專利名稱：從紅三葉中提取異黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅三葉中提取異黃酮的方法。
背景技術(shù)：
紅三葉(7h/o/〖wwpra^7^L.)為豆科三葉草屬的多年生草本植物，又名紅 車軸草、紅花苜蓿、紅菽草、金雀菜、三葉草。該植物除了可作優(yōu)良飼料和牧草 之外，國外民間還將其花序之煎劑用于祛痰、利尿和消炎，治療感冒和肺結(jié)核， 外敷治療膿腫、燒傷和眼疾等，并將其花、種子、根或全株制成浸膏劑、糊劑、 煎劑或泡茶飲用，治療胃潰瘍、胃癌、乳腺癌及腸癌等。我國民間則以紅三葉的 花序及帶花枝葉入藥，用于鎮(zhèn)痙、止咳、止喘，另外，還可將其全草制成軟膏， 治療局部潰瘍。
近年來國際上采用植物雌激素樣物質(zhì)替代激素療法，特別是采用天然來源的 異黃酮化合物治療婦女更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆等疾病取得了較 大成效。國內(nèi)外已經(jīng)對大豆Gfyc/"ewax ，野葛Pweran》/oZwto ，空心莧 茲er"a"/zera / /n./oxero/t/es,黃芪 A/ragfl/wj附e^m"acera， 紅三葉 7hyb/Z謂 pra/eme中異黃酮含量及其生理作用進行了較深入的研究，研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉 是少數(shù)幾種含有4種雌激素樣異黃酮(染料木素、大豆苷元、鷹嘴豆芽素A、 B) 的植物之一。而大豆只包含兩種主要的異黃酮染料木素和大豆苷元，不含鷹嘴豆 芽素A、 B。紅三葉具有比大多數(shù)異黃酮6倍以上的雌激素樣的活性且具有雙向 調(diào)節(jié)的作用。目前，紅三葉異黃酮的提取物是國際上公認(rèn)的治療婦女更年期綜合 征療效確切的植物藥，其銷量在美國多年來一直名列植物藥的前10位，我國每 年均有大量出口。因此，充分利用紅三葉資源，進行紅三葉異黃酮的開發(fā)，具有 重要的社會效益和經(jīng)濟效益。
關(guān)于紅三葉中異黃酮的提取制備工藝研究，國內(nèi)近幾年已有一些專利申請， 主要采用的是先選擇適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑進行提取，再采用有機溶劑萃取法或大孔吸 附樹脂柱層析法或者是二者相結(jié)合的方法進行精制純化。但工藝中普遍存在的不 足之處是提取的大多是異黃酮苷，而據(jù)國外有關(guān)研究報道，發(fā)揮藥效作用的為
異黃酮苷元，即使有些申請專利中提取的是異黃酮苷元，也是采取先用有機溶劑 提取苷，再水解轉(zhuǎn)化成苷元的方法，工序復(fù)雜。有機溶劑萃取中使用了大量有機 溶劑，易燃、易爆、成本高，制得的紅三葉提取物中殘留有機溶劑對人體健康無 益。大孔吸附樹脂柱層析前，樣品溶液未經(jīng)過任何處理，造成樹脂污染嚴(yán)重，使 用周期短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種較簡便、高效率的從紅三葉中 提取獲得高純度異黃酮的方法，從而使之用作保健食品和醫(yī)藥品的原料。
本發(fā)明通過一歩水解法、水沉堿溶法、膜分離、柱層析等歩驟，可獲得高純 度的異黃酮產(chǎn)品。
一種從紅三葉中提取異黃酮的方法，其特征在于該方法包括以下歩驟
A、 取紅三葉全草，粉碎，用含鹽酸的乙醇溶液加熱回流提取，合并提取液， 過濾，濾液備用；
B、 將上述濾液回收乙醇，濃縮，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，離心，沉 淀用氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH至9-11，離心，上清液備用；
C、 將上述上清液在巻式膜分離設(shè)備中依次進行微濾、超濾及納濾；
D、 將上述經(jīng)過納濾的原液過大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄去水
洗液，繼以含水乙醇洗脫，收集該洗脫液。
E、 將上述洗脫液回收乙醇后，濃縮，干燥，得紅三葉異黃酮產(chǎn)品。 在本發(fā)明的A歩驟中，含鹽酸的乙醇溶液為含0.1 1.0mol/L鹽酸的
65wt。/。 85wt。/。食用乙醇。
在本發(fā)明的C歩驟中，沉淀物用氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH 9 11，離心后 上清液保溫至25 40°C ，在操作壓力0.10 0.15 MPa下進行膜分離。
在本發(fā)明的C步驟中，膜分離過程，依次采用了微濾、超濾、納濾技術(shù)。 所用的膜材為聚偏氟乙烯膜、聚醚砜膜或聚砜膜；微濾膜孔徑為0.2 0.45 pm， 超濾膜截留分子量為50000 1000 KD，納濾膜截留分子量為300 100 KD。
在本發(fā)明的D步驟中，經(jīng)過納濾后的樣品原液，無需濃縮，直接過大孔吸 附樹脂，先用水洗至接近無色，棄去水洗液，再用20 40wt。/。乙醇洗脫，棄去 該洗脫液，繼以60 80wt。/。乙醇洗脫，收集該洗脫液。通過A歩驟，可獲得異黃酮含量為5%的粗品；通過C步驟，經(jīng)膜分離后可 獲得含量為10%的異黃酮，最終可獲得含量高于60%的異黃酮。
本發(fā)明以含鹽酸的乙醇溶液為提取溶劑，采用一步水解法，使紅三葉中異黃 酮苷全部轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元，簡化了工藝，提高了產(chǎn)品的藥用價值'另外，由于 紅三葉原植物中既含有異黃酮苷又含有異黃酮苷元，而二者的極性、溶解性等方 面有差異，如果二者同時存在，給后續(xù)的精制純化工藝帶來困難，必然造成苷或 苷元的損失，因此，本發(fā)明首先采用一步水解法，經(jīng)一次提取，將紅三葉中異黃 酮苷全部轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元，這樣在后續(xù)的精制純化過程中只考慮苷元，并利用 苷元不溶于水、易溶于稀堿液的性質(zhì)，使苷元得以初步純化。
本發(fā)明采用了國際上公認(rèn)的20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途的前沿技 術(shù)之一膜分離技術(shù)進行分離純化， 一方面提高產(chǎn)品中異黃酮苷元的純度， 一方面 使大孔吸附樹脂柱層析前的樣品溶液得以凈化，減輕了樹脂的損害，延長了樹脂 的使用周期，另外，納濾技術(shù)的應(yīng)用使樹脂柱層析前的樣品溶液無需濃縮，可直 接上樣，簡化了工序。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點 (1)用含鹽酸的食用乙醇為提取溶劑，將紅三葉中的異黃酮苷全部轉(zhuǎn)化成 異黃酮苷元，該法既提高了產(chǎn)品的藥用價值，又簡化了工藝。(2)利用異黃酮苷 元不溶于水、易溶于稀堿液的特性，使其得到初步純化。(3)依次采用微濾、超 濾、納濾等技術(shù)，對稀堿水溶解的異黃酮苷元進行膜分離，提高其純度，并使大 孔吸附樹脂柱層析前的樣品溶液得以凈化，減輕對樹脂的損害，延長樹脂的使用 周期，另外，納濾技術(shù)的應(yīng)用使樹脂柱層析前的樣品溶液無需濃縮，可直接上樣， 簡化了工序。(4)經(jīng)過納濾后的樣品原液，過大孔吸附樹脂。該工藝簡單、可適 合工業(yè)化大生產(chǎn)，且制備過程中，僅采用食用級乙醇為溶劑，污染少，成本低。 本發(fā)明在紅三葉異黃酮的整個制備過程，僅采用水和食用級乙醇為溶劑，減 少污染，所得終產(chǎn)品中無有機溶劑殘留。


圖1為采用本發(fā)明的制備方法所得到的紅三葉異黃酮提取物的高效液相色 譜圖。
圖2為采用本發(fā)明的制備方法所得到的紅三葉異黃酮提取物的紫外光譜 圖。
具體實施方式
實施例1
取紅三葉全草，粉碎，用含lmol/L鹽酸的85%乙醇溶液加熱回流提取2次， 每次1.5小時，合并提取液，過濾，濾液備用。
將上述濾液回收乙醇，濃縮，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，離心，沉淀用 氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH至10，離心，上清液備用。
將上述上清液保溫至4(TC，在巻式膜分離設(shè)備中依次進行微濾、超濾及納 濾，操作壓力0.15MPa。其中微濾膜材為聚偏氟乙烯膜，孔徑為0.45)am，超濾 膜為聚砜膜，截留分子量為5000 KD，納濾膜為聚醚砜膜，截留分子量為200 KD。
將上述經(jīng)過納濾的原液過D1C)1型大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄 去水洗液，再用30%乙醇洗脫，棄去該洗脫液，繼以70%乙醇洗脫，收集該洗 脫液。
將上述洗脫液回收乙醇后，濃縮，干燥，得紅三葉異黃酮產(chǎn)品。 實施例2
取紅三葉全草，粉碎，用含0.5mol/L鹽酸的65%乙醇溶液加熱回流提取2 次，每次2小時，合并提取液，過濾，濾液備用。
將上述濾液回收乙醇，濃縮，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，離心，沉淀用 氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH至9，離心，上清液備用。
將上述上清液保溫至3(TC，在巻式膜分離設(shè)備中依次進行微濾、超濾及納 濾，操作壓力0.10 MPa。其中微濾膜材為聚偏氟乙烯膜，孔徑為0.2 pm，超濾 膜為聚醚砜膜，截留分子量為IOOOKD，納濾膜為聚砜膜，截留分子量為100 KD。
將上述經(jīng)過納濾的原液過AB-8型大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄 去水洗液，再用20%乙醇洗脫，棄去該洗脫液，繼以60%乙醇洗脫，收集該洗 脫液。
將上述洗脫液回收乙醇后，濃縮，干燥，得紅三葉異黃酮產(chǎn)品。 實施例3
取紅三葉全草，粉碎，用含0.1mol/L鹽酸的95%乙醇溶液加熱回流提取2 次，每次1小時，合并提取液，過濾，濾液備用。
將上述濾液回收乙醇，濃縮，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，離心，沉淀用 氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH至11，離心，上清液備用。
將上述上清液保溫至25°C，在巻式膜分離設(shè)備中依次進行微濾、超濾及納 濾，操作壓力0.12 MPa。其中微濾膜材為聚偏氟乙烯膜，孔徑為0.2 pm，超濾 膜為聚醚砜，截留分子量為50000 KD，納濾膜為聚砜膜，截留分子量為300 KD。
將上述經(jīng)過納濾的原液過AB-8型大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄 去水洗液，再用40%乙醇洗脫，棄去該洗脫液，繼以80%乙醇洗脫，收集該洗 脫液。
權(quán)利要求
1. 一種從紅三葉中提取異黃酮的方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、取紅三葉全草，粉碎，用含鹽酸的乙醇溶液加熱回流提取，合并提取液，過濾，濾液備用；B、將濾液回收乙醇，濃縮，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，離心，沉淀用氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH至9-11，離心，上清液備用；C、將上述上清液在卷式膜分離設(shè)備中依次進行微濾、超濾及納濾；D、將上述經(jīng)過納濾的原液過大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄去水洗液，繼以含水乙醇洗脫，收集該洗脫液。E、將上述洗脫液回收乙醇后，濃縮，干燥，得紅三葉異黃酮產(chǎn)品。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在A歩驟中，含鹽酸的乙醇溶液為含0.1 1.0mol/L鹽酸的65wt％ 85wt％食用乙醇。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在C歩驟中，沉淀物用氫氧化鈉溶液溶解并調(diào)pH 9 11，離心后上清液保溫至25 40℃，在操作壓力0.10 0.15MPa下進行膜分離。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在C步驟中，膜材料為聚偏氟乙烯膜、聚醚砜膜或聚砜膜；微濾膜孔徑為0.2 0.45 μm，超濾膜截留分子量為 50000 1000KD,納濾膜截留分子量為300 100KD。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在D歩驟中，經(jīng)過納濾后的樣品原液，無需濃縮，直接過大孔吸附樹脂，先用水洗至接近無色，棄去水洗液，再用20 40wt％乙醇洗脫，棄去該洗脫液，繼以60 80wt％乙醇洗脫，收集該洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從紅三葉中提取異黃酮的方法。本發(fā)明通過一步水解法、水沉堿溶法、膜分離、柱層析等步驟，可獲得高純度的異黃酮產(chǎn)品。本發(fā)明采用了膜分離技術(shù)進行分離純化，一方面提高產(chǎn)品中異黃酮苷元的純度，一方面使大孔吸附樹脂柱層析前的樣品溶液得以凈化，減輕了樹脂的損害，延長了樹脂的使用周期，另外，納濾技術(shù)的應(yīng)用使樹脂柱層析前的樣品溶液無需濃縮，可直接上樣，簡化了工序。該工藝簡單、可適合工業(yè)化大生產(chǎn)，且制備過程中，僅采用食用級乙醇為溶劑，污染少，成本低。
文檔編號C07D311/36GK101205224SQ20061010532
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者勇 劉, 師彥平, 娟 陳 申請人:中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所