專利名稱：：涉及分析物測定的方法、混合物、試劑盒和組合物的制作方法涉及分析物測定的方法、混合物、試劑盒和組合物本jt^Mf,辨小伊標(biāo)趟僅^f逸織^厚辨，而不^視^"任^r才^;艱浙摩迷辨j趟。領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過質(zhì)鐠法進(jìn)行分析物測定的方法、混合物、試劑盒和組合物。概述本發(fā)明涉及通過質(zhì)量分析測定分析物。分析物可以是能夠與胺基或肼基反應(yīng)從而形成穩(wěn)定加合物的任何目標(biāo)分子。例如，分析物的反應(yīng)活性基團(tuán)可以是羧酸、醛或酮基，其中由所述醛或酮基形成的加合物可被還原而形成穩(wěn)定的被標(biāo)記分析物。分析物的非限定性實例包括但不限于生物學(xué)上重要的羧酸化合物(例如前列腺素、脂肪酸、肉堿等)、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、類固醇以及質(zhì)量小于1500道爾頓并包含合適的反應(yīng)活性官能團(tuán)的其它小分子?？衫迷试S對復(fù)雜混合物中的分析物進(jìn)行相對和/或絕對定量的獨(dú)特標(biāo)記試劑來測定分析物。所述標(biāo)記試劑可成組使用用于分析復(fù)雜樣品混合物，其中標(biāo)記試劑可以是同量異位(isobaric)的(包括同分異構(gòu)的同量異位體(isobar))和/或包含具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的標(biāo)記試劑(即質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑，在本文中又稱為"質(zhì)量差異性標(biāo)簽")。例如，可利用同量異位的和/或質(zhì)量差異性的標(biāo)簽進(jìn)行生物學(xué)重要化合物(例如羧酸化合物如前列腺素、脂肪酸、肉堿等)的多重定性和定量分析，在一些實施方案中，可利用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM)在三重四極桿、線性離子阱儀器上進(jìn)行。參考圖la，同量異位組中的標(biāo)記試劑可包含報告物部分、平衡物(或連接物)部分和反應(yīng)活性基團(tuán)部分，其中在該組成物與分析物反應(yīng)后的形式中所述反應(yīng)活性基團(tuán)被所述分析物取代。這種通式的標(biāo)記試劑和被標(biāo)記分析物的實例已在例如以下的文件中公開公開的共同未決和共有申請人:的美國專利申請US2004-0219685Al、US2005-0114042Al、US2005-0147982Al、US2005-0147985Al、US2005-0147987Al、US2005-0148771Al、US2005-0148773Al和US2005-0148774Al。在一些實施方案中，同量異位(包括同分異構(gòu)的同量異位)的標(biāo)記試劑可用于標(biāo)記例如兩個或更多個不同樣品中的分析物，其中所述一組中的不同標(biāo)記試劑都具有相同的粗略質(zhì)量但其中每個報告物部分能夠被獨(dú)特地進(jìn)行同位素編碼，使得所述組中的每個報告物部分都具有獨(dú)特的粗略質(zhì)量。因為所述組中的所有試劑都可具有相同的粗略質(zhì)量但可包含獨(dú)特粗略質(zhì)量的報告物部分，所以平衡物(或連接物)部分通常(但不是必需)還可包含一個或多個重原子同位素，從而"平衡，，每個獨(dú)特報告物的質(zhì)量，使得所述組中每種標(biāo)記試劑的報告物/連接物組合都具有相同的粗略質(zhì)量。在一些實施方案中，質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑(即質(zhì)量差異性標(biāo)簽)可用來標(biāo)記例如兩個或更多個不同樣品中的分析物，其中一組中的不同標(biāo)記試劑都具有明顯不同的質(zhì)量(即與所述組中的其它試劑相比都可具有已知的質(zhì)量差異)。因為所述組中的所有試劑都可具有已知的質(zhì)量差異，所以不需要使所述標(biāo)記試劑斷裂以定量兩個不同樣品中類似分析物的相對量。然而，在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可以是可斷裂的。如下面所更詳細(xì)討論的，各種通式的化合物(包括含有具有相同結(jié)構(gòu)通式但還進(jìn)行了同位素編碼的化合物的組)可制備成同量異位和/或質(zhì)量差異性的組。通常，組可作為同量異位的標(biāo)記物組或者作為質(zhì)量差異性的標(biāo)記物組而使用，但還可以預(yù)見，作為本發(fā)明的一個實施方案，在同一實驗中可同時聯(lián)合使用同量異位標(biāo)記試劑的組與質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組。如本文中所更詳細(xì)討論的，新型標(biāo)記試劑(或被標(biāo)記分析物)的一個實例示于圖lb中。雖然圖示是未取代形式的(除了Ri和R2)，但應(yīng)當(dāng)理解所述標(biāo)記試劑可以是取代或未取代的。在圖中，某些鍵顯示被斷裂，從而從所述標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物中至少釋放出所述獨(dú)特報告物部分以及任選地平衡物部分。對于已經(jīng)用同量異位標(biāo)記試劑標(biāo)記過的被標(biāo)記分析物而言，在質(zhì)鐠儀(通常在MSn分析中，其中n為大于1的整數(shù))中觀測到的每種獨(dú)特報告物離子(有時稱為特征離子(signatureion))都可用來確定樣品或樣品混合物中分析物的量。對于已經(jīng)用質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑標(biāo)記過的被標(biāo)記分析物而言，可通過MSi分析中被標(biāo)記分析物的相對強(qiáng)度來定量。圖4a示例了兩組4種不同編碼形式的標(biāo)記試劑，AI至AIV組具有圖lb中所示的基本結(jié)構(gòu)(例如Ri和R2可彼此獨(dú)立地為氫或甲基)，其中星號(*)用于指示適當(dāng)時"C原子替代"C原子的位置、"N原子替代"N原子的位置或180替代160原子的位置。這些組可用來實施至少4重實驗(4-plexexperiment)。然而，可以預(yù)計，通過用重原子同位素進(jìn)一步取代化合物，可制得超過4種的不同化合物，從而可進(jìn)行多于4重實驗。通常，標(biāo)記試劑、被標(biāo)記分析物以及所述標(biāo)記試劑和/或被標(biāo)記分析物的一些中間體可用式I化合物(包括其鹽形式和/或其水合物形式)來表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>其中Z可以是氫或共價連接的分析物，其中原子或基團(tuán)XpRpR2、Y、J和K在下文中作更詳細(xì)描述。因此，在一些實施方案中，可以通過分析物與式I'化合物(包括其鹽形式和/或其水合物形式)所代表之標(biāo)記試劑的反應(yīng)來標(biāo)記分析物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>其中原子或基團(tuán)R"R2、Y、J和K在下文中作更詳細(xì)描述。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可以成組使用，其中這些組包含同分異構(gòu)和/或同量異位的化合物，從而所述被標(biāo)記分析物同樣可以是同分異構(gòu)和/或同量異位的。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可以成組使用，其中這些組包含質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑(即具有不同粗略質(zhì)量的標(biāo)記試劑)。在一些實施方案中，同量異位(包括同量異位的同分異構(gòu)體)標(biāo)記試劑和質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑一起使用。而且，在一些實施方案中，被標(biāo)記分析物因此可以用式I"(包括其鹽形式和/或其水合物形式)來表示J、AJ,rX1,其中Z"代表與標(biāo)記試劑共價連接的分析物，其中原子或基團(tuán)R2、Y、J和K在下文中作更詳細(xì)描述。如本文中所述，可制備兩種、三種、四種、或更多種同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組，從而允許4重或更多重實驗。例如，可同時鑒定和/或定量已經(jīng)各自被差異性標(biāo)記并然后混合的4種(或更多種)不同樣品中的分析物。對同量異位的標(biāo)記試劑組而言，可通過確定與所述同量異位組中每種不同標(biāo)記試劑相關(guān)的每種獨(dú)特報告物離子的相對豐度來實現(xiàn)定量。對質(zhì)量差異性組而言，可通過確定與所述質(zhì)量差異性組中每種不同標(biāo)記試劑相關(guān)的每種被標(biāo)記分析物的相對豐度來實現(xiàn)定量。因此，本發(fā)明的實施方案尤其適合于復(fù)雜樣品混合物的多重分析(multiplexanalysis)。例如，本發(fā)明的一些實施方案可用于蛋白質(zhì)組分研究中。本發(fā)明的一些實施方案還可用于小分子分析，比如用于肉堿、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、維生素、前列腺素、脂肪酸和/或氨基酸分析?？墒褂猛慨愇缓?或質(zhì)量差異性試劑的實驗分析包括但不限于時間過程研究、生物標(biāo)志物分析、多重蛋白質(zhì)組分析、多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)實驗(mudpitexperiment)、親和捕獲(affinitypull-down)、翻譯后修飾(PTM)的測定(參見例如^Hf的美國專利申請US2005-0208550Al)以及多重控制實驗。本^"試戎術(shù)入,摔會埋席,以T摩迷餘^農(nóng)^于舉辨說效時厲辨。這些/#^##;#4"任*"才^:應(yīng)教本^:銀教,好態(tài)厲。圖la是標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物的要素以及一些斷裂特征的舉例說明。圖lb是示例性的基于N-甲基哌溱的標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物的一般性要素以及一些斷裂特征的舉例說明。圖lc是所標(biāo)識通式的被標(biāo)記分析物的一般性要素以及一些斷裂特征的舉例i兌明。圖2是兩種不同標(biāo)記試劑的通式(即結(jié)構(gòu)A和結(jié)構(gòu)B)的舉例說明。圖3是利用根據(jù)結(jié)構(gòu)A和B的標(biāo)記試劑所標(biāo)記的分析物(表示為被標(biāo)記分析物A，，和B")的可能斷裂性質(zhì)以及由其產(chǎn)生的可能片段的質(zhì)量的舉例說明。圖4a是兩種可能的同量異位標(biāo)記試劑(分別基于結(jié)構(gòu)A和結(jié)構(gòu)B)的組的舉例說明，其中每種標(biāo)記試劑產(chǎn)生同樣的報告物離子組。圖4b是圖4a中所述報告物離子114-117的可能結(jié)構(gòu)以及非編碼的(即"冷")報告物離子113的可能結(jié)構(gòu)的舉例說明。圖5a和5b是兩種可能的質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑(分別基于結(jié)構(gòu)A和結(jié)構(gòu)B)的組的舉例說明。圖6a和6b分別是利用結(jié)構(gòu)A和結(jié)構(gòu)B的示例性化合物來標(biāo)記分析物的方法的舉例說明。本^請#摩//^^全謬義妖和類似#并廣6括但不很于爭W、昔W—請、X聿、并^、^漠一X^河^"坊坊確遽過f/^全卑并入本Jt哞而^于任^r斧全命辨盡的，而不論這些jt妖々類似^^并辨多式'如^r。定義A于v^禪本說效^的厲辨，摔炎^T迷定義，'以卓，^辨術(shù)語A摔逸括詳復(fù)炎多^;,^之##。A于;醉禪二本說坊并及輿;^^歡在^T"迷定義與任^^^t斧f逸^^摩I《W辨任^遞過參孝并入本jt辨jt伴j尹該舒語^法咖我廯辨'摩況7^摔,^c以r迷定義^涼，餘^效確措i^^c種^^乂廣辨如在岸犖處初炎^該i語好Jt伴^義本丈#"4"W^法J"措"々/4"，餘#^#說銀4者在炎^"々/4"坊^不合適的緣況T。本丈哞不^炎量艱定減者炎^"一"廣"""^砉措"一個減/個"，餘#^//"說坊4者在炎>^"一個減,個"適辨橫況7。"逸括"、"逸舍"、可3換炎^，##,奮在艱斧人4一個4^個-滋才黃時澥迷*炎^7^語辨'，況7",本銀減拔^入f摔會理岸，在一些^沐勞況T,摩迷-滋才黃T炎眉^t"^t丄由…i^r^/4"洽…i4"^t^迷。還^歲理席，4一些其磁才黃哞，#紫辨義^4'迷存關(guān)些動#辨^^并不#要，^要本發(fā)銀時我導(dǎo)^^r其滋,就^r。而產(chǎn)，在一些^滋才黃尹，^r"yf^迷^兩個，戎^/付爽4辦。a.)本文中所用的"分析物"指可測定的目標(biāo)分子。分析物的非限定性實例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、(DNA或RNA)、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、類固醇、維生素、前列腺素、脂肪酸、肉堿和分子量小于1500道爾頓(Da)的其它小分子。分析物或含有分析物的樣品的來源不受限制，因為它們可來自任何來源。分析物可以是天然的或合成的。分析物或含有分析物的樣品的來源的非限定性實例包括細(xì)胞或組織、或其培養(yǎng)物(或傳代培養(yǎng)物)。分析物來源的非限定性實例包括但不限于粗制細(xì)胞裂解物或經(jīng)處理的細(xì)胞裂解物、體液、組織提取物或來自分離過程的級分(或部分)，所述分離過程比如色譜分離、一維電泳分離、二維電泳分離或毛細(xì)管電泳分離。體液包括但不限于血液、尿、糞便、脊髓液、腦液、羊水、淋巴液或來自腺體分泌物的流體。對于經(jīng)處理的細(xì)胞裂解物，我們意指除了裂解細(xì)胞所需的處理外還處理細(xì)胞裂解物，從而對所收集的材料進(jìn)行更多處理。例如，所述樣品可以是含有一種或多種分析物的細(xì)胞裂解物，所述分析物是通過用一種或多種蛋白水解酶處理細(xì)胞裂解物從而消化前體肽和/或蛋白質(zhì)而形成的肽。b.)除了當(dāng)基于使用時上下文而清楚地表明并非此意(例如當(dāng)參考另外所述的具體結(jié)構(gòu)時)以外，"酯"均指酯和/或石克酯。c.)本文中所用的"斷裂"指共價鍵的斷裂。d.)本文中所用的"片段/斷裂"指斷裂的產(chǎn)物(名詞)或引起斷裂的操作(動詞)。e.)本文中所用的"水合物形式"指化合物的任何水合狀態(tài)或者化合物的超過一種7JC合狀態(tài)的混合物。例如，本文中所述標(biāo)記試劑可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，本文中所述標(biāo)記試劑的樣品可包括一水合物、二水合物和半水合物形式。f.)本文中所用的卣素基團(tuán)指-F、-Cl、-Br或-I。g.)本文中針對化合物使用的"同位素富集"指已富集了一個或多個重原子同位素(例如穩(wěn)定同位素比如氘('D，)、13C、15N、180、37C1或81Br)的化合物(例如標(biāo)記試劑)。在一些實施方案中，還可以使用不穩(wěn)定的同位素(例如"C或311)。"富集"意指重原子同位素的量超過了天然同位素豐度。在多個實施方案中，所述同位素富集的化合物可包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個同位素富集位因為同位素富集并非100%有效，所以在化合物的樣品中可存在雜質(zhì)，其為較少富集的狀態(tài)并且具有較低的質(zhì)量。同樣，由于過度富集(例如不期望的富集)以及由于天然同位素豐度，在化合物的樣品中可存在具有較大質(zhì)量的雜質(zhì)。在一些實施方案中，每種差異性標(biāo)記的重原子同位素都可以至少80。/。的同位素純度存在于同位素富集位點上。在一些實施方案中，每種差異性標(biāo)記的重原子同位素都可以至少93%的同位素純度存在于同位素富集位點上。在一些實施方案中，每種差異性標(biāo)記的重原子同位素都可以至少96%的同位素純度存在于同位素富集位點上。在一些實施方案中，每種差異性標(biāo)記的重原子同位素都可以至少98%的純度存在于同位素富集位點上。h.)本文中所用的"同位素富集位點"指化合物中重原子同位素替代輕形式原子(例如13C替代12C、180替代160、15N替代"N或者氘替代氫)的位置。i.)本文中針對化合物使用時，"輕"指未富集重原子同位素的化合物。本文中針對原子使用時，"輕"指該原子的最低質(zhì)量同位素。本文中針對化合物使用時，"重"指富集了至少一種重原子同位素的化合物。本文中針對原子使用時，"重"指該原子的重質(zhì)量同位素。j.)本文中所用的"標(biāo)記試劑"指適于標(biāo)記待測定分析物的結(jié)構(gòu)部分。術(shù)語標(biāo)記物(label)與術(shù)語標(biāo)簽(tag)和標(biāo)志(mark)以及其它的等價術(shù)語和短語是同義的。例如，被標(biāo)記分析物還可以稱為被標(biāo)簽分析物或被標(biāo)志分析物。因此術(shù)語"標(biāo)記物"、"標(biāo)簽"、"質(zhì)量標(biāo)簽"、"標(biāo)志物"以及這些術(shù)語的衍生詞都是等價和可互換的，指適合標(biāo)記或者已經(jīng)標(biāo)記待測定分析物的結(jié)構(gòu)部分。有時候標(biāo)記試劑可稱為標(biāo)簽試劑、質(zhì)量標(biāo)簽試劑或筒稱為質(zhì)量標(biāo)簽(例如質(zhì)量差異性標(biāo)簽)。k.)本文中所用的"天然同位素豐度"指基于同位素在自然界的天然優(yōu)勢度(prevalence)在化合物中所發(fā)現(xiàn)的一種或多種重同位素的水平(或分布)。例如，由活植物材料中所獲取的天然化合物通常可包含相對于12C約1.08%的13C。I.)本文中所用的同量異位物(isobar)是具有相同的名義粗略質(zhì)量而在結(jié)構(gòu)上和化學(xué)上不能區(qū)分的化合物(除了重原子同位素的同位素含量和/或分布以外)。"化學(xué)上不可區(qū)分的"意指所述同量異位物包含同樣的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)(若不考慮重原子同位素的分布)并具有基本上相同的化學(xué)反應(yīng)性和分離性質(zhì)。m.)本文所用的"支持物"、"固相支持物"、"固相載體"或"樹脂"意指任何固相材料。固相支持物包括術(shù)語如"支持物"、"合成支持物"、"固相"、"表面"、"膜"和/或"支持物"。固相支持物可由有機(jī)聚合物構(gòu)成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。固相支持物還可以是無機(jī)的，比如玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)、或反相二氧化硅。固相支持物的結(jié)構(gòu)可以是珠、球、微粒、顆粒、凝膠、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的或非平面的。固相支持物可以是多孔的或非多孔的，并且可具有膨脹特性或非膨脹特性。固相支持物可以以孔(well)、坑(depression)或其它容器、器皿、結(jié)構(gòu)特征(feature)或位置(location)的形式而構(gòu)建。多個固相支持物可以設(shè)置為不同位置上的陣列，其對試劑的自動遞送是可尋址的，或者通過檢測方法和/或i殳備而尋址。n.)本文中所用的"樣品或其級分"或"樣品級分"可用于指樣品的級分。樣品的級分可僅通過取樣品的級分而產(chǎn)生，或者通過進(jìn)行導(dǎo)致樣品分級為兩個或更多個級分的分離過程而產(chǎn)生。除非說明書的內(nèi)容中另外指出，否則這些短語是等價和可互換的，指任何形成類型的樣品級分(或部分)。o.)本文中所用的"特征離子"(signatureion)和"報告物離子"是可互換的，都是指由報告物部分通過標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物的斷裂而產(chǎn)生的獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子。特征離子或報告物離子可用來鑒別用于標(biāo)記分析物的獨(dú)特標(biāo)記試劑，并且所述特征離子或報告物離子在MS/MS分析(或MSn分析)中的峰強(qiáng)度可與所分析樣品中存在的被標(biāo)記分析物的量相關(guān)聯(lián)。本文中所用的特征離子或報告物離子有時僅稱為報告物。本文中所用的報告物部分有時也僅稱為報告物。應(yīng)當(dāng)理解，報告物部分指與標(biāo)記試劑、被標(biāo)記分析物或其片段相連的基團(tuán)，報告物離子指當(dāng)連接所述報告物部分與標(biāo)記試劑、被標(biāo)記分析物或其片段的鍵斷裂時所產(chǎn)生的片段離子。因此，使用"報告物"一詞的上下文可指明其意向含義。還應(yīng)當(dāng)理解，短語"獨(dú)特的報告物部分"與"具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物部分"是等價并可互換的，"獨(dú)特的報告物離子"與"具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子"是等價并可互換的。p.)本文中所用的術(shù)語"鹽形式"包括化合物的鹽或化合物的鹽的混合物。此外，化合物的兩性形式也被包括在術(shù)語"鹽形式，，中。具有胺鹽酸、氫溴酸、醋酸、高氯酸等)反應(yīng)得到。含有季銨基團(tuán)的化合物還可含有反陰離子，比如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、高氯酸根等。具有羧酸或其它酸性官能團(tuán)的化合物的鹽可通過使所述化合物與合適的堿(例如氫氧化物堿)進(jìn)行反應(yīng)而制得。因此，酸性官能團(tuán)的鹽可具有反陽離子，例如鈉、鉀、鎂、鈣等。q.)本文中所用的"合成化合物"指通過操作過程包括操作天然途徑而產(chǎn)生的化合物。因此，可利用合成化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生合成化合物。然而，本文中所用的"合成化合物"還旨在包括例如通過酶方法產(chǎn)生的化合物，所述酶方法包括例如給生物體(如細(xì)菌或酵母)喂飼同位素富集的化合物，所述生物體可改變這些同位素富集的化合物從而產(chǎn)生本文中所述的同位素富集的標(biāo)記試劑、或所述標(biāo)記試劑的中間體。r.)本文中所用的"合成富集"指操作合成或天然過程從而產(chǎn)生合成化合物，比如本文中所述的同位素富集的標(biāo)記試劑或所述標(biāo)記試劑的中間體。s.)公認(rèn)的是，原子或分子的質(zhì)量可以取近似，常近似到最接近的整數(shù)原子質(zhì)量單位或最接近的原子質(zhì)量單位的十分之一或百分之一。本文中所用的"粗略質(zhì)量"指在一定范圍內(nèi)的絕對質(zhì)量和近似質(zhì)量，在所述范圍內(nèi)使用質(zhì)量接近的不同原子類型的同位素，使得對于平衡所述報告物和/或連接物部分的質(zhì)量的目的(使得在同分異構(gòu)和/或同量異位的標(biāo)記試劑的組和試劑盒中所述報告物/連接物組合的粗略質(zhì)量是相同的)它們在功能上是等價的，而不論所用的不同同位素類型在質(zhì)量上的極小差異是否能被檢測到。例如，氧的常見同位素的粗略質(zhì)量是16.0(實際質(zhì)量15.9949)和18.0(實際質(zhì)量17.9992)，碳的常見同位素的粗略質(zhì)量是12.0(實際質(zhì)量12.00000)和13.0(實際質(zhì)量13.00336),氮的常見同位素的粗略質(zhì)量是14.0(實際質(zhì)量14.0031)和15.0(實際質(zhì)量15.0001)。盡管這些值為近似值，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果在一組中的一個標(biāo)記物中同位素富集部位使用180同位素，則在該組含有"O的不同標(biāo)記物中，多出的2個質(zhì)量單位(超過粗略質(zhì)量為16.0的氧同位素的值)可通過例如在所述標(biāo)記物中的其它地方引入兩個碳13C原子替代兩個12C原子、兩個15N原子替代兩個14N原子或甚至一個13C原子和一個15N原子替代"C和"N以補(bǔ)償"0而得到補(bǔ)償。這樣，所述同量異位組中的兩個不同標(biāo)記物可具有相同的粗略質(zhì)量，因為在所述組或試劑盒的所有標(biāo)記物中，使用兩個"C原子(替代兩個"C原子)、兩個"N原子(替代兩個14N原子)、一個13C和一個15N(替代12C和"N)或一個180原子(替代一個"O原子)而實現(xiàn)質(zhì)量增加2道爾頓，它們之間極小的實際質(zhì)量差異并不會對本分析自身造成妨礙。顯然，結(jié)構(gòu)中相同重原子同位素的分布并不是在產(chǎn)生同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組時所唯一考慮的因素?？蓪⒅卦油凰仡愋突旌弦援a(chǎn)生具有所期望粗略質(zhì)量的同量異位或質(zhì)量差異性標(biāo)記物。這樣，對重原子同位素的選擇(組合)以及其分布都可在制備可用于本發(fā)明實施方案的同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑時進(jìn)行考慮。t.)本文中所用的術(shù)語"烷基"指可以是完全飽和的直鏈或支鏈C2-C8烴或環(huán)狀C3-Cs烴(即環(huán)烷基比如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)己基亞甲基)。本文中所用的術(shù)語"烷基"指可被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"烷基"還旨在指其中烷基鏈上的一個或多個亞曱基可被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)所代替的那些化合物。在一些實施方案中，烷基可以是能被完全飽和的直鏈或支鏈c2-c6烴或環(huán)狀u.)本文所用的術(shù)語"亞烷基"指直鏈或支鏈的烷基鏈或者環(huán)狀烷基，其包含與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的至少兩個連接點(例如{-<:112}-(亞甲基)、-{CH2CH2}-(亞乙基)}、^、\等，其中括號表示連接點)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語"亞烷基，，指可被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"烷基"還意在指其中亞烷基的^鏈上的一個或多個亞曱基(如果有)可被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)所替代的那些化合物。在一些實施方案中，亞烷基可以是d-d。烴。在一些實施方案中，亞烷基可以是CVC6烴。v.)本文使用的術(shù)語"烯基，，指包含一個或多個雙鍵的直鏈或分支的CrC8碳?xì)浠衔锘颦h(huán)狀QrCs碳?xì)浠衔铩Ｔ诒疚闹惺褂脮r，術(shù)語"烯基"指可被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"烯基"還旨在表示烯基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。在一些實施方案中，烯基可以是包含一個或多個雙鍵的直鏈或分支的CrC6碳?xì)浠衔锘颦h(huán)狀CVC6碳?xì)浠衔?。w.)本文使用的術(shù)語"亞烯基"指包含連接至少兩個結(jié)構(gòu)部分的兩個連接點的烯基。在本文中使用時，術(shù)語"亞烯基，，指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"亞烯基"還旨在表示亞烯基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。x.)本文使用的術(shù)語"炔基"指包含一個或多個三鍵的直鏈或分支的C2-Cs碳?xì)浠衔锘颦h(huán)狀CVC8碳?xì)浠衔铩Ｔ诒疚闹惺褂脮r，術(shù)語"炔基"指可被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"炔基"還旨在表示炔基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。在一些實施方案中，炔基可以是包含一個或多個三鍵的直鏈或分支的C2-Q碳?xì)浠衔锘颦h(huán)狀C3-Q碳?xì)浠衔铩.)本文使用的術(shù)語"亞炔基，，指包含連接至少兩個部分的兩個連接點的炔基。在本文中使用時，術(shù)語"亞炔基"指可以被取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"亞炔基"還旨在表示亞炔基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。z.)本文使用的術(shù)語"脂肪族"指如上文定義的任何直鏈、分支或環(huán)狀的烷基、烯基和炔基部分。在本文中使用時，術(shù)語"脂肪族"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。aa.)本文使用的術(shù)語"芳基"(單獨(dú)的或作為其他結(jié)構(gòu)部分的一部分(例如芳基烷基等))指碳環(huán)芳族基團(tuán)，例如苯基。芳基還包括稠環(huán)多環(huán)芳環(huán)系，其中碳環(huán)芳環(huán)與另一碳環(huán)芳環(huán)稠合(例如l-萘基、2-萘基、l-蒽基、2-蒽基等)，或者碳環(huán)芳環(huán)與一個或多個碳環(huán)非芳環(huán)稠合(例如四氫亞萘基、茚滿等)。本文使用的術(shù)語"芳基"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。ab.)本文使用的術(shù)語"雜芳基"指包含l、2、3或4個雜原子的芳族雜環(huán)，所述雜原子各自獨(dú)立地選自氮、硫和氧。本文使用的術(shù)語"雜芳基"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。雜芳基可以與一個或兩個環(huán)(如環(huán)烷基、芳基或雜芳基環(huán))稠合。雜芳基與分子的連接點可以在雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或芳基環(huán)上，所述雜芳基可通過碳或雜原子而連接。雜芳基的實例包括咪唑基、吡咯基、吡咬基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、吲哚溱基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、四氫吲哚基、氮雜吲咮基(azaindolyl)、咪哇并p比咬基、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2,3嘧咬基或吡唑并[3,4嗜咬基，它們中的每一個均可任選地被取代。ac.)本文使用的術(shù)語"亞芳基"指包含與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連的至少兩個連接點的芳基或雜芳基(例如亞苯基等)。亞芳基與碳環(huán)非芳環(huán)稠合的連接點可以在芳環(huán)或非芳環(huán)上。本文使用的術(shù)語"亞芳基"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。ad.)本文使用的術(shù)語"芳基烷基"指通過亞烷基連接物與另一結(jié)構(gòu)部分連接的芳基或雜芳基。本文使用的術(shù)語"芳基烷基"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"芳基烷基"還旨在表示芳基烷基的烷基鏈中的一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。ae.)本文使用的術(shù)語"芳基亞烷基"指具有與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連的至少兩個連接點的芳基烷基。第二個連接點可以是芳環(huán)或亞烷基。本文使用的術(shù)語"芳基亞烷基"指可以是取代或未取代的基團(tuán)。在一些實施方案中，術(shù)語"芳基亞烷基"還旨在表示芳基亞烷基的烷基鏈中的一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替代的化合物。當(dāng)芳基亞烷基發(fā)生取代時，取代基可以在該芳基亞烷基的芳環(huán)或亞烷基結(jié)構(gòu)部分中的任何一個或兩個上。af.)本文使用的術(shù)語"任選取代的，，以及"取代或未取代的"是等同的并可互換。任何烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞烷基的合適取代基均包括在本發(fā)明實施方案所使用的反應(yīng)條件下穩(wěn)定的任何取代基。合適取代基的非限制性實例可包括烷基(如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)己基等)、鹵代烷基(如三氟甲基、2，2，2-三氟乙基等)、烷氧基(如曱氧基、乙氧基等)、芳基(如苯基)、芳基烷基(如芐基)、硝基(N02)、氰基(-CN)、季銨氮原子或鹵素基(如氟、氯、溴和/或碘)。此外，烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞坑基的一部分可任選地被=0或-S取代。ag.)本文使用的術(shù)語"活性酯"指在堿性條件下易于與胺、醇和某些硫醇反應(yīng)以分別提供酰胺、酯和硫酯的化合物。還可參考LeoAPaquette，五wc^c/c/^/fl/orOrgfl/i/c5[y"幼es,'s1，,2巻JohnWileyandSons,NewYork,1995，i作為活性酯是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的明確術(shù)語的證據(jù)。ah.)本文使用的術(shù)語"雜環(huán)"指在環(huán)中包含至少兩種不同元素的任何環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)。還可參考Z)/"iVwflij5,Vc/re挑/欲j;fl/irfM(o/ecw/fl/"5/0/05^，OxfordUniversityPress,Oxford,1997,其作為雜環(huán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的明確術(shù)語的證據(jù)。ai.)本文使用的術(shù)語"離去基團(tuán)"指在取代反應(yīng)或置換反應(yīng)中從被認(rèn)為是反應(yīng)底物的殘基或主要部分上離去的任何帶電或不帶電的原子或基團(tuán)。還可參考Ox/bn/D/crtVmfl^</必/"c/re附/s^);Mo/ec"/flr丑iV/tfgy，OxfordUniversityPress,Oxford,1997，其作為離去基團(tuán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的明確術(shù)語的證據(jù)。aj.)本文使用的術(shù)語"保護(hù)基團(tuán)"指與分子中的官能團(tuán)反應(yīng)并與其結(jié)合從而防止該官能團(tuán)參與該分子的后續(xù)反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，所述基團(tuán)隨后可除去，從而再生出未保護(hù)的官能團(tuán)。還可參考ft^in/D/"/cmflo;c!/"5,Vc/fe附/sffj;Afo/ecw/"r5iV/ogy,OxfordUniversityPress,Oxford,1997，其作為保護(hù)基團(tuán)是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的明確術(shù)語的證據(jù)。具體實施方案應(yīng)該理岸，7爻"無迷"一，#^#論^，及本發(fā)'銀付；神賞滋才黃哞殆一些4'全率。/.凝迷標(biāo)記試劑標(biāo)記試劑可包含報告物部分、平衡物部分(或連接物部分)和反應(yīng)活性基團(tuán)(圖la)。標(biāo)記試劑可以與分析物反應(yīng)，從而產(chǎn)生被標(biāo)記分析物。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑被組織成組。在一些實施方案中，所述組可以是同分異構(gòu)和/或同量異位的。在一些實施方案中，所述組可以是質(zhì)量差異性的。在一些實施方案中，所述組可以是同量異位的和/或同分異構(gòu)的和質(zhì)量差異性的。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可具有如圖2所示的一般結(jié)構(gòu)A或B。一般結(jié)構(gòu)A和B的標(biāo)記試劑可與分析物反應(yīng)而形成如圖3所示的結(jié)構(gòu)A"和B"。在一些實施方案中，所述被標(biāo)記分析物可以在質(zhì)譜儀中斷裂。一些可能的片段及其相應(yīng)質(zhì)量可見于圖3中。一般結(jié)構(gòu)A和B的同量異位的標(biāo)記試劑的兩個可能的組可見于圖4a中，可能的報告物離子見于圖4b中?；谝话憬Y(jié)構(gòu)A和B的兩組質(zhì)量差異性標(biāo)簽可見于圖5a和圖5b中。圖6a和圖6b舉例說明了利用一般結(jié)構(gòu)A和B的標(biāo)記試劑對分析物進(jìn)行標(biāo)記。反應(yīng)活性基團(tuán)在本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中使用的標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)(有時使用縮寫"RG"表示)可以是能夠與樣品中的一種或多種反應(yīng)活性分析物的一個或多個官能團(tuán)反應(yīng)的親核性基團(tuán)。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實施方案中，可以認(rèn)為所述反應(yīng)活性基團(tuán)包括與連接物(平衡物)相關(guān)的原子或基團(tuán)。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)所述反應(yīng)活性基團(tuán)由下述的一些具體結(jié)構(gòu)部分所代表時，分析物可以通過一個或多個額外的原子或基團(tuán)與連接物(平衡物)相連，所述原子或基團(tuán)可以認(rèn)為或不認(rèn)為是所述連接物(平衡物)的一部分。所述反應(yīng)活性基團(tuán)可以預(yù)先存在或者其可在原位制備。反應(yīng)活性基團(tuán)的原位制備可以在不存在反應(yīng)活性分析物的情況下進(jìn)行，或者其可在存在反應(yīng)活性分析物的情況下進(jìn)行。在一些實施方案中，所述反應(yīng)活性基團(tuán)可以在原位通過原位除去保護(hù)基團(tuán)而形成。因此，任何可通過親核均涵蓋在本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中。在標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)是親核物的情況下，其可與分析物的合適的親電基團(tuán)反應(yīng)。多個合適的親核基團(tuán)和親電基團(tuán)對是已知的并且常用于化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中。包含合適的可與分析物(例如生物學(xué)上重要的羧酸化合物(例如前列腺素、脂肪酸、肉堿等)、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇或質(zhì)量小于1500道爾頓的其它小分子)偶聯(lián)的親核基團(tuán)的試劑的非限定性實例描述于PierceLifeScience&AnalyticalResearchProductsCatalog&Handbook(aPerstorpBiotecCompany),Rockford，IL61105，USA中。其它合適的試劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可從多家供貨商(比如Sigma-Aldrich)商業(yè)獲得。在一些實施方案中，標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)可以是親核物，比如氨基或肼基。在一些實施方案中，所述親核性反應(yīng)活性基團(tuán)可以是氨基烷基基團(tuán)或烷基肼基團(tuán)。報告物部分本發(fā)明實施方案中所使用標(biāo)記試劑的報告物部分(有時使用縮寫"RP，，表示)可以是具有可測量的獨(dú)特質(zhì)量(或者質(zhì)鐠儀中的質(zhì)荷比)的基團(tuán)。因此，在一些實施方案中，同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記試劑組中的每種報告物部分均具有獨(dú)特的粗略質(zhì)量，并且組中每種標(biāo)記試劑的相應(yīng)特征離子彼此不同。不同的報告物部分可包含一個或多個重原子同位素，以實現(xiàn)其獨(dú)特的粗略質(zhì)量。例如，存在下述同位素碳(12C、13C和"C)、氮(14N和"N)、氧(160和180)、硫。S和"S)或氫(氫、氘和氚)，并且它們可用于制備報告物部分的不同基團(tuán)。它們不是限制性的，因為在報告物部分中還可使用其它輕原子和重原子。包含輕原子和重原子同位素的適于制備報告物部分的基本起始材料可得自多個商業(yè)來源，例如CambridgeIsotopeLaboratories,Andover，MA(參閱www.isotope.com的"基本起始材料"列表)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支機(jī)構(gòu))。CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec還可根據(jù)定制合成合同制備所需要的化合物，A^^L報告物部分可以包含固定的電荷，或者可以在分析過程中電離。由于報告物部分可以包含固定電荷或者可被電離，因此所述標(biāo)記試劑可以鹽(或鹽的混合物)或兩性離子的形式分離或用于標(biāo)記反應(yīng)活性分析物。報告物部分(或報告物離子)的電離有利于在質(zhì)鐠儀中對其進(jìn)行測定。因此，被標(biāo)記分析物中存在的報告物部分可以作為片段離子(有時稱為特征離子(或報告物離子))而測定。電離后，特征離子(即報告物離子)可包含一個或多個凈的正電荷或負(fù)電荷。因此，報告物離子可包含一個或多個酸性基團(tuán)和/或堿性基團(tuán)，因為這些基團(tuán)可易于在質(zhì)語儀中電離。例如，報告物部分可包含一個或多個堿性氮原子(帶正電)和/或一個或多個電離的酸性基團(tuán)，例如羧酸基、磺酸基或磷酸基(帶負(fù)電)，只要在平衡時存在多于一個或或負(fù)電荷的報告物離子即可。包含至少一個堿性氮的報告物部分的非限定性實例包括取代或未取代的含有嗎啉、哌啶或艱溱的化合物。獨(dú)特的報告物部分可以與目的樣品相關(guān)聯(lián)，從而利用所述獨(dú)特的報告物部分標(biāo)記該樣品中的一種或多種分析物。這樣，可將關(guān)于獨(dú)特報告物部分的信息(一般在質(zhì)鐠儀中通過特征離子(即報告物離子)來檢測)與關(guān)于所述樣品中一種或全部分析物的信息相關(guān)聯(lián)。然而，在測定特征離子時，獨(dú)特的報告物部分并不一定要與分析物物理連接。相反，特征離子的獨(dú)特粗略質(zhì)量可例如在斷裂被標(biāo)記分析物的離子以產(chǎn)生子片段離子和特征離子之后，在串聯(lián)分析儀中的第二質(zhì)量分析中進(jìn)行測定。測定的特征離子可用于鑒定所測定分析物所源自的樣品。此外，相對于其他特征離子的量或者相對于與校正標(biāo)準(zhǔn)物相關(guān)的特征離子的量(校正標(biāo)準(zhǔn)物例如為預(yù)期存在于所述樣品中且用特異性報告物部分標(biāo)記的分析物)，所述獨(dú)特的特征離子的量(常表示為濃度和/或量)可用于測定所述樣品或所述多個樣品(例如用于形成樣品混合物的樣品)中分析物的相對量和/或絕對量(常表示為濃度和/或量)。在一些實施方案中，不是使用內(nèi)部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物，而是能夠基于將多種特征離子的峰強(qiáng)度與校正曲線進(jìn)行比較而進(jìn)行絕對定量。因此，可將信息(例如特定樣品中一種或多種分析物的量)與用于標(biāo)記每種特定樣品的報告物部分相關(guān)聯(lián)。當(dāng)還確定所述分析物的身份時，該信息能夠與涉及不同特征離子的信息相關(guān)聯(lián)，從而輔助確定一種或多種樣品中每種被標(biāo)記分析物的身份和量。在一些實施方案中，報告物部分可包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分中的亞甲基碳共價連接的氮原子，其中所述取代或未取代的亞甲基碳(而不是該乙酸部分中羧酸(或硫代羧酸)基團(tuán)的羰基)是該報告物的一部分。因此，在一些實施方案中，羧酸(或硫代羧酸)基可用于連接報告物與連接物，但不認(rèn)為是報告物的一部分。所述氮原子可被一個、兩個或三個基團(tuán)烷基化。例如，包含氮原子的部分可以是取代的伯胺，例如甲基、乙基或丙基基團(tuán)，或者是取代的仲胺，例如二甲胺、二乙胺、二正丙基胺或二異丙基胺。因此，例如，報告物部分"RP"可由以下的式X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、x8或x9表示，其中報告物部分"RP"以括號為界<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>報告物部分可以是5、6或7員雜環(huán)，其包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分的亞曱基碳共價連接的環(huán)氮原子，所述取代或未取代的N-烷基化乙酸部分通過其羰基碳與分析物(直接或間接)相連，其中所述取代或未取代的亞甲基碳(而不是羧酸基的羰基碳)是該報告物的一部分。所述雜環(huán)可以是芳香或非芳香的。因此，所述報告物部分可由式Y(jié)-J代表，其中Y基團(tuán)可代表5、6或7員雜環(huán)，J基團(tuán)可代表所述取代或未取代的乙酸部分中取代或未取代的亞甲基。所述雜環(huán)可以是取代或未取代的。例如，該雜環(huán)部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包含適于將分析物與支持物連接的保護(hù)或未保護(hù)的基團(tuán)，例如胺、羥基或硫醇基(見圖6)。所述雜環(huán)還可包含額外的雜原子，例如一個或多個硅、氮、氧和/或硫原子。因此，例如，報告物部分"RP"可由以下的式X1。、X"、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X"或X"來表示，其中報告物部分"RP"以括號X21、X為界<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>可對報告物部分進(jìn)行選擇，以使其在對分析物進(jìn)行分析的通常條件下不發(fā)生亞斷裂(sub-fragment)。為了消除任何疑義，這是任選(而非必需)的特征。例如，可對報告物進(jìn)行選擇，以使其在質(zhì)譜儀中使被標(biāo)記分析物斷裂的解離能條件下不發(fā)生顯著的亞斷裂。"不發(fā)生顯著的亞斷裂"意指在成功測定被標(biāo)記分析物時，難于或不可能檢測到高于背景噪聲的報告物片段。在一些實施方案中，可有意將報告物離子的粗略質(zhì)量選擇成與不同于尋求測定的分析物或該分析物的任何預(yù)計片段的質(zhì)量(即"靜區(qū)")。例如，當(dāng)分析物為蛋白質(zhì)或肽時，可選擇報告物離子的粗略質(zhì)量使其不同于任何天然氨基酸或肽或其預(yù)計片段。這可有利于分析物測定，因為對分析物而言，樣品中不存在具有完全相同質(zhì)量的任何可能組分，這可提高任何分析結(jié)果的置信度。對于肽而言，可預(yù)計背景極低的質(zhì)量范圍的實例可見于表l。表l:選擇與肽分析相關(guān)的標(biāo)記物片段離子m/z的可能"靜區(qū)"<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>所述報告物部分可以是非聚合的?？蛇x擇報告物部分以產(chǎn)生表明其質(zhì)量小于250原子質(zhì)量單位(amu)的m/z的特征離子。可選擇^L告物部分以產(chǎn)生表明其質(zhì)量小于200原子質(zhì)量單位(amu)的m/z的特征離子?？蛇x擇報告物部分以產(chǎn)生表明其質(zhì)量小于150原子質(zhì)量單位(amu)的m/z的特征離子。這些小分子可容易地在第二質(zhì)量分析中進(jìn)行測定，所述第二質(zhì)量分析中不含樣品中與所述第一質(zhì)量分析具有同樣一致質(zhì)量(coincidentmass)的其它組分。在這種情況下，可以對第一質(zhì)量分析中測定的選定離子進(jìn)行第二質(zhì)量分析，一般在串聯(lián)質(zhì)鐠儀中進(jìn)行(或者，例如在單級儀器中通過源后衰變)來進(jìn)行。由于可以從第一質(zhì)量分析中選出具有特定質(zhì)荷比的離子用于可能的斷裂和進(jìn)一步的質(zhì)量分析，因此第一質(zhì)量分析中未選擇的離子不進(jìn)行第二質(zhì)量分析，從而不污染第二質(zhì)量分析的譜。而且，質(zhì)鐠儀的靈敏度和檢測器(用于定量)的線性在這一低質(zhì)量范圍內(nèi)可相當(dāng)穩(wěn)健。此外，質(zhì)鐠儀技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)可允許在這一質(zhì)量范圍內(nèi)獲得小于l道爾頓的基線質(zhì)量分辨率。由于所有這些原因，具有上述特征的報告物處理可使用本文所述方法為復(fù)雜混合物中的所測分析物提供相當(dāng)準(zhǔn)確的定量。平衡物(或連接物)部分根據(jù)與分析物的反應(yīng)是否已經(jīng)發(fā)生，可用于本發(fā)明實施方案中的標(biāo)記試劑的平衡物(或連接物)部分(有時使用簡稱"LK")將報告物部分與分析物相連或者將報告物部分與反應(yīng)活性基團(tuán)相連?？蛇x擇連接物以產(chǎn)生連接連接物與報告物部分的鍵(RL鍵)和連接連接物與分析物的鍵(LA鍵)在質(zhì)鐠儀中均斷裂的中性物質(zhì)(即在質(zhì)鐠儀中經(jīng)歷中性丟失)。可將連接物設(shè)計成當(dāng)經(jīng)歷解離能水平時進(jìn)行亞斷裂從而僅產(chǎn)生連接物的中性片段。可將連接物設(shè)計成產(chǎn)生一種或多種可檢測的片段。關(guān)于同量異位的標(biāo)記試劑組，連接物部分可包含一個或多個重原子同位素，以便其質(zhì)量補(bǔ)償混合物中的每種被標(biāo)記分析物的報告物部分或組和/或試劑盒的標(biāo)記試劑的粗略質(zhì)量上的差異。而且，對于混合物中的每種被標(biāo)記分析物而言或者對于組和/或試劑盒的標(biāo)記試劑而言，才艮告物/連接物組合(即報告物/連接物部分)的合計粗略質(zhì)量(即作為一個整體看待的粗略質(zhì)量)可以相同。更具體地，在報告物部分的獨(dú)特粗略質(zhì)量與被標(biāo)記分析物所來源樣品相關(guān)聯(lián)并且所述報告物/連接物組合的合計粗略質(zhì)量對于樣品混合物中的每種被標(biāo)記分析物而言都相同(不考慮樣品混合物所來源的樣品)的情況下，連接物部分可以補(bǔ)償來自不同樣品(每種樣品均利用同量異位組中的不同試劑進(jìn)行標(biāo)記)的被標(biāo)記分析物的報告物部分之間在粗略質(zhì)量上的差異。這樣，當(dāng)被標(biāo)記并且然后混合而形成樣品混合物時，兩種或更多種樣品中同樣分析物的粗略質(zhì)量可以具有相同的粗略質(zhì)量。例如，組和/或用于標(biāo)記分析物的試劑盒中的被標(biāo)記分析物或標(biāo)記試劑可以是同量異位的。因此，如果在質(zhì)鐠儀中從樣品混合物的初次質(zhì)量分析中選擇具有特定質(zhì)荷比(取自樣品混合物)的離子(即選定的離子)，則來自不同樣品(其組成樣品混合物)的相同分析物可成比例地由所述選定的離子在樣品混合物中的相應(yīng)濃度和/或量來代表。因此，連接物不僅將報告物與分析物連接起來，它還可用于補(bǔ)償獨(dú)特報告物部分的質(zhì)量差異，從而使多種樣品中被標(biāo)記分析物的報告物/連接物部分的粗略質(zhì)量一致。(參見圖4a及其中示例的兩組同量異位標(biāo)記試劑)由于連接物可作為標(biāo)記試劑中報告物部分的質(zhì)量平衡物，因此連接物中的原子數(shù)越大，組和/或試劑盒中不同的同分異構(gòu)/同量異位標(biāo)記試劑的可能數(shù)目就越大。換言之，通常連接物所包含的原子數(shù)越大，可能的報告物/連接物組合的數(shù)目就越大，因為同位素幾乎可在連接物中的任何位置上被取代而產(chǎn)生連接物部分的同分異構(gòu)體和/或同量異位物，其中連接物部分用于抵消報告物部分的質(zhì)量差異，從而產(chǎn)生獨(dú)特的同分異構(gòu)和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組。這些不同組的標(biāo)記試劑特別適用于相同和/或不同樣品中分析物的多重分析。組和/或試劑盒中標(biāo)記試劑的總數(shù)可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。組或試劑盒中標(biāo)記試劑的多樣性僅受報告物和連接物部分中的原子數(shù)、可用于取代輕同位素的重原子同位素以及可以合成方式安置同位素的多種合成構(gòu)型的限制。然而，如上文所指出，多種同位素富集的基本起始材料可便利地從制造商(例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec)獲得。可將這些同位素富集的基本起始材料用于產(chǎn)生同量異位和質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑(即具有不同粗略質(zhì)量的標(biāo)記試劑)的方法中，或者用于產(chǎn)生同位素富集的起始材料的方法中，所述同位素富集的起始材料可用于產(chǎn)生成組的同量異位和質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的合成方法中。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑包含質(zhì)量差異性標(biāo)簽的組。對于這些組而言，連接物部分任選地不包含任何重原子同位素，因為所述連接物通常不用來"平衡"不同的報告物。這樣，所述組中每種不同試劑具有獨(dú)特的質(zhì)量和獨(dú)特的報告物部分，當(dāng)所述獨(dú)特的報告物部分從所述被標(biāo)記分析物上斷裂時，可在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生獨(dú)特的特征離子。制備適用于標(biāo)記試劑組中的標(biāo)記試劑的某些實例在下面進(jìn)行詳述。例如，連接物部分可由式1#代表其中，XpK、Ri和R2所代表的原子或基團(tuán)在下面進(jìn)行詳述。報告物/連接物的組合(即報告物/連接物部分)標(biāo)記試劑可包含彼此直接鍵連的報告物部分和連接物部分。如上文所述，在一些實施方案中，報告物/連接物部分對于標(biāo)記試劑(即對于同量異位的試劑組)的組和/或試劑盒中的每一種成員而言在粗略質(zhì)量上都是相同的。而且，連接報告物部分與連接物部分的鍵可設(shè)計成在經(jīng)受解離能時至少在一部分選定的離子中斷裂，從而從連接物部分和/或連接物/分析物部分(而不論所述試劑組是否是同量異位的)釋放報告物離子。因此，可以在MS/MS分析中直接觀測所述報告物離子(在質(zhì)鐠儀中作為m/z比來觀測)及其強(qiáng)度。報告物/連接物部分可包含組或試劑盒中多種標(biāo)記試劑中的相同或不同的重原子同位素的多種組合。在科學(xué)文獻(xiàn)中，這有時稱為"編碼"、"同位素編碼"或簡稱"編碼"。例如，Abersold等>^開了同位素編碼的親和標(biāo)簽(ICAT;參閱WO00/11208)。在一個方面中，Abersold等的試劑與本發(fā)明的一些標(biāo)記試劑不同，Abersold未教導(dǎo)兩種或更多種相同質(zhì)量的標(biāo)記試劑，例如同分異構(gòu)和/或同量異位的標(biāo)記試劑。相反，Abersold等教導(dǎo)了其標(biāo)記試劑的"輕"形式和"重"形式。關(guān)于本文中所公開的質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑，Abersold的試劑不在質(zhì)鐠儀中斷裂而釋放出可觀測到分析物的片段(子)離子的特征離子。因此，不同于Abersold的試劑，本文中所公開的質(zhì)量差異性試劑允許通過分析單個的MS/MS圖鐠或適于形成所述圖鐠的單一的數(shù)據(jù)組而對分析物進(jìn)行鑒定和定量。在一些實施方案中，報告物和/或連接物部分可包含可用于將標(biāo)記試劑或被標(biāo)記分析物固定在支持物上的原子或基團(tuán)。固定可以是直接或間接的。例如，在以下情況下可發(fā)生直接固定與報告物和/或連接物相關(guān)的原子或基團(tuán)(例如報告物和/或連接物的烷基胺取代基)在一些實施方案中可與支持物的反應(yīng)活性基團(tuán)(例如可切割連接物)直接相互作用以實現(xiàn)固定。相比較而言，如果例如報告物和/或連接物的取代基(例如報告物和/或連接物的烷基胺取代基)被修飾(例如被生物素化)并且所述修飾基團(tuán)與支持物的反應(yīng)活性基團(tuán)(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)相互作用而實現(xiàn)固定，則發(fā)生間接固定。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的實施方案分析物能與結(jié)合在支持物上的標(biāo)記試劑反應(yīng)，其中每種支持物包含獨(dú)特的標(biāo)記試劑，從而不同的樣品與不同的支持物反應(yīng)；本發(fā)明還涵蓋這樣的實施方案每種不同樣品與不同的標(biāo)記試劑反應(yīng)，并且反應(yīng)產(chǎn)物其后被固定在相同或不同的支持物上。在任何一種情況下，都通常通過從支持物上切割掉被標(biāo)記分析物來獲得用于質(zhì)鐠分析的樣品混合物。質(zhì)譜儀/質(zhì)譜法(MS):可利用能夠選擇并斷裂分子離子的串聯(lián)質(zhì)鐠儀和其它質(zhì)鐠儀來實施本發(fā)明的方法。串聯(lián)質(zhì)語儀能根據(jù)分子離子的質(zhì)荷比(m/z)來選擇并斷裂分子離子(單級質(zhì)i普儀也有此能力，但程度較低)，然后記錄所得的片段(子)離子鐠。更具體地，子片段離子鐠可通過對選定的離子施加解離能(例如碰撞誘發(fā)解離能(CID))而產(chǎn)生。例如，可以在第一質(zhì)量分析中選擇對應(yīng)于具有特定m/z比的被標(biāo)記肽的離子，使其斷裂并在第二質(zhì)量分析中進(jìn)行再分析。可進(jìn)行這樣的串聯(lián)質(zhì)量分析的代表性儀器包括但不限于磁性四扇區(qū)(magneticfour-sector)、串聯(lián)飛行時間、三重四極桿、離子阱和混合四極桿飛行時間(Q-TOF)質(zhì)鐠儀。這些類型的質(zhì)語儀可以與多種電離源聯(lián)用，所述電離源包括但不限于電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸附電離(MALDI)。電離源可用于產(chǎn)生帶電荷的物質(zhì)，其用于在分析物還不具有固定電荷時進(jìn)行第一質(zhì)量分析。其它質(zhì)鐠儀器和斷裂方法包括MALDI-MS儀器中的源后衰變和4吏用MALDI-TOF(飛行時間)-TOFMS進(jìn)行的高能CID。關(guān)于串聯(lián)質(zhì)譜儀最近的綜述可參閱R.Aebersold和D.Goodlett的Mss5^eCn附e^j/Vo&o附/cs.C/re附.及ev.101:269-295(2001)。通過解離能進(jìn)行的斷裂已公認(rèn)，鍵可以由于在質(zhì)鐠儀中發(fā)生的過程而斷裂。此外，可以在質(zhì)譜儀中通過對離子施加解離能來誘導(dǎo)鍵的斷裂。例如，可以通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生解離能?？捎糜谠谫|(zhì)鐠儀中斷裂離子的解離能的其它非限定性實例包括碰撞激活的解離(CAD)、光誘導(dǎo)解離(PID)、表面誘導(dǎo)解離(SID)、電子誘導(dǎo)解離(EID)、電子捕獲解離(ECD)、熱/黑體紅外輻射解離(BIRD)、源后衰變或其組合。質(zhì)鐠領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會理解，施加引起斷裂的解離能的其它示例性技術(shù)包括但不僅限于光解離、電子捕獲和表面誘導(dǎo)解離。通過碰撞誘導(dǎo)解離斷裂鍵的方法包括通過與惰性氣體碰撞而將選定離子的動能狀態(tài)提高到發(fā)生鍵斷裂的點。例如，可以通過在碰撞室中與惰性氣體(例如氮、氦或氬)碰撞來傳遞動能?？梢詡鬟f至該離子的動能的量與允許進(jìn)入碰撞室的氣體分子數(shù)成比例。當(dāng)存在更多的氣體分子時，可以對選定的離子傳遞更大量的動能，當(dāng)存在的氣體分子較少時，可以傳遞較少的動能。因此，很明顯，可以控制質(zhì)鐠儀中所施加的解離能。還公認(rèn)，某些鍵比其它鍵更不穩(wěn)定。分析物或報告物/連接物/非編碼可檢測標(biāo)記物部分中鍵的不穩(wěn)定性取決于該分析物的性質(zhì)和該報告物/連接物/非編碼可檢測標(biāo)記物部分的性質(zhì)。因此，可以調(diào)節(jié)解離能，從而以可測定的方式使分析物和/或標(biāo)記試劑(例如報告物/連接物組合)斷裂。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解如何對質(zhì)語儀的組件進(jìn)行這樣的常規(guī)調(diào)整并由此獲得合適的解離能水平，從而使被標(biāo)記分析物的至少一部分離子斷裂成特征離子(即報告物離子)和子片段離子。例如，可以對在第一質(zhì)量分析中選擇/分離的離子施加解離能。在串聯(lián)質(zhì)鐠儀中，可使提取的離子經(jīng)受解離能，從而導(dǎo)致斷裂，接著轉(zhuǎn)移至第二質(zhì)量分析器中。所選定的離子可具有選定的質(zhì)荷比。所述質(zhì)荷比可以在一定的質(zhì)荷比范圍內(nèi)，這取決于質(zhì)鐠儀的特性。當(dāng)使用碰撞誘導(dǎo)解離時，可通過使離子穿過碰撞室而將其從第一質(zhì)量分析器轉(zhuǎn)移至第二質(zhì)量分析器，在所述碰撞室中可以施加解離能以產(chǎn)生片段離子。例如，被送至第二質(zhì)量分析器進(jìn)行分析的離子可包括一些或一部分殘留的(未斷裂的)選定離子(如果有的話)以及被標(biāo)記分析物的報告物離子(特征離子)和子片段離子。通過計算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫分析來確定分析物在一些實施方案中，可以基于子離子斷裂模式來確定分析物，所述模式通過與已知或"理論"分析物的譜圖進(jìn)行計算機(jī)輔助的比較來分析。例如，在低能CID條件下斷裂的肽離子的子離子鐠可以認(rèn)為是許多離散斷裂事件的總和。常用的命名法根據(jù)所斷裂的酰胺鍵和鍵斷裂后保持帶電的肽片段來區(qū)分子片段離子(Reopstorff等，所ow^/.Afass5^"/wfi.，11:601(1988))。電荷保留在斷裂酰胺鍵的N端側(cè)導(dǎo)致形成b-型離子。如果電荷保留在斷裂酰胺鍵的C端側(cè)，則片段離子稱為y-型離子。除了b-和y-型離子以外，CID質(zhì)鐠還可含有其他診斷性片段離子(它們包括由于谷氨酰胺、賴氨酸和精氨酸發(fā)生氨中性丟失(-17amu)或者含有羥基的氨基酸(如絲氨酸和蘇氨酸)發(fā)生水丟失(-18amu)而產(chǎn)生的離子)；所述診斷性片段離子以及b-和y-型離子都是子片段離子。已經(jīng)觀測到某些氨基酸在低能CID條件下比其他氨基酸更易于斷裂。這對于含有脯氨酸或天冬氨酸殘基的肽而言特別明顯，在天冬氨酰-脯氨酸鍵處更為明顯(Mak,M.等，及flp,V/Mass5^"n附"12:837-842(1998))。因此，Z"，-pro二聚體或Z，，，-asp二聚體(其中Z，"是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸)的肽鍵與所有其他氨基酸二聚體組合中的肽鍵相比通常更不穩(wěn)定。因此，就肽和蛋白質(zhì)樣品而言，低能CID鐠含有重疊的b-和y-系列離子、來自同一肽的內(nèi)部片段離子以及銨和其它中性丟失離子方面的冗余的序列特異性信息。解釋這些CID鐠以從頭匯集親本肽氨基酸序列雖然具有挑戰(zhàn)性且費(fèi)時，但仍可行。用于測序的計算機(jī)輔助的從頭方法的最新進(jìn)展描述于Huang，Y.，Ross,P，Smirnov,I,Martin，S.和Pappin,D.2003,Proceedingsof6thInternationalSymposiumonMSinHealthandLifeSciences,2008年8月24日-28日，SanFranciscoCA。肽序列鑒定中最重要的進(jìn)展是開發(fā)了將肽CID譜與現(xiàn)存于蛋白質(zhì)和DNA序列數(shù)據(jù)庫中的肽序列相關(guān)聯(lián)的計算機(jī)算法。這樣的方法例如以下程序SEQUEST(Eng，J.等丄爿附.3ffl^5^e"n附.，5,976-989(1994))和MASCOT(Perkins,D.等￡/e"n/7/^^ws，20:3551-3567(1999))。筒言之，將實驗性肽CID鐠(MS/MS鐠)與從得自蛋白質(zhì)或基因組序列數(shù)據(jù)庫的肽序列中通過計算機(jī)產(chǎn)生的"理論"子片段離子鐠進(jìn)行匹配或關(guān)聯(lián)。這種匹配或關(guān)聯(lián)是基于預(yù)計質(zhì)量與MS/MS模式中子片段離子的觀測質(zhì)量之間的相似性。根據(jù)實驗與"理論"片段語之間的吻合程度來對可能的匹配或關(guān)聯(lián)評分。對給定肽氨基酸序列進(jìn)行檢索的參數(shù)非常具有區(qū)分力，以至于單個肽CID謙就足以鑒定全基因組或表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中的任何給定蛋白質(zhì)。其他綜述可參閱Yates,J.R.Trends,(7e/iC/cs，76:5-8(2000)和Yates,J.R.,f/e"n)/7/^"s/s7久.893畫卯0(1998)。因此，MS/MS鐠的子片段離子分析不僅可用于確定被標(biāo)記分析物的分析物，它還可用于確定所測定分析物所來源的分析物。例如，在MS/MS分析中對肽的鑒定可用于確定該肽從何種蛋白質(zhì)中由于蛋白質(zhì)的酶消化而切割下來?？深A(yù)見到這樣的分析可用于其它分析物，例如核酸、脂質(zhì)、類固醇和/或前列腺素。RL鍵和LA鍵報告物部分的原子與連接物部分的原子之間的鍵是RL鍵。連接物部分的原子與分析物的原子之間的鍵是LA鍵。在一些實施方案中，至少在一部分所選的離子中，RL鍵和LA鍵在經(jīng)受解離能水平時可斷裂。因此，在一些實施方案中，可以調(diào)節(jié)質(zhì)鐠儀中的解離能水平，使得被標(biāo)記分析物的至少一部分所選離子中的RL鍵和LA鍵都斷裂。RL鍵的斷裂從分析物中釋放所述報告物部分，從而能夠獨(dú)立于分析物來測定所述報告物離子。LA鍵的斷裂從分析物中釋放所述報告物/連接物部分，或者從分析物中釋放所述連接物，這取決于RL鍵是否已經(jīng)斷裂。在一些實施方案中，RL鍵可以比LA鍵更不穩(wěn)定。在一些實施方案中，LA鍵可以比RL鍵更不穩(wěn)定。在一些實施方案中，RL和LA鍵可以具有相同的不穩(wěn)定性。簡言之，RL鍵被設(shè)計成在本發(fā)明的各種實施方案中斷裂從而釋放所述報告物離子，但LA鍵可以斷裂或不斷裂。在一些實施方案中，當(dāng)目的分析物是蛋白質(zhì)或肽時，可以相對于酰胺(肽)鍵來調(diào)節(jié)RL鍵和LA鍵的相對不穩(wěn)定性。RL鍵、LA鍵或其二者可以比典型酰胺(肽)鍵的不穩(wěn)定性更高、相同或更低。例如，在解離能條件下，相比于Z，，，-pro二聚體或Z"，-asp二聚體中的肽鍵，RL鍵和/或LA鍵可以較不易于斷裂，其中Z，，，是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些實施方案中，鍵RL和鍵LA可在與典型酰胺鍵相比大致相同的解離能水平下斷裂。在一些實施方案中，RL鍵和鍵LA可在與典型酰胺鍵相比較高的解離能水平下斷裂。在一些實施方案中，還可存在這樣的鍵RL和LA，使得鍵LA的斷裂引起鍵RL的斷裂，并且反之亦然。這樣，鍵RL和鍵LA可基本上同時斷裂，使得沒有顯著量的分析物(或其子片段離子)包含部分標(biāo)記物。"顯著量的分析物"意指在質(zhì)譜儀(例如MS/MS分析)中可檢測到小于25%、優(yōu)選小于10%的部分標(biāo)記的分析物。由于在一些實施方案中分析物的標(biāo)記片段與未標(biāo)記片段在質(zhì)鐠(例如MS/MS分析)中存在明確的界限，因此這一特征可使通過計算機(jī)輔助分析從子片段離子鐠中鑒定分析物得以簡化，因為在用于對分析物子片段離子進(jìn)行分析的質(zhì)量計算中不需要對殘留的標(biāo)記物進(jìn)行補(bǔ)償。而且，由于在一些實施方案中分析物的片段離子可以被完全標(biāo)記或者未標(biāo)記(但不是部分標(biāo)記)，因此可以很少有或者沒有由于跨過斷裂鍵之間的同位素分布所導(dǎo)致的子片段離子在質(zhì)量上的散布，就像由施加解離能水平所引起的被標(biāo)記分析物的斷裂所導(dǎo)致的部分標(biāo)記分析物中單個不穩(wěn)定鍵的每一側(cè)都存在同位素的情況那樣。分析物的標(biāo)記如上文所述，可通過使分析物的官能團(tuán)與標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來標(biāo)記分析物。分析物上的官能團(tuán)可以是親電基團(tuán)，標(biāo)記試劑的官能團(tuán)可以是親核基團(tuán)。親電物與親核物可發(fā)生反應(yīng)而在分析物和標(biāo)記試劑之間形成共價連接。標(biāo)記反應(yīng)可在溶液中發(fā)生。在一些實施方案中，分析物或標(biāo)記試劑之一可與支持物結(jié)合。有時標(biāo)記反應(yīng)可在含水條件下進(jìn)行?？梢赃x擇含水條件用于生物分子例如蛋白質(zhì)、肽和/或核酸的標(biāo)記。有時標(biāo)記反應(yīng)可在有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行?？梢赃x擇有機(jī)溶劑用于小分子的分析物。水與有機(jī)溶劑的混合物或有機(jī)溶劑可廣泛使用。例如，可以制備水與約5%至約95%有機(jī)溶劑(體積/體積)的溶液并用于標(biāo)記分析物。在一些實施方案中，可以制備水與約50%至約95%有機(jī)溶劑(體積/體積)的溶液并用于標(biāo)記分析物。在一些實施方案中，可以制備水與約65%至約80o/。有機(jī)溶劑(體積/體積)的溶液并用于標(biāo)記分析物。有機(jī)溶劑的非限定性實例包括N，N，-二曱基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇，例如曱醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用本領(lǐng)域的知識和本文的公開內(nèi)容并結(jié)合常規(guī)實驗，根據(jù)標(biāo)記試劑的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)來確定合適的溶劑條件，以便于對分析物進(jìn)行標(biāo)記。在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時，可對pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH可以為4-10。pH也可在此范圍之外。通常，可以通過加入非親核性有機(jī)堿來調(diào)節(jié)非水反應(yīng)的堿度。合適的堿的非限定性實例包括N-曱基嗎啉、三乙胺和N，N-二異丙基乙胺?；蛘?，可以使用生物緩沖劑(例如]\-[2-羥乙基哌嗪^-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES))或無機(jī)緩沖劑(例如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)來調(diào)節(jié)含水溶劑的pH。因為至少一個所述反應(yīng)活性基團(tuán)可以是親電基團(tuán)，選擇不包含任何親核基團(tuán)的緩沖液可能是理想的。本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行常規(guī)實驗后能夠確定可用于調(diào)節(jié)標(biāo)記反應(yīng)的pH以利于用標(biāo)記試劑對分析物進(jìn)行標(biāo)記的其他緩沖劑。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)標(biāo)記試劑的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)，僅使用本文的公開內(nèi)容并結(jié)合常規(guī)實驗來確定有利于分析物標(biāo)記的合適的溶劑條件和pH。樣品處理在本發(fā)明的一些實施方案中，可以在標(biāo)記分析物之前和之后處理樣品。處理可有利于分析物的標(biāo)記。處理可有利于對樣品成分的分析。處理可簡化對樣品的操作。處理可有利于上述兩項或更多項。例如，可以用酶或化學(xué)品處理樣品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和肽)、核酸酶(以降解核酸)或其他一些酶?？梢赃x擇具有高度可預(yù)測降解模式的酶。還可以將兩種或更多種蛋白酶和/或兩種或更多種核酶一起使用或與其它酶一起使用，以降解樣品組分。例如，蛋白裂解酶胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，其切割賴氨酸或精氨酸與非特定氛基酸之間的肽鍵，從而產(chǎn)生包含氨基端(N端)以生的肽是可以預(yù)測的，其在胰蛋白酶消化產(chǎn)物樣品中的存在情況和/或量可指示其來源蛋白的存在情況和/或量。此外，肽的游離胺末端可以(C端)的肽。這樣，蛋白質(zhì)切割所產(chǎn)是有利于其標(biāo)記的優(yōu)良親核物。其他示例性蛋白裂解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。例如，蛋白質(zhì)(例如蛋白質(zhì)g)在用諸如胰蛋白酶的蛋白酶進(jìn)行消化時可產(chǎn)生三種肽(例如肽B、C和D)。因此，已經(jīng)用蛋白裂解酶(如胰蛋白酶)消化過并在分析中證實含有肽B、C和D的樣品可以說最初包含所述蛋白質(zhì)g。肽B、C和D的量也與所消化樣品中蛋白質(zhì)g的量相關(guān)。這樣，任何鑒定和/或定量樣品(或其片段)中肽B、C和D中的一種或多種的測定均可用于對原始樣品(或其片段)中蛋白質(zhì)g進(jìn)行鑒定和/或定量。由于酶的活性是可預(yù)測的，因此從序列已知的蛋白質(zhì)的降解中產(chǎn)生的肽序列是可以預(yù)測的。使用這一信息可以產(chǎn)生"理論"肽信息。因此，在對實際樣品質(zhì)譜分析的子片段離子(如上所述)進(jìn)行的計算機(jī)輔助分析中確定"理論"肽片段可用于確定一種或多種未知樣品中的一種或多種肽或蛋白質(zhì)。(參見例如上述標(biāo)題為"通過計算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫分析來確定分析物"的部分)。在一些實施方案中，樣品處理可包括處理待標(biāo)記分析物的前體。例如，如果待標(biāo)記分析物是來自經(jīng)消化蛋白質(zhì)的肽且選擇標(biāo)記試劑(對于本實例而言)使之與該肽或肽分析物反應(yīng)，則可以以有利于標(biāo)記反應(yīng)的方式處理樣品中的蛋白質(zhì)(分析物前體分子)。在這個實例中，可以用還原劑(例如三[2-羧乙基磷化氫(TCEP))還原蛋白質(zhì)，然后通過與封閉試劑(例如曱基硫代磺酸曱酯(methylmethanethiosulfonate，MMTS)的反應(yīng)而封閉。這樣，蛋白質(zhì)的硫醇基被封閉，從而不干擾分析物的胺與標(biāo)記試劑之間的標(biāo)記反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，對某些其他前體分子的處理可使用易于獲得的試劑和可調(diào)整的方案并可借助常規(guī)實驗來進(jìn)行。試劑和條件的確切選擇可根據(jù)待標(biāo)記的分析物和標(biāo)記試劑的性質(zhì)來進(jìn)行。在一些實施方案中，樣品處理可包括將分析物或分析物前體固定到固相支持物上，無論是否用標(biāo)記試劑對該固相支持物進(jìn)行了標(biāo)記。固定可包括共價固定以及吸附和其他非共價固定手段(例如靜電固定)。在一些實施方案中，固定可有利于降低分析物的復(fù)雜性。在一些實施方案中，固定可有利于分析物的標(biāo)記。在一些實施方案中，固定可有利于分析物前體的標(biāo)記。在一些實施方案中，固定可有利于對包含某些特性的樣品組分中的級分(例如其包含或缺少半胱氨酸部分)進(jìn)行選擇性標(biāo)記。在一些實施方案中，固定可有利于純化。固定可有利于以上兩項或更多項。分離，包括分離樣品混合物在一些實施方案中，對被標(biāo)記分析物的樣品或樣品混合物的處理可包括分離?？蓪?biāo)記或未標(biāo)記的分析物、標(biāo)記或未標(biāo)記的分析物前體或其級分進(jìn)行一次或多次分離?？蓪Φ米怨滔嗖东@的一種或多種級分或分離過程的其它產(chǎn)物進(jìn)行一次或多次分離?？梢詫煞N或更多種前述樣品類型進(jìn)行分離，并可在質(zhì)量分析之前進(jìn)行不同類型的分離。例如，可以制備包含來自不同樣品的差異性標(biāo)記分析物的樣品混合物。差異性標(biāo)記意指每種標(biāo)記物包含可鑒定的獨(dú)特特性。(例如在MS/MS分析中包含產(chǎn)生獨(dú)特的"特征離子"的獨(dú)特的報告物部分)。為了分析樣品混合物，可以分離該樣品混合物的組分，并僅對該樣品混合物的一種級分進(jìn)行質(zhì)量分析。這樣，可以顯著降低分析的復(fù)雜性，因為可以對分離的分析物獨(dú)立地分析質(zhì)量，從而提高了分析方法的靈敏度。當(dāng)然，可以對樣品混合物的一種或多種其它級分重復(fù)進(jìn)行一次或多次分析，從而允許對樣品混合物中的所有級分進(jìn)行分析?？墒褂孟率龇蛛x條件來測定包含樣品混合物的每種樣品中的每種被標(biāo)記分析物的量(前提是加入到所述樣品混合物中的每種樣品的量是已知的)在所述分離條件下被差異性標(biāo)記的相同分析物在一定的濃度下或以一定的量被共洗脫，所述濃度或量與其在樣品混合物中的豐度成比例。因此，在一些實施方案中，樣品混合物的分離可使分析簡化，同時保持質(zhì)量分析(例如MS/MS分析)中所測定信號與樣品混合物中被差異性標(biāo)記的分析物的量之間的相關(guān)性。分離可以通過色鐠法進(jìn)行。例如，可使用液相色鐠/質(zhì)鐠法(LC/MS)來實現(xiàn)樣品分離和質(zhì)量分析。此外，適于分離目的分析物的任何色鐠分離方法都可以使用。例如，色鐠分離可以是正相色鐠法、反相色鐠法、離子交換色譜法(即陰離子交換色譜法或陽離子交換色譜法)、分子大小排阻色鐠法或親和力色鐠法。分離可以通過電泳進(jìn)行。可使用的電泳分離技術(shù)的非限定性實例包括但不限于一維電泳分離、二維電泳分離和/或毛細(xì)管電泳分離。同量異位的標(biāo)記試劑或試劑組可用于標(biāo)記樣品的分析物，當(dāng)進(jìn)行分離步驟時，同量異位的標(biāo)記試劑尤其有用，因為標(biāo)記試劑組中的同量異位的標(biāo)記物是基本上不能區(qū)分的(并且通過從所述分析物除去報告物后的片段的粗略質(zhì)量也不能區(qū)分)。因此，同一組合物中被不同同量異色鐠分離。因為它們基本上是不能區(qū)分的，所以來自分離過程的洗脫液可包含一定量的每種被同量異位標(biāo)記的分析物，所述分析物與樣品混合物中被標(biāo)記分析物的量成比例。此外，根據(jù)對于如何制備樣品混合物的了解(加入各部分的樣品以及其它任選的組分(例如校正標(biāo)準(zhǔn)物)以制備樣品混合物)，可將樣品混合物中被標(biāo)記分析物的量返回去與被標(biāo)記分析物所來源樣品中的被標(biāo)記分析物相關(guān)聯(lián)。所述標(biāo)記試劑還可以是質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑(即具有不同粗略質(zhì)量的標(biāo)記試劑)。質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑可用來標(biāo)記例如兩種或更多種不同樣品中的分析物，其中組中不同的標(biāo)記試劑均具有不同的質(zhì)量(即與組中其它試劑相比已知的質(zhì)量差異)。因為組中所有的試劑都可具有已知的質(zhì)量差異，所以不需使標(biāo)記試劑斷裂來定量兩種不同樣品中類似分析物的相對量。然而，在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可以是可斷裂的。分析物的相對和絕對定量在一些實施方案中，有可能對樣品混合物中差異性標(biāo)記的相同分析物進(jìn)行相對定量。例如，有可能通過比較在質(zhì)量分析(例如對第一質(zhì)量分析中觀測到的選定的^L標(biāo)記分析物進(jìn)行的第二質(zhì)量分析)中測定的報告物離子(即特征離子)的相對量(例如所報告的峰面積和/或高度)來對差異性標(biāo)記的相同分析物進(jìn)行相對定量。換言之，當(dāng)每種報告物離子能與用于產(chǎn)生樣品混合物的每種特定樣品的信息相關(guān)聯(lián)時，則該才艮告物離子相對于質(zhì)量分析中所觀測到的其它報告物離子的相對量就是該分析物在樣品混合物中的相對量。當(dāng)組成樣品混合物的組分已知(例如組成樣品混合物的每種樣品的量已知)時，則可以基于對具有選定質(zhì)荷比的被標(biāo)記分析物觀測到的報告物離子的相對量反過來計算該分析物在用于制備該樣品混合物的每種樣品中的相對量?？梢詫Φ谝毁|(zhì)量分析中觀測到的所有差異性標(biāo)記分析物重復(fù)這一過程。這樣，可以測定用于產(chǎn)生樣品混合物的每種不同樣品中每種反應(yīng)活性分析物的相對量(常以濃度和/或量表示)。在另一些實施方案中，可以確定分析物的絕對量。就這些實施方案而言，可以向樣品混合物中加入已知量的一種或多種差異性標(biāo)記分析物(校正標(biāo)準(zhǔn)物)，或者可將報告物離子的強(qiáng)度與校正曲線相關(guān)聯(lián)。校正標(biāo)準(zhǔn)物可以是以用于標(biāo)記樣品混合物中分析物的標(biāo)記物組中的同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記物進(jìn)行了標(biāo)記的預(yù)期分析物，只要該校正標(biāo)準(zhǔn)物的報告物部分與形成該樣品混合物的任何樣品相比都是獨(dú)特的即可。一旦確定了校正標(biāo)準(zhǔn)物的報告物離子相對于樣品混合物中差異性標(biāo)記分析物的報告物離子的相對量，就有可能參考加入該樣品混合物中的校正標(biāo)準(zhǔn)物的量來計算該樣品混合物中所有差異性標(biāo)記分析物的絕對量(常以濃度和/或量表示)。這樣，還可以基于制備該樣品混合物的知識來確定每種差異性標(biāo)記分析物(在該分析物來源的樣品中存在校正標(biāo)準(zhǔn)物)的絕對量?；蛘撸梢酝ㄟ^分析被標(biāo)記分析物的代表性樣品來產(chǎn)生校正曲線，其中每種樣品包含不同已知量的被標(biāo)記分析物?？梢詫⑺治龅谋粯?biāo)記分析物的報告物離子的峰強(qiáng)度(同量異位組)或者被標(biāo)記分析物的峰強(qiáng)度(質(zhì)量差異性組)對已知量的每種被標(biāo)記分析物作圖，從而產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。一旦產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以將未知樣品中報告物離子或被標(biāo)記分析物(如果需要)的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定測試樣品中分析物的量。雖然有上述內(nèi)容，但如果需要還可以就報告物部分中任何天然存在或人工產(chǎn)生的同位素豐度對報告物離子(特征離子)的強(qiáng)度進(jìn)行校正。有多種方式來校正報告物部分的特征離子中雜質(zhì)的同位素豐度。這種校正的一個實例可見于已公開的于2004年8月12日提交的名稱為"MethodandApparatusForDe-ConvolutingAConvolutedSpectrum"的共同未決的共有美國臨時專利申請No.US2005-0114042Al?；旧?，可以使用數(shù)學(xué)公式和計算，通過對標(biāo)記試劑重疊同位素群的巻積鐠進(jìn)行去巻積(deconvolution)來測定與單個標(biāo)記試劑中同位素群相關(guān)的上限質(zhì)量(up-mass)和下限質(zhì)量(downmass)峰的強(qiáng)度。無論值是如何測得，越準(zhǔn)確地定量每種報告物離子(即特征離子)的強(qiáng)度，原始樣品中分析物的相對和絕對定量就越準(zhǔn)確。蛋白質(zhì)組分析本發(fā)明的實施方案可用于復(fù)雜分析，因為可以利用質(zhì)量分析技術(shù)以快速和重復(fù)的方式將樣品復(fù)合、分析和再分析。例如，可以分析一種或多種樣品中的一種或多種分析物的量。可以分析組成樣品混合物的樣品中分析物的量(常以濃度和/或量表示)。由于樣品處理和質(zhì)量分析可以快速進(jìn)行，因此這些方法可以重復(fù)多次，使得樣品混合物中許多差異性標(biāo)記分析物的量都可以針對其在分析物所來源的樣品中的相對和/或絕對量進(jìn)行測定?？梢允褂眠@種快速多重分析的一項應(yīng)用是蛋白質(zhì)組分析領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)可以看成是在結(jié)構(gòu)、功能和生物過程調(diào)節(jié)方面描述基因組序列中所編碼信息的實驗性方法。這可通過對細(xì)胞或組織所表達(dá)的全蛋白質(zhì)組組分進(jìn)行系統(tǒng)性分析來實現(xiàn)。與本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物實施方案聯(lián)用的質(zhì)鐠法是這種全局蛋白質(zhì)分析的一種可能的工具。例如，對于一組9種同量異位標(biāo)記試劑而言，在實驗中可獲得9個時間點以測定蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。例如，基于生長中的細(xì)胞對特定剌激的應(yīng)答。還可以進(jìn)行較少的時間點但引入一個或多個對照。還可以在同一多重實驗中進(jìn)行雙重測定或三重測定。在所有情況下，都可在單次多重實驗中測定蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，任選地在存在一個或多個任選的對照下和/或樣品重復(fù)下進(jìn)行。此外，因為對樣品混合物的處理是平行進(jìn)行的，所以結(jié)果是直接可比的，從而不需進(jìn)行補(bǔ)償來解釋方案或?qū)嶒灄l件的微小變化。因此，可使用這些同量異位標(biāo)記試劑的實驗分析包括但不限于時間過程實驗、生物標(biāo)志物分析、多重蛋白質(zhì)組分析、多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)實驗、親和捕獲、翻譯后修飾(PTM)測定和多重對照實驗。//逸合#在一些實施方案中，本發(fā)明涉及式I(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>其中基團(tuán)Y-J可以是任何報告物基團(tuán)。合適的報告物基團(tuán)的性質(zhì)已在前文描述過。合適的報告物基團(tuán)的性質(zhì)還描述于美國公開專利申請No.US2004-0219685-A1中，尤其是第41-47段。例如，報告物可包含作為基團(tuán)Y的5、6或7元雜環(huán)，其中所述雜環(huán)可以是取代或未取代的，并可任選地與支持物可切割地相連，其中所述雜環(huán)包含至少一個通過共價鍵與基團(tuán)J相連的環(huán)氮原子?；鶊F(tuán)J可以是取代或未取代的亞甲基基團(tuán)，由式-CJ，2-表示，其中每個J，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碟、-R3、-OR3、-SR3、畫R3，OR3或-R3，SR3?；鶊F(tuán)K可以是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-X2-(CK，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其中n是0或2~10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，彼此獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SRt、國R4，OR4或國R4，SR4。關(guān)于基團(tuán)Ri和R2:(l)R!是氫、氘或R6，R2是氫、氘或R7;或者(2)Ri和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-X2-(CR，2)Jp-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是l5的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、■SR5、畫R5，OR5或畫R5，SRs。原子或基團(tuán)X!可以是O、=S、=NH或-NR。原子或基團(tuán)X2可以是-0-或-S-?；鶊F(tuán)z可以是氫或共價連接的分析物。每個R3、R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。例如，每個R3、R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地可以是曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。每個R3'、Rt，、和/或Rs，各自獨(dú)立地可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。例如每個IV、R4，和/或Rs，各自獨(dú)立地可以是亞曱基、亞乙基、亞丙基、亞環(huán)丙基、亞正丁基、亞環(huán)丁基、亞正戊基、亞環(huán)戊基、亞正己基或亞環(huán)己基。在一些實施方案中，Y-J可以是由上述的式X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、XS或X"斤代表的基團(tuán)。在一些實施方案中，Y-J可以是由上述的式X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25或X26所代表的基團(tuán)。所述組合物可以是同位素富集的(即編碼的)。所述組合物可以是同位素富集的以包含一種或多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含兩種或更多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含三種或更多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含四種或更多種重原子同位素。所述5、6或7元雜環(huán)可以是包含至少一個可與基團(tuán)J共價連接的氮原子的任意5、6或7元雜環(huán)。例如，其可以是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌溱?？赡艿娜〈衙枋鲇谏鲜?定義"部分中，其中所述雜環(huán)可以包含一個或多個所述取代基。例如，取代基可以是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或其它烷基(在每種情況下'D，是氘)。所述取代基可以與環(huán)的雜原子相連。例如，所述雜環(huán)可以是N-曱基哌嗪。所述雜環(huán)可以是芳族或非芳族的。在一些實施方案中，報告物部分可以與支持物可切割地相連。多種支持物在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，各種包含三苯曱基部分的支持物商業(yè)上有售或者可制得(例如三苯甲基氯支持物(Trityl-Cl)或2-氯三苯甲基氯支持物)。例如，標(biāo)記試劑的報告物部分的羥基或硫醇基可以與合適支持物的可切割連接物反應(yīng)。所述可切割連接物可以是"立體位阻的可切割連接物"。可切割連接物的切割將從支持物上釋放出標(biāo)記物或被標(biāo)記分析物。立體位阻的固相支持物的非限定性實例包括三苯曱基氯樹脂(trityl-Cl，Novabiochem，P/N01-64-0074)、2-氯三苯曱基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/NQ-1755)、MBHA(AppliedBiosystemsP/N400377)、4-甲基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem，P/N01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0076)、羥基-(2-氯苯基)曱基腸PS(Hydroxy國(2國chorophnyl)methyl-PS)(Novabiochem,P/N01-64-0345)、Rink酸樹脂(NovabiochemP/Ns01-64-0380,01-64-0202)、NovaSynTGT醇樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0074)。多種其它可切割連接物是本領(lǐng)域中已知的，可利用這些可切割連接物并僅使用可商購的材料、常規(guī)實驗以及本文所提供的教導(dǎo)來制備合適的支持物。因此，在一些實施方案中，所述5、6或7元雜環(huán)可包含有利于其與合適支持物進(jìn)行可切割連接的原子或基團(tuán)。例如，所述基團(tuán)可以是含有氨基、羥基或疏醇基的亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。所述原子可以是哌溱環(huán)的仲氮。對于示例性哌溱化合物和其制備方法的論述可見于公開的美國專利申請No.US2004-0219685Al中。例如，所述支持物接合的N-烷基哌溱乙酸化合物可以與二胺反應(yīng)，然后與二酸反應(yīng)，從而形成可用作標(biāo)記試劑的支持物接合的化合物，其中同位素編碼可基于反應(yīng)物的性質(zhì)。再參考式I，基團(tuán)Y-J-(無論是否與支持物可切割地連接)可形成報告物部分。所述報告物部分可包含至少一個同位素富集的位點。所述報告物部分可包含至少兩個同位素富集的位點。所述報告物部分可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或更多個同位素富集的位點。所述報告物部分在質(zhì)鐠儀中可包含固定電荷或者是可電離的。例如，含有堿性基團(tuán)(例如氨基)的化合物容易質(zhì)子化而引入電荷，酸性化合物(例如羧酸基團(tuán))容易脫質(zhì)子而引入電荷(參見Roth，Kennethetal,"ChargeDerivatizationofPeptidesforAnalysisbyMassSpectrometry",Af證5^"n附欲j;及ev/e鄉(xiāng),17:255-274(1998))。平衡物(連接物)部分可以由式1#所代表的基團(tuán)形成其中RpR2、Xi和K如前所定義。所述平衡物部分可包含至少一個同位素富集位點。所述平衡物部分可包含至少兩個同位素富集位點。所述平衡物部分可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、#I15、16或17個或更多個同位素富集位點。在一些實施方案中，所述組合物可由式II(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage78</formula>其中W是用來取代所述6元雜環(huán)上的至少一個M基團(tuán)的原子或基團(tuán)，且處于所述六元環(huán)上氮的鄰、間或?qū)ξ??；鶊F(tuán)W可以是-N(H)-、-N(R，，)-、-N(R"，)-、-P(R，，)-、-P(R，，，)畫、-O-或國S-。如果選擇為-N(R"，)-或-P(R，，，)-，則該基團(tuán)可用于使所述組合物與支持物可切割地連接。每個其余的基團(tuán)M可以各自獨(dú)立地是-CM，r，其中每個M，可以各自獨(dú)立地是氫、氖、氟、氯、溴、碘、-R8、-OR"-SR8、-R8，OR8il-R8，SR8o基團(tuán)J、K、XpRpR2和Z如前所定義。每個R，，各自獨(dú)立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基，每個R"，各自獨(dú)立地可以是H2N-R9，-、H(R1())N-R9，-、(R1())2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⒃摶衔锱c支4物可切割地連接的可切割連接物。每個Rg和/或Rw可以各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基，每個Rs，和/或IV可以各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。在一些實施方案中，所述組合物可由式III(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage78</formula>其中s可以是05的整數(shù)?；鶊F(tuán)RpR2和Z如前所定義。原子或基團(tuán)Rn可以是氫、氘、甲基、C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或其它烷基或-R，"，其中R"，如前所定義。例如，所述組合物可以選自如下所示的化合物(包括其鹽形式和/或水合物形式)V-XII或XXV至XXXII中之一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或者lsO替代160的同位素富集位點，Z是氫或共價連接的分析物。在一些實施方案中，所述組合物可以由式IV(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>其中，Rn和Z如前所定義。例如，所述組合物可選自如下所示的化合物(包括其鹽形式和/或水合物形式)XV至XXIII或XXXV至XXXXI中之一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者lsO替代"O的同位素富集位點，Z是氫或共價連接的分析物。在一些實施方案中，所述組合物可由式III*(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>其中，Ru和Z如前所定義。例如，所述組合物可選自如下所示的化合物(包括其鹽形式和/或水合物形式)M至MV或MVI至MXIII中之<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者lsO替代160的同位素富集位點，Z是氫或共價連接的分析物。如上述，所述組合物可以鹽形式和/或水合物形式存在。該組合物是否以鹽形式存在通常取決于取代基的性質(zhì)和數(shù)目以及其存在和/或分離的條件。眾所周知，可以通過用酸處理使堿性基團(tuán)(如胺)質(zhì)子化，從而形成該胺的鹽。例如，含有標(biāo)記試劑的哌溱可作為單TFA鹽、單HC1鹽、二TFA鹽或二HC1鹽而得到(參閱如美國專利7>布號US2005-0148771Al)。還眾所周知，可以通過用堿處理4吏酸性基團(tuán)(比如羧酸)脫質(zhì)子而形成羧酸鹽，參考文獻(xiàn)同上。還眾所周知，含有堿性基團(tuán)(比如胺)和酸性基團(tuán)(比如羧酸)的化合物可以以兩性離子形式存在。所有這些都認(rèn)為是鹽形式，組合物中這些官能團(tuán)的離子化狀態(tài)取決于其所存在的任何溶液的pH,或者如果是分離的，則取決于其所分離溶液的pH。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員十分了解如何僅利用常規(guī)實驗和本文的公開內(nèi)容對本文所述組合物的任何反離子鹽形式的電荷態(tài)和性質(zhì)進(jìn)行操作。組合物是否以水合物形式存在還可取決于其存在或分離的條件。水合物僅包含一個或多個絡(luò)合的水分子。本發(fā)明公開內(nèi)容涵蓋任何可能的7JC合物形式或其組合。如前所述，基團(tuán)Z可以與分析物共價連接。所述分析物可通過分析物與標(biāo)記試劑的反應(yīng)而制得。所述分析物可以是任何分析物。例如，基團(tuán)Z可以是肽或蛋白質(zhì)?；鶊F(tuán)z還可以是氫并因此包含親核反應(yīng)活性基團(tuán)?？蓪?biāo)記試劑組織成組，所述組可以是同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記的組。已經(jīng)公開了標(biāo)記試劑的其它性質(zhì)。例如，所述標(biāo)記試劑可用于同一樣品或者兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的多重分析。所述標(biāo)記試劑可以是同位素富集的(即編碼的)。所述標(biāo)記試劑可以是同位素富集的以包含一種或多種重原子同位素。所述標(biāo)記試劑可以是同位素富集的以包含兩種或更多種重原子同位素。所述標(biāo)記試劑可以是同位素富集的以包含三種或更多種重原子同位素。所述標(biāo)記試劑可以是同位素富集的以包含四種或更多種重原子同位素。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以是被標(biāo)記的校正標(biāo)準(zhǔn)物。如本文中所述，可將已知量的校正標(biāo)準(zhǔn)物加入到混合物中以輔助目的分析物的絕對定量分析。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及已利用同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑標(biāo)記的分析物，比如感興趣的肽。因此，所述被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物可以是利用如本文中所述標(biāo)記試劑標(biāo)記過的任何分析物。所述標(biāo)記試劑可選自同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組。///.標(biāo)記和為、浙才法根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可將分析物標(biāo)記，然后進(jìn)行測定?？梢酝ㄟ^質(zhì)量分析測定被標(biāo)記分析物、分析物本身、分析物的一個或多個片段和/或標(biāo)記物的片段。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可用于分析同一樣品中的不同分析物，以及用于對兩種或更多種不同樣品中相同和/或不同的分析物進(jìn)行多重分析?？梢曰旌蟽煞N或更多種不同樣品以形成樣品混合物。在多重分析中，可以使用標(biāo)記試劑來確定分析物來源于樣品混合物中的何種樣品。可以測定該分析物在每種所述兩種或更多種樣品(其組合而形成樣品混合物)中的絕對和/或相對(例如相對于不同樣品中的同一分析物)量(常以濃度或量表示)。此外，可以使用分析物片段(例如子片段離子)的質(zhì)量分析來鑒定該分析物和/或該分析物的前體，例如在該分析物由前體分子降解而成的情況下。該分析中使用的樣品可以是包含分析物的任何樣品，所述分析物可用本文中所公開的標(biāo)記試劑(比如前面在標(biāo)題"組合物"項下所述的那些)進(jìn)行標(biāo)記。例如，樣品可以是粗制或經(jīng)處理的細(xì)胞裂解物、體液、組織提取物或細(xì)胞提取物。樣品可以是分離過程的級分。其它可能的樣品類型已在本文中討論過。樣品中的分析物可以是可用標(biāo)記試劑標(biāo)記的任何分析物。例如，所述分析物可以是肽和/或蛋白質(zhì)。其它可能的分析物類型已在本文中論述過'所述方法的一個區(qū)別在于以下事實來自不同樣品的分析物可用獨(dú)特的標(biāo)記物進(jìn)行差異性標(biāo)記(即編碼)，所述獨(dú)特的標(biāo)記物在化學(xué)上是同量異位的(具有同樣的粗略質(zhì)量)或者是質(zhì)量差異性標(biāo)簽，并且鑒定所述分析物所來源的樣品。對于同量異位的標(biāo)記試劑而言，所述差異性標(biāo)記的分析物在質(zhì)鐠儀的MS模式下并未被區(qū)分，因為其具有同樣的(總)質(zhì)荷比。常對組中的標(biāo)記試劑進(jìn)行選擇，從而使所述被標(biāo)記分析物也不可通過分離技術(shù)(比如色鐠法或電泳法，可在第一質(zhì)量分析前將其用于混合物)而區(qū)分。然而，當(dāng)被施加解離能(比如通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID))時，所述標(biāo)記物可斷裂而產(chǎn)生可在質(zhì)鐠儀中通過質(zhì)量(質(zhì)荷比)而解析的獨(dú)特報告物離子。可將在MS/MS(或MSn，其中n是大于1的整數(shù))質(zhì)鐠中所觀測到的每種獨(dú)特報告物離子的相對量與樣品混合物中被標(biāo)記分析物的相對量相關(guān)聯(lián)，并通過推斷與來源樣品中該分析物的相對量相關(guān)聯(lián)。因此，報告物離子(即特征離子)的相對強(qiáng)度可用來測定兩種或更多種不同樣品(其組合而形成樣品混合物)中分析物的相對量。根據(jù)報告物離子的信息，如果將每種分析物(對其而言期望獲得絕對定量)的校正標(biāo)準(zhǔn)物以已知量摻入樣品混合物中或者在可獲得報告物離子或被標(biāo)記分析物的校正曲線的情況下，可得出兩種或更多種樣品中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。例如，所述分析物可以是利用酶消化反應(yīng)處理樣品而由蛋白質(zhì)降解得到的肽。蛋白質(zhì)降解可通過利用一種或多種蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶)處理樣品而實現(xiàn)。通過對樣品混合物中的肽進(jìn)行定性和定量測定以及鑒定肽所來源的樣品(任選地同時測定來自該樣品中的其它肽)，可相對于肽所來源的樣品而將所述降解肽的前體蛋白進(jìn)行鑒定和/或定量。因為此方法允許對超過一種樣品(即來自樣品混合物)中的一種或多種蛋白質(zhì)進(jìn)行多重測定，所以它是一種多重方法。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明還涉及包括以下步驟的方法使兩種或更多種樣品(每種樣品包含一種或多種反應(yīng)活性分析物)與標(biāo)記試劑組中的不同標(biāo)記試劑反應(yīng)，從而產(chǎn)生兩種或更多種差異性標(biāo)記的樣品，所述樣品各自包含一種或多種被標(biāo)記分析物。所述標(biāo)記試劑可選自同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑的組。例如，組中的不同標(biāo)記試劑可以由式I，(包括其鹽形式和/或水合物形式)代表X1，其中原子或基團(tuán)Y、J、K、RpR2和&如前所定義。在一些實施方案中，Y可以是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌嚷部分。在一些實施方案中，組中的標(biāo)記試劑可以是同量異位和/或同分異構(gòu)的，其中所述組中每種不同的標(biāo)記試劑都具有相同的粗略質(zhì)量，但其中每種不同的標(biāo)記試劑的基團(tuán)Y-J(所述基團(tuán)形成報告物部分)在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特編碼，從而當(dāng)所述基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與所述標(biāo)記試劑片段的其余部分之間的鍵在質(zhì)譜儀中斷裂時，產(chǎn)生具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子。在一些實施方案中，報告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌溱或嗎啉基團(tuán)。在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑可以是一組質(zhì)量差異性標(biāo)簽，其中組中的所有標(biāo)記物都包含不同的質(zhì)量?？稍O(shè)計這些標(biāo)記試劑使其經(jīng)受解離能而發(fā)生斷裂，但是并非必須如此設(shè)計，因為分析通常以MS1模式進(jìn)行。因此，在一些實施方案中，組中每種不同標(biāo)記試劑的基團(tuán)Y-J都可在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特地編碼，使得在基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與標(biāo)記試劑的其余部分之間的鍵在質(zhì)鐠儀中斷裂時，產(chǎn)生具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子。不管所述組是否是同量異位的(和/或同分異構(gòu)的)或質(zhì)量差異性的，如果標(biāo)記試劑能夠產(chǎn)生報告物離子，則在一些實施方案中可選擇標(biāo)記試劑以使各自包含獨(dú)特的質(zhì)量。因此，每種具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子可用于鑒定每種被標(biāo)記分析物所來源的樣品。式I，的試劑包含可與分析物的羧酸部分反應(yīng)而形成酰胺的親核氮。所述親核氮還可與分析物的醛或酮反應(yīng)，但所述希夫堿(shiftsbase)通常被還原而形成穩(wěn)定的加合物。不管如何形成的，樣品混合物的被標(biāo)記分析物可由式I"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage89</formula>其中，原子或基團(tuán)Y、J、K、RpR2和Xi如前所定義，基團(tuán)Z"可以是共價連接的分析物。在一些實施方案中，變量Y可以是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌溱基團(tuán)。所述標(biāo)記方法可產(chǎn)生兩種或更多種差異性標(biāo)記的樣品，每種樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物。一旦利用對于該樣品而言獨(dú)特的標(biāo)記試劑將每種樣品中的分析物進(jìn)行標(biāo)記，則可將兩種或更多種差異性標(biāo)記的樣品或其部分混合而形成樣品混合物。所述樣品混合物可任選地包含一種或多種校正標(biāo)準(zhǔn)物。可記錄每種樣品(其組合而形成樣品混合物)的體積和/或量。相對于樣品混合物的總樣品體積和/或量而言，每種樣品的體積和/或量可用來測定來自樣品混合物分析的每種樣品中所鑒定分析物的量(常以濃度和/或量來表示)。因此，樣品混合物可包含復(fù)雜的混合物，其中通過對兩種或更多種樣品的每種中分析物的量進(jìn)行相對定量，或者在將校正標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品混合物中的情況下進(jìn)行絕對定量，而可將相同和/或不同分析物的相對量進(jìn)行鑒定和/或定量。對于標(biāo)記試劑的同量異位組而言，可以對混合物例如應(yīng)用光鐠技術(shù)，其中可對樣品混合物或其級分利用第一質(zhì)量分析器進(jìn)行第一質(zhì)量分析。然后可以對來自第一質(zhì)量分析的具有特定質(zhì)荷比的離子進(jìn)行選擇。給所選離子施加解離能(例如碰撞誘導(dǎo)解離(CID))從而誘導(dǎo)所選離子的斷裂。通過給被標(biāo)記分析物的所選離子施加解離能，至少在一部分所選離子中鍵可以斷裂。在一些實施方案中，兩種鍵的斷裂均可引起報告物/連接物部分的斷裂以及引起從分析物釋放出離子化的報告物部分(即報告物離子或特征離子)。多種標(biāo)記試劑的這種斷裂的實例示于圖la至lc中。解離能對所選離子的斷裂還可產(chǎn)生分析物的子片段離子。然后可將離子(剩余的所選離子、子片段離子和離子化的報告物部分(即特征離子))或其部分引導(dǎo)至第二質(zhì)量分析器中。在第二質(zhì)量分析器中，可對所選離子及其部分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。所述第二質(zhì)量分析可以確定樣品混合物中至少一種被標(biāo)記分析物的一些或全部子片段離子的以所選質(zhì)荷比和(粗略和/或絕對)質(zhì)量存在的每種獨(dú)特報告物離子的粗略質(zhì)量(或m/z)和相對量。對于以所選質(zhì)荷比存在的每種分析物而言，可利用子片段離子來鑒定具有所選質(zhì)荷比的分析物。例如，此分析可如前面標(biāo)題為"遛過^"^^^^磁炎凝為V^f進(jìn)^時為、浙參資^T，的部分中所述。因此，在一些實施方案中，所述方法還包括第二質(zhì)量分析中每種特征離子的粗略質(zhì)量和相對量以及第二質(zhì)量分析中一些或全部的子片段離子的粗略質(zhì)量和/或絕對質(zhì)量。無論所述試劑是來自同量異位組、質(zhì)量差異性組還是同量異位和質(zhì)量差異性試劑二者的組合，都有可能通過分析用于產(chǎn)生質(zhì)量圖鐠的單個質(zhì)量圖鐠或單個數(shù)據(jù)組而獲得對于分析物的鑒定和定量，因為有關(guān)報告物離子和子片段離子的信息存在于同樣的數(shù)據(jù)組或圖鐠中。在一些實施方案中，所述方法還包括通過分析子片段離子而測定與所選定的質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物(和/或其前體)。在一些實施方案中，所述方法的某些步驟可重復(fù)一次或多次。例如，在一些實施方案中，可對來自第一質(zhì)鐠分析的具有所選質(zhì)荷比(不同于任何以前所選的質(zhì)荷比)的離子進(jìn)行解離能處理，從而形成離子化的報告物部分(即特征離子)和至少一些前述所選離子的子片段離子?？蓪λx離子、報告物離子和/或子片段離子或其部分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。還可以測定第二質(zhì)量分析中每種獨(dú)特的特征離子的粗略質(zhì)量和相對量以及子片段離子的(粗略或絕對)質(zhì)量。任選地，可通過分析子片段離子而測定與所選質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物(或前體分子)。這樣，就可將這些信息用于對來自第一質(zhì)量分析的一種或多種其它分析物進(jìn)行的鑒定和/或定量。在一些實施方案中，在樣品混合物已被分級(例如通過色鐠法或電泳法分離)的情況下，重復(fù)所述方法一次或多次可能是有用的。例如，通過針對樣品的一種或多種其它級分重復(fù)所述方法，有可能分析全部的樣品混合物。可以預(yù)計，在一些實施方案中，可重復(fù)完整方法一次或多次，并且在這些重復(fù)中的每一次中，都可如上所述將某些步驟重復(fù)一次或多次。這樣，可以在最大可能程度上探求并測定樣品混合物的含量。還可針對兩種或多種樣品的新組而重復(fù)所述完整方法。質(zhì)鐠領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會理解，所述第一和第二質(zhì)量分析可以在串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)行。適于進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)量分析的儀器已在本文中描述過。雖然優(yōu)選串聯(lián)質(zhì)鐠儀，但也可施用單級質(zhì)鐠儀。例如，可通過錐電壓斷裂來誘導(dǎo)分析物斷裂，然后通過對所得片段利用單級四極桿或飛行時間質(zhì)鐠儀進(jìn)行質(zhì)量分析。在另一些實例中，可施用激光源對分析物施加解離能并記錄所得片段，然后在飛行時間或串聯(lián)飛行時間(TOF-TOF)質(zhì)鐠儀中進(jìn)行源后衰變。如前所述，在一些實施方案中，所述標(biāo)記試劑或標(biāo)記試劑組可以是支持物接合的。因此，除了適應(yīng)從支持物回收被標(biāo)記分析物外，可利用支持物接合的試劑實施上述方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及實施上述任何方法，其中組中每種不同的標(biāo)記試劑是支持物接合的并且通過可切割連接物與支持物連接，從而每種不同的樣品都可與具有組中不同標(biāo)記試劑的支持物反應(yīng)，并且其中所述方法還包括在進(jìn)行標(biāo)記樣品的步驟后但在進(jìn)行混合所述被標(biāo)記樣品前制備樣品混合物i)任選地清洗每種支持物以除去與支持物接合之標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)不反應(yīng)的每種樣品的成分；ii)切割所述可切割連接物從而從每種支持物上釋放出被標(biāo)記分析物，每種差異性標(biāo)記的樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的被標(biāo)記分析物是可通過與其相連的具有獨(dú)特質(zhì)量報告物部分鑒定和/或定量的；以及iii)任選地在混合之前收集每種樣品的被標(biāo)記分析物。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法還包括利用至少一種酶消化每種樣品以在對樣品的分析物進(jìn)行標(biāo)記之前部分或全部地降解樣品成分(還參見標(biāo)題為"樣品處理"的前述部分)。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。還可以將兩種或更多種酶一起使用，從而進(jìn)一步降解樣品成分。例如，所述酶可以是蛋白水解酶，比如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶(例如A、B、C等)。在一些實施方案中，方法還可包括在進(jìn)行所述第一質(zhì)量分析之前分離樣品混合物(還參見以上標(biāo)題為"分離，包括樣品混合物的分離"的部分)。這樣，可以僅針對樣品混合物的級分進(jìn)行所述第一質(zhì)量分析。分離可通過任何分離方法進(jìn)行，包括通過色鐠法和/或通過電泳法。例如，可在質(zhì)量分析之前使用液相色諉/質(zhì)鐠法(LC/MS)來實施這樣的樣品分析。此外，可使用適于分離目的分析物的任何色鐠分離方法。合適的色譜和電泳分離方法的非限定性實例已經(jīng)在本文中描述過。在一些實施方案中，所述方法可以與消化和分離步驟一起實施。雖然這些步驟是任選的，但常將它們一起實施，例如，當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析從而測定細(xì)胞中蛋白質(zhì)的上調(diào)和下調(diào)時。在一些實施方案中，可將方法的各步驟(無論有或沒有消化和/或分離步驟)重復(fù)一次或多次，從而鑒定和/或定量樣品中的一種或多種其它分析物或者兩種或更多種樣品(包括利用支持物接合的標(biāo)記試劑所標(biāo)記的樣品)的每種樣品中的一種或多種分析物。根據(jù)樣品混合物中是否存在校正標(biāo)準(zhǔn)物，特定分析物的定量可以相對于其它被標(biāo)記分析物進(jìn)行，或者特定分析物的定量可以是絕對的。如前所述，可通過對子片段離子的質(zhì)量(粗略質(zhì)量或絕對質(zhì)量)的分析而測定與所選離子相關(guān)的分析物。一種這樣的方法描述于標(biāo)題為"通過計算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫分析進(jìn)行的分析物測定"的部分中。一旦已對分析物進(jìn)行了測定，則關(guān)于第二質(zhì)量分析中每種獨(dú)特才艮告物離子的粗略質(zhì)量和相對量的信息以及子片段離子質(zhì)量的信息可為確定有關(guān)樣品混合物的其它信息提供絲?？赏ㄟ^質(zhì)鐠中的峰強(qiáng)度測定報告物離子的相對量。在一些實施方案中，可通過利用質(zhì)鐠儀分析所得報告物離子(特征離子)的峰高或峰寬(或峰面積)而測定每種獨(dú)特報告物離子的量。因為可利用不同的標(biāo)記試劑對每種樣品進(jìn)行標(biāo)記，并且每種標(biāo)記試劑都可包含產(chǎn)生獨(dú)特報告物離子的獨(dú)特報告物部分(所述獨(dú)特報告物離子可與用于配制樣品混合物的特定的差異性標(biāo)記樣品相關(guān)聯(lián))，因此在第二質(zhì)量分析中測定不同的報告物離子可用于鑒定差異性標(biāo)記的樣品(所選分析物的報告物離子由其而來)。在可見多個報告物離子的情況下(例如根據(jù)本發(fā)明的多重方法)，每種獨(dú)特報告物離子的相對量可相對于其它報告物離子而測定。因為在第二質(zhì)量分析中所測定的每種獨(dú)特報告物離子的相對量可與樣品混合物中分析物的相對量相關(guān)聯(lián)，并且因為用于制備樣品混合物的樣品的比例是已知的，所以可測定每種差異性標(biāo)記的樣品(其組合而形成樣品混合物)中分析物的相對量(常表示為濃度和/或量)。此外，在所測定的分析物是另一種目的化合物的副產(chǎn)物的情況下(例如所述分析物是降解反應(yīng)的產(chǎn)物，比如在分析物是通過蛋白質(zhì)消化而形成的肽的情況下)，可將分析物的定量信息與原始差異性標(biāo)記樣品中的成分相關(guān)聯(lián)。如上所述，可針對具有不同質(zhì)荷比的所選離子重復(fù)該分析一次或多次，從而獲M種樣品(其組合而形成樣品混合物)中的一種或多種其它被測分析物的相對量。此外，如果需要，可對與每種獨(dú)特特征離子相關(guān)的峰強(qiáng)度進(jìn)行天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度的校正，如前面在標(biāo)題為"分析物的相對和絕對定量"的部分中所述的。在一些實施方案中，所述分析物可以是樣品或樣品混合物中的肽。對樣品或樣品混合物中肽的分析可用來測定樣品或樣品混合物中可鑒定蛋白質(zhì)的量(常表示為濃度和/或量)，其中一種或多種樣品中的蛋白質(zhì)可在第一質(zhì)量分析之前被降解。此外，為測定目的，可將來自不同樣品的信息進(jìn)行比較，比如為比較與不同濃度的基質(zhì)(其可影響細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和/或死亡)一起孵育的細(xì)胞中蛋白質(zhì)的量的作用。其它非限定性的實例可包括在利用傳染物(比如細(xì)菌或病毒或其它疾病狀態(tài)比如癌癥)進(jìn)行感染后對細(xì)胞、組織或生物流體中所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平的比較。在另一些實例中，可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度隨時間變化(時間-過程)的研究以抬r驗藥物治療對細(xì)胞或組織中所表達(dá)的蛋白質(zhì)成分的作用。在另一些實例中，來自隨時間所取不同樣品的信息可用于檢測或監(jiān)測作為疾病(例如癌癥)或感染之結(jié)果的特定蛋白質(zhì)在組織、器官或生物流體中的濃度。這些實驗可包括一個或多個對照樣品。在一些實施方案中，所述實驗可用于測定兩個或更多個上述感興趣的性質(zhì)。在已向樣品混合物中加入已知量(常表示為濃度和/或量)的校正標(biāo)可利用所述與校正標(biāo)準(zhǔn)物相關(guān)的獨(dú)特特征離子的量來測定每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。這是可能的，因為與樣品混合物中校正標(biāo)準(zhǔn)物的獨(dú)特凈艮告物離子相關(guān)的分析物的量是已知的，并且對于與所選離子相關(guān)的被標(biāo)記分析物而言，參考所述校正標(biāo)準(zhǔn)物的特征離子的強(qiáng)度，可以測定所有獨(dú)特特征離子的相對量。因為對于每種獨(dú)特報告物部分(包括所述校正標(biāo)準(zhǔn)物的報告物部分)而言，所測的每種獨(dú)特特征離子的相對量與和每種差異性標(biāo)記的樣品(其組合而形成樣品混合物)相關(guān)的分析物的量成比例，因此，參考基于一定比例(參考用于制備產(chǎn)品混合物的配方而計算的)的獨(dú)特質(zhì)量的每種不同特征離子的量，可確定每種樣品中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。需要時，可對與每種獨(dú)特的特征離子相關(guān)的峰強(qiáng)度進(jìn)行天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度的校正。這樣的分析方法尤其可用于具有復(fù)雜性質(zhì)的多重樣品的蛋白質(zhì)組分析，特別是在第一質(zhì)量分析之前進(jìn)行被標(biāo)記分析物的預(yù)分離(例如^目色鐠分離或電泳分離)的情況下。例如，如果樣品混合物包含100fmol/mL的校正標(biāo)準(zhǔn)物，并且與所述校正標(biāo)準(zhǔn)物相關(guān)的獨(dú)特特征離子的相對強(qiáng)度是1，而與第一樣品相關(guān)的第一其它獨(dú)特特征離子的相對強(qiáng)度是一半并且與第二樣品相關(guān)的第二其它獨(dú)特特征離子的相對強(qiáng)Jbl2，則所述第一差異性標(biāo)記的樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量(假定等量的樣品1和樣品2混合而形成所述樣品混合物)是50fmol/mL(0.5x100fmol/mL)，所述第二差異性標(biāo)記的樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量(假定等量的樣品1和樣品2混合而形成所述樣品混合物)是200fmol/mL(2x100fmol/mL)。而且，例如，如果分析物是與特定蛋白質(zhì)相關(guān)的肽，可以推斷在樣品1中該蛋白質(zhì)的量是50fmol/mL以及在樣品2中該蛋白質(zhì)的量是200fmol/mL。因此，校正標(biāo)準(zhǔn)物的存在使得可在每種差異性標(biāo)記的樣品(其混合而形成樣品混合物)中對被標(biāo)記分析物(以及在某些情況下其前體)進(jìn)行絕對定量。如前所述，在一些實施方案中，可參考標(biāo)準(zhǔn)曲線測定與每種獨(dú)特報告物部分相對應(yīng)的具有獨(dú)特質(zhì)量的每種特征離子的絕對量。因此，可參考具有獨(dú)特質(zhì)量的每種不同特征離子的絕對量而測定樣品混合物中每種不同樣品的所測分析物的絕對量。如前所述，該分析可針對具有不同質(zhì)荷比的所選離子重復(fù)一次或多次，從而獲得每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中一種或多種其它分析物的絕對量。另外，如果需要，可如前所述對與每種獨(dú)特報告物離子相關(guān)的峰強(qiáng)度進(jìn)行天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度的校正。在一些實施方案中，可利用由式II，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施本文所述的方法其中W、M、J、K、RpR2和Xi如前所述。在一些實施方案中，可利用至少一種可由式III，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施本文所述方法其中s、RpR2和Ru如前所述。例如，可利用至少一種可由如下所示的式V，至XII，(包括其鹽形式和/或7jC合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施所述方法其中Ri和R2如前所述，符號*指示適當(dāng)時包含13<:替代12<:、"n替代14n或者180替代160的同位素富集位點。在一些實施方案中，可利用至少一種可由式IV，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施所述方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>其中Ru如前所述。例如，可利用至少一種可由如下所示的式XV，至XXIII，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施所述方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage98</formula>其中，符號4旨示適當(dāng)時包含"C替代"C、15N替代"N或者lsO替代"o的同位素富集位點。在一些實施方案中，可利用至少一種可由式III*，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施所述方法o其中，Rn如前所述。例如，可利用至少一種可由如下所示的式M，至MV，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施所述方法其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或者lsO替代"O的同位素富集位點。如前所述，在一些實施方案中，可利用質(zhì)量差異性標(biāo)簽組實施所述方法。因此，在一些實施方案中，所述方法還可包括針對樣品混合物或其級分進(jìn)行第一質(zhì)鐠分析，并測定與被標(biāo)記分析物相關(guān)的峰的相對強(qiáng)度。因為對分析物的鑒定可通過分析子離子片段來確定，因此所述方法還可包括利用解離能斷裂被標(biāo)記分析物的離子從而形成子離子片段并鑒定來自所述子離子片段的分析物。在一些實施方案中，可利用至少一種可由如下所示的式xxv，至XXXII，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施該方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage100</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者180替代"o的同位素富集位點。在一些實施方案中，可利用至少一種可由如下所示的式XXXV，至XXXXI，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施該方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage101</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13<:替代12(:、15n替代"n或者18o替代"o的同位素富集位點。在一些實施方案中，可利用至少一種可由如下所示的式mvi，至mxiii，(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的標(biāo)記試劑來實施該方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage102</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13c替代12c、15n替代14n或者180替代"o的同位素富集位點。蛋々賴工賴資在一些實施方案中，可在進(jìn)行樣品處理步驟之前進(jìn)行對樣品分析物的標(biāo)記。在一些實施方案中，可在其它樣品處理步驟當(dāng)中進(jìn)行對樣品分析物的標(biāo)記。在一些實施方案中，對分析物的標(biāo)記是樣品處理的最后步驟和/或恰在制備樣品混合物之前。利用蛋白質(zhì)組分析作為非限定性的實例，有至少幾種可使用的可能工作流程。為便于理解以下討論，有時對前體蛋白和分析物肽進(jìn)行區(qū)分。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在多個實施方案中，無論是蛋白質(zhì)和/或肽中的任一種或二者，都可認(rèn)為是本文中所述的分析物。在一種類型的工作流程中，所述前體蛋白可被消化成隨后可被標(biāo)記的肽分析物。在另一種類型的工作流程中，所述前體蛋白可利用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，然后被消化成被標(biāo)記的肽分析物。在又一種類型的工作流程中，所述前體蛋白質(zhì)可被捕獲到固相支持物上、消化，然后可將所述支持物接合的肽標(biāo)記。任選地，還可標(biāo)記所述流過肽(flowthroughpeptide).在另一種類型的工作流程中，前體蛋白質(zhì)可以捕獲到固相支持物上、被標(biāo)記，然后可以消化與支持物結(jié)合的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生被標(biāo)記的肽。任選地還可以分析所述流過肽。不論工作流程如何，在MS和MS/MS分析之前都可適當(dāng)時對被標(biāo)記肽進(jìn)行其它樣品處理(例如分析步驟)。，及詢'必經(jīng)^標(biāo)記時示斧/遂工#^資作為實例，可存在待分析的"對照"樣品和"測試，，樣品。如果例如目的是分析"對照"和"測試"樣品蛋白中的肽(作為分析物)，那么在一些實施方案中，可任選地減少樣品中的蛋白質(zhì)(任選地封閉半胱氨酸和用酶消化)從而產(chǎn)生可被標(biāo)記用于隨后分析的分析物蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，可將分析物肽標(biāo)記(標(biāo)簽)而不進(jìn)行進(jìn)一步的樣品處理。不論如何標(biāo)記，都可利用不同的標(biāo)記試劑(各自包含具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物部分(例如同分異構(gòu)和/或同量異位標(biāo)記物組中的標(biāo)記試劑))來標(biāo)記每種不同樣品中的分析物。在一些實施方案中，在標(biāo)記之前和/或標(biāo)記之后可能需要進(jìn)一步的樣品處理。例如，可以進(jìn)行分離步驟以除去某些類型的不感興趣的肽，從而降低樣品的復(fù)雜性?？蓪⒈粯?biāo)記樣品混合而獲得樣品混合物。在一些實施方案中，可在質(zhì)鐠分析之前將所述被標(biāo)記分析物肽進(jìn)行分離(例如高效液相色鐠法(HPLC))。另一個示例性的實施方案包括任選地封閉和再生半胱氨酸的v5克醇基(其可涉及肽捕獲)的步驟。為避免疑義，不言自明，可對其它樣品進(jìn)行處理，前提是可獲得其它的差異性標(biāo)記物以編碼每種不同的樣品或樣品級分。在一些實施方案中，可利用酶消化"對照"樣品和"測試"樣品，然后可通過可切割連接物將樣品的成分捕獲到固相支持物上。例如，所述支持物可包含可切割連接物和可與肽的結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)的反應(yīng)活性基團(tuán)。在一些實施方案中，可收集(而不是棄掉)流過支持物的肽(因為其不與支持物的官能團(tuán)反應(yīng))，利用同量異位和/或質(zhì)量差異性標(biāo)記試劑組中的標(biāo)記試劑將其標(biāo)記，并單獨(dú)分析或者與從支持物上收集的被標(biāo)記肽一起進(jìn)行分析?？衫脴?biāo)記試劑組中相同或不同的標(biāo)記試劑對流過固相支持物的肽進(jìn)行標(biāo)記。不論標(biāo)記試劑如何，都可任選地將其與通過MS/MS分析進(jìn)行分析的樣品混合物混合。還可對其獨(dú)立地進(jìn)行分析。對于支持物上保留的肽而言，可以在所述肽仍在支持物上時對其進(jìn)行標(biāo)記或者在其已被從支持物上切割掉時對其進(jìn)行標(biāo)記?？衫霉滔嘀С治锊东@前體蛋白。例如，可存在利用平行方式處理的兩種樣品?？赏ㄟ^清洗除去不含有半胱氨酸部分的肽并任選地將其收集(即流過)。它們還可任選地被消化、標(biāo)記和/或與樣品混合物一起分析，或者被單獨(dú)分析。所述支持物接合的蛋白質(zhì)可以被消化。然后可利用標(biāo)記試劑將所述支持物接合的含有半胱氨酸的肽進(jìn)行標(biāo)記并從支持物上切割掉。還可將所述支持物接合的含有半胱氨酸的肽先從支持物上切割下來然后再利用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記。來自不同樣品的被標(biāo)記肽(任選地包含不含半胱氨酸部分的被標(biāo)記肽)可被混合、處理和/或與樣品混合物一起分析，或者被單獨(dú)分析。可收集從支持物釋放的作為實施消化的結(jié)果的任何肽。通常這些肽是不含有硫醇基團(tuán)的肽?？衫脴?biāo)記試劑將這些肽任選地標(biāo)記并任選地混合、處理和/或與樣品混合物一起分析，或者被單獨(dú)分析。步及^^記趁,諒必辨^夢/逸工#諒程不論是否使用支持物來捕獲分析物用于分析，利用標(biāo)記試劑標(biāo)記分析物的步驟都可在消化或其它化學(xué)處理之前或之后進(jìn)行，前提是所述處理不以使得本文所述被標(biāo)記分析物的定量無效的方式改變標(biāo)記物。對于蛋白質(zhì)樣品而言，還可還原并封閉同一蛋白質(zhì)的半胱氨酸，利用標(biāo)記試劑標(biāo)記同一蛋白質(zhì)的N化-賴氨酸側(cè)鏈氨基，然后將所述蛋白質(zhì)消化成被標(biāo)記肽。不論其來源如何，都可對被標(biāo)記分析物進(jìn)行分析或者可對其進(jìn)一步處理(包括制備樣品混合物)，例如通過分離和/或通過固定到支持物上而處理。被標(biāo)記蛋白質(zhì)可從支持物上切割下來，然后被消化或者被標(biāo)記蛋白質(zhì)可在仍與支持物接合期間被消化。在后一種情況下，支持物接合的消化將從支持物上釋放不含有半胱氨酸部分的肽?？蓪⑦@些肽收集并任選地單獨(dú)分析，或者作為包含后者釋放的被標(biāo)記肽(含有半胱氨酸部分)的樣品混合物的一部分而分析。當(dāng)在消化成肽之前標(biāo)記所述前體蛋白時，消化模式可以做出改變。例如，利用胰蛋白酶的消化可預(yù)期主要產(chǎn)生C末端精氨酸肽，因為N-￡-賴氨酸側(cè)鏈氨基被標(biāo)記物修飾。因此，胰蛋白酶的活性可非常類似于Arg-C的活性。因為僅那些還含有賴氨酸側(cè)鏈的C末端精氨酸肽可被標(biāo)記并因此可在質(zhì)鐠儀中檢測到，所以這提供了一種進(jìn)一步降低有待進(jìn)一步處理和/或分析的樣品的復(fù)雜性的方法。在一些實施方案中，可還原蛋白質(zhì)并利用標(biāo)記試劑(例如硫醇特異性的標(biāo)記試劑)標(biāo)記半胱氨酸，然后將所述蛋白質(zhì)消化成用于分析的被標(biāo)記肽。所述被標(biāo)記肽分析物可被分析或者可被進(jìn)一步處理，例如，通過分離和/或固定到支持物上而處理。例如，可通過賴氨酸側(cè)鏈的N-a-氨基和/或N-e-氨基與支持物的官能團(tuán)的反應(yīng)而將被標(biāo)記肽固定到支持物上。具有用于固定含氨基官能團(tuán)的化合物的可切割連接物的支持物包括含有三苯甲基連接物的支持物(參見三苯甲基氯支持物(Trityl-Cl)或2-氯三苯甲基氯支持物，可購自Novabiochem(SanDiego，CA))。本工作流程與前述那些不同?？蓪⒈粯?biāo)記分析物從支持物上切割下來，進(jìn)一步處理和/或分析。本方法可能不會帶來實質(zhì)性的復(fù)雜性降低，因為所有的被消化肽都預(yù)計含有至少一個N-a-氨基。前述實例并非意在窮盡各種可能的工作流程。它們僅旨在示例性說明。關(guān)于在消化之前進(jìn)行標(biāo)記的實施方案，還可用于在進(jìn)行消化之前的進(jìn)一步的樣品處理中。雖然前述討論是通過具體實例的方式重點針對蛋白質(zhì)組分析和作為分析物的肽和/或蛋白質(zhì)的測定進(jìn)行的，但所述原理意在涵蓋很多類型的分析物，前述工作流程可適用于所述很多類型的分析物而不需要進(jìn)行過多的實驗。因此，本文所公開內(nèi)容的范圍并非旨在限制于所述的任何這些具體實例上?；?遂合#在一些實施方案中，本發(fā)明涉及混合物(例如樣品混合物)。例如，所述混合物可包含同量異位和/或質(zhì)量差異性的被標(biāo)記分析物。被標(biāo)記分氺斤物的示例性混合物及其制備方法和/或分析方法已經(jīng)在上述標(biāo)題為"標(biāo)記和分析方法"的部分中進(jìn)行了描述?？赏ㄟ^將兩種或更多種標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物的全部或部分混合而形成混合物，其中利用標(biāo)記試劑組中的不同標(biāo)記試劑將每種樣品進(jìn)行標(biāo)記，其中每種標(biāo)記試劑包含具有獨(dú)特(粗略)質(zhì)量的報告物部分?？梢杂蓛煞N或更多種被標(biāo)記分析物中的每種所來自(即來源)的標(biāo)記^JL鑒定所述每種不同標(biāo)記試劑的獨(dú)特才艮告物部分。所述標(biāo)記試劑可以是同位素編碼的同量異位(和/或同分異構(gòu))和/或質(zhì)量差異性的標(biāo)記試劑。因此，混合物中的兩種或更多種被標(biāo)記分析物可以是同量異位(和/或同分異構(gòu))和/或質(zhì)量差異性的。與這些方法相關(guān)的標(biāo)記試劑和被標(biāo)記分析物的性質(zhì)已在前面論述過?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允侨魏畏治鑫铩＠?，混合物中的分析物可以是肽?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允堑鞍踪|(zhì)?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允请暮偷鞍踪|(zhì)?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允呛怂岱肿印；旌衔镏械姆治鑫锟梢允翘妓衔铩；旌衔镏械姆治鑫锟梢?O旨質(zhì)?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允乔傲邢偎仡悺；旌衔镏械姆治鑫锟梢訟JI旨肪酸?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允侨鈮A類。混合物中的分析物可以是氨基酸?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允蔷S生素?；旌衔镏械姆治鑫锟梢允穷惞檀?。混合物中的分析物可以是質(zhì)量小于1500道爾頓的小分子?；旌衔镏械姆治鑫锟砂瑑煞N或更多種不同的分析物類型(例如l)脂質(zhì)和類固醇；或2)肽、脂質(zhì)、類固醇和碳7jc化合物)。混合物可包含任何形式的差異性標(biāo)記的分析物，所述分析物含有本文中所公開的新型報告物/連接物部分。例如，所述混合物可包含至少兩種可由式I"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的差異性標(biāo)記的分析物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage107</formula>其中原子或基團(tuán)Y、J、K、RpR2和Xi已經(jīng)在前面描述過并且其特性已公開過，并且其中由式I八所代表的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage107</formula>對于與特定樣品相關(guān)的所有被標(biāo)記分析物而言都是相同的，但其中式IA基團(tuán)包含至少一個不同于任何其它源自不同樣品(其組合而形成混合物)的被標(biāo)記分析物的同位素富集位點。Z，，是共價連接的分析物。在一些實施方案中，兩種被標(biāo)記分析物中的任一種都可來自不同的樣品。在一些實施方案中，每種不同標(biāo)記分析物的式I"的基團(tuán)Y-J(所述基團(tuán)可形成報告物部分)可以在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特地編碼，使得當(dāng)基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與被標(biāo)記分析物的其余部分之間的鍵在質(zhì)譜儀中斷裂時，可形成具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子，其不同于與來源于不同樣品(其組合而形成混合物)的任何其它被標(biāo)記分析物相關(guān)的任何報告物離子，其中所述獨(dú)特報告物離子能夠鑒定所述被標(biāo)記分析物所來源的樣品。基團(tuán)Z"是共價連接的分析物。對于每種不同的標(biāo)記物而言，混合物中的一些被標(biāo)記分析物可以相同，一些被標(biāo)記分析物可以不在一些實施方案中，式P基團(tuán)包含與被標(biāo)記分析物(其與特定樣品相關(guān))同樣的粗略質(zhì)量，但該粗略質(zhì)量不同于與源自不同樣品(其組合而形成混合物)的任何其它被標(biāo)記分析物相關(guān)的式IA基團(tuán)的粗略質(zhì)量，其中式I八基團(tuán)的粗略質(zhì)量能夠鑒定所述被標(biāo)記分析物所來源的樣品。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種可由式II"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表的差異性標(biāo)記的分析物其中W、M、J、K、RpR2、Xi和Z"如前所述。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式III"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表其中s、RpR2、Rn和Z"如前所述。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式V"、VI"、VII，，、VIII"、IX，，、X"、XI"或XII"(包括其鹽形式和/或7JC合物形式)所代表M、，N、/M一M1卩2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage109</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者lsO替代"O的同位素富集位點。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式XXV"、XXVI"、XXVII"、xxvni"、xxix"、xxx"、xxxr，或xxxn"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage110</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或者lsO替代"O的同位素富集位點。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式IV"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表其中Ru和Z"如上所述。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式XV"、XVI"、XVII"、XVIII"、xix"、xx"、xxr，、xxn"或xxin"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage112</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者lsO替代160的同位素富集位點。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式XXXV"、XXXVI"、XXXVII"、xxxvin"、xxxix"、xxxx"或xxxxi"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage112</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者180替代"o的同位素富集位點。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式111*"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula>其中Rn和Z"如上所述。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式M，，、MI"、Mil"、Mill"、MIV，，、或MV"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage114</formula>其中，符號*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者180替代"o的同位素富集位點。在一些實施方案中，所述混合物可包含至少兩種差異性標(biāo)記的分析物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式MVI"、MVII"、MVIII"、MIX"、MX"、MXI"、MXir，或MXIII"(包括其鹽形式和/或水合物形式)所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage114</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage115</formula>或其中，符號N旨示適當(dāng)時包含"C替代"C、15N替代"N或者180替代"o的同位素富集位點。K試浙盒在一些實施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒。所述試劑盒可包含本文中所述的標(biāo)記試劑和一種或多種其它試劑、容器、酶、緩沖劑和/或使用說明。所述試劑盒可包含兩種或更多種標(biāo)記試劑的組和一種或多種其它試劑、容器、酶、緩沖劑和/或使用說明。例如，所述試劑盒可包含Mxnr至少一種所選的其它試劑以實施定量兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的方法。例如，所述試劑盒可包含被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物，所述被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物含有具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的報告物部分。例如，所述試劑盒可包含被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物，所述被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物含有具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的標(biāo)記物部分。試劑盒中的兩種或更多種標(biāo)記試劑可以是同分異構(gòu)和/或同量異位的。例如，試劑盒中的一種或多種標(biāo)記試劑可以是如本文前面所述的式r、n，、m，、iv，、v，、vr、vn，、vm，、ix，、x，、xr、xn，、xm，、xv，、xvr、xvn，、xvm，、xix，、xx，、xxr、xxn，和/或xxm,的化合物(包括化合物組)。在一些實施方案中，所述試劑盒可以包含如本文前面所述的具有以下式的被標(biāo)記分析物(例如作為校正標(biāo)準(zhǔn)物):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage116</formula>例如用于同一樣品或者兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的多重分析。F丄^"部遂^^記試浙應(yīng)當(dāng)理解，以下所示的標(biāo)記試劑A和B各自代表了可制備并使用的諸多可能的標(biāo)記試劑中的一種。還應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅利用常規(guī)實驗以及本文中所公開的內(nèi)容即可容易地制得具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記試劑。因此，所公開內(nèi)容旨在是例證性的，且并非意在窮盡性或以任何方式進(jìn)行限制。顯示了可制備的示例性同位素編碼的同量異位組A和B的化合物。應(yīng)當(dāng)理解，以下所示的標(biāo)記試劑組各自代表了可制備并使用的諸多可能的標(biāo)記，劑組中的一種。還應(yīng)p當(dāng)理解，，領(lǐng)域技術(shù)人員，利用常，實驗劑組。因此，所公開內(nèi)容旨在是例證性的，且并非意在窮盡性或以任何方式進(jìn)行限制.示例性的組A:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>示例性的癥且B:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage118</formula>顯示了可制備的示例性同位素編碼的質(zhì)量差異性組C和D的化合物。應(yīng)當(dāng)理解，以下所示的標(biāo)記試劑組各自代表了可制備并使用的諸多可能的標(biāo)記試劑組中的一種。還應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅利用常規(guī)記試劑組。因此，所公開內(nèi)容旨在是例證性的，且并非意在窮盡性或以任何方式進(jìn)行限制。示例性的組C:和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage118</formula>示例性的組D:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage118</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage119</formula>可利用所示方法制備的其它示例性同位素編碼的化合物描述于本說明書和附圖以及權(quán)利要求書中。雖然已結(jié)合多個實施方案描述了本教導(dǎo)，但并不意味著;^:導(dǎo)限于這些實施方案。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，本教導(dǎo)涵蓋了各種替代方案、改變和等同方案。權(quán)利要求1.式I所代表的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，Y是5、6或7元雜環(huán)，其可以是取代或未取代的，并可任選地與支持物可切割地相連，其中所述雜環(huán)包含至少一個通過共價鍵與基團(tuán)J相連的環(huán)氮原子；J是由式-CJ’2-所代表的基團(tuán)，其中每個J’各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X2-(CK’2)m)p-所代表的基團(tuán)，其中n是0或2～10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1～5的整數(shù)，p是1～4的整數(shù)，每個K’各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；其中，1)R1是氫、氘或R6，并且R2是氫、氘或R7；或者2)R1和R2一起是由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X2-(CR’2)m)p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是1～10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1～5的整數(shù)，p是1～4的整數(shù)，每個R’各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；每個X2各自獨(dú)立地是-O-或-S-；和Z是氫或共價連接的分析物；其中，每個R3、R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；每個R3’、R4’和/或R5’各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和所述化合物包含至少一個同位素富集位點。2.權(quán)利要求1的化合物，其中基團(tuán)Y-J包含至少一個同位素富集位3.權(quán)利要求l的化合物，其中由式1#所代表的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>包含至少一個同位素富集位點；其中，K是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-X2-(CK，2)n0p-所代表的基團(tuán)，其中11是0或210的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-RVOR4^i-R4賃SR"其中，1)Ri是氫、氘或Re，并且R2是氫、氘或R7;或者2)&和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-X2-(CR，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是l5的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5，OR5或-Rs，SRs;Xi是-O、=S、=]\11或=117;和每個X2各自獨(dú)立地是-O-或-S-;其中，每個R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R4，和/或Rs，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。4.權(quán)利要求1的化合物，其中由式Y(jié)-J所代表的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>包含至少一個同位素富集位點，由式I#所代表的基團(tuán)包含至少一個同位素富集位點；其中，Y是5、6或7元雜環(huán)，其可以是取代或未取代的，并可任選地與支持物可切割地相連，其中所述雜環(huán)包含至少一個通過共價鍵與基團(tuán)J相連的環(huán)氮原子；J是由式-CJ，2-所代表的基團(tuán)，其中每個J，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3，OR^-R3，SR3;K是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-X2-(CK，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其中II是0或2~10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-&、其中，1)Ri是氫、氘或R6，并且R2是氫、氘或R7;或者2)&和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-X2-(CR，2)n0p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是l5的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5，OR5或-R5，SR55Xi是二O、=S、NH或-NR7;和每個X2各自獨(dú)立地是-O-或-S-;其中，每個R3、R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R、R4，和/或Rs，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。5.權(quán)利要求l的化合物，所述化合物由式II所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式人zJ、乂N、zN、TTM、N、K人Z丄丄M—MXi其中，W是用來取代所述6元雜環(huán)上至少一個M基團(tuán)的原子或基團(tuán)，且處于所述六元環(huán)上所述氮的鄰、間或?qū)ξ唬錇?N(H)-、-N(R，，)-、-翠"，)國、-P(R，，)國、-P(R，，，)-、-O曙或-S-;每個其余的基團(tuán)M各自獨(dú)立地是-CM，2-，其中每個M，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、R8、OR8、SR8、國Rs，OR8或-R8，SR8;J是由式-CJ，2-所代表的基團(tuán)，其中每個J，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3,OR;^-R3，SR3;K是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-Xr(CK，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其中II是0或2~10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-&、-OR4、-SR4、-1^,0議4或-114，8114;其中，1)Ri是氫、氘或R"并且R2是氫、氘或R7;或者2)Ri和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-Xr(CR，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是l5的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5，OR5或-Rs,SRs;X^=0、=S、=冊或=,;每個X2各自獨(dú)立地是-O-或-S-;每個R"各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；每個R，，，各自獨(dú)立地是H2N-R9，-、H(R1())N-R9，-、(R1())2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⒃摶衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；Z是氫或共價連接的分析物；其中，每個R3、R4、R5、R6、R7、Rg和/或Rn)各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R3，、R4，、R5，、R6，、Rs，和/或IV各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。6.權(quán)利要求5的化合物，所述化合物由式III所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式III其中，s是0-5的整數(shù)；Ri是氫、氘或R"A是氫、氘或F^;Ru是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R"，，和Z是氫或共價連接的分析物；其中，R，,，是H2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9,-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；以及其中，每個R。R7和/或Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。7.權(quán)利要求6的化合物，其中所述化合物由式V、VI、VII、VIII、IX、X、XI或XII所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者180替代160的同位素富集位點；Ri是氫或R6;R2是氫或R7;和Z是氫或共價連接的分析物；其中，R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳8.權(quán)利要求6的化合物，其中所述化合物由式XXV、XXVI、XXVII、XXVIII、XXIX、XXX、XXXI或XXXII所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>或XXXII其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代"N的同位素富集位點；Ri是氫或R6;R2是氫或R7;和Z是氫或共價連接的分析物；其中，R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳9.權(quán)利要求5的化合物，所述化合物由式IV所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式/~/\^N、T、7其中，Ru是氫、氘、曱基、-C(H)2D、-C(H)D"國CD3或-R，"，和Z是氫或共價連接的分析物；其中，R，，，是H2N國R9，國、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；以及其中，每個IV各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。10.權(quán)利要求9的化合物，其中所述化合物由式XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII或XIII所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或lsO替代160的同位素富集位點；和Z是氫或共價連接的分析物。11.權(quán)利要求9的化合物，其中所述化合物由式XXXV、XXXVI、XXXVII、XXXVIII、XXXIX、XXXX或XXXXI所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代"N的同位素富集位點；和Z是氫或共價連接的分析物。12.權(quán)利要求5的化合物，所述化合物由式111*所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，Ru是氫、氘、曱基、-C(H)2D、-C(H)D2、《03或-11，"，Z是氫或共價連接的分析物；其中，R，，，是H2N國R9，-、H(R10)N-R9，-、(R1(j)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；以及其中，每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳13.權(quán)利要求12的化合物，其中所述化合物由式M、MI、MII、MIII、MIV或MV所4戈表，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或180替代160的同位素富集位點；和Z是氫或共價連接的分析物。14.權(quán)利要求12的化合物，其中所述化合物由式MVI、MVII、MVIII、MIX、MX、MXI、MXII或MXIII所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13c替代12c或15n替代"n的同位素富集位點；和z是氫或共價連接的分析物。15.權(quán)利要求1至6、9或12中任一項的化合物，其中所述化合物包含兩個或更多個同位素富集位點。16.權(quán)利要求1~15中任一項的化合物，其中Z是氫。17.權(quán)利要求1~15中任一項的化合物，其中Z是肽和/或蛋白質(zhì)。18.權(quán)利要求1~15中任一項的化合物，其中Z是前列腺素、脂肪酸、肉堿、碳7jC化合物、脂質(zhì)、氨基酸、維生素或類固醇。19.權(quán)利要求1~15中任一項的化合物，其中所述化合物是校正標(biāo)準(zhǔn)物。20.—種方法，其包括a)使兩種或更多種樣品與標(biāo)記試劑組中的不同標(biāo)記試劑反應(yīng)，其中每種樣品包含一種或多種反應(yīng)活性分析物，從而形成兩種或更多種差異性標(biāo)記的樣品，所述每種差異性標(biāo)記樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中所述組中的不同標(biāo)記試劑由式I，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，Y是5、6或7元雜環(huán)，其可以是取代或未取代的，并可任選地與支持物可切割地相連，其中所述雜環(huán)包含至少一個通過共價鍵與基團(tuán)J相連的環(huán)氮原子；J是由式-CJ，2-所代表的基團(tuán)，其中每個J，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、珙、-R3、-OR3、-SR3、"R3,OR3或-R3，SR3;K是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-Xr(CK，2)Jp-所代表的基團(tuán)，其中n是0或2~10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-&、-OR4、--R4予OR4^i-R4贅SR4;其中，l)Ri是氫、氘或R6，并且R2是氫、氘或Rs或者2)R和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-X2-(CR，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是15的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、國R5,OR5或國R5，SRs;X乂《、=S、=冊或=冊7;每個X2各自獨(dú)立地是-O-或-S-;每種標(biāo)記試劑包含至少一個同位素富集位點；和每個R3、R、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、基、雜芳基或芳基烷基；每個R、R4，、和/或Rs，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；以及b)混合兩種或更多種所述差異性標(biāo)記的樣品或其部分、以及任選地一種或多種校正標(biāo)準(zhǔn)物，從而產(chǎn)生樣品混合物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述組中的標(biāo)記試劑均是同量異位的，其中所述組中的每種不同的標(biāo)記試劑均具有相同的粗略質(zhì)量，但其中形成每種不同標(biāo)記試劑的報告物部分的基團(tuán)Y-J在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特地編碼，使得當(dāng)所述基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與所述標(biāo)記試劑的剩余部分之間的鍵在質(zhì)譜儀中斷裂時，產(chǎn)生具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述組中的標(biāo)記試劑均具有不同的質(zhì)量。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述組中的每種不同標(biāo)記試劑的基團(tuán)Y-J在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特地編碼，使得當(dāng)所述基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與所述標(biāo)記試劑的剩余部分之間的鍵在質(zhì)鐠儀中斷裂時，產(chǎn)生具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物離子。24.權(quán)利要求21的方法，還包括c)對所述樣品混合物或其級分進(jìn)行第一質(zhì)鐠分析；d)對來自所述第一質(zhì)譜分析的選定質(zhì)荷比的被標(biāo)記分析物的離子施加解離能，從而形成至少一些所選離子的報告物離子和子片段離子；以及e)對所選離子、報告物離子和/或子片段離子或其級分進(jìn)行第二質(zhì)量分析。25.權(quán)利要求24的方法，還包括f)測定第二質(zhì)量分析中每種報告物離子的粗略質(zhì)量和相對量以及一些或全部子片段離子的粗略質(zhì)量和/或絕對質(zhì)量。26.權(quán)利要求25的方法，還包括g)通過分析子片段離子來測定與所選質(zhì)荷比相關(guān)的被標(biāo)記分析物。27.權(quán)利要求26的方法，還包括h)在不同的選定質(zhì)荷比下對所述差異性標(biāo)記分析物的選定離子重復(fù)步驟(d)至(f)或(d)至(g)—次或多次。28.權(quán)利要求27的方法，還包括I)重復(fù)步驟(c)至(f)、(c)至(g)或(c)至(h)—次或多次，每次應(yīng)用所述樣品混合物的不同級分。29.權(quán)利要求26至28中任一項的方法，還包括重復(fù)步驟(c)至(I)一次或多次。30.權(quán)利要求20至29中任一項的方法，其中基團(tuán)Y是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌漆部分。31.權(quán)利要求21或23中任一項的方法，其中具有獨(dú)特質(zhì)量的每種報告物離子鑒定每種被標(biāo)記分析物所源自的樣品。32.權(quán)利要求20至31中任一項的方法，其中所述組中的每種不同標(biāo)記試劑與支持物結(jié)合并通過可切割連接物與所述支持物相連，使得每種不同樣品與載有所述組中不同標(biāo)記試劑的支持物反應(yīng)；并且其中所述方法還包括在進(jìn)行步驟(b)之前進(jìn)行i)任選地清洗支持物以除去不與標(biāo)記試劑的反應(yīng)活性基團(tuán)反應(yīng)的樣品成分；ii)切割所述可切割連接物從而釋放并收集兩種或更多種差異性標(biāo)記的樣品，每種樣品包含一種或多種被標(biāo)記分析物，其中與特定樣品相關(guān)的所述被標(biāo)記分析物是可通過與之相連的具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物部分鑒定和/或定量的；以及iii)任選地在將被標(biāo)記分析物的每種樣品混合之前收集被標(biāo)記分析物的每種樣品。33.權(quán)利要求20至32中任一項的方法，還包括c)用至少一種酶消化每種樣品以部分或完全地降解所述樣品或樣品混合物的成分。34.權(quán)利要求20至33中任一項的方法，還包括c)分離所述樣品混合物。35.權(quán)利要求25的方法，其中確定所述第二質(zhì)量分析中具有獨(dú)特質(zhì)量的每種報告物離子相對于其它報告物離子的相對量。36.權(quán)利要求35的方法，其中將與所鑒定分析物相關(guān)的具有獨(dú)特質(zhì)量的每種報告物離子的相對量與合并形成所述樣品混合物的每種差異性標(biāo)記樣品的量相關(guān)聯(lián)，從而確定在合并形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標(biāo)記樣品的每種樣品中所述分析物的相對量。37.權(quán)利要求35的方法，其中i)所述樣品混合物包含已知量的用于所測分析物的校正標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述校正標(biāo)準(zhǔn)物包含用于所測分析物的具有獨(dú)特質(zhì)量的報告物部分，并且根據(jù)與所述校正標(biāo)準(zhǔn)物相關(guān)的獨(dú)特報告物離子的量來確定與每種獨(dú)特報告物部分相對應(yīng)的具有獨(dú)特質(zhì)量的每種報告物離子的絕對量；以及ii)根據(jù)具有獨(dú)特質(zhì)量的每種不同報告物離子的絕對量來確定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測分析物的絕對量。38.權(quán)利要求35的方法，其中i)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定與每種獨(dú)特報告物部分相對應(yīng)的具有獨(dú)特質(zhì)量的每種報告物離子的絕對量；以及ii)根據(jù)具有獨(dú)特質(zhì)量的每種不同報告物離子的絕對量來確定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測分析物的絕對量。39.權(quán)利要求21的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式III，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中，s是0-5的整數(shù)；Ri是氫、氘或R"R2是氫、氘或RS和Ru是氫、氘、曱基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或國R，"，其中，R"，是H2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；每個R6、R7和/或Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。40.權(quán)利要求39的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式v，、vi，、vn，、vnr、ix，、x，、xr或xii，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或者lsO替代"O的同位素富集位點；A是氫或R6;R2是氫或R7;和R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳41.權(quán)利要求21的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式IV，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式Ru是氫、氘、曱基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或-R"，，并且R"，是H2N-R9,畫、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⒃摶衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；和每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Rn)各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。42.權(quán)利要求41的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式XV，、XVI，、xvn，、xvnr、xix，、xx，、xxr、xxn，或xxiir所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或lsO替代160的同位素富集位點。43.權(quán)利要求21的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式III"所代表其中，Ru是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或-R，"，其中，R，"是H2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳44.權(quán)利要求43的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式M，、MI，、MII，、MIII，、MIV，或MV，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或180替代160的同位素富集位點。連接物;45.權(quán)利要求22或23的方法，還包括c)對所述樣品混合物或其級分進(jìn)行第一質(zhì)鐠分析；和d)測定與被標(biāo)記分析物相關(guān)的峰的相對強(qiáng)度。46.權(quán)利要求45的方法，還包括e)施加解離能以使被標(biāo)記分析物的離子斷裂，從而形成子離子片段；和f)由所述子離子片段鑒定所述分析物。47.權(quán)利要求45或46的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式XXV，、xxvr、xxvn，、xxvm，、xxix，、xxx，、xxxr或xxxn，所代表，48.包括其鹽形式和/或水合物形式0XXVI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代14N的同位素富集位點。49.權(quán)利要求45或46的方法，其中至少一種標(biāo)記試劑由式MVr、MVII，、MVIir、MIX，、MX，、MXI，、MXII，或MXIII，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代14N的同位素富集位點。50.包含至少兩種被標(biāo)記分析物的混合物，其中所述被標(biāo)記分4斤物中的至少兩種來源于不同的樣品，其中所述混合物中的每種被標(biāo)記分析物均由式I"所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>包括其鹽形式和/或水合物形式；其中，Y是5、6或7元雜環(huán)，其可以是取代或未取代的，其中所述雜環(huán)包含至少一個通過共價鍵與基團(tuán)J相連的環(huán)氮原子；J是由式-CJ，2-所代表的基團(tuán)，其中每個J，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3，OR^-R3,SR3;K是由式-(CK，2)n-或-((CK，2)m-Xr(CK，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其中II是0或1~10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是1~5的整數(shù)，p是1~4的整數(shù)，每個K，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-&、-OR4、-SR4、-R47OR4R^SR"其中，1)&是氫、氘或Rs,并且R2是氫、氘或Rs或者2)&和R2—起是由式-(CR，2)q-或-((CR，2)m-XHCR，2)m)p-所代表的基團(tuán)，其形成橋接所述兩個氮原子的環(huán)，其中q是l10的整數(shù)，每個m各自獨(dú)立地是l5的整數(shù)，p是l4的整數(shù)，每個R，各自獨(dú)立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5，OR^-R5，SR5;X義O、=S、=麗或=冊7;每個X2各自獨(dú)立地是-0-或-S-;和Z"是共價連接的分析物；其中，每個R3、R4、R5、R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；每個R3'、R4，和/或Rs，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和其中，由式IA所代表的基團(tuán)對于與特定樣品相關(guān)的所有被標(biāo)記分析物而言是相同的，但其中式IA的基團(tuán)包含至少一個不同于任何其它被標(biāo)記分析物的同位素富集位點，所述其它被標(biāo)記分析物來源于合并形成所述混合物的不同樣51.權(quán)利要求50的混合物，其中形成報告物部分的基團(tuán)Y-J在一個或多個同位素富集位點被獨(dú)特地編碼，使得當(dāng)基團(tuán)Y-J的基團(tuán)J與被標(biāo)記分析物的其余部分之間的鍵在質(zhì)鐠儀中斷裂時，產(chǎn)生具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的報告物離子，該報告物離子不同于與任何其它被標(biāo)記分析物相關(guān)的任何報告物離子，其中所述其它被標(biāo)記分析物來源于合并形成所述混合物的不同樣品，并且其中所述獨(dú)特報告物離子能夠鑒定所述被標(biāo)記分析物所源自的樣品。52.權(quán)利要求50的混合物，其中由式IA所代表的基團(tuán)包含對于與特定樣品相關(guān)的所有被標(biāo)記分析物而言相同的粗略質(zhì)量，但所述粗略質(zhì)量不同于與任何其它被標(biāo)記分析物相關(guān)的式IA基團(tuán)的粗略質(zhì)量，所述其它被標(biāo)記分析物來源于合并形成所述混合物的不同樣品，并且其中式IA基團(tuán)的粗略質(zhì)量能夠鑒定所述被標(biāo)記分析物所源自的樣53.權(quán)利要求5052中任一項的混合物，其中所述被標(biāo)記分析物中的一種或多種是肽和/或蛋白質(zhì)。54.權(quán)利要求5052中任一項的混合物，其中所述被標(biāo)記分析物中的一種或多種是前列腺素、脂肪酸、肉堿、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、維生素和/或類固醇。55.權(quán)利要求50~52中任一項的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式III"所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>其中，s是05的整數(shù)；Ri是氫、氘或R"R2是氫、氘或R^Ru是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或畫R，，，，和Z"是共價連接的分析物；其中R，，，是H2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⒃摶衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；每個R6、R7和/或RK)各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基。56.權(quán)利要求51的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式V"、VI"、VII"、VIII"、IX"、X"、XI"或XII"所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或lsO替代160的同位素富集位點；Ri是氫或R6;R2是氫或I^;和Z"是共價連接的分析物；其中R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。57.權(quán)利要求52的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式xxv，，、xxvr，、xxvn，，、xxvin，,、xxix，，、xxx"、xxxr，或xxxn,，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代14N的同位素翥Ri是氫或R6;R2是氫或R7;和富集位點Z"是共價連接的分析物；其中R6和/或R7各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。58.權(quán)利要求5052中任一項的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式IV"所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>Ru是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、CD3或-R"，，和Z"是共價連接的分析物；其中R"^H2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9，-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⑺龌衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Ri。各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。59.權(quán)利要求51的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式XV"、xvr，、xvn"、xvnr，、xix"、xx"、xxr，、xxn"或xxni"所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>其中，其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或lsO替代160的同位素富集位點；Z"是共價連接的分析物。60.權(quán)利要求52的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式xxxv，，、xxxvr，、xxxvn"、xxxvm"、xxxix"、xxxx，，或XXXXI"所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代"N的同位素富集位點；Z"是共價連接的分析物。61.權(quán)利要求50-52中任一項的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式III"，所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式R『PN^yN-NH，，其中，Ru是氫、氘、甲基、-C(H)2D、C(H)D2、CD3或-R"，，Z"是共價連接的分析物；其中，R，，AH2N-R9，-、H(R10)N-R9，-、(R10)2N-R9,-、HO-R9，-、HS-R9，-或?qū)⒃摶衔锱c支持物可切割地連接的可切割連接物；每個R9，各自獨(dú)立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基；和每個Rw各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。62.權(quán)利要求51的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式M"、MI"、MII"、MIII"、MIV"或MV"所代表，包括其鹽形式和/或7JC合物形式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或lsO替代160的同位素富集位點；Z"是共價連接的分析物。63.權(quán)利要求52的混合物，其中至少一種被標(biāo)記分析物由式MVI"、MVII"、MVIII"、MIX"、MX包括其鹽形式和/或水合物形式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>其中，*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代"N的同位素富集位點;z"是共價連接的分析物。64.—種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求119中任一項的至少一種化合物。65.權(quán)利要求64的試劑盒，其還包含至少一種另外的試劑，所述另外的試劑被選用于進(jìn)行定量兩種或更多種不同樣品中一種或多種分析物的測定。66.權(quán)利要求64的試劑盒，其中所述化合物是包含具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的報告物部分的被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物。67.權(quán)利要求64的試劑盒，其中所述化合物是包含具有獨(dú)特粗略質(zhì)量的標(biāo)記物部分的被標(biāo)記校正標(biāo)準(zhǔn)物。68.式A所代表的化合物其中所述化合物包含至少一個同位素富集位點。69.式B所代表的化合物70.同量異位化合物的組，其包含由式AI、AII、AIII和AIV所代表的化合物其中所述化合物包含至少一個同位素富集位點。其中*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代"N或180替代"O的同位素富集位點。71.同量異位化合物的組，其包含由式BI、BII、BIII和BIV所代表的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中*指示適當(dāng)時包含13C替代12C、15N替代14N或lsO替代160的同位素富集位點。72.具有不同粗略質(zhì)量的結(jié)構(gòu)相似化合物的組，其包含由式AI和AV所代表的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>其中*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代"N的同位素富集位點。73.具有不同粗略質(zhì)量的結(jié)構(gòu)相似化合物的組，其包含由式BI和BV所代表的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>其中*指示適當(dāng)時包含13C替代12C或15N替代14N的同位素富集位點全文摘要本發(fā)明涉及利用包含親核性反應(yīng)活性基團(tuán)的標(biāo)記試劑通過質(zhì)譜法進(jìn)行分析物測定的方法、混合物、試劑盒和組合物，所述親核性反應(yīng)活性基團(tuán)與分析物的官能團(tuán)反應(yīng)而產(chǎn)生被標(biāo)記分析物。所述標(biāo)記試劑可以作為同量異位組、質(zhì)量差異性標(biāo)記組或者同量異位組和質(zhì)量差異性標(biāo)記組的組合而使用。文檔編號C07D295/00GK101541774SQ200780032408公開日2009年9月23日申請日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日發(fā)明者斯科特·B·丹尼爾斯,蘇巴卡爾·戴伊,蘇巴西什·普爾卡亞斯塔申請人:阿普里拉股份有限公司