專利名稱：解聯(lián)蛋白變體及其藥學(xué)用途的制作方法
解聯(lián)蛋白變體及其藥學(xué)用途 與相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用,而該整 聯(lián)蛋白的抑制劑被認(rèn)為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥llj、溶骨性轉(zhuǎn)移13j和惡性腫瘤誘 導(dǎo)的高釣血癥.本發(fā)明的另一方面是包含本發(fā)明多肽和藥學(xué)上可接受栽體的生理上可接受的組合物。
本發(fā)明的另 一方面是包含選自SEQ ID NO: 57-69的氨基酸序列的多肽。
018!本發(fā)明的另一方面是使用解聯(lián)蛋白變體治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物(包括人)中avp3整聯(lián)蛋白相關(guān)疾病的方法。該方法包括對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的解聯(lián)蛋白變體的步猓.在該方法中采用的多肽可被聚乙二醇化或與白蛋白綴合。
10191在本發(fā)明的一個(gè)方面，該解聯(lián)蛋白可源自蛇毒液，并可選自如下之一馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥西海岸響尾蛇素、大具竅蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、黃綠竹葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛頭蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、原矛頭蝮素酶、烏蘇里蝮蛇素和霍皮響尾蛇素.應(yīng)當(dāng)理解，上文的一般描述和下文的詳細(xì)描述均為示例性的，僅用
16于解釋，并不對(duì)所主張的本發(fā)明構(gòu)成限制。圖7是顯示用RD蛋白(但不用阿倫膦酸鹽)治 療的SCID小鼠中對(duì)PC-3骨腫瘤生長(zhǎng)的抑制的圖.
10521圖8是顯示用RD蛋白治療的SCID小鼠中對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的體重下降 的抑制的圖，
053j圖9A是顯示在脛骨內(nèi)注射PC-3細(xì)胞后，在每條腿的脛骨近端中 的可視球形腫瘤生長(zhǎng)(在中間圖(middle panel)中以箭頭指示)以及用RD 蛋白治療的SCID小鼠中對(duì)骨腫瘤生長(zhǎng)的抑制的照片.
0S4圖9B為脛骨的放射照片，其顯示了用RD蛋白治療的SCID小鼠中對(duì)PC-3
害的抑制圖9C是對(duì)圖9B中數(shù)據(jù)進(jìn)行定量的圖，其顯示了用RD蛋白治療圖9D是顯示用RD蛋白治療的SCID小鼠中對(duì)PC-3腫瘤誘導(dǎo)的 I型膠原C-末端端肽增加的抑制的圖。

圖10A是顯示用RD蛋白治療的棵鼠中對(duì)MDA-MB-231骨腫瘤生 長(zhǎng)的抑制的圖，圖IOB是顯示用RD蛋白治療的棵鼠中對(duì)MDA-MB-231骨腫瘤誘 導(dǎo)的I型膠原C-末端端肽增加的抑制的困.
060j圖IOC是顯示用RD蛋白治療的棵鼠中對(duì)MDA-MB-231骨腫瘤誘 導(dǎo)的高^(guò)血癥的抑制的圖。
0611圖10D是顯示在注射MDA-MB-231細(xì)胞并用RD蛋白治療的棵鼠 中白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)變化的圖.圖15A-C顯示馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體的核苷酸序列SEQ ID NO: 43-56。
1074圖16A-H顯示解聯(lián)蛋白變體的氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO: 78-135。
發(fā)明詳迷
|0751本發(fā)明在如下的實(shí)施例中得到更具體的描迷，所述實(shí)施例僅作闡 迷之用，因?yàn)槠渲械亩喾N修改和變化將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見 的，現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。在說(shuō)明書和所附整個(gè)權(quán)利 要求書中所用的"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文明確地另 行指出。此外，在說(shuō)明書和所附整個(gè)權(quán)利要求書中所用的"在…中"的含義包 括"在...內(nèi)，，和"在...上，，，除非上下文明確地另行指出.此外，在本說(shuō)明書中 所用的一些術(shù)語(yǔ)在下文進(jìn)行更具體的定義.在本說(shuō)明書中所引用和討論的所 有參考文獻(xiàn)均全文引入作為參考，其引用程度如同每篇參考文獻(xiàn)單獨(dú)引入作 為參考《
1076]現(xiàn)在將詳細(xì)提及本發(fā)明包括的實(shí)施方式(示例性實(shí)施方式)，其 實(shí)施例在附圖中得到舉例說(shuō)明， 定義"組合物"指通常包含栽體(例如本領(lǐng)域常規(guī)的藥學(xué)上可接受的栽 體或賦形劑)并適于因治療、診斷或預(yù)防目而施用至對(duì)象的混合物。它可包 含細(xì)胞培養(yǎng)物，其中多肽或多核苷酸存在于細(xì)胞或培養(yǎng)基中。例如，口服施 用的組合物可形成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠嚢、緩釋制劑、漱口劑或 散劑。
0891 "疾病"指需要醫(yī)療干預(yù)或希望進(jìn)行醫(yī)療千預(yù)的任意病狀、感染、 病癥或綜合征。這種醫(yī)療干預(yù)可包括治療、診斷和/或預(yù)防。
叢適用于本發(fā)明的融合伙伴(fusion partner)包括例如胎球蛋白、 人血清白蛋白、Fc和/或一種或多種它們的片段。還提供了綴合蛋白，例如 聚乙二醇綴合物，
1095I還可采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學(xué)合成本發(fā)明的肽(例如，參見 Hunkapiller等人，Nature, 310:105 111 (1984); Grant編(1992) Synthetic Peptides, A Users Guide, W. H. Freeman and Co.;美國(guó)專利6，974，884)), 例如，對(duì)應(yīng)于多肽片段的多肽可通過(guò)采用肽合成儀或通過(guò)采用本領(lǐng)域已知的 固相方法來(lái)合成.術(shù)語(yǔ)ARLDDL指具有RGD基序變體48ARLDDL53的馬來(lái)亞蝮蛇 蛇毒蛋白變體，人重組RANKL和M-CSF購(gòu)自R&D Systems (Minneapolis, MN)。 I型膠原C-末端端肽ELISA試劑盒得自Cross Laps (Herlev，丹麥)， 所有其它的化學(xué)品得自Sigma,
實(shí)施例1
編碼馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白和變體的DNA的構(gòu)建 f0160I馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白可作為模板在栽體pGEX-2KS [20j中克隆和 表達(dá)。編碼Rho的DNA由優(yōu)先用于巴斯德畢赤酵母(朽c/^Vii7fls勿n's)的密碼 子組成。采用具有促進(jìn)純化的Eco及/識(shí)別和六個(gè)組氨酸殘基的正義引物 ( sense primer )
5-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAG GAATGTGACTGTTCTT-3' (Rho-Pic-l ; SEQ ID NO: 3)通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)來(lái)擴(kuò)增Rho DNA。反義引物為具有//識(shí)別和TCA (或TTA)終止 密碼子的5'-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' 或5'- CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' (Rho-Pic-2; SEQ ID NO: 4)。純化該P(yáng)CR產(chǎn)物，然后連接至酵母重組栽體 pPICZoA的五C( 及/和SflcJ/位點(diǎn)。用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/>^5 菌林，在瓊脂 板上用低鹽LB (1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、 1.5°/。瓊脂， pH7.0 )和25 jig/ml抗生素Zeocin選擇菌落.Rho的RGD基序的修飾對(duì)于Rho的生物活性具有獨(dú)特的作用 序列修飾導(dǎo)致了對(duì)整聯(lián)蛋白allbp3或a5pi結(jié)合基質(zhì)蛋白的抑制活性降低， 并對(duì)整聯(lián)蛋白avp3的選擇性增加。表4顯示了通過(guò)Rho及其衍生物抑制細(xì) 胞粘附的ICso的結(jié)果.
41RD及其衍生物對(duì)細(xì)胞粘附至ECM的抑制
IC50 (nM)
RGD基序變體
&SEQIDNO: a"b|33/Fg av(33/Fg a鄰1/Fn
鄰PRGDMP53(29)
站ARGDDP53 (30)
站ARGDDV53(31)
48ARGDDL53(32)
48pRGDDL53(33)
站ARGDDM53(34)
幼PRGDDM53(35)
48PRLDMP53(36)
*48PRLDMP53-5K
48PRLDDL53(37)
"ARLDDL53(38)
48PRIDMP53 (39)
，RHDMP53(40)
48PRGDNP53(4"
21.0 ±".2(17" 850.9 ± 322.6 (3) 255.2 ±107.2 (3) 1518.1 ±740.4(4) 1224-0 ±231.2 (4) 627.2 ±317.6 (3) 1117.8 ±379.7 (3) 2219.8 ±996.9 (6) 2408.0 ±1090.0 (2) >5880 (3)
59217.8 ±966.4 (3〉 >5880 (2) 2109.0 ±810.0 (3) 185,0 ±61.7 (4) 2591.0 ±572.2 (3)
13.0 ±5.7 (20) 45.3 ± 17.4 (3) 15.8 ±5.5 (3) 41.3 ± 16.0 (5) 76.0 ± 16.0 (4) 49.0 ±19,2 (6)
211.0 ±91.3 (5) 35.0 ± 14.1 (5)
114.8 ±51.1 (4) 342.3 ±110.1(3) 36.8 ± 12.8 (3)
119.9 ±19.7(3) 131.6 ±35.3(3) 24.8 ± 13.1 (5)
204.1 ± 87.0 (3)
256.8 ±87.5 (21) 5044.5 ±1554.5 (3) 213,1 ±74.4 (3)
526.7 ± 200.3 (5) 3017.0 ±801.5 (3〉
350.8 ± 81.0 (4) 4047.3 ±1784.3 (4) 3043.3 ±1117.6 (4) >3730 (3)
>5880 (4)
23171.0 ±925,5 (3) >5880 (3) >5880(3) 357.0 ± 80.6 (3) 3462.0 ±1525.5 (4)
"spRGDMP"(29)指Rho的RGD基序，并包含SEQ ID NO: 29所示的 氨基酸序列；48PRLDMP"(36)指RD變體的RGD基序，并包含SEQ ID NO:
36所示的氨基酸序列。a該數(shù)值表示實(shí)驗(yàn)次數(shù)。
01741馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體對(duì)allb(J3和/或a5pl的親和性比Rho低 得多(表4 )。如表4所示，例如RD (即，PRLDMP )在抑制整聯(lián)蛋白allbp3 和a5pl上的ICs。分別比Rho提高超過(guò)104和10倍，此外，ARLDDL在抑 制整聯(lián)蛋白allbp3和a鄰l上的ICs。分別比Rho提高超過(guò)2000倍。聚乙二 醇化RD和人白蛋白結(jié)合的RD對(duì)allbp3結(jié)合的ICs。分別比Rho提高113.7 和129，9倍(表5).因此，該變體對(duì)血小板的親和性相比于Rho明顯降低 (表5)。
實(shí)施例7
RD及其衍生物對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響
在第二藥物治療期(the second drug treatment period )后，處死 大鼠，并測(cè)量脛骨和股骨的BMD和BMC.如表9所示，RD后處理 (posttreatment)有效逆轉(zhuǎn)卵巢切除的骨喪失作用。對(duì)于骨體積的保持， RD比阿倫膦酸鹽更有效。
表9
RD后處理抑制大鼠中OVX-誘導(dǎo)的骨損失
Sham
OVX
RD
阿倫膦酸鹽
骨長(zhǎng)度，mm 脛骨
濕重，mg
BMD， g/cm2 脛骨
脂C，g
股骨 骨體積，％
4.04±0.03 3.69±0.03
766.6±19.9 1002.6±17.4
0.114±0.003 0.137±0.002
0.315±0.013 0.442±0.012 18.1±1,2
4.05±0，03 3.68±0.02
661±18.2* 861±10.7*
4.01±0.03 3.71±0.06
749±20.1§ 985.3±9.8§
4.02±0.05 3.68±0.05
712.1±10.1§ 912.4±10.9§
0.10U0.002* 0.113±0.009§ 0.108±0.002§ 0.121±0.002* 0.135±0.004§ 0.131±0.003§
0.272±0,006* 0.299±0.011§ 0.289±0.009§ 0.391±0.008* 0.441±0.018§ 0.401±0.017§ 7.9±2.1* 16.3±2.7§ 12.1±1.3§
BMD是骨礦物質(zhì)密度的縮寫；BMC是骨礦物質(zhì)含量的縮寫。
數(shù)值為平均值± SD。
*與Sham組相比，p<0.05
§與OVX組相比，p<0.05
RD: 1,M,注射(1.5/mg/kg/隔天)
阿倫膦酸鹽p.o. (1.5/mg/kg/隔天)
每組n=5
實(shí)施例15
RD在骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物中對(duì)軟骨細(xì)胞損傷的抑制01941通過(guò)僅在雄性Sprague-Dawley大鼠的右膝上進(jìn)行手術(shù)來(lái)獲得骨 關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，手術(shù)涉及前交叉韌帶處理(anterior cruciate ligation transaction)和部分內(nèi)側(cè)半月板切除。手術(shù)后，通過(guò)肌內(nèi)途徑(1.5 mg/kg/ 隔天)或局部關(guān)節(jié)注射(每周一次)施用RD蛋白直至手術(shù)后6周的最后一 天，并在該天處死大鼠。將每個(gè)關(guān)節(jié)包埋在石蠟中，切片，并用0.1%番紅 -O和蘇木精染色，如圖4B所示，右膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞被關(guān)節(jié)炎損傷，在肌 內(nèi)注射(閨4D)或局部施用(圖4C) RD時(shí)均抑制軟骨細(xì)胞層破壞。
實(shí)施例16
RD在骨關(guān)節(jié)炎大鼠中對(duì)血液細(xì)胞因子升高的抑制 10195j通過(guò)上述的手術(shù)形成骨關(guān)節(jié)炎大鼠。手術(shù)后六周，獲取血清以測(cè) 量細(xì)胞因子的血液水平，如困5A-5C所示，骨關(guān)節(jié)炎大鼠中的細(xì)胞因子(例 如c-反應(yīng)性蛋白、IL-ip和IL-6)的血清水平升高，施用RD顯著抑制骨關(guān) 節(jié)炎誘導(dǎo)的細(xì)胞因子升高.
實(shí)施例17
RD在骨關(guān)節(jié)炎小鼠中對(duì)血液細(xì)胞因子上升的抑制01961通過(guò)上述的手術(shù)形成骨關(guān)節(jié)炎小鼠。手術(shù)后六周，獲取血清以測(cè) 量細(xì)胞因子水平。如困6A-6C所示，骨關(guān)節(jié)炎小鼠中的細(xì)胞因子(例如c-反應(yīng)性蛋白、IL-ip和IL-6)的血清水平升高，施用RD顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子升高。
實(shí)施例18
01971使用在無(wú)特殊病原體(SPF)條件下于22 ± 2'C飼養(yǎng)于動(dòng)物隔離箱 (IVC架)中的體重20-22g (6周齡)的重癥綜合型免疫缺乏癥(SCID)雄性小 鼠或BALB/c- nu/nu雄性小鼠。在第1天將人前列腺癌PC-3細(xì)胞或人乳腺 癌MDA-MB-231細(xì)胞(1 x 106細(xì)胞，含于15ml無(wú)菌PBS中)分別注射入 SCID小鼠或棵鼠的左和右脛骨的骨徵中。在笫11天，將動(dòng)物隨機(jī)分為三組， 并開始施用測(cè)試物質(zhì)。通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射施用RD(1.5 mg/kg)，通過(guò)皮下(SC) 注射給予阿倫膦酸鹽(1.5 mg/kg)，每日一次，總共15個(gè)劑量(施用5天，停2天，持續(xù)3周)，在實(shí)驗(yàn)期間，每周觀察并記錄體重和腫瘤生長(zhǎng)情況，一個(gè)月后，處死小鼠，測(cè)量后腿重量。減去對(duì)照腿的重量以反映相對(duì)腫瘤重量。此外，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集血液樣本，以進(jìn)行紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血小板的血液計(jì)數(shù)，并測(cè)量I型膠原的C-末端端肽(CTX)和血清鉤濃度，[01981為了測(cè)定骨質(zhì)溶解，通過(guò)軟X-光生成裝置(Young-kid EnterpriseCo.， Ltd.,臺(tái)北，臺(tái)灣)拍攝放射照片。用一水合三氯乙醛深度麻醉動(dòng)物，以俯臥位躺在柯達(dá)科學(xué)成像膠片(Kodak Scientific Imaging film, 13 x 18 cm)上，并在45kV的X射線下暴露5秒。使用閨像分析軟件(Image-pro plus 3.0)測(cè)量骨質(zhì)溶解程度，
實(shí)施例19骨中腫瘤生長(zhǎng)和高血鈣癥的抑制聚乙二醇化產(chǎn)物或與白蛋白的綴合物可延長(zhǎng)蛋白藥物的持續(xù)時(shí)間 并其降低抗原性。為了使RD蛋白的抗原性最小化并延長(zhǎng)其持續(xù)時(shí)間，可按 如下制備聚乙二醇化的RD蛋白將20 mM NaCNBH3中的RD蛋白(4mg) 在pH 5下與5mM PEGk5-丙醛(0-甲基-0，-[2-(6-氧代己?；被?乙基l聚乙 二醇5，000)(Sigma)于4'C反應(yīng)12小時(shí)，通過(guò)反相C18 HPLC純化聚乙二醇 化RD蛋白。純化后的聚乙二醇化RD蛋白的最終產(chǎn)率大于60%.
02041如表6所示，聚乙二醇化RD抑制破骨細(xì)胞的分化。此外，用聚 乙二醇化RD(I.M., 1.5mg/kg，每周一次)治療兩周抑制BMD和BMC的喪 失(表6),這些數(shù)據(jù)顯示，聚乙二醇化RD不喪失其體內(nèi)活性.
實(shí)施例21 MATRIGELTMPlug抗血管生成測(cè)定0205j據(jù)報(bào)道，整聯(lián)蛋白ctvP3與血管生成有關(guān)。因此使用對(duì)先前描述 方法略微改動(dòng)的MATRIGELtm plug血管生成測(cè)定來(lái)調(diào)查RD蛋白是否能夠 抑制血管生成(321,簡(jiǎn)單而言，將含有200ng/ml VEGF的MATRIGELtm等 分試樣(500fil) (Becton Dickinson Lab.)皮下注射入6-8周齡C57BL/6小鼠的背部區(qū)。MATRIGELTM迅速形成栓塞(plug).在處死前每天(RD/ld)或隔 天(RD/2d或HSA-RD)肌肉內(nèi)施用RD(3mg/kg)。 8天后，取出栓塞并拍照(困 11A)。采用Drabkin法和Drabkin試劑盒525(Sigma)通過(guò)測(cè)量栓塞中血紅 蛋白(作為血液血管形成的指示)來(lái)對(duì)新血管進(jìn)行定量(圖11B )。如圖11A 和11B所示，使用MATRlGELTMplug測(cè)定，RD蛋白有效抑制血管生成。 *: <0.05相對(duì)于對(duì)照組.
實(shí)施例22
放射性配體結(jié)合測(cè)定RD相關(guān)蛋白的特異性 |02061為了確定RD及其衍生物PGP是否結(jié)合avp3整聯(lián)蛋白以外的其 它受體，使用RD及其衍生物PGP來(lái)分析對(duì)其配體為蛋白的受體的靶標(biāo)特 異性(測(cè)定者M(jìn)DS Pharma services,臺(tái)北，臺(tái)灣)。對(duì)Lewis大鼠皮內(nèi)/皮下(SC)注射牛H型膠原(2mg/ml，含于不完全弗氏佐劑中)。隨著大鼠發(fā)展類風(fēng)濕性疾病，它們被隨機(jī)分為多個(gè)研究組.在關(guān)節(jié)炎的臨床征象清晰可見(例如，由踝關(guān)節(jié)腫大所證明)的第一天開始治療。測(cè)量爪體積后，處死大鼠，采集踝和膝關(guān)節(jié)，以供檢查組織病理學(xué)變化。從對(duì)本說(shuō)明書和本文所披露的本發(fā)明的實(shí)踐的考慮，本發(fā)明的其它實(shí)施方式將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。有意將本說(shuō)明書和實(shí)施例僅可視作舉例說(shuō)明，本發(fā)明真實(shí)的范圍和精神將由隨附的權(quán)利要求書指明。參考文獻(xiàn)列表
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權(quán)利要求
1、治療和/或預(yù)防與αvβ3整聯(lián)蛋白相關(guān)的疾病的方法，其包括對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述多肽包含對(duì)αvβ3整聯(lián)蛋白具有選擇性的解聯(lián)蛋白變體。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述解聯(lián)蛋白是選自如下的解聯(lián)蛋 白的變體馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥西海岸 響尾蛇素、大具寫蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇素、 西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、黃綠竹 葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛頭蝮蛇 抑制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白眉蝮蛇 素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、原矛 頭蝮素酶、烏蘇里蝮蛇素和霍皮響尾蛇素。
3、 如權(quán)利要求2所迷的方法，其中所述解聯(lián)蛋白變體包括馬來(lái)亞蝮蛇 蛇毒蛋白的變體，
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的變體。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體包 含選自SEQ ID NO: 30-42的氨基酸序列。
6、 如權(quán)利要求4所迷的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體包 含選自SEQ ID NO: 57-69的氨基酸序列。
7、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的多肽被聚乙二醇化或與白蛋 白綴合.
8、 如權(quán)利要求1所迷的方法，其中所述avP3整聯(lián)蛋白相關(guān)的疾病選自 骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤或癌生長(zhǎng)及其相關(guān)癥狀、血管生成相關(guān)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn) 移、骨內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移、惡性腫瘤誘導(dǎo)的高鈣血癥、血管生成相關(guān)的眼部疾病、 佩吉特病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及骨關(guān)節(jié)炎。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述血管生成相關(guān)的眼部疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血誘導(dǎo)的新血管形成性視網(wǎng)膜病、高度近視以及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。
10、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述avp3整聯(lián)蛋白相關(guān)的疾病包括骨質(zhì)疏水^癥。
11、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所迷的骨質(zhì)疏松癥與選自如下的病理狀態(tài)相關(guān)絕經(jīng)后雌激素缺乏、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、卵巢切除、佩吉特病、骨癌、骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、破骨細(xì)胞形成增加以及破骨細(xì)胞活性增加，
12、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所迷骨質(zhì)疏松癥包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥或骨喪失。
13、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
14、 治療和/或預(yù)防卵巢切除誘導(dǎo)的生理變化的方法，其包括對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述多肽包含對(duì)avp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的解聯(lián)蛋白變體。
15、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述解聯(lián)蛋白是選自如下的解聯(lián)蛋白的變體馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥西海岸響尾蛇素、大具竅蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、黃綠竹葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛頭蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、原矛頭蝮素酶、烏蘇里蝮蛇素和霍皮響尾蛇素.
16、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述解聯(lián)蛋白變體包括馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白的變體。
17、 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的變體，
18、 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所迷的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體包含選自SEQ ID NO: 30-42的氨基酸序列。
19、 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體包含選自SEQ ID NO: 57-69的氨基酸序列。
20、 如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述的多肽被聚乙二醇化或與白 蛋白綴合。
21、 如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人，
22、 抑制和/或防止骨內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及與之相關(guān)的癥狀的方法，其 包括對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中所述多肽包含對(duì)avp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的解聯(lián)蛋白變體。
23、 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述解聯(lián)蛋白是選自如下的解聯(lián) 蛋白的變體馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥西海 岸響尾蛇素、大具竅蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇 素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、黃 綠竹葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛頭 蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白眉 蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、 原矛頭蝮素酶、烏蘇里蝮蛇素和霍皮響尾蛇素。
24、 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述解聯(lián)蛋白變體包括馬來(lái)亞蝮 蛇蛇毒蛋白的變體。
25、 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含SEQ ID NO: 1的變體。
26、 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含選自SEQ ID NO: 30-42的氛基酸序列。
27、 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含選自SEQ ID NO: 57-69的氨基酸序列.
28、 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的多肽被聚乙二醇化或與白 蛋白綴合.
29、 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的癥狀包括選自如下的病理 癥狀破骨細(xì)胞活性增加、骨吸收增加、骨損害、高鈣血癥、體重下降及其 任意組合.
30、 如權(quán)利要求22所迷的方法，其中所述骨內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)包括骨癌細(xì)胞以及來(lái)源于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、腎癌、卵巢癌、胰腺 癌和骨髄瘤中的一種或多種的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，
31、 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人，
32、 對(duì)avp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的多肽，其中所迷多肽是解聯(lián)蛋白的 變體。
33、 如權(quán)利要求32所述的多肽，其中所述解聯(lián)蛋白是選自如下的解聯(lián) 蛋白的變體馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥西海 岸響尾蛇素、大具竅蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇 素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、黃 綠竹葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛頭 蝮蛇押制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白眉 蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、 原矛頭蝮素酶、烏蘇里蝮蛇素和霍皮響尾蛇素。
34、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中所述解聯(lián)蛋白包括馬來(lái)亞蝮蛇蛇 毒蛋白的變體.
35、 如權(quán)利要求32所述的多肽，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含SEQ ID NO: 1的變體，
36、 如權(quán)利要求35所述的多肽，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含選自SEQ ID NO: 30-42的氨基酸序列.
37、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白變體 包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，并包括在選自SEQ ID NO: 1的位置48、 50、 52或53的位置上的至少一個(gè)氨基酸置換。
38、 如權(quán)利要求37所述的多肽，其中所述氨基酸置換選自位置48上的 Ala，位置50上的Leu、 He和His,位置52上的Asp、 Met和Asn,以及 位置53上的Val、 Leu和Met,
39、 如權(quán)利要求38所述的多肽，其中所述氨基酸置換位于位置50或 52上。
40、 如權(quán)利要求37所述的多肽，其中所迷多肽包含在選自SEQ ID NO: l的位置48、 50、 52或53的至少兩個(gè)位置上的氨基酸置換。
41、 如權(quán)利要求40所述的多肽，其中所述氨基酸置換選自位置48上的 Ala，位置50上的Leu、 lie和His,位置52上的Asp、 Met和Asn，以及 位置53上的Val、 Leu和Met。
42、 如權(quán)利要求41所述的多肽，其中所述氨基酸置換位于位置48和 52上。
43、 如權(quán)利要求41所述的多肽，其中所述氨基酸置換位于位置52和 53上。
44、 如權(quán)利要求37所述的多肽，其中所迷多肽包含在選自SEQIDNO: l的位置48、 50、 52或53的至少三個(gè)位置上的氨基酸置換。
45、 如權(quán)利要求44所述的多肽，其中所述氨基酸置換選自位置48上的 Ala，位置50上的Leu、 lie和His,位置52上的Asp、 Met和Asn，以及 位置53上的Val、 Leu和Met.
46、 如權(quán)利要求45所述的多肽，其中所述氨基酸置換位于位置48、 52 和53上。
47、 如權(quán)利要求45所述的多肽，其中所述氨基酸置換位于位置50、 52 和53上。
48、 如權(quán)利要求37所述的多肽，其中所述多肽包含在選自SEQIDNO: l的位置48、 50、 52或53的至少四個(gè)位置上的氨基酸置換。
49、 如權(quán)利要求48所述的多肽，其中所述氨基酸置換選自位置48上的 Ala,位置50上的Leu、 lie和His,位置52上的Asp、 Met和Asn，以及 位置53上的Val、 Leu和Met。
50、 如權(quán)利要求32所述的多肽，其中所述多肽由包含選自SEQIDNO: 43- 56的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。
51、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中與馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白相比，所 述多肽對(duì)allbp3和/或a5pl的親和性降低至少約5、 50或100倍。
52、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中與馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白相比，所 述多肽對(duì)allbp3和/或a5pi的親和性降低至少約200倍，
53、 如權(quán)利要求32所述的多肽，其中與馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白相比，所 述多肽對(duì)allb卩3和/或a5pl的親和性降低至少約1000或2000倍.
54、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中與馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白相比，所 述多肽對(duì)血小板的親和性降低至少約5、 50、 100、 1000或2000倍。
55、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中與馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白相比，所 述多肽在凝血時(shí)間延長(zhǎng)方面的顯示降低的活性.
56、 如權(quán)利要求32所迷的多肽，其中所述的多肽被聚乙二醇化或與白 蛋白綴合。
57、 生理上可接受的組合物 可接受的栽體.
58、 生理上可接受的組合物 可接受的載體。
59、 生理上可接受的組合物 可接受的栽體.
60、 生理上可接受的組合物 可接受的栽體。
61、 生理上可接受的組合物 可接受的栽體。
62、 如權(quán)利要求57所迷的生理上可接受的組合物，其中所迷的多肽被 聚乙二醇化或與白蛋白綴合，
63、 包含選自SEQIDNO:57-69的氨基酸序列的多肽，
64、 制備如權(quán)利要求32所迷的多肽的方法，其包括如下步驟a. 用編碼所述多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；b. 使所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；以及c. 分離所述多肽，
65、 如權(quán)利要求64所迷的方法，其中(b)進(jìn)一步包括向所述培養(yǎng)基添加 甲醇。
66、 如權(quán)利要求64所迷的方法，其進(jìn)一步包括使所述宿主細(xì)胞在不含氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
67、 如權(quán)利要求64所述的方法，其中(c)進(jìn)一步包括進(jìn)行色譜柱色謙， 以獲得所述多肽.，其包含權(quán)利要求37所述的多肽和藥學(xué)上 ，其包含權(quán)利要求40所迷的多肽和藥學(xué)上 ，其包含權(quán)利要求44所述的多肽和藥學(xué)上 ，其包含權(quán)利要求48所述的多肽和藥學(xué)上 ,其包含權(quán)利要求50所迷的多肽和藥學(xué)上
68、 如權(quán)利要求64所述的方法，其進(jìn)一步包括進(jìn)行HPLC,以獲得所 述多肽。
69、 如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，
70、 編碼對(duì)avp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的多肽的多核苷酸，其中所述多 肽是解聯(lián)蛋白的變體。
71、 如權(quán)利要求70所述的多核苷酸，其中所述解聯(lián)蛋白是選自如下的 解聯(lián)蛋白的變體馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹葉青素、食魚蝮素、墨西哥 西海岸響尾蛇素、大具竅蝮蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響 尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華麗蛇毒素、黃綠竹葉青蛇素、 黃綠付葉青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛頭蝮蛇素、美洲矛 頭蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、白 眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原響尾蛇素、黃綠付葉青蛇毒素、原矛頭蝮素、 原矛頭蝮素酶、烏蘇里坺蛇素和霍皮響尾蛇素.
72、 如權(quán)利要求70所述的多核苷酸，其中所述解聯(lián)蛋白包括馬來(lái)亞蝮 蛇蛇毒蛋白的變體。
73、 如權(quán)利要求72所述的多核苷酸，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白 變體包含SEQ ID NO: 1的變體。
74、 如權(quán)利要求73所述的多核苷酸，其中所述的解聯(lián)蛋白變體包含選 自SEQ ID NO: 30-42的氨基酸序列。
75、 如權(quán)利要求70所述的多核苷酸，其中所述的馬來(lái)亞蝮蛇蛇毒蛋白 變體包含SEQIDNO:29的氨基酸序列，并包括在選自SEQIDNO:l的位 置48、 50、 52或53的位置上的至少一個(gè)氨基酸置換.
76、 如權(quán)利要求75所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換選自位置48 上的Ala，位置50上的Leu、 Ile和His,位置52上的Asp、 Met和Asn， 以及位置S3上的Val、 Leu和Met,
77、 如權(quán)利要求76所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換位于位置50 或52上。
78、 如權(quán)利要求75所述的多核苷酸，其中所述多肽包含在選自SEQID NO:l的位置48、 50、 52或53的至少兩個(gè)位置上的氨基酸置換。
79、 如權(quán)利要求78所迷的多核苷酸，其中所述氨基酸置換選自位置48 上的Ala，位置50上的Leu、 Ile和His，位置52上的Asp、 Met和Asn, 以及位置53上的Val、 Leu和Met.
80、 如權(quán)利要求79所迷的多核苷酸，其中所述氨基酸置換位于位置48 和52上。
81、 如權(quán)利要求79所迷的多核苷酸，其中所迷氛基酸置換位于位置52 和53上。
82、 如權(quán)利要求75所述的多核苷酸，其中所述多肽包含在選自SEQID NO:l的位置48、 50、 52或53的至少三個(gè)位置上的氨基酸置換。
83、 如權(quán)利要求82所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換選自位置48 上的Ala，位置50上的Leu、 lie和His，位置42上的Asp、 Met和Asn， 以及位置53上的Val、 Leu和Met。
84、 如權(quán)利要求83所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換位于位置48、 52和53上。
85、 如權(quán)利要求83所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換位于位置50、 52和53上。
86、 如權(quán)利要求75所述的多核苷酸，其中所述多肽包含在選自SEQID NO:l的位置48、 50、 52或53的至少四個(gè)位置上的氨基酸置換。
87、 如權(quán)利要求86所述的多核苷酸，其中所述氨基酸置換選自位置48 上的Ala，位置50上的Leu、 lie和His，位置42上的Asp、 Met和Asn， 以及位置53上的Val、 Leu和Met.
88、 如權(quán)利要求70所迷的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 43-56和78-135的序列，
89、 如權(quán)利要求70所迷的多核苷酸，其中所迷多核苷酸編碼權(quán)利要求 37所述的多肽。
90、 編碼對(duì)civp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的多肽的多核苷酸，其中該多肽 是整聯(lián)蛋白的變體，且其中該多核苷酸編碼權(quán)利要求40所述的多肽。
91、 編碼對(duì)Givp3整聯(lián)蛋白具有選摔性的多肽的多核苷酸，其中該多肽 是整聯(lián)蛋白的變體，且其中該多核苷酸編碼權(quán)利要求44所述的多肽。
92、 編碼對(duì)ttvp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的多肽的多核苷酸，其中該多肽 是整聯(lián)蛋白的變體，且其中該多核苷酸編碼權(quán)利要求48所述的多肽。
93、 編碼對(duì)avp3整聯(lián)蛋白具有選擇性的多肽的多核苷酸，其中該多肽 是整聯(lián)蛋白的變體，且其中該多核苷酸編碼權(quán)利要求50所述的多肽.
94、 多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求73所述的多核苷酸雜交。
95、 由權(quán)利要求94所迷的核苷酸編碼的多肽。
全文摘要
本發(fā)明披露了解聯(lián)蛋白變體及其藥學(xué)用途。所述解聯(lián)蛋白變體包括具有整聯(lián)蛋白avβ3受體-拮抗劑活性且與野生型解聯(lián)蛋白相比整聯(lián)蛋白aIIbβ3和/或a5β1受體-阻斷活性大大降低的分離多肽。該變體由編碼修飾的氨基酸序列的修飾的解聯(lián)蛋白核苷酸序列所編碼，導(dǎo)致該多肽與野生型解聯(lián)蛋白相比對(duì)整聯(lián)蛋白aIIbβ3和/或a5β1的親和性大大減少。所述變體可用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與avβ3整聯(lián)蛋白相關(guān)的疾病，其包括骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤或癌生長(zhǎng)、血管生成相關(guān)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、骨內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移、惡性腫瘤誘導(dǎo)的高鈣血癥、血管生成相關(guān)的眼部疾病、佩吉特病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及骨關(guān)節(jié)炎。血管生成相關(guān)的眼部疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血誘導(dǎo)的新血管形成性視網(wǎng)膜病、高度近視以及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。
文檔編號(hào)C07K17/00GK101677537SQ200780051774
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者莊偉哲, 湯智昕, 符文美, 陳秋月, 黃德富, 黃溫雅 申請(qǐng)人:國(guó)立臺(tái)灣大學(xué);財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開發(fā)中心美國(guó)子公司