專利名稱：抗腫瘤特異性標志蛋白ts/medp的抗體制備及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多種細胞和分子生物學技術，包括細胞同步化技術、mRNA差 異顯示技術、RACE技術、原核表達蛋白質、RT-PCR、 mRNA原位雜交、多克隆 抗體制備、免疫化學、Western blot、流式細胞、RMi和動物實驗。 。
背景技術：
世界上與腫瘤相關的疾病中，胃癌占第二位，并且是亞洲人群中最常見的 惡性腫瘤，嚴重的危害著人類的健康。人們期望能闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制， 從而有效的預防和治療這一惡性腫瘤。盡管大量的研究證實胃癌的發(fā)生與多 種因素有關包括寸大食、環(huán)境以及細菌或病毒感染，如幽門螺旋桿菌的感染， 近年來分子機制研究發(fā)現(xiàn)眾多基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，如E-cadherin表達 的缺失、p53基因、TGF-0、 c-met、 erbB-2和RUNX3等，這些研究解釋了胃 癌部分發(fā)病機制，對于胃癌的詳細的分子發(fā)病機制我們還知之甚少。
與正常細胞相比，肺瘤細胞的最根本的特征之一就是細胞周期調(diào)控異常， 正常細胞向惡性細胞轉化過程中，多基因變異積累賦予了腫瘤細胞特有的功 能，如腫瘤細胞產(chǎn)生許多自身的生長因子，對于抑止細胞生長的信號不敏感， 逃避凋亡，具有無限的復制潛能，均能歸結到變異的基因導致細胞周期調(diào)控 異常，特別是細胞周期checkpoint異常，從而賦予腫瘤細胞失控性生長的特 性。盡管Cyclin和CDK的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)闡明了細胞周期的基本調(diào)控機制，對于 Gl-S期checkpoint也有了較多的了解，如P53、 P21、 GADD45、 TGF-p 、 P27、 P16、 Rb、 E2F參與G1-S期checkpoint的調(diào)控，但是距我們對于認識細胞周 期調(diào)控的詳細分子調(diào)控機制還甚遠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是綜合利用上述技術，需要找到參與與胃癌發(fā)生發(fā)展，并 且參與細胞周期調(diào)控的關鍵基因，從而闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一 步篩選到胃癌分子標志物及治療胃癌的分子耙點。此項研究將mRNA差異顯示 技術和細胞同步化技術結合，以胃癌細胞系BGC823為研究對象，獲得了一個
周期差異性表達基因，將其全長mRNA克隆并命名為7^/(/a5 ，提交至Genbank， 基因號為DQ150361, r5/M^戶基因編碼389aa蛋白質，分子量42. 3kd，生物軟 件預測包含多個砩酸化位點， 一個可與具有SH3 Domain的蛋白質結合脯氨酸 富集區(qū)， 一個與CC結構域，因此推測TS/MDEP基因具有重要的生物學功能。
基因差異性表達提示其具有特定的生物學功能，因此我們采用不同的技 術，在細胞和組織水平驗證了 7^/Jffi"尸基因的表達特征，此基因在14/17株 腫瘤細胞中表達，并且呈現(xiàn)周期特異性表達，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823 中表達最高，隨著細胞分裂的完成，其表達量逐漸降低。更重要的是在配對 的胃癌組織中表達，而正常胃粘膜中未見表達，還證實TS/MEDP基因在多種 細胞增殖旺盛的胚胎組織中表達，因此TS/MEDP基因在組織中具有如下表達 特征TS/MDEP在細胞增值旺盛的胚胎組織高表達，成年后組織細胞中此基 因被關閉，在腫瘤細胞中又出現(xiàn)高表達，符合癌基因的表達規(guī)律，因此75/#朋戶 基因是一個新的候選癌基因。
特別是在BGC823中RNAi干擾TS/MEDP基因后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變 化，細胞增殖受到明顯抑制，細胞集落形成能力和致瘤性顯著降低，并且干 擾后細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。這一結果表明TS/MEDP基因在參與細胞增殖調(diào)控 和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學功能。并且可能成為預測胃癌生物學 行為的分子標志物。
本發(fā)明的技術內(nèi)容是克隆了周期依賴性表達的新基因r5/yK57 P ( Tumor Specificity and Mitosis Phase-dependent Expression protein),提交到 Genebank接受號為DQ15(B61。通過合成多肽并與大分子蛋白質KLH連接后， 免疫新西蘭白兔，ELISA測定抗體滴度后，取兔血清，并用原核表達的TS/MDEP 蛋白質進行親和層析，細胞周期和腫瘤特異性表達，經(jīng)過純化制備了抗 TS/MEDP的特異性多克隆抗體。此抗體可以通過Western blot和免疫組織化學技術，檢測到TS/MEDP 蛋白的表達。
通過檢測基因的表達，發(fā)現(xiàn)其在細胞及組織中的表達規(guī)律，在細胞中呈 現(xiàn)周期特異性表達，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823中表達最高，隨著細胞分 裂的完成，其表達量逐漸降低，在組織中，TS/MDEP在細胞增值旺盛的胚胎 組織高表達，更重要的是，7^/(ffiZ 戶基因在胃癌組織中表達，而正常的胃粘
膜不表達。
進一步功能研究表明757^5ZW基因在細胞增殖中具有重要的作用并和細 胞分裂密切相關，在腫瘤腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學功能。因為細 胞周期調(diào)控異常是腫瘤細胞的根本特征，因此r5/^F"戶是一個候選癌基因。 利用我們制備的抗TS/MDEP的抗體可以對胃癌進行診斷，并且基于我們闡明 的此基因的功能，7^/1/gZW基因可能成為診斷胃癌的分子標志物或者治療胃 癌的分子靶點。
采用本發(fā)明提供的技術方案，利用分子細胞生物學技術，在胃癌細胞中 克隆出一個新基因，命名為rS/M^戶(Tumor Specificity and Mitosis Phase-dependent Expression protein, DQ150361 )。制備了抗T5/M^尸的多 克隆抗體，通過抗體純化技術獲得了高特異性抗體。從mRNA和蛋白質水平驗 證了 r5/M^戶基因在肺瘤細胞系和組織中的表達特征，確定其在包括胃癌細 胞系在內(nèi)的14林腫瘤細胞系中表達，并呈現(xiàn)細胞周期依賴性，在胃癌、乳腺 癌和宮頸癌組織中過量表達而相應正常組織不表達，且在多種胚胎組織中表 達。因此，我們證實了 73，/#/^尸在細胞增殖旺盛的胚胎組織中高表達，成年 后此基因被關閉，在腫瘤細胞中又出現(xiàn)高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，7^/#/^戶 為周期特異性表達，提示7^/M^戶高表達導致細胞周期調(diào)控異常和參與腫瘤 的發(fā)生發(fā)展。我們首次獲得的抗TS/MDEP的抗體可用于監(jiān)測細胞周期進程和 胃腸腫瘤的臨床生物學行為。 附困說明
圖1是篩選到差異表達cDNA片斷A54-3， Northern blot預測其mRNA 全長，并通過RACE技術獲得TS/MDEP基因的mRNA全長。
圖2是制備的多克隆抗體可與原核表達的TS/MDEP蛋白質特異結合，說 明其具有4艮高的特異性。
圖3是r5/M i"戶基因在多種腫瘤細胞系中表達，并呈現(xiàn)周期特異性表達。 Gl/M期的mRNA表達水平高于G2/S期；而蛋白質水平在M期表達最高，隨著 細胞分裂的完成，表達逐漸降低。
圖4是/5ZM^戶基因在組織中表達特征75ZM^P基因在mRNA和蛋白質 水平均呈現(xiàn)顯著的差異性表達，胃腫瘤組織中表達而正常胃粘膜中不表達； 在多種胚胎組織中75/M7i^基因表達。
圖5是抑制73/ytfflfi^基因表達對細胞形態(tài)和周期的影響。RNAi抑制 7^/M^戶基因表達后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞扁平、變大、出現(xiàn)巨 細胞、有突觸樣偽足出現(xiàn)，并且細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。
圖6是7^/M^ 基因被千擾后抑制了細胞的增殖和成瘤能力。千擾后細 胞比對照增殖明顯降低，而且軟瓊脂和棵鼠成瘤實驗證實，千擾后細胞在體 內(nèi)和體外的致瘤能力均顯著降低。
具體實施例方式
下面結合


本發(fā)明的具體實施方式
。
材料方法 一'械絲
胃癌細胞系BGC823、 MGC803、 SGC7901 、 PAMC82、 MKN45、 SNU1、 SNU5、 SNU16、 RF1 、 RF48在5。/。胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，AGS、 N87和結腸癌 細胞系LOVO在10。/o胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，列腺癌細胞系PC-3，肝癌 細胞系BEL7421,乳腺癌細胞系MCF7，食管癌細胞系EC9706在10%胎牛血 清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均還有終濃度為100, 000 units/L青霉素 和100mg/L鏈霉素，在5%(:02中37。C培養(yǎng)。
二，狄財化
將胃癌細胞系BGC823以20%密度接種于若千個直徑IOO咖培朱孤中，37 。C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時達對數(shù)生長期，在細胞密度為40%-80%時換2. 5mM TdR/DMEM條件培養(yǎng)基，繼續(xù)在5°化02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時，然后棄掉 TdR條件培養(yǎng)基，用常規(guī)培養(yǎng)基洗一遍，加入常規(guī)培養(yǎng)基37"C培養(yǎng)6小時。 其后將培養(yǎng)亞放入本所細胞室自行研制的高壓N20罐中，向罐中注入C02 400ml，將蓋子密封。打開N20入口開關，放出上層偽氣后，緩緩向管中充氣， 在30分鐘內(nèi)使其壓力達到0. 55MP，然后將&0罐放入37。C培養(yǎng)箱中放置18 小時，滿18小時后將N20罐取出并放出N20。倒置顯微鏡下見大量(90%)變 圓，這些細胞為M期細胞，部分已經(jīng)漂浮在培養(yǎng)液中，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使 M期細胞懸浮于培養(yǎng)液中，吸出細胞培養(yǎng)液，離心后棄上清，收集的細胞即 為M期細胞。剩余M期細胞繼續(xù)培養(yǎng)5小時后可收集G1期細胞。部分G1期 細胞換TdR條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18小時。18小時后換常規(guī)培養(yǎng)基再繼續(xù)培
養(yǎng)5小時即可收獲S期細胞，S期細胞繼續(xù)培養(yǎng)7小時后可收獲G2期細胞。 收獲的不同周期細胞用PROFILE n流式細胞儀(COULTER公司)檢測。
采用酸性酚-異硫酸氰胍-步法提取Gl和S期的胃癌細胞系BGC823總 RNA，根據(jù)用于mRNA差異顯示W(wǎng)^ ^Xr尸y^/zw W戶ro/7/e( Genomyx Corporation H兌明書進行操作，具體如下，逆轉錄反應體系20jnl: DEPC-H20 8. 8 m 1， 5 x buffer 4. 0 ji 1，證p(250 ^iM) 2. 0 ji 1， DTT(100mM) 2. 0 p 1 ， DNase處理后的總RNA ( 0. 5 p g/m 1) l.Oy 1,3，錨定引物AP 2. 1， MMLV
(200u/|Lil) 0. 2jal;反應如下RNA加入3，錨定引物AP 70X:粹育5分 鐘，立即插冰冷卻，然后加入其它成分(DEPC-H20， dNTP， DTT， MMLV， buffer )， 42°C 5分鐘，50°C 50分鐘，70°C 15分鐘，逆轉錄產(chǎn)物-20。C保存。DD-PCR 反應體系20jnl如下,8.2jil，10xbuffer 2. Opl'MgCh (25Mm) 1.2
jul， dNTP(250jaM) 1.6^1， 3，錨定引物AP(2. 5 nM) 2. 0 p 1， 5，錨定引 物arp (2. 5 m m) 2. 0 y 1， TaqE (5u/ p 1) 0. 2 n 1， rt-Mix 2. 0 n 1， [ cx -35S]Datp(12nci/y 1) 0.8jal， PCR程序95°C 2分鐘，92°C 15秒，50°C 30秒，72°C 2分鐘，4個循環(huán)，92°C 15秒，60°C 30秒，72°C 2分鐘，25 個循環(huán)，72°C 7分鐘，產(chǎn)物-20。C保存。DD-PCR產(chǎn)物6%聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制6%聚丙烯酰胺凝膠，聚合過夜，加樣前預電泳30分鐘，溫度55"C，電 壓1760v，電流28mA，恒功率50W;樣品6 m 1變性后上樣，電泳4小時后揭膠， 80X:真空干燥2小時，進行放射自顯影。在X光片上找到G1與S期差異表 達的cDNA片斷，并切膠回收進行PCR再擴增，之后產(chǎn)物測序鑒定。見圖1A， mRNA差異顯示獲得了 Gl/S期差異表達cDNA片斷A54 - 3，此片斷在Gl期高表 達。
坊,Ab"Ae/B W/of
提取的細胞系總RNA,依據(jù)OD值計算得到的濃度，取20yg總RNA,經(jīng) RNA變性膠分離，將電泳RNA膠用蒸餾水沖洗若干次去甲醛，10xSSC 100ml 搖洗l小時解鏈，用150ml 20xSSC做轉移液，利用毛細宏吸作用將RNA轉 移到硝酸纖維素膜，80X:于烤箱中烘干2小時；65。C雜交液中預雜交過夜， 雜交前標記探針如下取探針150ng加水(試劑盒提供)至30 n 1，置沸水中
變性5分鐘后，迅速插水冷卻，約三分鐘后，依次加入以下試劑，Labeling 5 xbuffer 10jul， MixdA(G，T)TP 2 n 1 ， 10mg/ml BSA 2 m 1 ， ct-32P dCTP (50 in ci) 5 y 1， Klenow enzyme (5u/ pi) 1 y 1，混勻室溫放置2小時，根據(jù)純 化柱說明將探針純化。標記的探針70。C變性，換新的雜交液10ml后加入變 性的探針，65。C雜交過夜。洗脫液洗脫后-70X:暴光2周顯影。見圖'1B，在 五林腫瘤細胞系中，證實均有r5/M^尸基因的表達，且其mRNA全長約4. Okb。
按說明TRIZOL提取腫瘤細胞系和組織總RNA，分光光度計定量，分別取5 jag總RM反轉錄，各加入O. 1 oligodT,加DEPC-treated H20至20 y 1, 70°C ， 10分鐘變性，迅速插冰冷卻，各加入5 x RT buffer 6 |u 1 ， dNTP 2 ju 1 (2.5raM)， RNase抑制劑0. 5m1 (40u/jh 1)，充分混勻，加入M-MLV逆轉錄酶 各lyl混勻，37。C孵育l小時，70°C 15分鐘滅活，分裝后-2(TC保存?zhèn)溆谩?然后PCR擴增，所用引物，上游引物序列:5， -TGGCATCTTTACTGGACTGG-3， 下游引物序列5， -TGGCACCTCGTGGATAGAGC-3，，擴增片段長度為385bp， 包含SAGEtag 。PCR反應體系20 m L:歸15. 0 y 1 ， 10 x Buffer (含MgCl》 2.0ml， dNTP (2. 5 mM)0.5^1，上游引物(5mM)0. 5 m 1 ，下游引物(5 juM) 0. 5jil， TaqDNA聚合酶(5U/y L) 0. 5pl， DNA模板(100ng/jnL) 0. 5jul。 PCR擴增條件，^Mt如下95。C預變性2min30sec，循環(huán)反應程序為 94。C變性500sec，退火50sec; 72"C延伸50sec， 30 cycles,循環(huán)反應結束 后，72°C， 10min充分延伸，4。C保存，PCR產(chǎn)物行1. 2%瓊脂糖凝膠鑒定。以 p-actin為內(nèi)對照，Mock為陰性對照。見圖3A和圖4A，分別證實了， 75/M^ 基因在多種腫瘤細胞系中表達，并呈現(xiàn)細胞周期依賴性表達，RT-PCR證實 其mRNA表達在Gl/M期高于阿哥、Q/S期；在組織中證實此基因在多種胚胎 組織中表達，如胃、小腸、大腸等，最重要的是在配對的胃癌組織中證實 ri/M^戶基因在胃癌組織中表達而配對的正常胃組織表達陰性。
六，
通過軟件分析T/MDEP的親水性區(qū)域和抗原表位性區(qū)域，參照使用多肽 制備抗體的一般原則，選擇出三個肽段，分別位于蛋白質的N末端、中間段
和c末端。因為合成的多肽分子量較小，不能充分引發(fā)免疫反應，因此需要 選擇合適的載體，增強其免疫原性。我們將合成的多肽連接到KLH上，通過 在新西蘭白兔脊柱兩側多點注射，第一次免疫，注射500ug多肽，以后劑量 減半，每周注射一次，共免疫四次。最后，取兔的全血，分離血清，分裝保 存。釆用抗體純化技術(CNBr-activated Sepharose 4B)將多抗純化后，通 過免疫組化和Western blot驗證多抗的特異性和檢測TS/MDEP蛋白的表達特 征。見圖2，原核表達并純化后獲得TS/MDEP蛋白質，并用質譜鑒定，與含 有抗TS/MDEP抗體的血清雜交后，證實我們多肽制備的抗體可與表達的全蛋 白特異性結合，因此，我們進一步采用親和層析的方法，用原核表達的抗體 純化血清中的抗體，顯著的提高了抗體的特異性。
七，名瘦逸必
采用ABC法，細胞系滴片后2°/。甲醛固定，0. 3% HA甲醇室溫IO分鐘， PBS洗3次x5分鐘。滴加一抗(l: 50)，濕盒4。C過夜，PBS洗3次x 5分 鐘，滴加二抗l: 200稀釋，室溫孵育30分鐘，PBS洗3次x5分鐘，滴加三 抗l: 400稀釋，室溫孵育30分鐘，PBS洗3次x5分鐘，DAB-H202顯色，鏡 下控制3-5分鐘，PBS漂洗，終止顯色，蘇木素復染45秒，1%鹽酸酒精分色， 溫熱的自來水沖洗反藍，95%和100%乙醇脫水各5分鐘，二甲苯透明，中性 樹膠封片。見圖4C，使用純化后的抗體對胃癌及正常組織制備的組織陣列進 行染色，證實，在胃的腫瘤組織中TS/MDEP蛋白表達，而正常胃組織中不表 達，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。
A， ffl^W^設殺Jt
用上述同樣的引物，在BGC823中RT-PCR大量擴增TS/MEDP基因片斷， 割膠回收純化后，將此cDNA片斷插入pGEM-T Easy載體T/A克隆(Promega )， 轉化感受態(tài)DH5ot，小量提取質粒，測序鑒定。然后標記探針使用地高辛探 針標記試劑盒(Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品)，根據(jù)說明書操作，將地高 辛標記在探針上，分別用RNA polymerase Sp6和RNA polymerase T7標記出 正義探針和反義探針，標記好的探針-20。C保存。按如下過程進行mRNA原位 雜交切片脫蠟，逐級乙醇回水，0. 2NHC1平衡切片，切片于2xSSC(預熱) 70TC孵育15分鐘，用DEPC處理的PBS液洗切片2分鐘，切片于4% PFA(預 冷)中4X:平衡5分鐘，用DEPC處理的PBS液洗切片2次，每次2分鐘。切 片于2xSSC中平衡5分鐘，在每張切片上加適量的預雜交液，濕盒7(TC孵 育8分鐘再37。C l小時，2xSSC洗切片2次，每次2分鐘。逐級乙醇脫水， 將探針加熱到70。C加入到水冷的預雜交液中(按10ng/ n 1)，制備單鏈探針， 加200jnl雜交液在切片上，蓋上蓋玻片，濕盒43。C孵育過夜，切片滴加2 xSSC移去蓋玻片，室溫2xSSC洗切片20分鐘，lxSSC洗20分鐘，43。C 0.5 x SSC洗20分鐘，室溫0. 5 x SSC洗20分鐘。切片于洗滌溶液平衡5分鐘， 在每張切片上加封閉溶液稀釋的綿羊血清(l:20用封閉溶液配置)，濕盒室 溫賻育20分鐘，棄去封閉液，在每張切片上加封閉溶液稀釋的堿性磷酸酶抗 地高辛抗體(1:500 )，濕盒室溫孵育1小時或4X:過夜，，棄去抗體液，切 片于洗滌溶液中洗2次，每次15分鐘，切片于底物溶液中平衡5分鐘，在每 張切片上加新鮮配制的彩色溶液，濕盒室溫孵育，避光半小時，當染色理想 時，用終止溶液終止反應，將終止溶液沖洗后，逐級乙醇脫水、封片(地高 辛核酸檢測試劑和亦為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品)。見圖4B，在包含 大樣本的組織陣列中，采用不同的方法再次證實T5/M^尸基因的mRNA在胃 癌組織中表達，而在正常胃粘膜中表達陰性。以正義探針為對照，證實我們 選擇的探針有很好的特異性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表l。
使用SMART RACE cDNA Amplification Kit( CL0NTECH)進行5'末端和 3'末端RACE，具體過程按使用說明提取胃癌細胞系BGC823的總RM，變性膠 電泳鑒定，將m飄分別反轉錄成5'-RACE-Ready c腿和3 -RACE-Ready c應， 均釆用巢式PCR， 5'RACE ^f吏用的引物GSP1: GGATCGGTCCCCTCGTCCACCCG， NGSP1: CCCACGGCGACAATAGCGACTACTT, PCR反應體系50 yl: 5-RACE-Ready cDM 2.5jnl，UPM(10x) 5yl，GSPl(或者NGSPl) lnl,MasterMix 41.5 jliI， PCR反應程序95"C 3分鐘充分變性，95°C 2分鐘，退火溫度梯度62 °C， 63. 4t:， 64. 4°C 50秒，延伸72°C 50秒，共擴增30個循環(huán)，充分延 伸72°C IO分鐘;3'RACE4吏用的引物:GSP2: TCCCAGCACTTGAGGCCAGGAGT, PCR 反應體系50jnl: 3'-RACE-Ready cDNA 2.5yl， UPM(10x) 5jnl， GSP2 1 jul， Master Mix 41.5jnl， PCR反應程序95°C 2分鐘充分變性，95°C 1
分鐘30秒，退火溫度梯度56°C， 58. 4°C， 60°C 50秒，延伸72°C 50秒，共 擴增30個循環(huán)，充分延伸72t: IO分鐘。將擴增的片斷切膠回收純化，T/A 克隆后測序驗i正。見圖1C，D,通過RACE寸支術，得到了 TS/MDEP mRNA的全長 (3877bp)，其包含了 5，端的G-Caping結構，3，端的加尾信號，此mRNA 包含了 一個完整的CDS (編碼序列)，并且在翻譯起始位點含有Kozak序列。 十一，細f挽
根據(jù)s iRNA乾序列設計的共同標準及ps iRNA-hHlneo質粒特征應用軟件 s iRNA Wizard v2. 4設計TS/MDEP基因的尋把序列，選擇TS/MDEP基因cDNA 上符合條件的3段序列并經(jīng)BLAST分析排除同源序列，根據(jù)質粒說明，設計 合成發(fā)夾結構，退火形成雙鏈結構，末端帶有BbsI酶切的酶切位點，之后與 BbsI酶切后的ps iRNA-hHlneo質粒連接，轉化細菌，抗生素篩選后，挑取克 瘞，測序鑒定后，大提質粒分裝-70。C儲存。轉染胃癌腫瘤細胞系BGC823, 錄小時加選擇性培養(yǎng)基(400ng/ml G418)，每3天換液，締選69天后，挑 取單克隆，每個片斷挑取6個擴大培養(yǎng)，然后提取RNA和蛋白質，進行RT-PCR 和Western blot驗證，證實3c克隆中TS/MDEP基因被干擾，并且觀察細胞 形態(tài)，MTT證實TS/MDEP基因被干擾生后細胞生長狀況，及細胞流式檢測細 胞周期改變，軟瓊脂集落形成實驗觀察細胞集落形成能力，以及棵鼠致瘤實 驗觀察TS/MDEP基因被干擾生后細胞致瘤性的變化。見圖5、 6， RNAi抑制 T^/M^戶基因表達后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞扁平、變大、出現(xiàn)巨 細胞、有突觸樣偽足出現(xiàn)，并且細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯；ri/M^戶基因被干擾 后抑制了細胞的增殖和成瘤能力，干擾后細胞比對照增殖明顯降低，而且軟 瓊脂和棵鼠成瘤實驗證實，干擾后細胞在體內(nèi)和體外的致瘤能力均顯著P務低。
附
表1 ，原位雜交證實TS/MDEP基因在胃正常勦膜和胃癌中存在差異表達。
Histology
TS/MDEP expression
Positive
Nafdvc
Total f sises
Tnmor Normal
53 (53%) 0
47(47%) 20 (100°/o)
100 20
X2fe沐p<0.01
表2，免疫組織化學證實TS/MDEP基因在胃正常黏膜和胃癌中存在差異表達。
Histology
IS'^MDEF expression
Positive
N*gtiv
Total c s
Tumor Noinud
20 (48.7%)
0
21(5L3°b)
8 (100%>
41
X 2 test, ps0.0權利要求
1、抗腫瘤特異性標志蛋白TS/MEDP的抗體制備，其特征在于克隆了一個新的腫瘤相關基因TS/MDEP并提交到Genebank，接受號為(DQ150361)，證實為細胞周期和腫瘤特異性表達，并且制備了具有高度特異性的抗體。
2、 抗TS/MDEP的抗體的用途，其特征在于該抗體可以用Western blot和 免疫組織化學檢測細胞和組織中TS/MDEP蛋白的表達水平。
3、 根據(jù)權利要求2所述的抗TS/MDEP的抗體的用途，其特征在于在多種 細胞系TS/MDEP蛋白質呈現(xiàn)周期依賴性表達，即在M期表達最高，隨著細胞 分裂的完成，其表達水平逐漸降低。
4、 根據(jù)權利要求2所述抗TS/MDEP的抗體的用途，其特征在于TS/MDEP 蛋白可能成為腫瘤診治的分子靶標。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗腫瘤特異性標志蛋白TS/MEDP的抗體制備及用途。利用分子細胞生物學技術，在胃癌細胞中克隆出一個新基因，命名為TS/MDEP。制備了抗TS/MDEP的多克隆抗體，通過抗體純化技術獲得了高特異性抗體。從mRNA和蛋白質水平驗證了TS/MDEP基因在腫瘤細胞系和組織中的表達特征，確定其在包括胃癌細胞系在內(nèi)的14株腫瘤細胞系中表達，并呈現(xiàn)細胞周期依賴性，在胃癌、乳腺癌和宮頸癌組織中過量表達而相應正常組織不表達，且在多種胚胎組織中表達。證實了TS/MDEP在細胞增殖旺盛的胚胎組織中高表達，成年后此基因被關閉，在腫瘤細胞中又出現(xiàn)高表達。TS/MDEP為周期特異性表達，提示TS/MDEP高表達導致細胞周期調(diào)控異常和參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。首次獲得的抗TS/MDEP的抗體可用于監(jiān)測細胞周期進程和胃腸腫瘤的臨床生物學行為。
文檔編號C07K16/18GK101168566SQ20061015009
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權日2006年10月26日
發(fā)明者呂有勇, 李文梅, 梁云燕, 樊曉軍, 王代樹, 許小青 申請人:北京市腫瘤防治研究所