基于單酶反應(yīng)的l-谷氨酰胺的比色測(cè)定方法以及測(cè)定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于單酶反應(yīng)的L-谷氨酰胺的比 色測(cè)定方法以及基于該方法的測(cè)定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] L-谷氨酰胺是膳食中一種天然氨基酸，它在氨基酸代謝和生物合成中扮演著一個(gè) 必不可少的角色，同時(shí)這個(gè)氨基酸也參與到其他許多的代謝途徑。L-谷氨酰胺不僅是二十 種蛋白氨基酸的一員，也是重要的能量來源以及體內(nèi)的氨基供體。谷氨酰胺可以直接穿過 血-腦屏障，它不僅在血液中循環(huán)，也能在骨骼肌中儲(chǔ)存，而缺乏L-谷氨酰胺會(huì)引起一系列 疾病。因此，測(cè)量L-谷氨酰胺在人體內(nèi)的濃度可以作為一些疾病檢測(cè)的依據(jù)?？焖俣鴾?zhǔn)確 的L-谷氨酰胺測(cè)定方法將大大促進(jìn)對(duì)疾病的檢測(cè)。另外，L-谷氨酰胺也是細(xì)胞培養(yǎng)中重 要的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物，測(cè)量它的濃度可以用來理解細(xì)胞代謝和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過程。
[0003] 現(xiàn)有的L-谷氨酰胺測(cè)定方法都是基于兩個(gè)酶的體系，例如，在一個(gè)紫外吸收光譜 的方法中，L-谷氨酰胺先由一個(gè)谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)化成谷氨酸，而后再由谷氨酸脫氫酶和NAD 催化脫氫形成a-酮戊二酸、銨離子、以及NADH。NADH的形成可以通過其在340納米處的 吸收值測(cè)量出來，從而推算出L-谷氨酰胺的濃度。但是，很多其他的化合物在340納米下 也有吸收，如果這些化合物存在于樣品中，將影響整個(gè)測(cè)量的準(zhǔn)確度。
[0004] 雙酶測(cè)定方法主要有以下幾點(diǎn)不足：一是需要兩個(gè)酶的參與；二是測(cè)定結(jié)果會(huì)受 樣品中其他雜質(zhì)的干擾；三是反應(yīng)中使用的酶越多，反應(yīng)體系所需要的成分以及緩沖液也 就越多，這不僅增加成本，也提高了測(cè)定的誤差?，F(xiàn)有的雙酶測(cè)定方法還要求所有的底物必 須完全被轉(zhuǎn)化成谷氨酸，而谷氨酸也要在第二步反應(yīng)中百分之百被脫氫。因此反應(yīng)時(shí)間較 長。此外，如果一個(gè)樣品里已經(jīng)含有谷氨酸，它的含量需要被預(yù)先測(cè)定，并從左旋谷氨酰胺 最后的測(cè)定濃度中去除。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述【背景技術(shù)】中提到的現(xiàn)有的L-谷氨酰胺測(cè)定方法所存在的測(cè)定欠準(zhǔn)確、 測(cè)定成本高的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可快速準(zhǔn)確地測(cè)定出L-谷氨酰胺含 量的方法，且該方法成本較低。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了這樣一種基于單酶反應(yīng)的L-谷氨酰胺的比 色測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟：
[0007] (1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將已知不同濃度的L-谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品分別與indigoidine合 成酶、ATP、可溶性鎂鹽溶液以及緩沖液混合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為10-40°C，并在600納米下測(cè) 定反應(yīng)特定時(shí)間后溶液的吸光度值，然后根據(jù)L-谷氨酰胺的濃度與對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0008] (2)將待測(cè)樣品在與步驟（1)相同的反應(yīng)環(huán)境和反應(yīng)條件下反應(yīng)相同的時(shí)間，并 測(cè)定反應(yīng)后的溶液在600納米下的吸光度值；
[0009] (3)根據(jù)步驟⑴所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及步驟⑵測(cè)得的吸光度值測(cè)算出L-谷氨 酰胺的含量；
[0010] 所述ATP的濃度為0. 1-10毫摩爾/升，所述可溶性鎂鹽溶液的濃度為0. 1-10毫 摩爾/升，所述緩沖液的pH值為7-11，所述特定時(shí)間為1-40分鐘；在參與反應(yīng)之前，須使 用磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶對(duì)所述indigoidine合成酶的巰基化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行活化。
[0011]Indigoidine合成酶是一種非核糖體多肽合成酶，可用來合成 Indigoidine。目前已經(jīng)有幾個(gè)報(bào)道的Indigoidine合成酶，比如IndC(Erwinia chrysanthemi)>BpsA(Streptomyceslavendulae和Streptomycesaureofaciens)和 Sc_IndC(Streptomyceschromofuscus)。這些Indigoidine合成酶的氨基酸序列很相近， 基本構(gòu)造是一樣的，都含有C(縮合）-A(腺苷?；?Ox(氧化）-T(巰基化）這四個(gè)結(jié)構(gòu) 域。Indigoidine是一種來自細(xì)菌的天然藍(lán)色素。Indigoidine合成酶可以利用兩個(gè)分子 的L-谷氨酰胺合成indigoidine。其反應(yīng)過程如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在于包括w下步驟： (1) 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將已知不同濃度的心谷氨醜胺標(biāo)準(zhǔn)品分別與indigoidine合成酶、 ATP、可溶性鎮(zhèn)鹽溶液W及緩沖液混合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為l〇-4(TC，并在600納米下測(cè)定反應(yīng) 特定時(shí)間后溶液的吸光度值，然后根據(jù)k谷氨醜胺的濃度與對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線； (2) 將待測(cè)樣品在與步驟（1)相同的反應(yīng)環(huán)境和反應(yīng)條件下反應(yīng)相同的時(shí)間，并測(cè)定反 應(yīng)后的溶液在600納米下的吸光度值； (3) 根據(jù)步驟（1)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線W及步驟（2)測(cè)得的吸光度值測(cè)算出心谷氨醜胺 的含量； 所述ATP的濃度為0. 1-10毫摩爾/升，所述可溶性鎮(zhèn)鹽溶液的濃度為0. 1-10毫摩爾 /升，所述緩沖液的抑值為7-11，所述特定時(shí)間為1-40分鐘；在參與反應(yīng)之前，須使用磯酸 泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶對(duì)所述indigoidine合成酶的琉基化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行活化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在于： 所述indigoidine合成酶為IndC、BpsA或者Sc-IndC，所述IndC具有如SEQ ID NO. 1所示 的氨基酸序列，所述化sA具有如SEQ ID NO. 2或者如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，所 述5(3-111祀具有如569 10^.4所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在 于：所述緩沖液為磯酸鹽緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在 于：所述特定時(shí)間為20-30分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在 于：所述反應(yīng)溫度為20-3(TC。
6. 基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺測(cè)定試劑盒，其特征在于包含W下組分；indigoidine 合成酶、濃度為0. 1-10毫摩爾/升的ATP、濃度為0. 1-10毫摩爾/升的可溶性鎮(zhèn)鹽溶液W 及抑值為7-11的緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺測(cè)定試劑盒，其特征在于：所 述indigoidine合成酶為IndC、BpsA或者Sc-IndC,所述IndC具有如SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列，所述化sA具有如SEQ ID NO. 2或者如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，所述 Sc-IndC具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在 于：所述緩沖液為磯酸鹽緩沖液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征在 于；所述試劑盒的反應(yīng)溫度為10-4(TC。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的基于單酶反應(yīng)的k谷氨醜胺的比色測(cè)定方法，其特征 在于；所述試劑盒的反應(yīng)溫度為20-3(TC。
【專利摘要】基于單酶反應(yīng)的L-谷氨酰胺的比色測(cè)定方法以及測(cè)定試劑盒，涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，旨在解決現(xiàn)有測(cè)定方法存在的測(cè)定欠準(zhǔn)確、測(cè)定成本高的問題。該方法包括：將已知不同濃度的L-谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品分別與indigoidine合成酶、ATP、可溶性鎂鹽溶液以及緩沖液在10-40℃溫度下反應(yīng)，并在600納米下測(cè)定反應(yīng)1-40分鐘后溶液的吸光度值，繪制L-谷氨酰胺濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定待測(cè)樣品同樣條件下的吸光度值；測(cè)算L-谷氨酰胺的含量。該試劑盒包括indigoidine合成酶、濃度為0.1-10毫摩爾/升的ATP、濃度為0.1-10 毫摩爾/升的可溶性鎂鹽溶液以及pH值為7-11的緩沖液。該方法快速準(zhǔn)確。
【IPC分類】G01N21-31
【公開號(hào)】CN104535511
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410775824
【發(fā)明人】陶淑芳
【申請(qǐng)人】陶淑芳
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日