專利名稱：：一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于海洋微生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地說，其是抑制植物病菌的化合物，其涉及一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，還涉及含有該化合物的特性。技術(shù)背景長期以來，國內(nèi)的農(nóng)藥生產(chǎn)大多以仿造國外作為主導(dǎo)產(chǎn)品，隨著我國加入WTO,對具有自主產(chǎn)權(quán)的農(nóng)藥和無公害農(nóng)產(chǎn)品的要求日益提高，而從天然產(chǎn)物中開發(fā)高效低毒的新先導(dǎo)化合物是創(chuàng)制新農(nóng)藥的關(guān)鍵。目前植物化學(xué)殺菌劑的慢性殘毒和致癌作用已引起廣泛關(guān)注，亟需開發(fā)新型低毒抑制植物病菌，而新型抑制植物病菌農(nóng)藥先導(dǎo)化合物主要來自新生物源。生物源抗菌農(nóng)藥具有高效、無公害、與環(huán)境兼容性好等特點，與其他生物源農(nóng)藥相比，微生物源農(nóng)藥以其更容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、開發(fā)費用低的優(yōu)勢，成為國內(nèi)外開發(fā)新農(nóng)藥的首選資源，已開發(fā)的由微生物研制的新的抑制植物病菌化合物用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，不但獲得明顯的經(jīng)濟效益，也兼得了較好的生態(tài)效益和社會效益。創(chuàng)制生物農(nóng)藥是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和有機農(nóng)業(yè)，解決食品農(nóng)藥殘留問題的核心。由于陸地微生物研究較早，發(fā)現(xiàn)新的農(nóng)用微生物資源的機率明顯減少，海洋特殊的生境決定了微生物的代謝類型不同于陸地微生物，發(fā)現(xiàn)新農(nóng)藥化合物的機率將會大大增加，由海洋微生物資源發(fā)現(xiàn)新農(nóng)藥用化合物是國內(nèi)外研究的熱點。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的是提供一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，該化合物由海洋放線菌ZFC02(5Yr印to扱7cessp.)發(fā)酵物獲得，該化合物對稻瘟霉菌、鐮孢霉菌、灰葡萄孢菌、黑白輪枝菌、芽枝霉菌等多種植物病原真菌具有較強的抑制作用。本發(fā)明充分利用了海洋微生物這一特殊生境的天然資源，從菌株的獲得、培養(yǎng)發(fā)酵到化合物的提取，均出自申請人研究成果，由此獲得一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于該化合物由海洋放線菌ZFC02(6Yre/7to/^cessp.)發(fā)酵物獲得，具有通式(I)的化合物及其幾何異構(gòu)體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>通式(I)中，A、B、C、A'、B，、C，是氫，鹵素，氰基，羥基，C卜6的烷基，C卜6的烷氧基，C卜6的鹵代垸基，C卜6的鹵代烷氧基。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個不是氫。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個是羥基。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A'、B'、C'中至少一個不是氫。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個不是氫。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于化合物是3，8—二羥基一l一丙基蒽一9，10—二酮2，7—二羥基一3，6—二甲基蒽一9，10—二酮2—乙基—1，8—二羥基一3—甲基蒽一9，10—二酮2，6—二羥基一3—甲氧基一7—丙基蒽一9，IO—二酮l一(氯甲基)—8—乙基一3，6—二羥基蒽—9，10—二酮7—(氯甲氧基)一1，5-二羥基一2—甲基蒽一9，10—二酮3—氯—7—(氯甲基)一1，5—二羥基蒽一9，10—二酮2—乙基一1，5—二羥基一3—甲基一8—丙基蒽一9，10—二酮2(氯甲基)一l，5—二羥基一3—甲基一8—丙基蒽一9，IO—二酮2—(氯甲基)一1，5—二羥基一3—甲氧基一8—丙基蒽一9，IO—二酮2—乙基一1，8—二羥基一3，6—二甲基蒽一9，10—二酮。所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于該化合物為橙色固體，分辨質(zhì)譜HRFAB為m/z:282.0898[M]+、m/z:282.0815[M]+，不飽和度為11，紅夕卜光譜羥基為3419cm—'、3268cnf1.，羰基為1672cnT1、1624cm—1、1652cm—'、1630cm—1芳香環(huán)為1597cm—1、1560cm—'、1469cm—'、1601cm\1472cm—'。本發(fā)明的蒽醌類抑制植物病原真菌化合物效果在于對稻瘟霉菌、鐮孢霉菌、灰葡萄孢菌、黑白輪枝菌、芽枝霉菌等多種病原真菌具有較強的抑制作用，而新型抑菌藥劑的先導(dǎo)化合物主要來自新生境的微生物。生物源抗菌農(nóng)藥具有高效、無公害、與環(huán)境兼容性好等特點，與其他生物源抗菌農(nóng)藥相比，微生物源抗菌農(nóng)藥以其更容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、開發(fā)費用低的優(yōu)勢，使用前景廣。具體實施例本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下本發(fā)明涉及的化合物是由海洋放線菌ZFC02(5^r印to頂ycessp.)發(fā)酵物獲得，經(jīng)鑒定屬于已知鏈霉屬(5Yrep^/H/cessp.)放線菌。1、菌株人工培養(yǎng)菌株純化后，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化測試，獲得產(chǎn)抑菌物質(zhì)適宜的培養(yǎng)基淀粉20gKN03lg，K2HP040.5g，MgS040.5g，F(xiàn)eS040.Olg，NaCl3g，KC10.03g，MgCl20.23g，海泥浸提液200ml，pH7.025°C,150rpm，在此條件下振蕩培養(yǎng)10天。2、化合物的制備ZFC02菌株發(fā)酵物經(jīng)離心分為菌絲體和菌液兩部分。菌液部分薄膜蒸發(fā)(<50°C)濃縮至少量，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。無水甲醇脫鹽及一些水溶性培養(yǎng)基。樣品的甲醇液濃縮至干，溶于適量的水中，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取。菌絲體部分用甲醇動態(tài)提取，提取液用正丁醇萃取。對乙酸乙酯、正丁醇部分進(jìn)行化學(xué)分離?；瘜W(xué)分離綜合運用硅膠柱色譜，制備薄層(PTLC)，凝膠(S印hadexLH-20)柱色譜，反相(0DS)柱色譜和高效液相(HPLC)等色譜手段，以定向?qū)ふ?H-NMR譜中感興趣的信號、和DAD-HPLC分析譜中成系列的化合物為主。利用多種色譜方法(正相硅膠柱色譜，反相硅膠柱色譜，SephadexLH-20柱色譜)從對其發(fā)酵液乙酸乙酯部分，分離得到四個化合物，其中二個蒽醌類新化合物即為本發(fā)明涉及的化合物。運用用現(xiàn)代核磁共振技術(shù)CH，13C,C0SY，HMQC，HMBC，N0ESY)結(jié)合質(zhì)譜(MS)，紅外(IR)，紫外(UV)等多種譜學(xué)方法鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，計算機Chemdraw-3D模擬確定了它們的結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型。。3、化合物分析與鑒定化合物1，橙色固體，高分辨質(zhì)譜冊FAB(m/z:282.0898[MD確定分子式為C17H1404，化合物不飽和度為ll。紅外光譜顯示了羥基(3419cm—1)、兩個羰基(1672、1624cm—1)和芳香環(huán)(1597、1560、1469cm—1)的吸收峰。另外，紫外光譜吸收峰為228，258and432nm。從以上數(shù)據(jù)可知，該化合物為蒽醌類化合物。'H-NMR數(shù)據(jù)(見Table3.1)表明存在四個芳香質(zhì)子57.31(dd,J=8.5,1.0Hz),7.69(dd,J=8.5,7.5Hz)，7.84(dd，J=7.5，1.0Hz)，7.68(s)。根據(jù)'H-'HCOSY，可知存在兩個芳香系統(tǒng)，一個ABC系統(tǒng)，和一個五取代系統(tǒng)。通過^-NMR和'H-力COSY，顯示存在四個取代基，兩個羥基12.48(s，1-0H)，12.21(s,8-0H),一個甲基2.48(s，3-CH3),一個乙基2.82(q,J=7.5Hz，-CH2)，1.21(t,J=7.5Hz，-CH3)。通過HMQC和HMBC(見Figure3.1)歸屬了取代基的位置。該化合物不存在手性問題，立體結(jié)構(gòu)只有一種。綜上所述，該化合物結(jié)構(gòu)確定為2-ethyl-1,8-dihydroxy-3_methylanthracene-9，10-dione.如表1。NumberSH(500MHz)Sc(125MHz)鵬C1160.84(s)2139.02(s)3146.56(s)47.68(s)122.17(d)2，10'13,14,3-CH357.84(dd,J=7.5，1.0Hz)119.75(d)7，10,1267.69(dd，J=8.5,7.5Hz)136.84(d)877.31(dd，J=8.5,1.0Hz)124.39(d)128162.39(s)9192.90(s)10182.01(s)11130.45(s)12116.06(s)13113.00(s)14133.83(s)1，2.82(q,J=7.5Hz)19.60(t)1，2，3，2，2，1.21(t，J=7.5Hz)12.69(q)1，，23_CH32.48(s)20.18(q)2,3,41-0H12.48(s)1,2,138-OH12.21(s)7,8,12表1化合物2，橙色固體，高分辨質(zhì)譜冊FAB(m/z:282.0815[M]+)確定分子式為C17H1404，化合物不飽和度為11。紅外光譜顯示了羥基(3268cnT1)、兩個羰基(1652、1630cm—1)和芳香環(huán)(1601、1472cm—1)的吸收峰。紫外光譜吸收峰為223,280and410mn。以上光譜數(shù)據(jù)特征類似于化合物1，表明該化合物也是蒽醌類化合物。'H-國R數(shù)據(jù)(見Table3.2)表明存在五個芳香質(zhì)子，S7.00(d,J=2.5Hz)，7.45(d,J=2.5Hz),7.61(d，J=7.8Hz),7.70(dd，J=7.8,8.0Hz)，7.31(d，J=8.0Hz)。根據(jù)！H-C0SY，可知存在兩個芳香系統(tǒng)，一個間位耦合系統(tǒng)，和一個ABC系統(tǒng)。通過'H-NMR和'H」HCOSY，顯示存在三個取代基，兩個羥基11.10(bs，3-0H)，12.99(s,8-OH)，一個正丙基3.08(t，J=7.5Hz，-CH2)，1.60(m，_CH2)，0.99(t,J=7.OHz，-CH3)。通過HMQC和HMBC(見Figure3.2)歸屬了取代基的位置。該化合物不存在手性問題，立體結(jié)構(gòu)只有一種。綜上所述，該化合物結(jié)構(gòu)確定為3,8-dihydroxy-l-propylanthracene-9，10-dione，如表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、化合物對植物病原真菌的離體活性采用常規(guī)的96孔板法對上述幾種植物病原真菌進(jìn)行抑菌測試先將ZFC02化合物用用2%的DMSO溶液溶解成lnig/ml的母液，然后用倍半稀釋法稀釋至不同濃度。取處理液5(HiL加入到已經(jīng)加好各種病原真菌孢子液的96孔板中的第一行(留出空白對照列和陽性對照列)。每一列從第一行開始依次倍半稀釋到最后一孔，然后在27。C培養(yǎng)16小時，取出后在倒置顯微鏡下觀察孢子及菌絲體的形態(tài)及生長情況。根據(jù)活性指標(biāo)判斷活性情況，計算最小活性濃度(MIC)?？瞻讓φ詹捎?X的DMS0溶液，陽性對照采用傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥多菌靈。表3ZFC02化合物抑菌活性蒽醌類化合物1蒽醌類化合物2病原真菌拉丁學(xué)名多菌靈DMSO(Ug/mL)g/mL)(2%)稻瘟霉菌Pyriculaxiaoryzae1.957.80茄鏈孢菌Alternariasalani7.815.60鐮孢霉菌Fusariumoxysporrum7.87.80灰葡萄孢菌4iotrytiscinerea3.91.950黑白輪枝菌Verticilliumalboatrum1.953.90芽枝霉菌Cladosporiumfulvum15-67.80(Hg/mL)(y7.83.97.83.93.93.95、ZFC02化合物對植物病害的防治作用先將ZFC022個新蒽醌類化合物分別用2%的DMSO溶液溶解成lmg/ml的母液，然后用1%的DMSO用倍半稀釋法稀釋至7.8ug/tnL。盆栽植物3葉期接種上述病原真菌，接種孢子量為150個/mL200個/mL，接種9天左右葉片開始表現(xiàn)癥狀時，分別噴施上述2種化合物溶液，噴藥7天后調(diào)查病情指數(shù)，每個處理3盆重復(fù)，病情指數(shù)設(shè)0一4級，并設(shè)噴灑1XDMS0和化學(xué)農(nóng)藥多菌靈作為對照，用常規(guī)方法計算防效(％)。表4ZFC02化合物對植物病害的防治作用蒽醌類化合物植物病害化合物多菌靈(1%)水稻稻瘟病67.90蕃茄早疫病75.00黃瓜枯萎病67.80蕃茄灰霉病78.10茄黃萎病53.90蕃茄葉霉病DMSO(%)(%)78.585.870.985.968.965.6蒽醌類(%)86.073.367.278.153.773.9表中結(jié)果顯示，ZFC02化合物對植物6種病害的防治作用超過傳統(tǒng)農(nóng)藥多菌靈。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實施例進(jìn)行修改添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于該化合物由海洋放線菌ZFC02(Streptomycessp.)發(fā)酵物獲得，具有通式(I)的化合物及其幾何異構(gòu)體通式(I)中，A、B、C、A’、B’、C’是氫，鹵素，氰基，羥基，C1～6的烷基，C1～6的烷氧基，C1～6的鹵代烷基，C1～6的鹵代烷氧基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個不是氫。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個是羥基。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A'、B'、C'中至少一個不是氫。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于A、B、C中至少一個不是氫。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于化合物是-3，8—二羥基一1一丙基蒽一9，IO—二酮2，7—二羥基一3，6—二甲基蒽一9，IO—二酮2—乙基一1，8—二羥基一3—甲基蒽一9，10—二酮2，6—二羥基一3—甲氧基一7—丙基蒽一9，IO—二酮1_(氯甲基)_8_乙基_3，6—二羥基蒽一9，IO—二酮7_(氯甲氧基)一l，5—二羥基一2—甲基蒽一9，IO—二酮3—氯一7—(氯甲基)一1，5—二羥基蒽一9，IO—二酮2—乙基一1，5—二羥基一3—甲基一8—丙基蒽一9，IO—二酮2(氯甲基)一l，5—二羥基一3—甲基一8—丙基蒽一9，IO—二酮2—(氯甲基)_1，5—二羥基一3—甲氧基一8—丙基蒽一9，IO—二酮2_乙基一1，8—二羥基_3，6—二甲基蒽一9，IO—二酮。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，其特征在于該化合物為橙色固體，分辨質(zhì)譜HRFAB為m/z:282.0898[M]+、m/z:282.0815[M]+，不飽和度為11，紅外光譜羥基為3419cm—'、3268cm'、羰基為1672cm—'、1624cm—\1652cm—'、1630cm—'，芳香環(huán)為1597cm—'、1560cm—'、1469cnT1、1601cm—'、1472cm—'。全文摘要本發(fā)明提供一種新蒽醌類抑制植物病原真菌化合物，該化合物由海洋放線菌ZFC02(Streptomycessp.)發(fā)酵物獲得，該化合物對稻瘟霉菌、鐮孢霉菌、灰葡萄孢菌、黑白輪枝菌、芽枝霉菌等多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，物源抗菌農(nóng)藥具有高效、無公害、與環(huán)境兼容性好等特點，與其他生物源抗菌農(nóng)藥相比，微生物源抗菌農(nóng)藥以其更容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、開發(fā)費用低的優(yōu)勢，使用前景廣。文檔編號C07C50/34GK101274885SQ20071001413公開日2008年10月1日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者林文翰,王小如,黎田,立鄭申請人:國家海洋局第一海洋研究所