心20 min， 沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4"C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗 體，-70。C保存。
5) 單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG、 IgG,、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為，10A12的抗體類型及 亞類為IgGp單克隆抗體的輕鏈為k鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水 效價(jià)，結(jié)果為上述腹水效價(jià)均在10—6以上。 3.檢測(cè)鏈霉素殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立 1)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-鏈霉素結(jié)合物的制備
a) 50-1600 mg鏈霉素和30-300 mg羧甲基羥胺溶于含5-20 mg乙酸鈉的 Milli-Q超純水2-5 ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)15-30小時(shí)，合成鏈霉素-肟化合物；b) 以體積比為50: 25: 25的甲醇/氯仿/17%氨水為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠薄層層 析分離鏈霉素-肟化合物，鏈霉素-肟化合物保留在加樣線附近，刮下加樣線處的 硅膠，用Milli-Q超純水提取鏈霉素-肟化合物，提取物用濾紙過(guò)濾除硅膠，用冷 凍干燥儀干燥過(guò)濾液即獲純化的鏈霉素-肟化合物；c) 10-100 mg鏈霉素-肟化合物和l-8 g碳化二亞胺(EDC)溶于3-30 ml含20。/0 乙醇的Milli-Q超純水中，加入含10-100mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的l-10ml Milli-Q超純水配制的溶液，調(diào)pH至5-6.5，在室溫下攪拌反應(yīng)10-36小時(shí)；d) 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-鏈霉素偶聯(lián)產(chǎn)物放入透析袋中，用pH7.2的磷 酸鹽緩沖液(PBS)在4'C透析l-3天；e) 透析后的偶聯(lián)產(chǎn)物、鏈霉素、HRP溶液進(jìn)行紫外掃描，鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物， 分析發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描圖形與HRP及鏈霉素的掃描圖形明顯不同，說(shuō)明 鏈霉素己與HRP (酶標(biāo)鏈霉素半抗原)偶聯(lián)成功，偶聯(lián)產(chǎn)物分裝后于-2(TC冰箱 保存，用于檢測(cè)鏈霉素的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。2) 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法條件優(yōu)化用方陣試驗(yàn)法對(duì)抗體和酶標(biāo)半抗原的進(jìn)行一系列濃度的稀釋，確定直接競(jìng) 爭(zhēng)ELISA法抗體和酶標(biāo)半抗原的最適工作濃度。OD45o值約為1.0，抗體抗原用 量較少的濃度組合，即為抗體-抗原的最佳工作濃度。首先，將單抗用PBS (0.01 M,pH7.4)稀釋成一系列濃度，分別依次加入96孔酶標(biāo)板(10(HiL/well)， 37 °C 下溫育2h,PBST洗滌3次；用含2.0X脫脂奶的PBS封閉，每孔300 ^L， 37 °C 溫育0.5h，后用PBST洗滌3次；加入預(yù)先以PBS稀釋成不同濃度的酶標(biāo)半抗 原，在微量震蕩器上混勻，37 。C下溫育1 h， PBST洗滌3次；加入底物溶液(IOO pL/wel1)， 37 。C溫育15 min，加入終止液(50 pL/wel1)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD45。值。3) 抗體親和性及檢測(cè)靈敏度在優(yōu)化的條件下，在預(yù)先包被好單抗的酶標(biāo)板上，加入系列濃度的鏈霉素 標(biāo)樣，每濃度3孔重復(fù)，設(shè)不加鏈霉素對(duì)照和溶劑空白對(duì)照，50pL/wdl，再加入 0.89pg/ml酶標(biāo)半抗原50jiL，震蕩l min后37 T下溫育l h， PBST洗滌4次；加 入TMB底物溶液(100 pL/wel1)， 37 。C溫育15 min，加入2M硫酸終止液(50 ^iL/wel1)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD45Q值。以抑制率與鏈霉素濃度的半對(duì)數(shù)繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制率I計(jì)算公式如下(ODmax國(guó)ODmin) - (ODx誦ODmin)1%=-77^;-二 . 、-^ x訓(xùn)(ODmax- ODmin)式中ODmax-不加藥時(shí)的吸光值；OD^農(nóng)藥濃度為X時(shí)的吸光值；ODn^-空白 對(duì)照孔的吸光值。
以抑制率達(dá)到50%的農(nóng)藥濃度(IC5o)來(lái)表示抗體對(duì)鏈霉素的親和性，以IC1()
作為ELISA方法的檢測(cè)靈敏度。在優(yōu)化的ELISA分析條件下，對(duì)鏈霉素建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線，以考察其在最優(yōu)化的反應(yīng)體系中的檢測(cè)靈敏度。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得ICso為10.32 ng/ml，ICn)為0.5 ng/ml，線性范圍1.51-85.95 ng/m。 4)鏈霉素單抗的特異性
在優(yōu)化的條件下，將鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品、雙氫鏈霉素、卡那霉素、青霉素G、 慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、蔗糖、葡萄糖做系列稀釋，分別與單抗進(jìn)行直接 競(jìng)爭(zhēng)ELISA,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50%的濃度，以及上述幾 種物質(zhì)50%抑制率的濃度，然后計(jì)算出各類抗生素的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率 CR計(jì)算方法為CR。/。-鏈霉素IC5。/其它抗生素IC5。xl00。結(jié)果表明，10A12單 抗與雙氫鏈霉素的交叉反應(yīng)率為100%，與卡那霉素、青霉素G、慶大霉素、四 環(huán)素、氯霉素、蔗糖、葡萄糖的交叉反應(yīng)率均小于0.1%。說(shuō)明制備的單抗的特 異性很高，僅對(duì)鏈霉素和二氫鏈霉素有強(qiáng)的特異性反應(yīng)。 4.免疫層析試紙條的制備 膠體金的制備及單抗的金標(biāo)記
膠體金顆粒制備在100ml去離子水中加入in/。檸檬酸三鈉lml，煮沸后迅 速加入ie/。氯金酸lml，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后，4'C下保存?zhèn)溆?。通常情況下， 制備好的膠體金顆粒的大小平均為30 nm。 單抗的金標(biāo)記
取己制備好的膠體金溶液100ml，用O.l mol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH至lj8.0。邊攪 拌邊加入單抗2 mg，攪拌15 min，再逐滴加入2.5 ml 25 mg/ml聚乙二醇20000(PEG 20000)，攪拌20min。 20 000 r/min離心20 min，棄上清液，加入IO ml pH 7.4 PBS 緩沖液(含0.4mg/mlPEG)清洗2次。將沉淀用5ml含2% BSA的PBS緩沖液
(pH7.4)溶解，用0.22^無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4"C保存?zhèn)溆谩?br> 免疫層析試紙條的組裝
用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的鏈霉素-BSA抗原及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別 作為檢測(cè)線(T)和控制線(C)，在37'C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好 的金標(biāo)記鏈霉素單抗包被在膠體金結(jié)合墊上。將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸 纖維素膜及吸水墊依次粘貼在底板上，從而組成一個(gè)連續(xù)的微濾體系。將貼好 的板切割成4mm寬的條，裝入模板中制成檢測(cè)試劑板，避光、密閉、常溫保存?zhèn)溆谩?br> 用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴(約100ul)于上述試劑板的加樣孔中， 加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)；結(jié)果應(yīng)在3 5分鐘內(nèi)讀取，其他時(shí)間判讀無(wú)效；根據(jù)觀察區(qū) 的T、 C線的顏色比對(duì)來(lái)確定結(jié)果，T線顯色比C線深或者相等時(shí)，結(jié)果判定為陰 性。當(dāng)T線顏色顯色比C線淺時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
將硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品配置成不同濃度的分析試樣溶液0、 1、 3、 5、 7、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、卯、100 ng/ml，用檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定， 每個(gè)試樣做3個(gè)重復(fù)，5min后觀察結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)樣品中鏈霉素殘留 藥物的含量達(dá)到或超過(guò)lng/ml，由于大多數(shù)單克隆抗體被樣品中的鏈霉素殘留競(jìng) 爭(zhēng)結(jié)合，T線的包被抗原結(jié)合到的鏈霉素單克隆抗體就很少或者沒(méi)有，T線的顯 色明顯比C線淺或不顯色，結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)樣品中鏈霉素殘留的含量低于lng/ml 時(shí)，T線呈色與C線一致或比C線淺，結(jié)果為陰性；無(wú)論是陽(yáng)性還是陰性結(jié)果， 膠體金-鏈霉素單抗結(jié)合物總能與C線處的羊抗鼠IgG結(jié)合，形成一條紫紅色的條 帶。如果，C線不顯色，無(wú)論是T線有無(wú)，這時(shí)的結(jié)果均無(wú)效。 檢測(cè)試劑板的穩(wěn)定性試驗(yàn)
用同一批次不同檢測(cè)試劑板檢測(cè)同一樣品，及用不同批次檢測(cè)試劑板測(cè)定 同一樣品，其質(zhì)控線、檢測(cè)線的顯色時(shí)間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀基本相同。 將相同批次的試劑板置于37"C、室溫、4"C密閉保存3個(gè)月，每2周各檢測(cè)陽(yáng)性和 陰性奶樣各20份，結(jié)果顯示隨著時(shí)間和溫度的變化，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生大的變化。 根據(jù)37'C下一天相當(dāng)于1周估算，本試劑板可以在室溫下保存12個(gè)月。
權(quán)利要求
1.一種鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)將50-1600mg鏈霉素和30-300mg羧甲基羥胺溶于2-5ml含5-20mg乙酸鈉的Milli-Q超純水或雙蒸水中，攪拌反應(yīng)15-30小時(shí)，合成鏈霉素-肟化合物；b)以體積比為50∶25∶25的甲醇/氯仿/17％氨水為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠薄層層析分離鏈霉素-肟化合物，鏈霉素-肟化合物保留在加樣線附近，刮下加樣線處的硅膠，用Milli-Q超純水或雙蒸水提取鏈霉素--肟化合物，提取物用濾紙過(guò)濾除硅膠，用冷凍干燥儀干燥過(guò)濾液，獲得純化的鏈霉素-肟化合物；c)將10-100mg鏈霉素-肟化合物和1-8g碳化二亞胺溶于3-30ml含20％乙醇的Milli-Q超純水或雙蒸水中，加入1-10ml含10-100mg載體蛋白的Milli-Q超純水或雙蒸水，調(diào)pH至5-6.5，在攪拌反應(yīng)10-36小時(shí)，合成鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物；d)鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物放入透析袋中，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液在4℃透析1-3天；e)透析后的鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行紫外掃描，分析鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及濃度測(cè)定，分裝后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述一種鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的制備方法，其特征 在于所述的載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種 球蛋白或卵清蛋白。
3. —種如權(quán)利要求l所述方法制備的鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的用途，其 特征在于所述的鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物用于鏈霉素抗體的制備、畜產(chǎn)品中鏈 霉素殘留的免疫學(xué)方法檢測(cè)分析。
4. 一種抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟1) 鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；2) 取免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇融合劑下融合， HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測(cè)分泌抗鏈霉素的細(xì)胞；3) 采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，獲得能穩(wěn) 定傳代并分泌抗鏈霉素特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；雜交瘤細(xì)胞注射入 BALB/C小鼠腹腔制備單抗腹水；4) 采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定抗鏈霉素單抗與鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡 那霉素、慶大霉素、青霉素G、安芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、蔗糖、葡萄糖 的交叉反應(yīng)率，選擇僅與鏈霉素、雙氫鏈霉素有特異性免疫反應(yīng)，且檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.5-3 ng/mL的單抗，可用于畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的免疫原是根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1方法偶聯(lián)的鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的免疫原的載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛 丙種球蛋白或卵清蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的免疫方法為用鏈霉素-載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml抗原0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充 分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2-0.3 m/只，間隔3-4周，取與一免等量抗 原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3 ml/只，共進(jìn) 行4-6次加強(qiáng)免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾 細(xì)胞進(jìn)行融合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗鏈霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于 所述的單抗腹水制備方法為取6-10周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10xl()S個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見(jiàn)小鼠 腹部明顯膨大，采取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克 隆抗體腹水。
9. 一種如權(quán)利要求4方法制備的鏈霉素單克隆抗體的用途，其特征在于，鏈 霉素單克隆抗體用于檢測(cè)畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的免疫學(xué)方法。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種鏈霉素單克隆抗體的用途，其特征在于所述 的用于檢測(cè)畜產(chǎn)品中鏈霉素殘留的免疫學(xué)方法為競(jìng)爭(zhēng)ELISA或免疫檢測(cè)試紙 條。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鏈霉素與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物和鏈霉素抗體的制備方法及用途。本發(fā)明關(guān)于匙孔血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等載體蛋白與鏈霉素偶聯(lián)的方法，并用與載體蛋白偶聯(lián)的鏈霉素免疫原免疫的BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，用與載體蛋白偶聯(lián)的鏈霉素作為包被抗原篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞、經(jīng)細(xì)胞克隆獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗特異性鏈霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并制備腹水單抗。利用制備的單抗建立了對(duì)鏈霉素具有高度特異性、靈敏性和精確性的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法及免疫膠體金試紙條。本發(fā)明提供的鏈霉素與載體蛋白的偶聯(lián)及鏈霉素單克隆抗體的制備方法，為快速檢測(cè)食品中鏈霉素殘留提供服務(wù)。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101407542SQ200810162219
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者吳建祥, 張少恩, 陳正賢 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)