專利名稱：激發(fā)針對在癌細胞和腫瘤基質上表達的結構域和亞結構域表位的多價免疫應答的方法和 ...的制作方法
技術領域：
本文公開的發(fā)明涉及誘導MHC I-類限制性免疫應答以及控制所述應 答的性質和程度，由此促進在致病過程中的有效的免疫干預。本發(fā)明涉及 可以刺激針對靶點細胞的細胞免疫應答的免疫原性組合物。本申請公開的 是一種免疫原性組合物，其包含編碼CTL表位PRAME425.433和PSMA288.297 或者每一種或兩種表位的交叉反應類似物的核酸構建體。本發(fā)明還提供使 用所述免疫原性組合物在施用所述組合物的受試者中激發(fā)平衡的免疫應 答的方法。
相關技術描述
癌癥通常在當部分機體中的細胞以不同于以有序方式生長、分裂和死 亡的正常細胞的無序方式持續(xù)生長和分裂時發(fā)生。盡管存在許多種類的癌 癥，但是它們通常由于異常細胞的超出控制的生長而起始。
用于癌癥的常規(guī)治療選擇包括手術、放射性治療和化學治療。正在研 發(fā)第四分枝治療，其叫作免疫治療。免疫治療試圖幫助免疫系統(tǒng)識別癌細 胞，和/或增強針對癌細胞的應答，以消滅癌癥。免疫治療包括主動和被 動免疫治療。主動免疫治療試圖刺激機體自身的免疫系統(tǒng)以抵抗疾病。被 動免疫治療通常不是依靠機體來攻擊疾??；相反，它們使用在患者機體外 產生的免疫系統(tǒng)成分(諸如抗體)。
除了各種類型的癌癥治療之外，存在對于其它治療選擇的持續(xù)的需
求。通過使用抗癌疫苗處理免疫系統(tǒng)是一種這樣的方法。
為了產生疫苗或其它免疫原性組合物，將可以增加針對其的免疫應答 的抗原或表位引入到受試者中。盡管贅生性(癌癥)細胞來源于正常細胞， 并且因此在遺傳水平上與正常細胞基本上相同，但是己知許多贅生性細胞 呈遞腫瘤-相關的抗原(TuAAs)。在理論上，這些抗原可以被受試者的免疫 系統(tǒng)所用，以識別并且攻擊作為外來物的贅生性細胞。不幸地，贅生性細 胞通常似乎被宿主的免疫系統(tǒng)所忽略。
免疫系統(tǒng)可以分成兩類獨立的效應器武器。第一類是先天性免疫，其 包括許多細胞成分和應答所有的傳染性刺激的可溶因子。另一類是適應性 免疫應答，其定為特異性應答來自傳染性介質的精確的表位。適應性免疫 應答還分成兩種效應器武器，叫做體液和細胞免疫系統(tǒng)。體液武器集中在
由B-淋巴細胞產生抗體，而細胞武器包括細胞毒性T淋巴細胞的殺傷細
胞活性。
細胞毒性T淋巴細胞(CTL)不識別在傳染劑自身上的表位。相反，CTL 檢測展示在感染細胞表面的來源于傳染劑的抗原片段。結果，只是在它們 被感染細胞處理并且因此展示在細胞表面之后，抗原才為CTL明顯可見。
所述細胞表面上的抗原處理和展示系統(tǒng)已被很好地建立。CTL識別短 肽抗原，其與I類主要組織相容性復合體分子(MHC)非-共價締合而展示在 表面上。這些I類肽又來源于胞質蛋白的降解。
在大部分情形中，贅生性過程發(fā)展以避免免疫防御機制，其通過應用 一定范圍的導致免疫忽略、耐受性或背離的策略。有效破壞免疫耐受性或 修復針對在癌細胞上表達的抗原的免疫背離的方法已在參考文獻中描述 (Okano F,等J/mmwrn /.(免疫學雜志)2005， Mar 1; 174(5):2645-52; Mocellin S,等，￡^ Ce〃/ 仏(表達細胞研究)2004 Oct 1; 299(2):267-78; BanatGA,等，^wmmo〃mmz^o^zer.(癌癥免疫免疫學治療)2001 Jan;49(ll):573-86)，并且除了它們與顯著水平的系統(tǒng)免疫性相關外，所述 方法幾乎不導致腫瘤負擔的減小。影響這一過程的顯著有限的因子是抗一 腫瘤效應器細胞的次優(yōu)運輸、局部活化和/或活性。實際上，在大部分情 形中己經表明，免疫細胞的腫瘤內部呈遞極少出現(xiàn)一一與同炎性過程諸如 器官排斥、傳染性或自體免疫綜合征相關的那些進行比較。
相對于針對不同的單個表位的免疫應答的量級，由暴露于包含多個表 位的抗原(在天然介質中或當接種時)引起的免疫應答先天性地與層次相 關。這發(fā)生在T細胞表位諸如MHCI類和II類限制性表位的情形中，其 中己經很好地證明顯性和亞顯性。顯性表位是激發(fā)顯著的并且特異性的T
細胞增殖的那些；而亞顯性表位激發(fā)相對減小的應答，其特征在于具有減 小的功能性的特異性T細胞的有限的增殖。
對于免疫應答集中在某種抗原內的表位子集上存在多種原因，而不管
所述抗原是天然的還是工程化的。這些原因包括但不限于下述在蛋白酶
體(i類限制性)或內體(n類限制性)內產生特定的肽或多肽前體的效
率；它們通過TAP (用于I類肽)和備選機制選擇性轉運到發(fā)生負荷到 MHC上的區(qū)室；相對于占據(jù)新生成MHC分子的肽-結合裂口的蛋白伴侶 或不變多肽鏈，以及相對于由相同的或備選底物加工形成的其它競爭肽， 它們對于MHC分子的親和力；獲得的MHC-肽復合物的穩(wěn)定性；和T細 胞全體的功能性。
另外，由于它們的固有特性(諸如上文所述的那些)，來自在同一人 工分子上一起產生的不同抗原的兩個或多個表位呈現(xiàn)顯性/亞顯性關系。 這限制組合分子用于免疫治療目的的實際適用性，特別當進行共同靶向癌 細胞(贅生性)和基質成分(諸如新生脈管系統(tǒng))時。
發(fā)明概述
為了增強腫瘤過程的免疫介導的控制，除了對腫瘤細胞的直接攻擊之 外，本發(fā)明的實施方案提供對新生脈管系統(tǒng)的免疫介導的攻擊，作為目的 是在腫瘤內部建立炎性環(huán)境的二價或多價疫苗策略的成分，所述疫苗策略 導致收縮、穩(wěn)定或生長率和侵入的減少(局部或系統(tǒng)的)。這種方法可以 比單獨靶向癌細胞或新生脈管系統(tǒng)的策略更加有效地控制腫瘤過程，并且 對于治療指數(shù)(效率/安全性)有有利的影響。
一些實施方案涉及調節(jié)針對具有不同的固有免疫特性的表位的免疫 應答的方法和組合物(例如，在給出的免疫情形中顯性相對于亞顯性的狀 況)，其以與增加亞顯性表位的相對活性一致的方式進行，以實現(xiàn)針對多 種表位的平衡的免疫應答的共同誘導。當共同靶向諸如由癌細胞和/或潛
在的基質所表達的多種抗原時，本發(fā)明是有用的。
在一些實施方案中，共同耙向新生脈管系統(tǒng)和癌細胞，或者共同靶向 癌細胞上的多種抗原可以通過包含表達載體的免疫治療組合物而實現(xiàn)，所 述表達載體諸如質粒，其激發(fā)針對轉化的細胞、腫瘤細胞和新生脈管系統(tǒng)
的內皮細胞的免疫性。按照題目為"EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN (編碼耙點-相關的抗原的表位的表達載體及它們的設計 方法)"的美國專利公布申請No. 20030228634中所公開，完成以"串珠" 形式的質粒設計，所述申請完全結合于此作為參考。 一個優(yōu)選的實施方案 是一種二價質粒，其包含來源于在癌細胞上表達的分子和在新生脈管系統(tǒng) 上表達的分子的免疫原性成分。在本發(fā)明的特別的實施方案中，所述分子 與PRAME和PSMA表位及其交叉反應類似物相對應。
在另一個實施方案中，諸如質粒的載體表達來源于由癌細胞和新生脈 管系統(tǒng)共同表達的分子的免疫原性成分。在另一個實施方案中，諸如質粒 的載體表達來源于受體及其配體的免疫原性成分，在其中受體或配體中的 任一種由新生脈管系統(tǒng)表達，而癌細胞表達另一種。
在另一個實施方案中，載體編碼來自于由癌細胞或新生脈管系統(tǒng)(或 其它基質細胞)表達的分子的免疫原性成分，以及生物應答調節(jié)物，其包 括通過B和T細胞上的抗原受體作用的調節(jié)物和不作用的那些。
在一些實施方案中，載體可以以時間順序與其它免疫原性試劑一一諸 如肽一起施用_—用于增強或者調節(jié)針對癌細胞、新生脈管系統(tǒng)或二者的 治療活性(在下列各項中公幵題目為"METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE (控制I類MHC-限制型免 疫應答的方法)"的美國專利申請公布No. 20050079152;于2004年12月
29曰提交的美國臨時專利申請No. 60/640,402，和美國公布No._，
二者皆題目為METHODS TO ELICIT, ENHANCE, AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSE AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES: FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES (用于預防或治療 目的而激發(fā)、增強并且維持針對I類MHC-限制型表位的免疫應答的方 法)；和于2004年6月17日提交的題目為MULTIVALENT
IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA (用于癌癥的多價免疫治 療)的美國臨時申請No. 60/691,581，和題目為MUTLIVALENT IMMUNOTHERAPIES FOR CARCINOMA (用于癌癥的多價免疫治療)
(Atty. Docket No. MANNK.054A)的美國專利申請No. —/_，恰好在
這個申請日期提交， 一起均被授權，(filed on date even with this application both entitled),每一申請通過引用完全結合于此)和平衡針對亞顯性和顯 性表位的應答的目的。
由于這類表位可以參與在患病個體中發(fā)生的陰性選擇(中樞或外周)， 所以在先天性抗原的情形中誘導針對"亞顯性"表位的免疫應答為癌癥治 療提供益處。因此，包含多拷貝亞顯性表位的構建體可以用來誘導針對這 樣一種表位的增加的應答，同時保留針對顯性表位的免疫性。
另外，有效地共同誘導針對來自于由同一分子呈遞的不同抗原的表位 的免疫應答可以提供一種產生針對多種抗原的免疫性的更加實用的方法。 這對于腫瘤和傳染疾病的治療和預防有直接的暗示。
綜上所述，通過所述方法和組合物獲得的更廣的免疫應答更有效地處 理發(fā)病過程，這與主要由有限數(shù)目的特異性控制的免疫應答相反。另外， 在所述方法和組合物中的多價載體的實用性可以減少獲得平衡的、多價應 答所使用的眾多成分和繁瑣的施用流程的需要。
一些實施方案涉及表達PRAME和PSMA表位序列的二價質粒(諸如 在美國專利申請公布Nos. 20030220239, 20050221440, 20050142144和題 目為"EPITOPE SEQUENCES (表位序列)"的PCT專利公布No. PCT/US/11101中公開的那些，其都完全結合于此作為參考)，以及單獨或 與其它質粒組合使用這些組合物激發(fā)平衡的免疫應答的方法。所述方法可 以包括一個起始或導引(entraining)步驟，在所述步驟中所述組合物可以 被遞送到動物上的不同位置，但是優(yōu)選地遞送到淋巴系統(tǒng)，例如淋巴結。 所述導引步驟可以包括所述組合物的一次或多次遞送，例如，在一段時間 內分次(spread out)或者在一段時間內以連續(xù)的方式。
所述方法還可以包括增強步驟，其包括施用包含肽免疫原的組合物， 所述肽免疫原具有與由核酸組合物編碼的相應表位的基本的(substantial) 相似性或功能相似性。例如，所述免疫原可以是相應的表位的交叉反應序 列。增強步驟可以進行一次或多次，例如，在一段時間內間隔進行，以一 次推注(bolus)，或者在一段時間內連續(xù)進行。盡管不需要在所有的實施 方案中，但是一些實施方案可以包括包含免疫增強劑或佐劑的組合物的使 用。
已經觀察到，通過使用這種類型的免疫方案，所述質粒不但可以起始 免疫應答，它還偏向所述應答及其隨后針對效應器的增強，這與調節(jié)特征 相反。無需這種在先的基于核酸的免疫，肽的重復施用導致總是更多地由 調控性T細胞占優(yōu)的應答。這種針對效應器應答的長時間的偏愛叫作導引
(entrainment)。
其它實施方案包括其中所公開的質粒單獨或以任意組合使用的那些。 與這些表位相對應并且用于免疫策略的增強部分的所述肽組合物可以是 天然序列或者與所述天然表位序列基本上相似或功能上相似的肽類似物。 所述肽可以單獨地或與2種、3種或4種免疫原組合而結合在增強方案中。 關于使用少于全部肽表位的原因包括但不限于下述1)任一種抗原的次 最佳表達;2)患者不表達、或者不再表達相對應的抗原；3)產生針對一種 或另一種所述表位的較不強的應答，在所述情形中，為了獲得更加平衡的 應答，所述肽可以在不存在其它肽時給出；和4)如果通過它產生某種免 疫毒性，那么可以停止肽。
其它實施方案涉及通過改變核酸組合物中免疫原表位的相對數(shù)目而 調節(jié)免疫應答的方法。這些實施方案還可以包括改變所述免疫原的固有免 疫原性，例如，通過編碼在所述免疫原表位內的氨基酸取代。
實施方案另外可以包括通過由肽加強進行的選擇性上調而調節(jié)免疫 應答的方法。與這一增強步驟相對應的肽組合物可以是天然序列或與所述 天然表位序列基本上相似或功能上相似的肽類似物。所述選擇性上調可以 通過施用與亞顯性表位相對應的肽而實現(xiàn)，以獲得平衡的免疫應答。
其它實施方案包括編碼PSMA或PRAME表位的任一種的類似物的質 粒。其它實施方案可以包括不同的表位(諸如在題目皆為"EPITOPE SEQUENCES (表位序列)"的美國專利申請公布Nos. 20030220239和 20040180354中公開的那些，所述專利申請公布通過引用完全結合于此) 和以與在RP8和RP12質粒中所表達的表位相似的組合而取代的類似物，
以及作為所述免疫策略的增強部分而施用的相應的肽免疫原(諸如在于
2005年6月17日提交的題目為"EPITOPEANALOGUES (表位類似物)" 的美國臨時專利申請No. 60/691,889，并且其通過引用完全結合于此)。
一些實施方案涉及編碼一種多肽的核酸構建體，所述多肽包括一個或 多個拷貝的CTL表位PSMA288.297 (SEQ ID NO:6)和一個或多個拷貝的 CTL表位PRAME425.433 (SEQ ID NO: 5)，或包含一種或兩種所述表位的1-3 個取代的交叉-反應性類似物，其中所述多肽不包含完整的抗原。例如， 所述一種或兩種表位可以在釋放序列(liberation sequence)內編碼。所述 多肽還可以包含編碼一種或多種表位簇的序列。所述核酸構建體可以包含 PRAME表位簇，例如，PRAME的氨基酸422-509。所述核酸構建體可以 包含PSMA表位簇，例如， 一種或多種表位簇可以是PSMA的氨基酸3-45 或217-297。例如，PSMA表位類似物可以包含I297V取代。所述核酸構 建體還可以包含一種或多種核輸入序列、啟動子(例如，巨細胞病毒(CMV) 啟動子)、poly-A序列，或者一種或多種CpG免疫刺激基序。PRAME和 PSMA兩種表位的釋放序列可以位于，例如，所編碼的多肽的N-端部分。 例如，所編碼的多肽可以是SEQIDNO:2。 PRAME和PSMA兩種表位的 釋放序列可以位于，例如，所編碼的多肽的C-端部分。例如，所編碼的 多肽可以是SEQIDNO:4。
一些實施方案涉及包含上文以及本文其它地方所述的核酸構建體的 免疫原性組合物。
一些實施方案涉及治療患有癌癥的個體的方法，所述方法可以包括施 用治療有效量的上文及本文其它地方所述的核酸構建體的步驟。例如，所 述核酸構建體可以節(jié)內施用。個體可以患有在贅生性細胞或腫瘤-相關新 生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA或兩者的癌癥。
一些實施方案涉及治療患有癌癥的個體的方法。所述方法包括下列步 驟施用有效量的上文及本文其它地方所述的核酸構建體，以誘導免疫應 答；和通過用與所述核酸構建體所編碼的表位相對應的至少一種肽類似物 加強而增強免疫應答。例如，個體可以患有在癌細胞上表達PRAME并且 在腫瘤-相關的脈管系統(tǒng)細胞上表達PSMA的癌癥。所述個體可以患有在 贅生性細胞或腫瘤-相關新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA或兩者
的癌癥。
一些實施方案涉及上文及本文其它地方所述的免疫原性組合物或核 酸構建體在制備用于治療患有癌癥的個體的藥物中的應用。所述藥物可以 通過節(jié)內施用藥物而用于治療患有癌癥的個體。個體可以患有在贅生性細胞或腫瘤-相關新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA或兩者的癌癥。 一些實施方案涉及上文及本文其它地方所述的免疫原性組合物或核 酸構建體在制備用于誘導靶向腫瘤相關的新生脈管系統(tǒng)的免疫應答的藥 物中的應用。例如，所述腫瘤相關的新生脈管系統(tǒng)細胞展示PRAME。
跗圖簡述


圖1.兩個單價質粒和一個二價質粒的結構。
圖2.描述表達P2、 R2和RP5質粒的細胞中的X特異性細胞裂解的 "Cr-釋放檢測。數(shù)據(jù)描述如下x-軸顯示與不同效應器一起使用的靶點細 胞與耙點的比例；y-軸顯示相應的特異性裂解百分數(shù)。
圖3.設計表達PRAME和PSMA表位的其它質粒的結構。描述單價 PRAME質粒R2的結構。P2代表單價PSMA質粒。
圖4. PRAME和PSMA的ELISpot分析，其描述通過包含來自圖3所 述的不同抗原的表位的質粒獲得二價應答的誘導。在兩側淋巴結注射 PRAME / PSMA二價質粒(lmg/ml) 2次而將動物免疫。在顯色之前，將
5乂105個分離的脾細胞與10嗎PSMA288-297天然肽或10嗎Pmme425433天然
肽一起溫育42小時。圖標代表平均值+/- SEM。
圖5.在RP12 二價質粒免疫后PRAME和PSMA的四聚體分析。數(shù) 據(jù)顯示在只用質粒致敏的小鼠中針對PRAME和PSMA的二價免疫應答， 具有針對PRAME表位的應答的相對優(yōu)勢。
圖6A- 6B.在接受RP12或RP8二價質粒免疫然后PSMA288.297 (I297V) 肽類似物加強的小鼠中的PRAME和PSMA的四聚體分析(圖6A)。在經 過RP12或RP8 二價質粒免疫和PSMA288.297 (1297V)肽類似物加強的個體 動物中的PRAME和PSMA的四聚體分析(圖6B)。
圖7.在用RP12或RP8致敏并且用PSMA288-297 (I297V)和 PRAME425.433 (L426Nva, L433Nle)肽類似物加強的動物中的ELISpot分析。
圖8. RP8的多肽序列(SEQ ID NO:2)。 圖9. RP12的多肽序列(SEQ IDNO:4)。
優(yōu)選實施方案詳述
實施方案涉及可以激發(fā)針對顯性和亞顯性表位的多價免疫應答的組
合物。 一些實施方案還涉及設計所述組合物的方法，其通過選擇由癌細 胞和/或基質(新生脈管系統(tǒng))細胞表達的抗原；定義具有不同的內在免 疫特性的表位，其構成在所述癌癥或基質細胞上的有效免疫耙點；并且通 過減少顯性和亞顯性表位數(shù)目之間的比例而調節(jié)特定分子(諸如治療載 體)中的顯性和亞顯性表位的相對數(shù)目，同時提供用于在加工區(qū)室內的適 當?shù)漠a生的最佳側連殘基。
本發(fā)明描述其它方法，諸如用類似物序列或分子內優(yōu)先配置的表位取 代一個或多個拷貝的亞顯性表位，以修飾所述表位的相對免疫原性，并且 確保更平衡的、多價應答。檢測功效可以在設計一系列候選表位之后進行。 在致敏-增強免疫策略中，所述分子的使用可以通過選擇性增強針對亞顯 性表位的應答而得到補充。
關于疫苗設計的一般方法可以包括應用從天然或人工序列起始的確
定運算法則來尋找質粒、載體和包含多拷貝的顯性和亞顯性表位的分子的
顯性和亞顯性表位的正確比例；加工一系列化合物；體外和體內特性鑒定 步驟；和選擇激發(fā)理想的平衡免疫應答的適當?shù)馁|?；蚱渌d體。
當在本文中引用時，表位是指能夠刺激免疫應答的分子或物質。在優(yōu) 選的實施方案中，按照這一定義的表位包括但不必限于多肽和編碼多肽的 核酸，其中所述多肽能夠刺激免疫應答。在其它優(yōu)選的實施方案中，按照 這一定義的表位包括但不必限于在細胞表面呈遞的肽、與I類MHC的結 合裂口非-共價結合的肽，以致它們可以與T細胞受體相互作用。
MHC表位在本文是指對于哺乳動物I類或II類主要組織相容性復合 體分子(MHC)的具有已知的或預計的結合親和性的多肽。
本文引用的免疫表位是指一種多肽片段，其為MHC表位，并且其在 其中免疫蛋白體顯著活躍的細胞上展示。在另一個優(yōu)選的實施方案中，免 疫表位定義為包含按照前述定義的免疫表位的多肽，其通過一個至幾個額
外的氨基酸側連。在另一個優(yōu)選的實施方案中，免疫表位定義為包含表位 簇序列的多肽，其具有對于I類MHC具有已知的或預計的親和性的至少 兩種多肽序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，免疫表位定義為編碼按照任 一前述定義的免疫表位的核酸。
基本相似—一這一術語用于指當通過檢查所述序列判斷時以不重要
的(inconsequential)方式與參照序列不同的序列。編碼相同氨基酸序列 的核酸序列基本上相似，而不管在簡并位置的差異或者在任意非-編碼區(qū) 的長度或組成的適度差異。僅通過保守取代或較小長度變化而不同的氨基 酸序列基本上相似。另外，包含在N-端側連殘基數(shù)目上不同的持家表位 的氨基酸序列，或者在任一端的側連殘基數(shù)目不同的免疫表位和表位簇， 基本上相似。編碼基本上相似的氨基酸序列的核酸本身也是基本上相似 的。
功能相似一一這一術語用于指當通過檢查生物或化學特性判斷時以 不重要的方式與參照序列不同的序列，盡管所述序列可能不是基本上相似 的。例如，兩種核酸可以用作同一序列的雜交探針，但是編碼不同的氨基 酸序列。即使他們通過非保守氨基酸取代而不同(并且因此不滿足基本相 似的定義)，誘導交叉-反應性CTL應答的兩種表位是功能相似的。識別 同一表位的抗體對或TCRs可以彼此功能相似，而不管存在什么樣的結構 差異。在檢測免疫原性的功能相似性時，技術人員通常用"改變的"抗原 免疫，并且檢測所激發(fā)的應答(Ab, CTL,細胞因子生成等)識別所述革巴 點抗原的能力。因此，兩種序列可以設計成在某些方面不同而保留相同的 功能。這樣設計的序列變體在本發(fā)明的實施方案中。
I.質粒構建
本發(fā)明的一些實施方案提供許多質粒，例如，pRP8 (SEQ ID NO:l), pRP9,pRP10,pRPll,pRP12(SEQIDNO:3),禾卩pRP13，其具有激發(fā)或促進 針對腫瘤相關抗原PRAME和PSMA、特別是針對表位PRAME425_433和 PSMA288-297的二價應答的能力。在本發(fā)明的特別的實施方案中，提供作為 免疫原性組合物的質粒pRP12和pRP8。下文描述用于產生本發(fā)明的質粒 構建體的方法。
在優(yōu)選的實施方案中，質粒構建需要逐步連接一系列長的互補寡核苷
酸，從而導致編碼以"串珠"排列的表位的DNA序列的生成。這些DNA
攜帶用于限制性酶的適當?shù)恼承阅┒?，其可以用于進一步連接編碼表位簇
區(qū)域的DNAs，所述粘性末端通過在作為模板的關于PSMA或PRAME的 克隆cDNA上進行PCR而擴增。然后將完整的插入物連接到4/7II和￡coA I限制性位點之間的載體骨架中。完整的編碼序列通過DNA測序驗證。 基于PCR的誘變可以用來產生編碼類似表位肽的序列，或者調整顯性/亞 顯性表位的拷貝數(shù)目，以獲得理想的比例。兩種質粒RP8和RP 12的序 列詳細描述并且公開為SEQ IDNO.l和SEQ ID N0.3 。對于本文所述的具 體的質粒，載體骨架是由Invitrogen (Carlsbad, CA)進行的pVAX的改良版 本，其先前已在題目為Avoidance of Undesirable Replication Intermediates in Plasmid Propagation (在質粒增殖中避免不理想的復制中間體)的美國專 禾廿 6,709,844 禾卩題目為 Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens (編碼靶點-相關抗原的表位的表達載體)的美 國專利申請No. 09/561,572中公開，每一專利通過引用完全結合于此。本 領域的技術人員應該認識到，本發(fā)明的編碼序列可以放置在適于用作疫苗 的任何核酸載體中而不超出本發(fā)明的范圍。例如，編碼其它提及的質粒的 序列可以插入到與在pRP8和pRP12質粒中所用的骨架相同或相似的骨架 中。
pRP8禾P pRP12是編碼具有來自于PSMA (288-297及其類似物)和 PRAME (425-433)的HLA A2-限制性CTL表位的一種多肽的重組DNA質 粒。兩種多肽還包括包含PSMA (3-45， 217-297)和PRAME (422-509)的表 位簇的區(qū)域。側連定義的PSMA和PRAME表位的是對于通過免疫蛋白 體加工釋放所討論的表位的最優(yōu)化的短的氨基酸序列。用于多肽在質粒中 的編碼序列受控于來自巨細胞病毒的啟動子/增強子序列(CMVp)，當通過 APCs攝取時，其允許用于所述多肽的mRNA的有效轉錄。在編碼序列 3'末端的牛生長素多聚腺苷酸信號(BGH poly A)提供用于信使多聚腺苷化 以增加其穩(wěn)定性，以及用于從核轉出到用于翻譯的細胞質中的信號。攝取 后為了促進質粒轉運到核，將來自于猿猴病毒40 (SV40)的核輸入序列 (NIS)插入到質粒骨架中。所述質粒攜帶兩個拷貝的CpG免疫刺激性基序，
一個在NIS序列中， 一個在質粒骨架中。最后，所述質粒中的兩個原核遺
傳元件負責在大腸桿菌(五.co//)中擴增，卡那霉素抗性基因(Kan R)和 pMBl細菌復制起點。 -
A. RP8重組DNA質粒
對于RP8，所編碼的多肽的氨基酸序列(長度297個氨基酸殘基；SEQ ID NO:2)包含兩個釋放序列，在其N-端用于PRAME425-433的17個氨基 酸的底物(MKRPSIKR-^SX丄g/tt/G丄；SEQ ID NO:_)，和在其C-端用于 PSMA288—297 的 66 個 氨 基 酸 底 物 CRK-GLPSIPVHPI-LV-GLPSIPVHPI-KRISPEKEEQYIAKR-GLPSIPVH PI-KRPSIK- RGLPSIPVHPV; SEQ ID NO:8)。所編碼的免疫原的完整的肽 序列(SEQ IDNO:2)在圖8中顯示。
前8個氨基酸殘基的片段是已經表現(xiàn)出促進免疫蛋白體對CTL表位 的加工的人工序列。接下來的9個氨基酸G斜沐)是PRAME奶—433 ，在人 PBMC的體外免疫和在小鼠中的體內免疫中都引發(fā)強抗-腫瘤免疫應答的 有效的HLA A2-特異性CTL表位。這種PRAME表位序列之后是 PRAME422-5Q9片段(免疫原的氨基酸18—105)，其包含兩個表位簇 PRAME422-44a。PRAME459-487。兩種PSMA表位簇G斜體)，PSMA3-45(氨 基酸108-150;)和PSMA217-297 (氨基酸151-231)，放置在PRAME表位簇之 后。這些及其它PRAME和PSMA表位簇己經在美國專利申請Nos. 10/117,937, 11/067,064，禾Q 11/067,159中公開，每一申請題目為Epitope Sequences (表位序列)，并且每一申請通過引用完全結合于此。這些表位 簇包含許多預測的HLAA2-特異性表位，并且因此可以用于產生針對免疫 表位的應答(在題目為EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS (在抗原呈遞細胞中的表位同步性)的美國專利申 請公布No. 20030215425和題目為EPITOPE CLUSTERS (表位簇)的美 國專利申請公布Nos. 20030228634; 20040132088;和20040203051中描 述，每一專利申請公布通過引用完全結合于此)。具有多拷貝PSMA288.297 的"串珠"表位排列(GLPSIPVHPI(SEQIDNO:6);黑體)構成其余的多肽 (氨基酸232-297)。 4個拷貝的PSMA288.297結合最后的拷貝成為類似物
(GLPSIPVHPV; SEQIDNO:7)。已經表明，天然的PSMA288-29 及其類似 物都在人PBMC的體外免疫和小鼠的體內免疫中誘導顯著的CTL免疫， 其中所述類似物表現(xiàn)出升高的I類MHC結合和免疫原性。在PSMA288.297 表位序列之間是短的氨基酸序列，其被指定為"切割輔助序列"，以促進 表位的加工和釋放。因此這兩種表位以這樣的方式編碼，以致它們可以通 過pAPCs表達、加工和呈遞。
B. RP12重組DNA質粒
對于RP12質粒，所編碼的多肽的氨基酸序列(長度275個氨基酸殘基; SEQ ID NO:4)包含一種氨基酸底物或釋放序列和在其C-端包含用于 PRAME和PSMA兩種表位釋放的底物的雜合的"串珠"。所編碼的免疫 原的完整的多肽序列在圖9中顯示。SEQIDNO:9代表的釋放序列如下 KR-SLLQHLIGL-GDAAY-SLLQHLIGL-ISPEKEEQYIA-SLLQHLIGL-KRPSIKR GLPSIPVHPV。
所編碼免疫原的氨基酸片段2-44, 45-126和127-213分別是一個與另 一個連接的表位簇PSMA3—45, PSMA2n.297和PRAME422.5()9。在所述"串 珠"雜合底物中，在所述多肽的C-端存在3個拷貝的PRAME425—433 (SLLQHLIGL;黑體；SEQ ID NO:5)和1個拷貝的PSMA288—297類似物 (GLPSIPVHPV; sans serif黑體；SEQ ID NO:7)。在PRAME425.433和
PSMA288.297表位序列之間是短氨基酸序列，其被指定為"切割輔助序列"， 以促進表位的加工和釋放。因此，這兩種表位以這樣一種方式編碼，以致
它們可以由pAPCs表達、加工和呈遞。
關于RP12質粒的其它詳細內容在2005年6月17日提交的美國臨時 專利申請No. 60/691,579中公開，其題目為METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES, EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA (激發(fā)針對在癌細胞和腫瘤 基質上表達的顯性和亞顯性表位的多價免疫應答的方法和組合物)，其通 過引用完全結合于此。應用如用于RP8和RP12的方法以相似的方式構建 所有其它的質粒。質粒R2，還叫做pCTLR2，在實施例中公開。在圖1
和3中顯示的P2質粒是單價PSMA質粒。RP5質粒包含來自P2和R2 二 者的元件。
在本領域中己經充分建立用于構建或者設計質粒的許多方法，并且本 領域的技術人員應該已知這些方法。所述方法在許多參考文獻中描述，諸 如，例如，Molecular Cloning(分子克隆)，Sambrook J和Russell D. W., CSHL Press, (2001),其通過引用特意結合于此。
在構建編碼本發(fā)明的多肽表位的核酸時，可以使用相關的腫瘤相關抗 原(例如，PRAME和PSMA)的基因序列，或者所述多聚核苷酸可以由 任意相對應的密碼子組裝。對于IO個氨基酸的表位，這可以組成106數(shù) 量級的不同序列，這取決于具體的氨基酸組成。盡管很大，但是這是一種 代表這一長度的>1018個可能的多核苷酸的少部分的清楚而易于定義的設 置，并且因此在一些實施方案中，本文公開的具體序列的等價物包括在所 列出的序列之上的這種清楚而易于定義的變異。在選擇這些序列的具體的 一種用于疫苗時，可以使用諸如密碼子應用、自我-互補性、限制性位點、 化學穩(wěn)定性等的考慮，這對于本領域的技術人員應該是顯而易見的。
本發(fā)明中考慮的表位簇是一種多肽、或編碼其的核酸序列，其為包含 兩個或多個對于共有MHC限制型元件有結合親和性的已知的或預測的表 位的天然蛋白序列的片段，其中所述簇內表位的密度大于所有對于在完整 的蛋白序列之內的共有MHC限制型元件有結合親和性的已知的或預測的 表位的密度。表位簇及其應用在美國專利申請公布Nos. 20030220239， 20050221440, 20050142144; 20030215425, 20030228634, 20040132088, 20040203051和PCT專利申請公布No. PCT/US/11101中描述；所有這些 都通過引用完全結合于此。
用于本發(fā)明的底物或釋放序列是一種設計的或工程化的序列，其包含 或者編碼包埋在一種較大序列中的PRAME和/或PSMA表位，所述較大 序列提供允許PRAME和/或PSMA表位通過直接或與N-端剪切或其它處 理結合的免疫蛋白體處理而被釋放的情形。
下述是可以用于一些實施方案的所編碼的多肽序列的其它實例，例 如，它們可以通過許多質粒編碼或者用于所述方法，等等。PVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI
RP9
VPLESYEDIHGTLHLERIAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPC HCGDRTFYD PEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFG麗K
PVHPVKRPSVKRGLPSIPVHPV RP10
RLAYLHARLRELLCELGMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNL
EAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPVKRGLPSIPVHPVKRPSVKRGLP SIPVHPV
RP11
MKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLI3LSNLTHVLYPVPLESYEDI HGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFTOPEPILCPCF MPNKLNLLHETDSAVATARKPRWLCAGALVLAGGEFLLGELFGWFIKSAQLAGA KGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANE
KRGLPSIPVHPIERPSIKRGLPSIPVHPV
MKRSLLQHLIGLERPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGISNLTHVLYPVPLESYEDI HG1XHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCF
YAYRRGIAEAVGLPSIPVHPVLVGLPSIPVHPVKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHH KRPSIKRGLPSIPVHPV
VHPIKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI
II.本發(fā)明的免疫原性組合物
本發(fā)明考慮由癌細胞和由新生脈管系統(tǒng)表達的多種分子作為通過主 動免疫治療法治療癌癥中的治療靶點的應用。所述分子包括腫瘤-相關抗
原(TuAAs)，其為由癌細胞本身表達的抗原或者與腫瘤的非癌成分諸如腫 瘤-相關的新生脈管系統(tǒng)或其它基質相關的抗原。確定TuAA表達圖表可 以幫助使患者的癌癥狀況或類型與適當?shù)拿庖咧委焺┗蚍桨赶嗥ヅ?。在?體的實施方案中，腫瘤相關抗原PRAME和PSMA的表位用于設計二價 質粒，所述二價質?？梢栽谑┯盟鲑|粒作為癌癥治療劑的受試者中激發(fā) 強免疫應答。PRAME和PSMA的交叉-反應類似物也在本發(fā)明的實施方 案中得以考慮。
本發(fā)明所應用的腫瘤相關抗原PRAME還叫作MAPE、 DAGE和 OIP4。 PRAME在本領域內叫作睪丸癌(CT)抗原。然而，與許多CT抗原 不同，諸如MAGE、 GAGE禾卩BAGE，它在急性骨髓白血病中表達。 PRAME作為TuAA在美國專利No. 5,830,753中公開，其通過引用完全結 合于此。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供PRAME的表位及其類似物。
本發(fā)明所應用的另一種TuAA是前列腺-特異性膜抗原(PSMA)。發(fā)現(xiàn) PSMA在前列腺癌細胞中高度表達。然而，在正常的前列腺上皮細胞中以 及在非前列腺腫瘤的新生脈管系統(tǒng)中也注意到PSMA的表達。PSMA作 為一種抗-新生脈管系統(tǒng)制劑在美國臨時專利申請No. 60/274,063、與美國 專利公布申請Nos. 20030046714和20050260234中公開；每一 申請通過弓I 用完全結合于此。PSMA作為TuAA在美國專利No. 5,538,866中描述， 其通過引用完全結合于此。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供PSMA的 表位及其類似物。
當用于本文時，交叉-反應性類似物可以指，與天然肽序列相比，一 種包含1一3個氨基酸取代、和/或一個氨基酸刪除或添加的肽，其誘導區(qū) 別于背景、區(qū)別于與天然肽反應的CTL的效應器功能(例如，細胞溶解 或細胞因子分泌)。在優(yōu)選的實施方案中，效應器功能為由天然肽誘導的 功能的至少30, 50, 60, 70或80%。
在本發(fā)明的一些實施方案中，包含PRAME和PSMA的天然序列或(交 叉-反應的)類似物的肽還可以作為與本發(fā)明的質粒結合的肽加強而施用。
PRAME禾卩PSMA的天然肽序列和肽類似物在美國專利申請No. 20060057673和美國臨時專利申請No. 60/691,889中公開，每一申請通過 引用完全結合于此。肽類似物，PRAME425.433 L426Nva， L433Nle和 PSMA288.297 1297V在下述中描述美國臨時申請No. 60/580,962;美國專 禾U申請No. 11/155,929;美國臨時申請No. 60/581,001;美國專利申請No. 11/156,253;美國專利申請No. 11/156,369，題目為PRAME PEPTIDE ANALOGUES (PRAME肽類似物)(Atty Docket No. MANNK.052A)的美
國臨時專利申請No. 60/691,889,美國專利申請No. —/_,題目為
PSMA PEPTIDE ANALOGUES (PSMA肽類似物)(Atty Docket No.
MANNK.052A2)的美國專利申請No. _/_，以及題目為MELANOMA
ANTIGEN PETIDE ANALOGUES (黑素瘤抗原肽)(Atty Docket No.
MANNK.052A3)的美國專利申請No. —/_,每一申請通過引用完全結
合于此。
如上文所討論， 一些實施方案涉及用于治療癌癥的免疫原性組合物， 所述組合物包含編碼PRAME和PSMA的CTL表位及其交叉類似物的質 粒。所述免疫原性組合物可以激發(fā)充沛(robust)或強的細胞-介導的免疫 應答，以靶向具體的癌癥由此消除、根治或者減輕受試者的癌癥。
III.對于施用的導引-和-增強治療
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述組 合物包含編碼CTL表位PRAME425.433和PSMA288.297、或者這些表位中的 任一種或二者的交叉-反應類似物的核酸構建體。在本發(fā)明的一些實施方 案中，可以應用質粒致敏/肽加強方法，其中表達PRAME和PSMA表位 的重組DNA質?？梢耘c合成肽諸如PRAME禾口/或PSMA肽或其類似物聯(lián) 合施用。
按照一種最優(yōu)化的免疫時間表，包含編碼CTL表位PRAME425.433和 PSMA288.297、或者這些表位中的任一種或二者的交叉-反應類似物的核酸 構建體的本發(fā)明的免疫原性組合物，可以通過淋巴結注射直接遞送到器官 中，在所述器官中激發(fā)并且增強免疫應答。本發(fā)明的實施方案可以對具有 表達HLA-A2、特別是HLA-AM201的腫瘤組織的患者實行。因此，可以施用包含一種質粒和一種或多種肽及其類似物的免疫原性組合物，用于治 療受試者中的癌癥。本發(fā)明公開的實施方案涉及用于癌癥的導引-和-增強 治療，所述治療可以用于獲得二價或多價攻擊，提供增強腫瘤對攻擊的敏 感性的優(yōu)點。
因此，在具體的實施方案中，本發(fā)明提供用于癌癥治療的二價導引-和-增強治療。所述二價治療可以靶向腫瘤細胞上多于一個的抗原。在靶 向腫瘤細胞上多于一個抗原的情形中，因此增加抗腫瘤治療的有效濃度。 對與腫瘤相關的基質諸如脈管系統(tǒng)的攻擊，可以增加腫瘤細胞對靶向它們 的試劑的可接近性。因此，如果在二價或多價攻擊中待靶向的其余抗原也 不是由所述組織表達，那么甚至還在某些正常組織上表達的抗原可以受到 更多的考慮。本發(fā)明的質粒可以與表達其它表位的其它的質粒以及相對應 的增強肽聯(lián)合使用，以產生更高效價的治療流程。示例性的免疫原性產物 在下述中公開于2005年6月17日提交的美國臨時專利申請No.
60/691,581 ，和于恰好在本申請的日期提交的美國專利申請No.一/— (Atty. Docket No. MANNK.054A)， 每 一 申請題目為 MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR
CARCINOMA (用于癌癥的多價導引-和-增強免疫治療)，并且每一申請 通過引用完全結合。
當在本發(fā)明中考慮時，"導引"免疫原在許多實施方案中包括賦予T 細胞的誘導系的免疫特性的特別的穩(wěn)定性的誘導。
當在本發(fā)明中考慮時，關于T細胞應答的術語"加強或者增強"在許 多實施方案中包括增加細胞數(shù)目、活化的細胞數(shù)目、活性水平、增殖速率、 或參與特異的應答的T細胞的類似參數(shù)的過程。
本發(fā)明所用的導引-和-增強流程在下述中更詳細地描述美國專利公 布No. 20050079152,美國臨時專利申請No. 60/640,402,和美國專利申請 No. 11/323,572，每一題目為"METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES (用于預防或治療目的而激發(fā)、增強并且維持針對I類MHC-限制型表位的免疫應答的方法)"，其通過引用完全結合于此。
IV. 生物應答調節(jié)劑(BRMs)或免疫增強劑
在一些實施方案中，本發(fā)明還可以使用一種生物應答調節(jié)劑(BRM) 或免疫增強劑與包含編碼CTL表位PRAME和PSMA的重組DNA質粒 的免疫原性組合物聯(lián)合，用于激發(fā)免疫應答。本發(fā)明考慮的免疫增強劑或 BRMs可以以免疫抑制或免疫刺激性方式作用，以介導免疫應答。本發(fā)明 的免疫增強劑或BRMs可以是指通過除了與抗原受體之外的相互作用而 調節(jié)免疫系統(tǒng)或其細胞的活性的任何分子。當在本發(fā)明中考慮時，BRMs 還可以包括通過刺激先天免疫途徑而行使免疫調節(jié)作用的天然的或合成 的小有機分子。
在具體的實施方案中，本發(fā)明還考慮免疫增強劑或BRMs，其可以包 括但不限于，例如細胞因子諸如IL-12, IL-18, GM-CSF, flt3配體(flt3L)， 干擾素、TNF-a等；趨化因子諸如IL-8, MIP-3a， MIP-la， MCP-l, MCP-3, RANTES等。可以用于本發(fā)明的BRMs的其它實例是引起細胞因子或趨 化因子生產的分子，諸如關于Toll-樣受體(TLRs)的配體，肽聚糖、LPS 或類似物、未甲基化的CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODNs); dsRNAs諸如在 APC和先天免疫細胞上的細菌dsDNA (其包含CpG基序)以及合成的 dsRNA (polyl:C)，其分別結合TLR9和TLR3。 一類BRM包括大多數(shù)的 小的有機天然的或合成的分子，其通過剌激先天免疫途徑而行使免疫調節(jié) 作用。因此，可以使用結合TLRs的小分子，諸如新一代純合成的抗病毒 咪唑并喹啉，例如，咪喹莫特和瑞喹莫德，己經發(fā)現(xiàn)其通過結合TLRs 7 和8而刺激免疫性的細胞途徑(Hemmi，H.等,A^/www朋/ f房^^資學J 3: 196-200, 2002; Dummer,R.等，Z)ermato/ogy f^^^^瘋學J 207:116-118, 2003;其分別通過引用完全結合于此)。BRMs還可以包括激活pAPC或T 細胞的免疫增強佐劑，包括，例如內吞-模式的識別受體(PRR)配體、皂 樹皂苷、妥卡雷瑣等。
V. 遞送本發(fā)明的組合物的方法
在本發(fā)明中，包含編碼CTL表位PRAME和PSMA的重組DNA質
粒的免疫原性組合物或者所述質粒然后通過一種或多種肽作為一次或多 次加強的優(yōu)選的施用通過淋巴結注射進行。其它免疫流程，例如，使用質 粒用于除了初始給藥之外，取決于質粒本身，或者使用其它類型的增強試 劑，盡管是較不優(yōu)選的實施方案，但是并不從本發(fā)明的范圍中排除。本發(fā)
明的實施方案包括表達兩種免疫原PRAME和PSMA的二價質粒。在將
本發(fā)明的免疫原性組合物遞送到需要其的受試者中時，優(yōu)選淋巴結注射， 原因在于，它允許直接遞送到器官，在所述器官中，按照最優(yōu)化的免疫時 間表，激發(fā)并且增強免疫應答。
為了將所述免疫原性組合物引入到患者的淋巴系統(tǒng)中，所述組合物優(yōu) 選地導向淋巴管、淋巴結、脾或淋巴系統(tǒng)的其它適當部分。在一些實施方 案中，每一成分作為大丸劑施用。在其它實施方案中， 一種或多種成分通 過輸注遞送，通常持續(xù)幾個小時到幾天。優(yōu)選地，將所述組合物導向淋巴 結，諸如腹股溝或腋下淋巴結，通過向淋巴結中插入導管或針并且在整個 遞送過程中保持所述導管或針而進行。適當?shù)尼樆驅Ч芸捎媒饘倩蛩芰?br> (例如，聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯(PVC)、 TEFLON、聚乙烯等)制成。 例如，在將導管或針插入到腹股溝淋巴結時，在超聲波掃描控制下使用 Vialon Insyte W 套管和使用Tegaderm 透明包衣(TegadermTM， St. Paul, MN， USA)固定的24G3/4導管(Becton Dickinson, USA)，將腹股溝淋 巴結刺破。通常是有經驗的放射線學工作者進行這一步驟。導管頂端在腹 股溝淋巴結中的位置通過注射最小體積的鹽水而確定，注射的鹽水立即并 且明顯地增加淋巴結的大小。后一步驟允許證實頂端在結內。這一步驟可 以進行以保證頂端沒有從淋巴結滑出，并且可以在移植導管之后的許多天 重復進行。
本發(fā)明的治療組合物可以以與本領域的一名普通技術人員公知的標 準疫苗遞送流程一致的方式施用給患者。施用包含質粒和TuAAs PRAME 和PSMA的肽或肽類似物的本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，包括但不 限于，透皮的、節(jié)內的、節(jié)外、口服、靜脈內、皮內、肌內、腹膜內和粘 膜施用，通過注射或滴注或吸入遞送。激發(fā)CTL應答的一種特別有用的 疫苗遞送方法在澳大利亞專利No. 739189;題目皆為"A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE (誘導CTL應答的方法)"的美國專利Nos. 6,994,851和6,977,074中公開。
在將免疫原性組合物遞送或者施用給受試者時，可以考慮各種參數(shù)。 另外，可以使用劑量方案和免疫時間表。通常成分在治療組合物中的量將 隨患者到患者和隨抗原到抗原而不同，取決于如下因素，諸如抗原誘導 應答的活性；淋巴通過患者系統(tǒng)的流速；受試者的重量和年齡；治療的疾 病和/或病況的類型；疾病或病況的嚴重性；早先或并發(fā)的治療干涉；個 體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；需要保護的程度；施用方式等，所有這些 可以由操作者容易地確定。
一般地，所述治療組合物可以以從約1到約500微升/小時或約24到 約12000微升/天的速率遞送?？乖臐舛热绱?，以致在24小時過程中將 遞送約0.1微克到約10,000微克的抗原。所述流速基于下述知識每分鐘 大約約100到約1000微升的淋巴液流過成年人腹股溝淋巴結。目的是將 疫苗制劑在淋巴系統(tǒng)中的局部濃度最大化。關于患者的一定量的經驗研究 應該是必要的，以確定對于一種給定的疫苗制劑在人中最有效的輸注水 平。
在具體的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可以作為許多次連續(xù) 劑量而施用。所述劑量可以是獲得適當?shù)拿庖邞鹚枰?、 3、 4次或 更多次劑量。在本發(fā)明的其它實施方案中，預計免疫原性組合物的劑量將 在彼此約幾秒或幾分鐘內施用到右側或左側腹股溝淋巴結中。例如，質粒 (致敏)可以首先注射到右側淋巴結，然后在幾秒或幾分鐘內將第二質粒 注射到右側或左側腹股溝淋巴結。在其它情形中，可以施用表達一種或多 種免疫原的一種或多種質粒的組合。優(yōu)選在第一次注射到淋巴結后的后續(xù) 注射應該在第一次注射的約1, 2， 3, 4， 5， 6， 7, 8, 9， 10或更多分鐘之內但是 不大于約30,40, 50或60分鐘。類似的考慮應用到兩種肽分別施用到右側 和左側的淋巴結?？梢岳硐氲匾詭滋斓臅r間間隔施用本發(fā)明的免疫原性組 合物的劑量，其中在后續(xù)施用之間間隔幾天(1,2， 3， 4， 5, 6，或7或更多 天)。在其它情形中，對于本發(fā)明的組合物的后續(xù)施用可以理想地在初始 劑量施用之后約1， 2, 3或更多周內或約1， 2, 3或更多個月內通過兩側腹股 溝淋巴結注射而實行。
施用可以以與劑量制劑相容的任何方式，并且以治療有效的量進行。 本發(fā)明的免疫原性組合物的有效量或劑量是在待治療的受試者中提供理
想的應答所需要的量。
除了在本申請中己經公開的那些，下述申請通過全文引用清楚地結合 于此。使用所公開的類似物誘導、導引、維持、調節(jié)并且增強I類MHC-限制型T細胞應答，并且特別是針對抗原的效應器和記憶CTL應答的有 用的方法在下述中描述美國專利Nos. 6,994,851 (2/7/06)和6,977,074 (12/20/2005)， 二者題目皆為"A Method oflnducing a CTL Response (誘導 CTL應答的方法)"；于2003年6月17日提交的題目為"METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE (控制I 型MHC-限制型免疫應答的方法)"的美國臨時申請No. 60/479,393;和于 2004年12月29日提交的美國專利申請No. 10/871,707 (Pub. No. 2005 0079152)和臨時美國專利申請No. 60/640,402， 二者題目皆為"Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purpose (用于予頁防或治療目的而激 發(fā)、增強并且維持針對I類MHC-限制型表位的免疫應答的方法)"。類似 物可以用于研究以獲得另外最優(yōu)化的類似物。在下述中提供許多持家表 位于2002年4月4日提交的美國申請Nos. 10/117,937 (Pub. No. 20030220239 Al)，和10/657,022 (20040180354)，以及于2003年9月5日 提交的PCT申請No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO04022709A2);和 于2001年4月6日提交的美國臨時申請Nos. 60/282,211;于2001年11 月7日提交的60/337,017;于2002年3月7日提交的60/363,210;以及于 2002年9月5日提交的60/409,123;每一 申請題目為"Epitope Sequences (表位序列)"。類似物還可以用于這些申請中所述的各種模式中的任一 種。表位簇，其可能包含或包括瞬時類似物，在于2000年4月28日提交 的題目為EPITOPE CLUSTERS (表位簇)的美國專利申請No. 09/561,571 中公開并且更充分地定義。使用和遞送所述瞬時類似物的方法在美國專利 申請09/380,534和6977074 (于2005年12月20日授權)以及PCT申請No. PCTUS98/14289 (Pub. No. WO9902183A2)中描述，每一申請的題目皆為 "METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE (誘導CTL應答的方法)"。 用于所述免疫治療的有益表位選擇原則在下述中公開于2000年4月28 日提交的美國專利申請Nos. 09/560,465，于2001年12月7日提交的 10/026,066 (Pub. No. 20030215425 Al)，和于2001年11月7日提交的 10/005,905 ， 所有申請題目皆為"Epitope Synchronization in Antigen Presenting Cells (在抗原呈遞細胞中的表位同步性)";6, 861, 234 (01-3-2005授權；app. # 09/561,074 ),題目為"Method of Epitope Discovery
(表位發(fā)現(xiàn)的方法)"；09/561,571，于2000年4月28日提交，題目為 EPITOPE CLUSTERS(表位簇)；10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al),于 2002年3月7日提交，題目為"Anti-Neovasculature Preparations for Cancer
(用于癌癥的抗-新生脈管系統(tǒng)制備物)"；申請Nos. 10/117,937 (Pub. No. 20030220239 Al)和PCTUS02/11101 (Pub. No. WO02081646A2), 二者皆于 2002年4月4日提交，并且題目皆為"EPITOPE SEQUENCES (表位序列) ";禾P申請Nos. 10/657,022與PCT申請No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO04022709A2), 二者皆于2003年9月5日提交，并且題目皆為"EPITOPE SEQUENCES (表位序列)"。疫苗質粒總設計的方面在下述中公開于 2000年4月28日提交的題目為"Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens (編碼靶點-相關抗原的表位的表達載體)"的美 國專利申請Nos. 09/561,572，和于2002年11月7日提交的題目為 "Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design (編碼靶點-相關抗原的表位的表達載體以及它們 的設計方法)"的10/292,413 (Pub. No.20030228634 Al);于2002年8月 20日提交的10/225,568 (Pub No. 2003-0138808)，于2003年8月19日提交 的PCT申請No. PCT/US2003/026231 (Pub. No. WO 2004/018666)， 二者題 目皆為"EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS (編碼耙點-相關抗原的表位的表達載 體)"；以及題目為"AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION (在質粒增殖中避免不理 想的復制中間體)"的美國申請No. 6,709,844。在引導針對具體癌癥的免 疫應答中特別有益的特異性抗原的組合在下述中公開于2003年6月17
日提交的臨時美國專利申請No. 60/479,554，和于2004年6月17日提交 的美國專禾lj申請No. 10/871,708，以及PCT專禾U申請No. PCT/US2004/019571 (Pub. No. WO 2004/112825)，所有題目皆為 "Combinations of tumor-associated antigens in vaccines for various types of cancers (腫瘤-相關的抗原在用于各種類型的癌癥的疫苗中的組合)"。與 腫瘤新生脈管系統(tǒng)相關的抗原(例如，PSMA， VEGFR2, Tie-2)還用于與癌 癥疾病聯(lián)系，這在于2002年3月7日提交的題目為"Anti-Neovasculature Preparations for Cancer (用于癌癥的抗-新生脈管系統(tǒng)制備物)"的美國專 利申請No. 10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al)中公開。通過生物應答調 節(jié)劑的靶向施用而引發(fā)、維持和調節(jié)免疫應答的方法在于2004年12月 29日提交的美國臨時申請No. 60/640,727中公開。在誘導免疫應答時避 開CD4+細胞的方法在于2004年12月29日提交的美國臨時申請No. 60/640,821中公開。示例性的疾病、生物體和抗原以及與目標生物體、細 胞和疾病相關的表位在于2001年2月2日提交的題目為"METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE (誘導CTL應答的方法)"的美國申請No. 6977074 (于2005年12月20日授權)中描述。示例性的方法在于2004年 6月17日提交的美國臨時申請No. 60/580,969和于2006年1月12日公布 的美國專利申請No. 2006-0008468-A1中找至lj ， 二者題目皆為 "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS (腫瘤-相關的抗 原在各種類型的癌癥的診斷中的組合)"。方法和組合物還在于2004年 12月29曰提交的題目為"COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCAITED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCER (月中 瘤-相關的抗原在用于各種類型的癌癥的組合物中的組合)"的美國臨時申 請No. 60/640,598中公開。使用免疫方法包括使用瞬時類似物評估并且監(jiān) 測免疫應答性的診斷技術的結合在下述中更充分地討論于2004年6月 17日提交的臨時美國專利申請No. 60/580,964，和美國專利申請No. US-2005-0287068-A1 (于2005年12月29日公布)，二者題目皆為"Improved efficacy of active immunotherapy by integrating diagnostic with therapeutic methods (通過結合診斷和治療方法而提高主動免疫治療的功效)"。免疫 原性多肽編碼載體在下述中公開于2002年11月7日提交的題目為 Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design (編碼腫瘤-相關抗原的表位的表達載體以及它們
的設計方法)的美國專利申請No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al)， 和于2005年6月17日提交的題目為"Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes, expressed on cancer cells and tumor stroma (激發(fā)針對在癌細胞和腫瘤基質 上表達的顯性和亞顯性表位的多價免疫應答的方法和組合物)"的美國臨 時申請No. 60/691,579。其它有用的公開，包括相關的方法和組合物，在 于2005年6月17日提交的題目為"Multivalent Entrain-and-Amplify Immunotherapeutics for Carcinoma (用于癌癥的多價導引-和-增強免疫治 療)"的美國臨時申請No 60/691,581中找到。其它方法、組合物、肽和肽 類似物在皆于2004年6月17日提交并且題目分別為"SSX-2 PEPTIDE ANALOGS (SSX-2肽類似物)"和"NY-ESO PEPTIDE ANALOGS (NY-ESO 肽類似物)"的美國臨時申請Nos. 60/581,001和60/580,962中公開。在上 述段落中提及的每一申請和專利通過引用將其教導的全部完全結合于此。 其它類似物、肽和方法在下述中公開題目為"SSX-2 PEPTIDE ANALOGS (SSX-2肽類似物)"的美國專利申請公布No 20060063913;和于2006 年3月16日公布題目為"EPITOPE ANALOGS (表位類似物)"的美國專 利申請No.2006-0057673 Al;以及題目為"EPITOPE ANALOGS (表位類 似物)"的PCT申請公布No. WO/2006/009920;所有這些于2005年6月 17曰提交。其它方法和組合物在于2004年6月17日提交題目為"SSX-2 PEPTIDE ANALOGS (SSX-2肽類似物)"的美國臨時申請No. 60/581,001 和于2004年6月17日提交題目為"NY-ESOPEPTIDE ANALOGS(NY-ESO 肽類似物)"的美國臨時申請No. 60/580,962中公開；每一申請通過引用 完全結合于此。作為一個實例，但是不限于其，每一參考文獻通過引用結 合其關于I類MHC-限制型表位、類似物、類似物設計、表位和類似物的 應用、應用和制備表位的方法以及用于其表達的核酸載體的設計和應用的 教導。通過引用明確結合于此的其它申請為美國專利申請系列No. 11/156,253 (公布No. 20060063913),于2005年6月17日提交，題目為 "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS (SSX-2肽類似物)"；美國專利申請系列No. 11/155,929,于2005年6月17日提交，題目為"NY-ESO-l PEPTIDE ANALOGS (NY-ESO-1肽類似物)"(公布No. 20060094661);美國專利申
請系列No. 11/321,967,于2005年12月29日提交，題目為"METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIF正RS INTO LYMPHOID ORGANS (通過將生物應答調節(jié)劑耙點施 用到淋巴器官而引發(fā)、維持和處理免疫應答的方法)"；美國專利申請系 列No. 11/323,572,于2005年12月29日提交，題目為"METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE REPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES (用于預防或治療目的而激發(fā)、增強并且維持 針對I類MHC-限制型表位的免疫應答的方法)"；美國專利申請系列No. 11/323,520，于2005年12月29日提交，題目為"METHODS TO BYPASS
免疫應答中避開CD4+細胞的方法)"；美國專利申請系列No. 11/323,049, 于2005 年 12 月 29 日提交，題目為"COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS (腫瘤-相關的抗原在用于各種類型的癌癥的組合物 中的組合)"；美國專利申請系列No. 11,323,964,于2005年12月29日提 交，題目為"COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS (腫瘤-相關的抗原 在各種類型的癌癥的診斷中的組合)"；美國專利申請系列No. 60/691,889， 于2005年6月17日提交，題目為"EPITOPE ANALOGS (表位類似物)"。
VI.實施例
包括下述實例表明在設計包含那個激發(fā)二價免疫應答的PSMA和 PRAME的免疫原性表位的質粒中的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域的技 術人員應該理解，在下述實例中公開的方法代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的方法在本 發(fā)明的實踐中作用良好，并且因此可以考慮構成用于其實踐的優(yōu)選模式。 然而，按照本公開，本領域的技術人員應該理解，在公開的具體的實施方 案中可以進行許多變化，并且仍然獲得同樣的或相似的結果，而不背離本 發(fā)明的精神和范圍。
實施例1 設計編碼免疫原的質粒表達載體
質粒P2和R2 (還叫做pCTLR2)分別包含來自PSMA (在寬范圍的 癌癥新生脈管系統(tǒng)上或由前列腺癌細胞表達)和PRAME (由癌細胞表達) 的元件(圖1)。每一插入物包含抗原序列的片段以及由靶點細胞表達并 且通過免疫介導的攻擊可接近的多拷貝的表位。側連這些表位的是編碼已 知促進表位肽在細胞區(qū)室中的處理和產生的氨基酸的序列。另外，質粒 RP5包含來自P2和R2二者的元件，表達的免疫原彼此連接。
R2質粒按照上文所討論以及在下述中公開的質粒構建流程進行構 建于2005年6月17日提交題目為EPITOPE ANALOGS (表位類似物) 的美國臨時專利申請No. 60/691,889;和題目為PRAME EPITOPE
ANALOGS (PRAME表位類似物)的美國專利申請No. _/_ (Atty.
Docket No. MANNK.052A),其通過引用完全結合于此。R2,還叫作 pCTLR2，是一種重組DNA質粒疫苗，其編碼具有來自PRAME的HLA A2-特異性CTL表位SLLQHLIGL,氨基酸殘基425-433 ，和PRAME的 表位簇區(qū)域氨基酸422-509的一種多肽。在構建這一質粒時，在質粒中 編碼所述多肽的DNA序列置于來自巨細胞病毒的啟動子/增強子序列 (CMVp)的控制下，當被抗原呈遞細胞攝取時，其允許所述多肽的信使的 有效轉錄。在所述編碼序列3'末端的牛生長素多腺苷化信號(BGHpolyA) 為所述信使提供多腺苷化信號，以增強其穩(wěn)定性以及從核移動出來到細胞 質中。為了促進質粒轉運到核中，將來自猿猴病毒40的核輸入序列(NIS) 插入到所述質粒骨架中。將一個拷貝的CpG免疫刺激性基序加工到所述 質粒中以進一步加強免疫應答。另外，所述質粒中的兩個原核遺傳元件負 責在大腸桿菌中的擴增，卡那霉素抗性基因(KanR)和復制的pMB細菌起 點。
R2 (pCTLR2)的編碼的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)在長度上是
150個氨基酸殘基，顯示如下
malqsIlqhliglsnlthvIypvpIesyedihgtlMerlaylharlrellcelgrpsmvwlsanpcp hcgdrtfydpepilcpcfoipnJasIlqhliglgdaaysUqhligl^; eyi:ee^yz.asllqhliglkrpsikrsllqhligl 氨基酸殘基2-89對應代表PRAME422-509的表位簇區(qū)域。在這一表位 簇區(qū)域內，使用多種表位預測運算法則己經找到許多潛在的HLAA2-特異 性CTL表位。氨基酸殘基90-150是具有4個嵌入拷貝的PRAME425-433 CTL 表位(黑體)的表位釋放(synchrotopetm)序列。側鏈確定的PRAME CTL 表位的是短氨基酸序列，己經表明其在PRAME CTL表位的加工中起重要 作用。另外，將氨基酸序列ISPEKEEQYIA(SEQIDNO:—;對應PRAME 氨基酸276-286， /斜/^)加工到這一串珠區(qū)域，以促進所編碼的多肽表達的 基于抗體的檢測。
實施例2
工程化的免疫原性元件的顯性/亞顯性層次
進行研究，以評估將來自不同抗原的元件加工到同一表達載體中的策 略是否在這些元件中產生顯性/亞顯性層次。
將4組HHD轉基因小鼠用質粒P2、 R2、 RP5或P2和R2質粒的混 合物免疫，通過在第l、 4、 15和18天對每一淋巴結將在25pl PBS中的 25嗎/質粒直接接種到腹股溝淋巴結而進行。加強后IO天，用PRAME425-433 或PSMA，.，肽先體外后體內刺激脾細胞，并且在不同的效應器針對靶 點細胞比例(E: T比例)下針對"Cr-標記的肽包被的-T2細胞進行檢測。
簡要地，將在其表面上表達抗原的靶點細胞用鉻的放射性同位素 (s'Cr)標記。然后將脾細胞與靶點細胞混和，并且溫育幾個小時。溫育
后，收集上清，并且使用Y計數(shù)器在一式三份樣品中檢測細胞溶解活性。 表達抗原的細胞的裂解將510釋放到培養(yǎng)基中。通過比較在存在或不存在
效應器細胞時表達目的抗原或對照抗原的靶點細胞的裂解(即，鉻釋放)， 計算細胞-特異性裂解，并且通常表示為％特異性裂解。
使用每一重復的孔的平均cpm，計算對于效應器細胞的每一濃度的校 正的裂解百分數(shù)(圖2)。使用下式計算特異性裂解百分數(shù)釋放百分數(shù) =100X (實驗釋放一自發(fā)釋放)/ (最大釋放一自發(fā)釋放)。數(shù)據(jù)描述如 下x-軸顯示效應器對靶點的比例；y-軸顯示對應的特異性裂解百分數(shù)。 結果表示為％特異性細胞毒性(質粒R2還叫作CTLR2)。
結果顯示P2和R2分別激發(fā)顯著的細胞毒性免疫應答。然而，當將
P2和R2免疫原結合在RP5質粒內時，針對PRAME表位的免疫性保留， 而針對PSMA288.，表位的應答失去。這表明，從免疫學觀點看來，在這 兩種表位之間建立了層次。將P2和R2質?；旌突謴投r免疫性。
其它質粒的結構
為了設計導致更加平衡的針對PRAME和PSMA兩種表位的免疫性 (在RP5背景中的顯性和亞顯性)的表達載體，設計一套免疫原，并且 通過應用下述三種方法的各種組合而結合到同一質粒骨架中
1) 調整PRAME425—433 (顯性)表位的拷貝數(shù)和PSMA288—297 (亞顯性)表 位的拷貝數(shù)之間的比例，使之有利于后者。
2) 將較少顯性的表位置于C端位置，以便其不依賴于蛋白體加工而 具有正確的C-端。
3) 將較少顯性的表位(PSMA)突變(在表達的插入物內的一個或多 個拷貝)，以提高固有的免疫原性特性，諸如與I類MHC結合和在I類 MHC上的半衰期。
圖3顯示制備的各種質粒的設計圖案。在圖3中，"V"對應攜帶I297V
突變的PSMA嵐—297表位。
實施例4
通過包含來自不同抗原的表位的質粒實現(xiàn)二價應答的誘導
檢測按照上述實施例3中所述設計的質粒，以確定它們引發(fā)針對
PRAME425-433和PSMA288-297腫瘤相關抗原的二價免疫應答的能力。
將6組HHD轉基因小鼠(『8/組訴攜帶圖3所示的插入物的質粒(RP8: RP9, RP10, RP11, RP12,或RP13)免疫，通過在第1和第4天對每一淋巴 結將在25^1 PBS中的25嗎(質粒)直接接種到腹股溝淋巴結而進行。最 后一次質粒注射后7天，在第11天，將所有免疫動物處死，包括5只首 次用于實驗的對照。通過檢測IFN-Y生成斑點形成群落(SFC)的頻率而進行 ELISPOT分析，如下述。
簡要地，在第11天將脾從處死的動物分離，并且在密度離心后
(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs， Burlington, NC)，將單核細胞重懸在 HL-1培養(yǎng)基中。將脾細胞(每孔5X1()S個或2.5X1()S個細胞)與10嗎 PSMA288.297或PRAME425-433 ，天然肽在96孔濾膜平板(Multi-screen IP membrane 96-well plate, Millipore, MA)的三個復孔中溫育。在顯色之前， 將樣品在37'C 5%(:02和100%濕度溫育42小時。在與脾細胞一起溫育之 前，小鼠IFN-y包被的抗體(IFN-y抗體對，U-CyTech Biosciences, The Netherlands)用作包被劑，然后伴隨生物素酰化的檢測抗體。GABA綴合 物和U-CyTech Biosciences的有產權的物質用于IFN^斑點顯色。使用校 準用于IFN-y斑點分析的ELISpot斑點讀取軟件版本3.2.3，在AID國際 平板讀取儀上顯色后24小時檢測免疫動物中的CTL應答。
圖4顯示的結果表示對每一實驗組的平均IFN-Y斑點計數(shù)。數(shù)據(jù)表示 為每次處理IFN-y斑點(代表IFN-Y分泌細胞的群落)的頻率，表示為個 體動物應答的平均值+/-標準偏差(Std)。從免疫的或首次用于實驗的小
鼠分離并且用PSMA288.297天然肽刺激的脾細胞而產生的數(shù)據(jù)表明，與首
次用于實驗的對照(12.8 + 2.4 IFN-y斑點)或其它處理組相比較，RP12 誘導針對PSMA，.，抗原的最強的免疫性(55.8+/- 1.6 IFN-y斑點)。這 代表使用RP12質粒的5-倍增強的PSMA免疫應答。
另外，從免疫的或首次用于實驗的小鼠分離并且用PRAME425.433天然 肽刺激的脾細胞而產生的數(shù)據(jù)也表明，與首次用于實驗的對照(8.5 + 2.8 IFN-y斑點)或其它處理組相比較，用RP12免疫的動物表現(xiàn)出針對 PRAME425.433抗原的最強的免疫應答(234.5 + 3.7 IFN-y斑點)。這代表使 用RP12質粒大于20-倍增強的PRAME免疫應答。
綜上所述，圖4所示的結果顯示質粒RP12誘導針對PRAME和PSMA 表位的強二價免疫性。使用RP9，觀察到一些針對PRAME和PSMA表位 的二價免疫性，并且對于RP13、 RP10、 RP11和RP8，觀察到更小程度的 二價免疫性一一與質粒RP5(圖2)相比，所有這些質粒具有相對于PRAME 表位更有力的PSMA表位表現(xiàn)性。部分由于使用PSMA的I297V類似物， 所以這一觀察顯而易見。
實施例5 RP12質粒誘導二價應答
基于實施例4中6種質粒(RP8， RP9, RP10, RP11, RP12和RP13)的比 較，由于RP12是引發(fā)針對PRAME425-433和PSMA288.297 二者的強二價免疫 應答的唯一質粒，所以選擇RP12用于進一步分析。
將2只代表性HHD轉基因小鼠用攜帶插入物的RP12質粒(圖3所 示)免疫，通過在第l、 4、 15和18天對每一淋巴結將在25pl PBS中的 25嗎(質粒)直接接種到腹股溝淋巴結而進行。最后一次質粒注射后10 天，通過外周血單核細胞的四聚體染色和關于CD8表達的共染色而檢測 PRAME和PSMA表位-特異性CD8+T細胞的頻率。
簡要地，密度離心(Lympholyte Mammal， Cedarlane Labs)后將單核細胞 從外周血分離，并且用HLA-A*0201 PRAME MHC四聚體(Beckman Coulter, T02001)和HLA-A*0201 PSMA MHC四聚體(Beckman Coulter, T02001)染色。然后將這些細胞用FITC綴合的大鼠抗-小鼠CD8a (Ly-2) 單克隆抗體(BD Biosciences, 553031)共染色。使用BD FACS Calibur流式 細胞儀收集數(shù)據(jù)，并且使用Cdlquest軟件分析數(shù)據(jù)，通過控制(gating on) 淋巴細胞群體并且計算CD8+ CTL群體中四聚體陽性細胞的百分數(shù)而進 行。
圖5所示的結果表明，節(jié)內質粒免疫后，RP12質粒激發(fā)雙免疫性， 并且PRAME425.433特異性T細胞的頻率比對PSMA亞顯性表位特異的T 細胞的頻率高出幾倍。
實施例6
在用PRAME和PSMA質粒致敏并且用肽加強的小鼠中的二價免疫應答 為了確定使用質粒RP12和RP8是否能夠誘導針對腫瘤相關抗原
Prame425-43jn PSMA288.297的二價應答，在用PSMA288_297 I297V類似物進
行肽加強后，進行免疫動物的四聚體分析。
將HHD轉基因小鼠用圖3所示攜帶插入物的RP8或RP12質粒免疫，
通過在第1、 4、 15和18天對每一淋巴結將在25^1 PBS中的lOO^ig (質
粒)直接接種到腹股溝淋巴結而進行。在第29和32天，將小鼠用25呢
PSMA肌297肽類似物(I297V)加強。在開始肽加強前一天和完成質粒加
強后10天，通過四聚體染色(如上述)檢測PRAME和PSMA表位-特異 性T細胞的頻率，并且與在最后一次肽加強后7天的四聚體結果進行比較。
顯示在圖6A中的結果，表示為特異性CD8+ T細胞頻率的平均值士 SEM，表明在肽加強之前RP12質粒激發(fā)比RP8稍高的PSMA-特異性免 疫性。另外，在RP12和RP8的兩種情形中，發(fā)現(xiàn)在肽加強前針對PRAME 的免疫性是顯性的。然而，在使用PSMA亞顯性表位加強后，針對PRAME 和PSMA的免疫應答表現(xiàn)出更平衡的性質，特別在RP12的情形中，這表 現(xiàn)出激發(fā)針對不同免疫層次的表位的平衡的免疫應答的策略的優(yōu)點。
圖6B顯示在來自每組的3只代表性小鼠中的針對PRAME和PSMA 的免疫應答，并且進一步舉例說明由RP12質粒和PSMA(I297V)肽加強激 發(fā)的增強的二價應答。
實施例7
在PSMA肽加強及隨后的PRAME肽加強后的二價免疫應答 檢驗使用質粒RP12和RP8免疫在用PSMA288—2^1297V類似物第一次 肽加強和用Prame425—433 L426Nva， L433Nle肽類似物第二次加強后是否能 誘導針對Prame425—433和PSMA肌297表位那些腫瘤相關抗原的二價應答。
通過在第1、 4、 15和18天直接接種到腹股溝淋巴結而4次注射RP8 或RP12質粒(4mg/ml)將小鼠免疫。在第29天和32天，將小鼠用 PSMA288.297 I297V肽類似物(0.5mg/ml)加強，隨后在第42和59天分別用 0.5mg/ml和0.05mg/ml的Prame425-433 L426Nva, L433Nle肽類似物第二次 加強。將小鼠處死，并且如下進行ELISP0T分析(圖7)。
簡要地，在最后一次Prame425.433 L426Nva,L433Nle肽注射后10天， 將脾從處死的動物分離，并且在密度離心(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs， Burlington, NC)后，將單核細胞重懸在HL-1培養(yǎng)基中。將脾細胞(每 孔2X 105個細胞)與IO嗎PSMA，-297或PRAME425-433 ，天然肽在96孔 濾膜平板(Multi-screen IP membrane 96-well plate, Millipore, MA)的三個復 孔中溫育。在顯色之前，將樣品在37。C 5%(302和100%濕度溫育72小時。 在與脾細胞一起溫育之前，小鼠IFN-Y包被的抗體(IFN-Y抗體對，U-CyTech
Biosciences, The Netherlands)用作包被劑，然后伴隨生物素?；臋z測抗 體。GABA綴合物和來自U-CyTech Biosciences的各種物質用于IFN-y斑 點顯色。使用校準用于IFN-Y斑點分析的ELISpot斑點讀取軟件版本3.2,3， 在AID國際平板讀取儀上顯色后24小時檢測免疫動物中的CTL應答。
結果表明，在所有檢測劑量，RP12質粒激發(fā)比RP8更高的PSMA-特異性免疫性。對于RP12和RP8兩種質粒，發(fā)現(xiàn)針對PRAME的免疫性 在所有檢測的劑量都是顯性的。此外，在用PSMA和PRAME表位加強 后，RP12質粒表現(xiàn)出針對PRAME和PSMA的強平衡的免疫應答。
權利要求
1.一種編碼多肽或交叉-反應類似物的核酸構建體，所述多肽包含一個或多個拷貝的CTL表位PSMA288-297(SEQ ID NO6)和一個或多個拷貝的CTL表位PRAME425-433(SEQ ID NO5)，所述或交叉-反應類似物含有一種或兩種所述表位的1-3個取代，其中所述多肽不包含完整的抗原。
2. 權利要求1的核酸構建體，其中一種或兩種表位在釋放序列內編碼。
3. 權利要求1的核酸構建體，其中所述多肽還包含編碼一個或多個 表位簇的序列。
4. 權利要求3的核酸構建體，其包含PRAME表位簇。
5. 權利要求4的核酸構建體，其中所述表位簇是PRAME的氨基酸 422-509。
6. 權利要求3的核酸構建體，其包含PSMA表位簇。
7. 權利要求6的核酸構建體，其中所述一個或多個表位簇選自由 PSMA的氨基酸3-45和217-297組成的組。
8. 權利要求l的核酸構建體，其中PSMA表位類似物包含I297V取代。
9. 權利要求1的核酸構建體，其還包含核輸入序列。
10. 權利要求1的核酸構建體，其還包含啟動子。
11. 權利要求10的核酸構建體，其中所述啟動子是巨細胞病毒(CMV)啟動子。
12. 權利要求1的核酸構建體，其還包含poly-A序列。
13. 權利要求1的核酸構建體，其還包含一種或多種CpG免疫刺激 性基序。
14. 權利要求2的核酸構建體，其中所述PRAME和PSMA兩種表 位的釋放序列位于所編碼的多肽的N-端部分。
15. 權利要求14的核酸構建體，其中所編碼的多肽是SEQIDNO:2。
16. 權利要求2的核酸構建體，其中所述PRAME和PSMA兩種表位的釋放序列位于所編碼的多肽的c-端部分。
17. 權利要求16的核酸構建體，其中所編碼的多肽是SEQIDNO:4。
18. —種包含權利要求1的核酸構建體的免疫原性組合物。
19. 一種治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括施用治療有效量 的權利要求1的核酸構建體的步驟。
20. 權利要求19的方法，其中所述核酸構建體節(jié)內施用。
21. 權利要求19的方法，其中所述個體患有在贅生性細胞或腫瘤-相 關的新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA、或二者的癌癥。
22. —種治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括步驟 施用有效量的權利要求1的核酸構建體，以誘導免疫應答；并且通過用至少一種與由所述核酸構建體編碼的表位相對應的肽類似物加強 而增強所述免疫應答。
23. 權利要求22的方法，其中所述個體患有在癌細胞表達PRAME 并且在腫瘤-相關的脈管細胞上表達PSMA的癌癥。
24. 權利要求22的方法，其中所述個體患有在贅生性細胞或腫瘤-相 關的新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA、或二者的癌癥。
25. 權利要求1-17中任一項的核酸構建體用于制備治療患有癌癥的 個體的藥物中的應用。
26. 權利要求26的應用，其中所述藥物用于治療患有癌癥的個體， 其通過節(jié)內施用所述藥物進行。
27. 權利要求26-27任一項的應用，其中所述個體患有在贅生性細胞 或腫瘤-相關的新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA、或二者的癌癥。
28. 權利要求18的免疫原性組合物在制備用于治療患有癌癥的個體 的藥物中的應用。
29. 權利要求28的應用，其中所述藥物用于治療患有癌癥的個體， 其通過節(jié)內施用所述藥物進行。
30. 權利要求28-29任一項的應用，其中所述個體患有在贅生性細胞 或腫瘤-相關的新生脈管系統(tǒng)細胞中表達PRAME、 PSMA、或二者的癌癥。
31. 按照權利要求1-17中任一項的核酸在制備用于誘導耙向腫瘤相 關的新生脈管系統(tǒng)的免疫應答的藥物中的應用。32.權利要求31的應用，其中所述腫瘤-相關的脈管細胞展示 PRAME。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療癌癥的方法，其通過給需要所述治療的受試者提供包含編碼多肽或交叉-反應類似物的核酸構建體的免疫原性組合物而進行，所述多肽包括CTL表位PSMA_288-297和PRAME_425-433。在本發(fā)明的實施方案中，提供用于誘導、導引、和/或增強針對癌癥抗原的I類MHC限制型表位的免疫應答而產生有效的抗-癌免疫應答的方法和組合物。
文檔編號C07K14/435GK101198620SQ200680021601
公開日2008年6月11日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權日2005年6月17日
發(fā)明者裘志勇, 阿德里安·博特 申請人:曼康公司