專利名稱：酰胺衍生物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酰胺衍生物及其用途，具體地說，涉及一種N-(4-取代氨?；交?-5-取 代呋喃-2-曱酰胺類化合物及其用途。
背景技術：
痞疾是地球上發(fā)生最頻繁的寄生蟲病，是由按蚊進行傳播、具有潛在致命危險的疾病。 隨著已有抗癡藥物的耐藥性的不斷增加，疰疾的發(fā)病率日益增加，亟待具有新型治療作用的 抗痗藥物的發(fā)現。
紅細胞內期的癡原蟲在其酸性食物泡內水解宿主的血紅蛋白以獲得自身生命所需的能量 和氨基酸。生物學研究表明，在瘧原蟲的食物泡內包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶 (plasmepsins),半胱氨酸蛋白酶(falcipains),和金屬蛋白酶(falcilysins)。這些酶已成為疰疾 化學治療的潛在的靶標。
半胱氨酸蛋白酶是Mi約為21000~30000的蛋白質，在pH值為4~6.5時具有最高水解活 性，它的活性部位具有半胱氨酸殘基。癡原蟲的半胱氨酸蛋白酶屬于木瓜蛋白酶家族。已知 的癥原蟲半胱氨酸蛋白酶有四個亞型，falcipain-l, falcipain-2A, falcipain-2B, falcipain-3。 Falcipain 1是第一個表達得到的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶，其生物學研究表明，它對瘧原蟲的 無性生殖階段并無影響，但能顯著的影響卵嚢的功能。Falcipain-2A, falcipain-2B具有97 % 的同源性，僅在氨基酸序列的7位有所不同。通過寡核苦酸探針的監(jiān)測發(fā)現，falcipain-2B mRNA的表達水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在瘧原蟲營養(yǎng)體晚期 其表達的時間依賴性和峰值極為相似，這表明兩種不同的亞型具有相似的生物學功能。 Falcipain-3與falcipain-2在催化域有66.6 %的同源性，但是它們表達的階段有所不同。 Falcipain-2在營養(yǎng)體階段表達達到最高峰，而falcipain-3在更為成熟的疸原蟲階段表達達到高 峰。在這幾種亞型中，對于falcipain-2的研究最多，因此其抑制劑的開發(fā)亦受到更為廣泛的 關注。
近年來，"計算機輔助藥物設計"(Computer-Aided Drug Design, CADD)已成為現代藥物研 究與開發(fā)的一個重要方法和工具。運用計算機輔助藥物設計平均而言能縮短新藥研究周期0.9 年，節(jié)省研究與開發(fā)費用1.3億美元。因此，CADD方法已廣泛地應用于先導化合物的發(fā)現與優(yōu)化。計算機輔助高通量虛擬已經成為目前常用的一種計算機輔助藥物發(fā)現方法。其原理 是運用超級計算機通過分子對接的方法在多達數百萬的小分子化合物庫中尋找可以與某一特 定疾病耙標蛋白結合的化學結構，為進一步的分子、細胞、動物和臨床研究提供高效可靠的 小分子先導化合物。
綜上所述，以半胱氨酸蛋白酶falcipain-2作為靶標，結合CADD和各種水平的生物活性 測試試驗，設計并合成的小分子化合物，對開發(fā)抗瘧藥物具有重要的現實意義。
本發(fā)明綜合運用CADD和基于BIAcore的SPR實驗，發(fā)明人已經找到了 一個N-(4-取代 氨?；交?-5-取代呋喃-2-曱酰胺化合物，運用合理藥物設計方法針對此化合物進行結構修 飾，并測試此類化合物在體外酶水平實驗測試中抑制falcipain-2的活性，結果證明其具有較 強的falcipain-2抑制活性。
本發(fā)明所說的N-(4-取代氨?；交?-5-取代呋喃-2-曱酰胺類化合物，具有式I所示結構
式I中R!為氫，d-C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷基，CrC7飽和或不飽和環(huán)烷基， 5-7元芳(香)環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元雜環(huán)基；
R2為甲基或R3OCH2-， R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基；X為C 或S=0;
其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自鹵素、CVC6 直鏈或支鏈烴基、羥基、Q-Q烷氧基、d-C4不飽和烴氧基、羧基、酯基、C廣C6羧基烷氧基、 C廣C6酯基烷氧基、C廣Cs羧基烷基、C廣C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羥曱基、三氟曱基、 三氟甲氧基、巰基或d-Ct?；幸环N、二種或二種以上，取代基的個數為l-4; 所述雜環(huán)基的雜原子為氧、硫或/和氮，雜原子的個數為1-3。 在本發(fā)明一個優(yōu)選技術方案中，X為S-O時，其具有式U所示結構
發(fā)明內容式U中Ri為氫，5-7元芳(香)環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取 代的5-7元雜環(huán)基；
R2為曱基或R3OCH2-, R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基； 其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自面素、 d-C6直鏈或支鏈烴基或d-C4烷氧基中一種、二種或二種以上，取代基的個數為l-4; 所述雜環(huán)基的雜原子為氮，雜原子的個數為1-3。
更優(yōu)選的R！為氫、含氮6元雜環(huán)基或由d-Ct烷氧基取代的含氮6元雜環(huán)基； 更優(yōu)選的R2為曱基或R3OCH2-， R3為6元芳(香)環(huán)基或取代的6元芳(香)環(huán)基，其 中所述的取代的6元芳(香)環(huán)基的取代基為卣素或d-C3烷基，取代基的個數為1 ~4。 在本發(fā)明另一個優(yōu)選技術方案中，X為C時，其具有式Ib所示結枸
式IB中R！為氫，5-7元芳(香)環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取
代的5-7元雜環(huán)基；
R2為R3OCH2-， R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基； 其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自鹵素、
C廣C6直鏈或支鏈烴基或CrQ烷氧基中一種、二種或二種以上，取代基的個數為l-4; 更優(yōu)選的R！為氫、含氮6元雜環(huán)基或由d-C4烷氧基取代的含氮6元雜環(huán)基； 更優(yōu)選的R2為R3OCH2-， R3為6元芳(香)環(huán)基或取代的6元芳(香)環(huán)基，其中所述
的取代的6元芳(香)環(huán)基的取代基為鹵素或C!-C3烷基，取代基的個數為1 ~ 4。


圖1陽性對(Z-Phe-Arg-pNAHCl)照和化合物IA-1與FP-2蛋白相結合的動力學曲線圖，
其中各條線由上到下代表的化合物濃度依次為1 x 10_5M、 5x 1(T6M、 2.5x 10—6M、 1.25 xlO—6M、 6.25xl(T7M、 3.125 x 10墨7 M和0。 圖2.化合物IA-1和IA-5的ICso值。
具體實施例方式
一種制備本發(fā)明所述的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺類化合物的方法，其 主要合成路線如下所示<formula>formula see original document page 7</formula>
合成路線中Ac為乙?；?CH3CO)， Y為卣素(F、 Cl、 Br或I), 的含義與前文所 述相同。
具體包括如下步驟 式U所示化合物的制備
1) 將5-氯曱基呋喃-2-曱酸曱酯、R3OH (如取代芳基盼)、無機堿與有機溶劑混合，回流 過夜；蒸除大部分溶劑，加水，有機溶劑萃取，干燥，蒸干溶劑，得到5-(取代芳基氧曱基) 呋喃-2-曱酸甲酯(式II所示化合物)。
2) 將步驟1)中得到的化合物II與無機石咸投入到適量曱醇中，5(TC攪拌過夜；蒸除大部 分溶劑，加水，用鹽酸調pH^，析出固體，抽濾得5-(取代芳基氧曱基)呋喃-2-曱酸(式III 所示化合物)。
3 )室溫下Ri取代胺在堿性溶液中與對-乙酰氨基苯磺酰氯反應，溫度在40°C ~ 45°C ，攪 拌12-36小時。將反應液傾入水中，有機溶劑萃取，得到的有機層經干燥，過濾，減壓蒸除 溶劑，殘余物柱層析分離得4-乙酰氨基-N-Ri取代苯磺酰胺。將此磺酰胺投入到10%的氫氧 化鈉水溶液中回流2小時，控制反應液溫度在70°C ~ 80。C，濃鹽酸調pH=4-5,析出大量固體，經抽濾，水洗，千燥得產物4-氨基-N-R！取代苯磺酰胺(式IV所示化合物)。
4 )將步驟2 )中得到的化合物投入適量卣代試劑中回流2小時，減壓濃縮得5-(取代芳基
氧曱基)呋喃-2-曱酰囟(式V所示化合物)，不經純化直接用于下步反應。
用少量干燥的鹵代烴(如二氯曱烷)溶解曱酰卣(式V所示化合物)。室溫攪拌下，滴入
步驟3)中得到的化合物IV與吡啶的混合溶液中。室溫反應過夜，加水，用鹽酸調pH二2 3,
析出固體，抽濾，水洗、干燥得到化合物N-[(4-Ri取代氨磺酰)苯基]-5-芳基氧曱基呋喃-2-曱
酰胺(目標化合物之一 )。 或
1) 將氫氧化鈉溶于水中，控溫0。C-5。C,依次滴加氧化劑(如溴等)和5-曱基呋喃-2-甲趁，維持此溫度，攪拌反應1 3小時，反應液用乙醚萃取兩次，水層用鹽酸調pH-l,析 出大量固體，抽濾，水洗得5-曱基呋喃-2-甲酸(式VII所示化合物)。
2) 將步驟1)中得到的化合物VII投入適量卣代試劑中回流2小時，減壓濃縮得5-甲基 呋喃-2-曱酰卣(式VIII所示化合物)，不經純化直接用于下步反應。
用少量干燥的鹵代烴(如二氯曱烷)溶解化合物VIII。室溫攪拌下，滴入4-氨基-N-R！取 代苯磺酰胺(式IV所示化合物)與吡啶的混合溶液中。室溫反應過夜，加水，用鹽酸調pH=2 ~ 3，析出固體，抽濾，水洗、干燥得到化合物N-[(4-R!取代氨磺酰)苯基]-5-曱基呋喃-2-甲酰胺 (目標化合物之二)
式lB所示化合物的制備
1) 在四氫呋喃溶劑中，Ri取代胺、對-硝基苯曱酰卣(對-硝基苯曱酰氯)和有機堿回流 反應，攪拌12 36小時。將反應液傾入水中，有機溶劑萃取，得到的有機層經干燥，過濾， 減壓蒸除溶劑，殘余物柱層析分離得4-硝基-N-R,取代苯曱酰胺。將此酰胺投入到10%Pd-C 的醋酸水溶液(70%, V/V)中反應30小時，控制反應液溫度在20°C ~40°C,抽濾，濃縮得 產物4-氨基-N-R！取代苯曱酰胺(式VI所示化合物)。
2) 5-(取代芳基氧曱基)呋喃-2-曱酰鹵(式V所示化合物)溶于少量干燥的鹵代烴(如二 氯甲烷)中，室溫攪拌下，滴入由步驟1)中得到的化合物VI與吡啶的混合溶液中。室溫反 應過夜，加水，用鹽酸調pH-2 3，析出固體，抽濾，水洗得化合物N-[(4-R!取代氨曱酰)苯 基]-5-芳基氧曱基呋喃-2-甲酰胺(目標物之三，式IB所示化合物)。
在以下的實施例中將進一步舉例說明本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。實施例中的所有參數以及其余的說明，除另有說明外，都是以質量(克) 為單位。實施例1
5-(4-氯-3-曱基苯氧曱基)呋喃-2-曱酸甲酯(化合物II-1)的制備
將2.5克5-氯曱基呋喃-2-曱酸曱酯、2.2克4-氯-3-曱基苯酚、2.6克碳酸鉀與40毫升乙 腈混合，回流過夜；蒸除大部分溶劑，加水，乙酸乙酯萃取，酯層干燥，蒸干溶劑，得到白 色固體3.8克，收率94.5%。 mp 56-58 °C; 'H-NMR (DMS0-4， 500 MHz) 3 2.29 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 5.14 (s, 2H)， 6.80 (d, 1H), 6.91 (dd, 1H)， 7.07 (d, 1H), 7.20 (d， 1H), 7.30-7.33 (m， 2H); MS (EI) 附/z 280 (M+)。
實施例2
5-(4-氯-3-曱基苯氧曱基)呋喃-2-曱酸(化合物III-1)的制備
將1.7克II-l與0.5克一水合氫氧化鋰投入到20毫升曱醇中，50 。C攪拌過夜。蒸除大 部分溶劑，加水，用鹽酸調pH = 1 ，析出固體，抽濾得白色固體(III-1) 1.58克，收率97.5%。 mp 194-195 °C; ^-NMR (DMSO隱c4, 500 MHz) <5 2.28 (s， 3H), 5.11 (s， 2H), 6.74 (d， 1H)， 6.89 (dd, 1H)， 7.05 (d, 1H), 7.20 (d, 1H), 7.30 (d, 1H); MS (EI) w/z 266 (M+)。
實施例3
4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(化合物IV-1)的制備
室溫下將1.0克4-乙酰氨基苯磺酰氯加入到1.87克6-曱氧基嘧啶-4-胺與15毫升的吡啶 溶液中，于45。C攪拌24小時。將反應液傾入水中，乙酸乙酯萃取，酯層用無水硫酸鎂干燥， 過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物柱層析分離(洗脫劑曱醇/氯仿=1:20)得4-乙酰氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺，為橙色固體1.36克，收率52.8%。mp 223-224 °C; 'H-NMR(DMSO-^， 500 MHz) 5 2.07 (s, 3H)， 3.84 (s, 3H)， 6.33 (s, 1H)， 7.75 (d, 2H), 7.86 (d， 2H)， 8.41 (s, 1H); MS (EI) 油322(M+)。
將1.2克4-乙酰氨基-N. (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺投入到15毫升10%的氫氧化鈉水 溶液中回流2小時；控制反應液溫度在70-80 。C之間，濃鹽酸調pH-4 5,析出大量固體， 經抽濾，水洗，千燥得4-氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)，為黃色固體，0.58 克，收率55.9%。 mp 201-203 。C; 'H-NMR (DMSO-^， 500 MHz) <5 3.81 (s, 3H), 6.29 (s, 1H)， 6.57 (d， 2H)， 7.53 (d， 2H), 8.37 (s， 1H); MS (EI) w/z 280 (M^。實施例4
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-甲酰胺(IA-1)的制 備
將0.5克II-l與3毫升二氯亞^5風混合，回流攪拌2小時，減壓濃縮，殘余物用少量干燥 的二氯曱烷溶解。將上述溶液于室溫攪拌下，滴入0.58克IV-1與吡啶的混合溶液中。室溫反 應過夜，加水，用鹽酸調pH-2~3,析出固體，水洗，得到白色固體(Ia-1 )0.5克，收率50.5%。 mp 134-136 。C; 'H- NMR (DMS0-4 500 MHz) <5 2.28 (s， 3H)， 3.77-3.81 (m, 5H)， 6.28 (s， 1H)， 6.81 (d, 1H)， 6.91 (dd, 1H), 7.86-7.92 (m， 6H)， 8.36 (s， 1H); MS (EI) w/z 528 (M+)。
實施例5
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物IA的一種 (IA-2))的制備
將4-氯-3-甲基苯酚替換成4-氯苯酚，其余所需原料、試劑及制備方法同實施例1-4,得 棕色固體0.33克，收率32.8% (最后一步收率)。mp 71-74 。C; 'H-NMR (DMSO-c4, 500 MHz) 3 3.94 (s, 3H), 4.93 (s, 2H), 6.62 (d， 2H), 6.66 (d, 1H)， 6.95 (d, 2H)， 7.00 (d, 1H)， 7.23 (s, 1H), 7.34 (d， 2H)， 7.55 (d, 2H), 8.57 (s, 1H); MS (EI)附/z 515 (M+)。
實施例6
N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(3-甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物IA的一 種(U-3))的制備
將4-氯-3-甲基苯酚替換成3-曱基苯酚，其余所需原料、試劑及制備方法同實施例1-4, 得淡黃色固體0.87克，收率81.1%(最后一步收率)。mp 195-197 。C; ^- NMR (DMS0-4， 500 MHz) 3 2.29 (s, 3H)， 3.85 (s， 3H)， 5.14 (s, 2H), 6.35 (s, 1H)， 6.81 (t， 2H), 6.85 (m， 1H), 6.88 (s, 1H)， 7.19 (t, 1H), 7.41 (m, 1H)， 7.90-7.95 (m, 4H), 8.42 (s， 1H); MS (EI) m/z 494 (M"^
實施例7
N一[[(4-(6-曱氧基嗜啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧曱基)呋喃-2-甲酰胺(化合物IA的一種(U-4)) 的制備
將4-氯-3-曱基苯酚替換成苯酚，其余所需原料、試劑及制備方法同實施例1-4,得淡黃 色固體1.01克，收率92.4% (最后一步收率)。mp 195-196 。C; !H-NMR (DMSO-^， 500 MHz) 3 3.85 (s, 3H), 5.16 (s, 2H)， 6.35 (s， 1H)， 6.82 (d, 1H), 6.99 (t, 1H)， 7.06 (d， 2H), 7.33 (t, 2H)， 7.41 (m， 1H)， 7.90-7.96 (m， 4H)， 8.42 (s, 1H); MS (EI) w/z 480 (M+)。實施例8
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2，4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化 合物IA的一種(U-5))的制備
將4-氯-3-曱基苯酚替換成2,4-二氯-3,5-二曱基苯酚，其余所需原料、試劑及制備方法同 實施例1-4,得淡黃色固體0.4克，收率92.4% (最后一步收率)。mp 214-216 。C; "H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) S 2.34 (s， 3H)， 2.40 (s， 3H),3.74 (s， 3H)， 5.23 (s, 2H), 6.08 (s，lH)， 6.83 (d, 1H), 7.27 (s， 1H), 7.40 (d， 1H)， 7.78-7.81 (m, 4H), 8.20 (s， 1H); MS (EI) m/z 576 (M+)。
實施例9
N-(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-甲酰胺(化合物IA的一種(U-6))的制 備
將4-氨基-N- ( 6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替換成4-氨基苯磺酰胺，其余所需原 料、試劑及制備方法同實施例1、 2、 4,得淡黃色固體0.52克，收率65.4% (最后一步收率)。 mp 216-217 °C; 'H-NMR (DMSO-of6， 500 MHz) <5 2.31 (s， 3H)， 5.16 (s， 2H), 6.83 (d, 1H), 6.93 (dd, 1H), 7.09 (d, 1H)， 7.33 (d， 1H), 7.41 (m， 1H), 7.80 (d, 2H), 7.92 (m， 2H); MS (EI) w/z 420 (M+)。
實施例10
4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯曱酰胺(化合物VI-1)的制備
在四氫呋喃溶劑中，6-曱氧基嘧啶-4-胺、4-硝基苯曱酰氯和吡啶回流反應，攪拌12小時。 將反應液傾入水中，二氯曱烷萃取，得到的有機層經干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物柱 層析分離得4-硝基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯曱酰胺。將此酰胺投入到10% Pd-C的醋酸水溶液 (70%， V/V)中反應30小時，控制反應液溫度在20 40。C之間，抽濾，濃縮得產物4-氨基 -N-(6-T氧基嘧啶-4-)笨曱酰胺(VI-1),直接投入下步反應。
實施例11
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨?；鵠苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(IB-1)的制 備
將4-氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替換成4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯 曱酰胺VI-l,其余所需原料、試劑及制備方法同實施例1、 2、 4，得白色固體0.26克，收率 28.6% (最后一步收率)。mp 216-219 。C; 'H陽NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 3 2.29 (s, 3H)， 3.92 (s, 3H)， 5.15 (s，2H)， 6.81 (d， 1H)， 6.91 (dd， 1H)， 7.08 (d,lH)， 7.32 (d，lH)， 7.40 (d，lH)， 7.60 (s,lH)， 7.88 (d，2H), 8.03 (d,2H), 8.60 (s, 1H); MS (EI) w/z 492 (M+)。實施例12
N-(4-氨酰基苯基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物iB的一種(lB-2))的制 備
將4-氨基-N- (6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替換成4-氨基苯甲酰胺，其余所需原 料、試劑及制備方法同實施例1、 2、 4,得白色固體0.36克，收率49.3% (最后一步收率)。 mp 244-245 。C; 'H-NMR (DMSO-c4， 500 MHz) <5 2.31 (s， 3H)， 5.16 (s, 2H)， 6.82 (d， 1H)， 6.93 (dd， 1H), 7.09 (d， 1H), 7.33 (d, 1H), 7.39 (d, 1H)， 7.82 (d, 2H), 7.87 (d, 2H); MS (EI) w/z 384 (M+)。
實施例13
將2.9克氫氧化鈉溶于15毫升水中，控溫2。C 3。C, 一次滴加2克溴和1克5-曱基呋喃 -2-曱醛，加畢，控溫0 5。C攪拌反應1小時。反應液用乙醚萃取兩次(5 mLx2),水層用濃 鹽酸調pH= l,抽濾，水洗得黃色固體產物5-曱基呋喃-2-曱酸0.63克，收率55.3%。mp 109-110 。C; 'H-NMR (DMSO-A, 500 MHz) 3 2.34 (s， 3H), 6.29 (d, 1H), 7.12 (d, 1H)。
實施例14
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-曱基呋喃-2-甲酰胺(化合物Ia-7)的制備
以5-曱基呋喃-2-甲酸為原料，其余所需原料、試劑及制備方法同實施例3-4，得淡黃色固 體0.79克，收率51.2%(最后一步收率)。mp 234-236 。C; 'H-NMR (DMSO-d6， 400 MHz) 32.37 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 6.33 (s, 2H)， 7.27 (s, 1H)， 7.90 (m, 4H), 8.39 (s， 1H); MS (EI) w/z 388 (M+)。
實施例15
N-(4-氨磺酰苯基)-5-甲基呋喃-2-曱酰胺(化合物U-8)的制備
以5-曱基呋喃-2-曱酸和4-氨基苯磺酰胺為原料，其余所需原料、試劑及制備方法同實施 例4，得淡黃色固體0.98克，收率88.3%(最后一步收率)。mp 249-262 。C; 'H-NMR (DMSO-A, 400 MHz) S 2.38 (s， 3H), 6.33 (s, 1H)， 7.27 (s， 1H), 7.76 (d, 2H)， 7.89 (s， 2H); MS (EI)附/z 280 (M+)。
實施例16
本發(fā)明化合物IA-1與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定
Falcipain-2蛋白酶與IA-1結合活性的篩選和動力學常數的測定基于SPR (表面等離子共 振)原理，使用的儀器是Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)。
(1) Falcipain-2質粒(pQE30-Fa12)的構建
根據Falcipain-2 cDNA序列設計引物，正向和反向《I物分別為 5 ， CGTGG ATCCC AAATG AATTATGA AG3 ，和5'ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含Ba附///和SaZ /酶切位點，通過PCR 擴增Falcipain-2片段，將酶切后的PCR產物和表達載體pQE30連接后鑒定正確，轉化入大 腸桿菌M15 (Qiagen)進行表達。
(2) Falcipain-2 (FP-2)蛋白的表達與純化
將構建好的質粒pQE30-Fa12轉入大腸桿菌M15中得到表達工程菌，將工程菌培養(yǎng)于含 100嗎/mL氨千青霉素和50ng/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(蛋白胨10g/L, 酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L)。然后按1:100轉接入1 L含氨節(jié)青霉素和卡那霉素的新鮮 LB培養(yǎng)基中，37° C下，220轉/分培養(yǎng)。當OD600達到約0.8時，加入IPTG至終濃度0.5 mM, 同時將溫度降到25°C培養(yǎng)12小時進行蛋白的誘導表達。4000轉/分離心30分鐘收集菌體， 收集好后放于-80。C超低溫冰箱保存過夜。將菌體用20 mL的buffer 1 (20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, and 10 mM imidazole, pH 8.0)懸起，將懸浮液冰浴上超聲波破碎(300 W，工作30分 鐘， 一次5秒，中間間隔10秒)。破碎后得到的細胞勻漿在4 °C，以10000轉/分離心30分 鐘，棄上清，用20 mL的buffer 2 (6 M guanidine HCl 20 mM Tris-Cl 250mM NaCl 20 mM imidazole, pH 8.0)溶解沉淀，室溫下溫和攪拌l小時，10000轉/分離心30 min,并將上清上 樣到用Binding buffer 2 (6 M guanidine HCl, 20 mM Tris-Cl, 250 mM NaCl, pH 8.0)平衡好的Ni2 +-NTA柱上，先后用Wash buffer 1 (8 M urea, 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl pH 8.0)和Wash buffer 2 (8 M urea, 20 mM Tris-Cl, 30mM imidazole)各30ml洗去非特異性結合的雜蛋白，再用 Elution buffer (8 M urea, 20 Mm Tris-Cl， 1 M imidazole) 10 ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE檢 測蛋白的分子量和純度。
(3) FP-2包涵體蛋白的復性
將純化得到的蛋白加入10 mM DTT, 37 °C下溫浴45分鐘后，將蛋白溶液稀釋到10 pg/ml 進行透析(透析液訓mMTris-Cl， ImMEDTA, 20% glycerol, 250 mM L-arginine， ImM GSH， ImMSSG, pH 8.0)過夜。將透析好的蛋白濃縮即可用作酶抑制活性的測定。
(4) FP-2蛋白的偶聯
徹底清洗Biacore 3000機器后，用HBS-EP緩沖液(10 mM Hepes, 150 mM NaCl， 3 mM EDTA and 0.005% (v/v) surfactant P20, pH 7.4)平衡機器至基線平穩(wěn)。0.2M N-ethyl-N，-dimethylaminopropyl carbodiimide(N-乙基-N，-二曱基氨丙基碳二亞胺)和50mMM N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS )1:1混和，以5 pL/min進樣7分鐘以活化芯片表面。FP-2 蛋白用lOmM乙酸鈉，pH4.2，稀釋至終濃度為69 pg/ml,以5 pL/min流速進樣。最后，用 1 M鹽酸乙醇胺,pH 8.5以5 pL/min流速進樣7分鐘，封閉芯片表面，最終FP-2蛋白的偶聯量為9300RU左右。
(5) 化合物篩選
底物Z-Phe-Arg-pNA HC1 (Bachem AG)作為陽性對照。IA-1用100% DMSO溶解，母液 濃度為10mM。用HBS-EP緩沖液稀釋化合物，至終濃度為1 (aM和10 jxM, DMSO的終濃 度為0.1%。根據IA-1與芯片上FP-2蛋白的結合的RU ( Response Unit,共振單位)值，判 斷化合物是否具有結合活性。有結合活性的化合物可進行詳細的動力學實驗。結果證明IA-1 與FP-2蛋白有明顯的結合。
(6) 動力學測定
IA-1用工作緩沖液HBS-EP (含0.1% DMSO),分別配成不同的濃度梯度，以30 nl/min 進樣1 min,解離2 min，然后用相同緩沖液穩(wěn)定2 min。得到IA-1與FP-2蛋白相互作用的傳 感圖，再用Biacore分析軟件中的1 : 1 (Langmuir)結合模型或穩(wěn)態(tài)模型進行擬合，得到確切 的動力學和熱力學常數。
(6)試驗結果表1陽性對照和IA-1與FP-2蛋白結合常數的測試結果
表1
序號編號
1Ia-149.0
2Z-Phe-Arg-pNA.HCl~32.1
實施例17本發(fā)明化合物對falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的測定
(1) Falcipain-2 (FP-2)蛋白的表達與純化和FP-2包涵體蛋白的復性 參見實施例16
(2) 本發(fā)明化合物對FP-2酶抑制活性的測定
在197 的100 mM NaOAc, 10 mM DTT, pH 5.5的buffer體系中加入FP-2蛋白(終 濃度10 pg/ml)和溶于DMSO的待測化合物溶液，終濃度10 和0 (陰性對照)，室溫下 孵育30 min后用MD SpectraMax M5酶標儀于excitation 355腿；emission 460腿處連續(xù)測15 min內的RFU值，計算出反應速率Km，以下列公式得出待測化合物在10 jaM下百分抑制率，
計算公式為
(對照組Km值-實驗組Km值)/對照組Km值x100 %(3)化合物活性測試結果見表2.: N-(4-取代氨?；交?-5-取代呋喃-2-甲酰胺類化合物對 falcipain-2抑制率數據表2.
序號編號抑制率(％, 10pM)
1U-l59.7
2Ia-210.7
3Ia-311.6
4Ia-49.3
5Ia-564.8
6Ia-622.4
7Ib-134.0
8Ib-230.0
9Ia-74.9
10Ia-80
實施例18
本發(fā)明部分化合物對falcipain-2蛋白酶半數有效抑制濃度(IC5o)的測定
選取10 nM抑制率在50 %以上的化合物測IC5o,選擇合適的化合物濃度梯度，實驗方法 和體系如實施例17 。根據化合物在不同濃度下FP-2酶活的反應速率Km ，計算化合物在不同 濃度下對FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin軟件進行擬合得到化合物的IC50 值，結果見表3 N-(4-取代氨酰基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺類化合物對falcipain-2酶活抑制IC50 和圖2。表3.
序號編號
17.08
2Ia-53.71本發(fā)明的^(4-取代氨?；交?-5-取代呋喃-2-曱酰胺類化合物的制備方法具有反應條件 溫和、原料豐富易得、操作及后處理簡單等優(yōu)點，且本發(fā)明的化合物毒性很低。
本發(fā)明的N-(4-取代氨?；?-5-取代呋喃-2-曱酰胺類化合物在計算機虛擬篩選以及在 falcipain-2蛋白酶結合試驗和酶抑制試驗中均顯示了陽性結果。應證了其藥理作用機制。因此， 本發(fā)明的化合物可用于制備falcipain-2抑制劑。
權利要求
1、一種酰胺衍生物，其具有式I所示結構式I中R1為氫，C1-C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷基，C3-C7飽和或不飽和環(huán)烷基，5-7元芳(香)環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元雜環(huán)基；R2為甲基或R3OCH2-，R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基；X為C或S＝O；其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自鹵素、C1-C6直鏈或支鏈烴基、羥基、C1-C4烷氧基、C1-C4不飽和烴氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羥甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巰基或C1-C4?；幸环N、二種或二種以上，取代基的個數為1～4；所述雜環(huán)基的雜原子為氧、硫或/和氮，雜原子的個數為1～3。
2、 如權利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X為S=0時，R,為氫，5-7元芳(香) 環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元雜環(huán)基；R2為曱基或R3OCH2-， R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基；其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自鹵素、 C,-C6直鏈或支鏈烴基或CrC4烷氧基中一種、二種或二種以上，取代基的個數為l-4;所述 雜環(huán)基的雜原子為氮，雜原子的個數為1 3。
3、 如權利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中Ra為氫、含氮6元雜環(huán)基或由 d-C4烷氧基取代的含氮6元雜環(huán)基。
4、 如權利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R2為曱基或R3OCH2-， R3為6 元芳(香)環(huán)基或取代的6元芳(香)環(huán)基，其中所述的取代的6元芳(香)環(huán)基的取代基 為卣素或d-C3烷基，取代基的個數為1 ~ 4。
5、 如權利要求3或4所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物為N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧 啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯 基]-5-[(3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧曱基)呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2,4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧曱基] 呋喃-2-曱酰胺、^(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧 基嗜啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-曱基呋喃-2-曱酰胺或N-(4-氨磺酰苯基)-5-曱基呋喃-2-曱酰胺。
6、 如權利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X為C時，Ri為氫，5-7元芳(香) 環(huán)基，5-7元雜環(huán)基，取代的5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元雜環(huán)基；R2為R3OCH2-， R3為5-7元芳(香)環(huán)基或取代的5-7元芳(香)環(huán)基；其中，所述取代的5-7元芳(香)環(huán)基和取代的5-7元雜環(huán)基中的取代基選自囟素、 C廣C6直鏈或支鏈烴基或C廣C4烷氧基中一種、二種或二種以上，取代基的個數為1 4。
7、 如權利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中Ra為氫、含氮6元雜環(huán)基或由 C廣C4烷氧基取代的含氮6元雜環(huán)基。
8、 如權利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R2為R3OCH2-， R3為6元芳(香) 環(huán)基或取代的6元芳(香)環(huán)基，所述的取代的6元芳(香)環(huán)基的取代基為卣素或d-Q 烷基，取代基的個數為1-4。
9、 如權利要求7或8所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物為N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨酰基]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺或N-(4-氨?；?基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺。
10、 如權利要求l、 2、 3、 4、 6、 7或8所述的酰胺衍生物在制備由瘧原蟲引起的瘧疾的 治療藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酰胺衍生物及其用途。本發(fā)明公開了一類N-(4-取代氨?；交?-5-取代呋喃-2-甲酰胺化合物，并測試該類化合物在體外酶水平實驗測試中抑制falcipain-2的活性，結果證明其具有較強的falcipain-2抑制活性。因此，本發(fā)明所提供的N-(4-取代氨?；交?-5-取代呋喃-2-甲酰胺類化合物可作為瘧原蟲食物泡內半胱氨酸蛋白酶(falcipain-2)抑制劑，從而阻止瘧原蟲在宿主體內的進一步增殖。
文檔編號C07D405/12GK101565418SQ200810036510
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權日2008年4月23日
發(fā)明者劉彥青, 盧偉強, 希金弗, 進 朱, 劍 李, 李洪林, 旭 沈, 夫 洛, 蔣華良, 鵬 車, 曈 陳, 陳莉莉, 瑾 黃 申請人:華東理工大學;中國科學院上海藥物研究所