專利名稱：合成多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種對納米藥物載體進(jìn)行耙向修飾的 小分子多肽。
技術(shù)背景納米藥物是指以納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、納米粒、聚合物膠束、以 及縮合體為載體，以一定的方式與藥物結(jié)合在一起制成的制劑，其粒徑通常在10nm到1000nm之間。納米藥物載體是用于包裹或吸附藥物作為藥物輸送系統(tǒng) 的物質(zhì)，它對藥物的釋放、分布、藥效等有很重要的影響，是近年來國內(nèi)外研 究的熱點(diǎn)，如納米脂質(zhì)體(nanoliposome)、固體脂質(zhì)(solid lipid nanopartices, SLN)、納米粒(nano-particles,NP)、縮合體(condensates)及聚合物膠束以等。 納米載體最大的特點(diǎn)就是多用途性，他們具有很大的比表面積，藥物更容易吸收, 而且通過包裹和吸附機(jī)制還可以對藥物起到保護(hù)作用，這樣就延長了藥物在體 內(nèi)的半衰期,增加藥物的藥理作用。能否將治療藥物有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官或靶組織細(xì)胞，并維持治療濃度一定 的時(shí)間，是藥物治療成功與否的關(guān)鍵。對于多數(shù)納米制劑來說，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 的清除作用和非特異性細(xì)胞反應(yīng)是其應(yīng)用的主要障礙。納米載體能夠和許多血 液內(nèi)容物以及非靶細(xì)胞非特異性結(jié)合，嚴(yán)重影響了納米藥物的治療作用，同時(shí) 伴隨著副作用的增加。M.origs和M.kursa等研究發(fā)現(xiàn)，以PEI為載體的縮合體 (核酸載體的一種)能夠和血液中的清蛋白、纖維蛋白原、載脂蛋白(a-i、 a-ii、 h、 c-ni)以及甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合迅速聚集而被清除，導(dǎo)致治療基 因無法到達(dá)靶細(xì)胞。更為嚴(yán)重的是PEI/DNA復(fù)合物與紅細(xì)胞結(jié)合后，很可能 會(huì)引起血管或肺部毛細(xì)支氣管堵塞而產(chǎn)生嚴(yán)重后果(M. Ogris, P. Steinlein， M. Kursa， K. Mechtler， R. Kircheis, E. ^Vagner, The size of DNA/transferrin—PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells, Gene Ther.5(1998) 1425-1433.)。目前主要采取親水修飾和靶向修飾的方法來克服 PEI/DNA縮合體的這些缺點(diǎn)。納米載體經(jīng)親水性聚合物修飾后，穩(wěn)定性增加，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長，并具 有一定的RES逃逸能力，但是由于表面的電荷被屏蔽，甚至被反轉(zhuǎn)，極大地 影響了納米制劑的細(xì)胞攝取效率，加之其特異性差，很難達(dá)到理想的治療效果。 為此研究者們在進(jìn)行親水性修飾的同時(shí)在縮合體表面偶聯(lián)各種各樣的配體，以 提高縮合體的轉(zhuǎn)染效率。包括一些糖類化合物、轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白、葉酸、生長因子 以及具有特異性定位作用的抗體(Kai Kraemer， Susanne Fuessel, Uta Schmidt, et al， Antisense-mediated hTERT Inhibition Specifically Reduces the Growth of Human Bladder Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 2003; (9): 3794-3800.)。"NGR序列"是指包含"Asn-Gly-Arg"在內(nèi) -類多肽序列，是最近發(fā)現(xiàn)的 一種腫瘤靶向配體，它能夠被表達(dá)于新生血管的氨基肽酶N (CD13)特異性 的識別，由于腫瘤生長迅速，血管生長旺盛，CD13多表達(dá)于腫瘤組織和腫瘤 細(xì)胞(Corti A, Ponzoni M, Tumor vascular targeting with tumor necrosis factor alpha and chemotherapeutic drugs. Ann N Y Acad Sci. 2004;1028:104-12.)。與其 它腫瘤靶向配體不同的是，"NGR序列"不僅能夠與CD13陽性腫瘤細(xì)胞結(jié)合， 更能特異的靶向腫瘤組織的新生血管，相對于靶向腫瘤細(xì)胞的配體而言，它更 有利于縮合體突破微循環(huán)障礙這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)的瓶頸。Moffatt.S等制備了 CNRGC-PEG-PEI/DNA-beta縮合體，在體外實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染CD 13陽性的肺癌 細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的效率是 PEG-PEI/DNA-beta的5倍，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)的熒光強(qiáng)度是肺臟的 12倍，充分證明了"NGR序列"的腫瘤靶向性(Moffatt S, Wiehle S, Cristiano RJ, Tumor-specific gene delivery mediated by a novel peptide- polyethylenimine-DNA polyplex targeting aminopeptidase N/CD13. Hum Gene Ther. 2005;16(l):57-67.)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服納米藥物體內(nèi)腫瘤靶向性差的難題，提供一種新型廣譜納米藥物載體的靶向修飾劑合成多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供合成多肽在制備用于預(yù)防和治療腫瘤的納 米藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)納米載體的一般特性設(shè)計(jì)了一系列的多肽分子，適用于表面呈 電負(fù)性、中性和弱陽性的納米載體的耙向修飾。—種合成多肽(NGR多肽)，包含"Asn-Gly-Arg"序列，其氨基酸序列為X-Asn-Gly-Arg-Y-Z其中Asn-Gly-Arg為氨基酸序列，X選自Gly或Cys， Y選自非堿性氨 基酸殘基，Z由Lys或包括Lys在內(nèi)的5 50個(gè)氨基酸的殘基組成。所述非堿性氨基酸殘基Y的非堿性氨基酸指除賴氨酸、精氨酸和組氨酸以 外的其他氨基酸。所述氨基酸的殘基Z由Lys所組成或由Lys和其他氨基酸的殘基組成，Lys 的數(shù)量占總氨基酸殘基數(shù)的摩爾百分含量不少于40%。Asn表示英文名稱為asparagine，中文名稱為天冬酰胺的氨基酸的相應(yīng)殘 基,簡稱N。Gly表示英文名稱為glycine,中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基，簡稱G。Arg表示英文名稱為arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基,簡 稱R。Cys表示英文名稱為cysteine,巾文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基, 簡稱C。Lys表示英文名稱為lysine,中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基,簡稱K。本發(fā)明所涉及的多肽序列，包括式(I )所表示的片段、類似物和同族物 以及他們的衍生物，如反手鏈、反向序列及Cys殘基間在自然條或?qū)嶒?yàn)室條件 下所形成的新序列。上述合成多肽與納米藥物載體結(jié)合制成的納米藥物具有腫瘤耙向性，用于 預(yù)防和治療腫瘤，其中納米藥物載體為納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、納米粒、 聚合物膠束中的一種，或其縮合體的一種。納米脂質(zhì)體英文名稱為nanoliposome，其特征在于， 一種由磷脂雙分子 層組成的閉合囊泡，其粒徑在10nm到1000nm之間；固體脂質(zhì)納米粒英文名稱為solid lipid nanopartices (SLN)，其特征在于， 一種將藥物包裹于類脂材料中制成的固體顆粒，其粒徑在10nm到1000nm之 間；納米粒英文名稱為nanoparticles(NP),其特征在于， 一種以聚合物固態(tài)膠 體顆粒為載體，以一定方式與藥物結(jié)合而制成的制劑，包括納米球(nanospheres, NS)和納米囊(nanocapsules， NC)。其粒徑在10 nm至U 1000 nm之間；縮合體英文名稱為condensates,其特征在于， 一種以多聚陽離子和高價(jià) 金屬離子為載體，與核酸通過靜電力結(jié)合后，巻曲、塌陷、緊縮后形成的非病 毒基因載體，其粒徑10nm到1000nm之間；聚合物膠束其特征在于， 一種以同時(shí)具有親水集團(tuán)和疏水基團(tuán)，由親水 和熟水高分子組成的二嵌段共聚物在水中形成的膠束為載體，以一定方式與藥 物結(jié)合而制成的制劑，其粒徑在10nra到1000nm之間。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明所涉及的多肽序列，源于以納米藥物載體為底物的靶向修飾研究， 實(shí)驗(yàn)顯示上述多肽序列明顯提高了納米藥物載體的靶向性，顯著提高了納米制 劑對腫瘤生長的抑制作用。本發(fā)明所涉及的合成多肽可用于納米載體的靶向修飾，對納米載體表面的 化學(xué)基團(tuán)沒有特殊要求，適用于各種表面呈電負(fù)性、中性和弱陽性的納米載體 的耙向修飾，為非病毒納米藥物載體的靶向修飾提供了一種新穎的方法，在制 備用于預(yù)防和治療腫瘤的藥物中有著重要的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不局限于下列實(shí)施例。 實(shí)施例lNGR多肽(CNGRCK2HK3HKn， "H"指組氨酸殘基)修飾的ASON/L-PEI 縮合體的制備(l)。將反義寡聚核苷酸(ASON， 5'-CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3') 溶于含有5%葡萄糖、1 Q/。Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；將線型聚 乙烯亞胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5。/。葡萄糖、1%右旋糖 酐70的水溶液中，得L-PEI 、 NGR多肽混合溶液；將L-PEI/NGR混合液與 ASON溶液等體積混合，渦旋振蕩5 s，放置20 min ，得核酸濃度N/P (PEI 中氨基數(shù)/ASON中磷酸根殘基數(shù))為6.8 (6.5 PEI +0.3NGR)的縮合體混懸液。實(shí)施例2NGR多肽(GNGRCK6HK13HK7HK15， "H"指組氨酸殘基)修飾的 ASON/L-PEI縮合體的制備(2)。將反義寡聚核苷酸(ASON， 5'國CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3') 溶于含有5%葡萄糖、"/。Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；將線型聚 乙烯亞胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5M葡萄糖、1%右旋糖 酐70的水溶液中，得L-PEI 、 NGR多肽混合溶液；將L-PEI/NGR混合液與 ASON溶液等體積混合，渦旋振蕩5 s，放置20 min ，得核酸濃度N/P (PEI 中氨基數(shù)/ASON中磷酸根殘基數(shù))為6.8 (6.5 PEI +0.3NGR)的縮合體混懸液。NGR多肽(CNGRSK5， "S"指絲氨酸殘基)修飾的ASON/L-PEI縮合體 的制備(3)。將反義寡聚核苷酸(ASON， 5'-CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3') 溶于含有5%葡萄糖、"/。Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；將線型聚 乙烯亞胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5。/。葡萄糖、1%右旋糖 酐70的水溶液中，得L-PEI 、 NGR多肽混合溶液；將L-PEI/NGR混合液與ASON溶液等體積混合，渦旋振蕩5 s，放置20 min ,得核酸濃度N/P (PEI 中氨基數(shù)/ASON中磷酸根殘基數(shù))為6.8 (6.5 PEI +0.3NGR)的縮合體混懸液。 實(shí)施例4NGR多肽(GNGRCK5Q)修飾的他莫昔芬聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制 備(l)。取pH為1.5的鹽酸水溶液適量，加入一定量的右旋糖酐-70和他莫昔芬， 攪拌溶解后，緩慢滴加適量的氰基丙烯酸正丁酯(5 d/min)，繼續(xù)攪拌6h; 0.45)im 的垂融玻璃漏斗過濾，取濾液置于透析袋(截留分子量8000 12000)中， 于10體積的pH為1.5的鹽酸水溶液中進(jìn)行透析，每8h換水一次，透析24h; 透析結(jié)束后，以lmol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，加入適量的NGR多肽， 緩緩攪拌30min，即得。實(shí)施例5NGR多肽(GNGRCK5NK7NK9HK17， "H"指組氨酸殘基)修飾的他莫昔 芬聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備(2)。取pH為L5的鹽酸水溶液適量，加入一定量的右旋糖酐-70和他莫昔芬， 攪拌溶解后,緩慢滴加適量的氰基丙烯酸正丁酯(5 d/min)，繼續(xù)攪拌6h; 0.45pm 的垂融玻璃漏斗過濾，取濾液置于透析袋(截留分子量8000 12000)中， 于10體積的pH為1.5的鹽酸水溶液中進(jìn)行透析，每8h換水一次，透析24h; 透析結(jié)束后，以1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，加入適量的NGR多肽， 緩緩攪拌30min，即得。NGR多肽(GNGRDK5QK7QK19， "D "指天冬氨酸，"Q"指谷氨酰胺殘 基)修飾的質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體的制備。取l-棕櫚酰-2-油酰-磷脂酰膽堿(POPC)、雙十二垸基二甲基溴化銨 (DDAB)、 2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、 2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG2,)各適量，置于圓底燒瓶中，加入于氯仿/乙醇混合液適量，振搖使脂質(zhì)完全溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，常溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑得均勻干膜。加入Tris，HCl緩沖溶液，超聲分散。加入超螺旋的質(zhì)粒DNA適量，渦旋 振蕩2min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分水分，將圓底燒瓶放入干冰冷凍5min，取出放 入水浴鍋，4(TC水浴2min，重復(fù)本步操作10次。加入超純水適量稀釋，渦旋 混勻。依次用400 nm， 200 nm， 100 nm和50 nm的聚碳酸酯膜加壓過濾。加 入胰腺內(nèi)切酶I和外切酶m， 37 °C孵育lh，加入EDTA溶液。用瓊脂糖凝膠 柱，以PI^7.0的HEPES緩沖溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。最后加入NGR多肽適 量，緩緩攪拌30min，即得產(chǎn)物。NGR多肽(GNGRCK SK13NK17， "S"指絲氨酸殘基)修飾的質(zhì)粒DNA 脂質(zhì)體的制備。取l-棕櫚酰-2-油酰-磷脂酰膽堿(POPC)、雙十二烷基二甲基溴化銨 (DDAB)、 2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、 2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG2,)各適量，置于圓底燒瓶中，加入于氯仿/乙醇混合液適量， 振搖使脂質(zhì)完全溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，常溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑得均勻干 膜。加入TrisflCl緩沖溶液，超聲分散。加入超螺旋的質(zhì)粒DNA適量，渦旋 振蕩2min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分水分，將圓底燒瓶放入干冰冷凍5min，取出放 入水浴鍋，4(TC水浴2min，重復(fù)本步操作10次。加入超純水適量稀釋，渦旋 混勻。依次用400nm， 200 nm， 100 nm和50 nm的聚碳酸酯膜加壓過濾。加 入胰腺內(nèi)切酶I和外切酶m， 37 °C孵育lh，加入EDTA溶液。用瓊脂糖凝膠 柱，以PH-7.0的HEPES緩沖溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。最后加入NGR多肽適 量，緩緩攪拌30min，即得產(chǎn)物。NGR多肽(GNGRCK5HK HK13HK14， "H"指組氨酸殘基)修飾的紫杉 醇固體脂質(zhì)納米粒的制備取紫杉醇和硬脂酸適量，加入一定量的丙酮，振蕩混合均勻，超聲使其充分溶解。加入適量的卵磷脂和DSPE，微熱使其溶解，得有機(jī)相。另取F68和 DSPE-PEG，Q適量，置于圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水，超聲使其充分溶 解，加熱使溫度保持在74士3X:，得水相。攪拌下將有機(jī)相注入水相中，繼續(xù)攪 拌，使丙酮完全揮發(fā)并濃縮至水相體積的1/2左右。取出反應(yīng)殘液，將另外一 份等體積的水相快速注入反應(yīng)殘液中，攪拌下加入適量的NGR多肽，繼續(xù)攪 拌3h，即得。 實(shí)施例9NGR多肽(CNGRCK3FK2YK3FK5， "F"指苯丙氨酸，"Y"酪氨酸)修飾 的紫杉醇兩親性嵌段共聚物納米囊的制備。以熔融縮聚反應(yīng)合成聚乙二醇單甲醚-b-聚(D,丄-乳酸)兩親性二嵌段共聚物 (PEDLLA)，將適量的紫杉醇和PEDLLA溶于丙酮，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至60°C 蒸發(fā)2h，得到紫杉醇共聚物固體基材；真空干燥，2X: 8t:儲(chǔ)存。制備PMT 時(shí)，紫杉酚共聚物固體基材在6(TC恒溫水浴中預(yù)熱至透明膠狀，渦流攪拌下加 入60。C的超純水，形成載藥納米囊分散液，3 000 r/min離心30 min.取上清， 加入適量的NGR多肽，攪拌30min，即得。
權(quán)利要求
1.一種合成多肽，包含“Asn-Gly-Arg”序列，其氨基酸序列為 X-Asn-Gly-Arg-Y-Z其中Asn-Gly-Arg為氨基酸序列，X選自Gly或Cys，Y選自非堿性氨基酸殘基，Z由Lys或包括Lys在內(nèi)的3～50個(gè)氨基酸的殘基組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成多肽，所述非堿性氨基酸殘基Y的非堿性 氨基酸指除賴氨酸、精氨酸和組氨酸以外的其他氨基酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成多肽，氨基酸的殘基Z由Lys所組成或由 Lys和其他氨基酸的殘基組成，Lys的數(shù)量占總氨基酸殘基數(shù)的摩爾百分含量不 少于40%。
4. 權(quán)利要求1 3任一合成多肽與納米藥物載體結(jié)合制成的納米藥物具有 腫瘤耙向性，用于預(yù)防和治療腫瘤，其中納米藥物載體為納米脂質(zhì)體、固體脂 質(zhì)納米粒、納米粒、聚合物膠束中的一種，或其縮合體的一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含“Asn-Gly-Arg”序列的合成多肽，其氨基酸序列為X-Asn-Gly-Arg-Y-Z，其中Asn-Gly-Arg為氨基酸序列，X選自Gly或Cys，Y選自非堿性氨基酸殘基，Z由Lys或包括Lys在內(nèi)的3～50個(gè)氨基酸的殘基組成。本發(fā)明的合成多肽可用于納米載體的靶向修飾，對納米載體表面的化學(xué)基團(tuán)沒有特殊要求，適用于各種表面呈電負(fù)性、中性和弱陽性的納米載體的靶向修飾，為非病毒納米藥物載體的靶向修飾提供了一種新穎的方法，在制備用于預(yù)防和治療腫瘤的藥物中有著重要的應(yīng)用。
文檔編號C07K7/00GK101220083SQ200810049169
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者周天洋, 張振中 申請人:鄭州大學(xué)