專利名稱：用于免疫或制備單克隆抗體的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及使用T細(xì)胞表位增強(qiáng)免疫的方法和T細(xì)胞表位、其編碼核酸、載體、宿主細(xì)胞、藥物組合物、人工抗原及其用途。
背景技術(shù)：
外源蛋白抗原進(jìn)入機(jī)體后首先被樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞(APC)吞噬，抗原在APC內(nèi)被降解，其中包含的T細(xì)胞表位與MHC II分子結(jié)合而呈遞于APC表面。在淋巴結(jié)內(nèi)，抗原特異的T輔助細(xì)胞(Th)被呈遞了Th表位肽的APC激活后移動到富含B細(xì)胞的濾泡附近。濾泡內(nèi)抗原特異的B細(xì)胞則通過其表面的膜免疫球蛋白(mIg)結(jié)合外源蛋白抗原的B細(xì)胞表位而吞噬該蛋白，經(jīng)過與APC細(xì)胞同樣的生化過程，將抗原內(nèi)包含的Th表位與MHC II分子復(fù)合物呈遞于細(xì)胞表面。抗原特異的T細(xì)胞與抗原特異的B細(xì)胞通過細(xì)胞表面TCR與MHC II-肽復(fù)合物的相互識別而結(jié)合，進(jìn)而通過B7-CD28、CD40-CD40L等分子的相互作用及細(xì)胞因子分泌而激活B細(xì)胞(GarsideP，Ingulli E，Merica RR，et al.Science 1998，281(5373)96-99)。
根據(jù)抗體產(chǎn)生的機(jī)理，抗原特異性Th細(xì)胞的活化程度和速度對抗體產(chǎn)生的時(shí)間和滴度有重要的影響?？s短抗原特異性抗體產(chǎn)生的時(shí)間、提高抗體產(chǎn)生的滴度對于以下舉例的及其它相關(guān)的領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾膬r(jià)值1提高非顆粒蛋白抗原的免疫原性。基因工程顆粒性蛋白疫苗具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)性，能夠在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)全面的體液免疫、粘膜免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，這已被大量的實(shí)踐所證明(Kirnbauer R，Booy F，Cheng N，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1992；89(24)12180-12184)。目前正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的四價(jià)人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗，包括HPV6、11、16、18四型，均為基因工程顆粒性蛋白疫苗，有報(bào)道其對持續(xù)性感染的保護(hù)率達(dá)到88％，對相關(guān)疾病的保護(hù)率可達(dá)100％(Villa LL，Costa RL，Petta CA，et al.Lancet Oncol 2005；6271-278)。然而，非顆粒性蛋白疫苗的免疫原性則往往很弱，難以誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)反應(yīng)。Clair NS等將人血清白蛋白交聯(lián)之后免疫大鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體最高可增強(qiáng)30倍[StClair N，Shenoy B，Jacob LD，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1999；96(17)9469-9474]。非顆粒性蛋白形成顆粒之后免疫原性大為增強(qiáng)的現(xiàn)象雖然為人所共知，其機(jī)制卻并未被闡明。對于那些尚未在體外建立培養(yǎng)系統(tǒng)的病原微生物而言，由于無法進(jìn)行滅活疫苗或減毒疫苗的研制，因此基因工程疫苗成為疫苗研究的重要方向，然而試圖使表達(dá)出的靶蛋白形成顆粒的嘗試常常是不成功的，因此提高非顆粒蛋白抗原的免疫原性是疫苗研究急待解決的重要問題。
2縮短多肽或其它弱免疫原性抗原的單克隆抗體研制周期，并提高抗體滴度。
本發(fā)明滿足了上述需要。本發(fā)明的一個(gè)目的在于通過預(yù)激活抗原特異性Th細(xì)胞，提高蛋白特異性抗體產(chǎn)生的速度并提高抗體產(chǎn)生的滴度。本發(fā)明的其它目的從以下說明中將是顯然的。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明涉及一種制備抗體的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體。
本發(fā)明還涉及一種免疫動物的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體。
本發(fā)明還涉及一種提高目標(biāo)抗原免疫原性的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體。
本發(fā)明還涉及一種提高抗體產(chǎn)生的速度的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體。
本發(fā)明還涉及一種提高產(chǎn)生抗體的滴度的方法，其中以免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體。
目標(biāo)抗原是待針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答例如待針對其產(chǎn)生抗體的抗原。
在本發(fā)明中，目標(biāo)抗原可以是天然的或者人工合成的。下文將進(jìn)一步說明目標(biāo)抗原。
T細(xì)胞表位肽和目標(biāo)抗原共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)，因此，這種共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)的抗原在本發(fā)明中也稱為本發(fā)明的人工抗原。如果抗原已經(jīng)天然含有T細(xì)胞表位，則該抗原可以不和T細(xì)胞表位肽共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)，也可以進(jìn)一步和另外的T細(xì)胞表位肽共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)。
在本發(fā)明這些方法中，優(yōu)選地，使用T細(xì)胞表位肽的免疫發(fā)生在目標(biāo)抗原免疫之前。
在本發(fā)明中，所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
優(yōu)選地，所述T細(xì)胞表位肽免疫可以增強(qiáng)共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該表位肽的目標(biāo)抗原的免疫原性，和/或縮短抗所述抗原的抗體產(chǎn)生的時(shí)間和/或提高所述抗體的滴度。
在另一方面，本發(fā)明還涉及一種增強(qiáng)免疫的方法，其中在個(gè)體接觸目標(biāo)抗原之前、同時(shí)、和/或之后，用目標(biāo)抗原中所含的T細(xì)胞表位肽免疫個(gè)體，其中，所述免疫優(yōu)選發(fā)生在個(gè)體接觸目標(biāo)抗原之前。
在另一方面，本發(fā)明還涉及一種預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體，其中優(yōu)選地，使用T細(xì)胞表位肽的免疫發(fā)生在目標(biāo)抗原免疫之前。
相應(yīng)的，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位肽和與該表位肽共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)的目標(biāo)抗原聯(lián)合一起在制備藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病。
在本發(fā)明上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述T細(xì)胞表位肽為不超過大約15個(gè)(例如5-10個(gè)，例如10、11、12、13、14、15個(gè))氨基酸的多肽，或數(shù)個(gè)(2-20個(gè)，如2-10個(gè)，包括2、3、4、5、6、7、8、9個(gè))此類多肽的共價(jià)偶聯(lián)或者融合產(chǎn)物，該類多肽可以特異性地激活宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫采用的T細(xì)胞表位肽和目標(biāo)抗原是蛋白質(zhì)形式或者是編碼此蛋白質(zhì)的核酸形式，其中優(yōu)選地所述目標(biāo)抗原是戊型肝炎病毒或者AIV抗原，更優(yōu)選地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其變體或片段，其中優(yōu)選地所述抗原性疾病由戊型肝炎病毒引起。
在另一方面，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位肽，其包含(或者由如下序列組成)(a)SEQ ID NO1或者7所示的序列；(b)SEQ ID NO1或者7所示序列的保守性變異體，其中，所述保守性變異體的氨基酸序列與SEQ ID NO1或者7之氨基酸序列相比，存在一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))保守性氨基酸的替換、添加和/或刪除；或(c)(a)或者(b)所述序列的活性片段；其中，所述保守性變異體和活性片段能保持與H-2d型主要組織相容性復(fù)合物分子的特異性結(jié)合，或者能夠特異性地激活宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地，所述表位肽優(yōu)選長大約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地所述表位肽來源于含有選自SEQ ID NO1-7的序列的天然序列，例如不超過15個(gè)氨基酸的多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽包含SEQ ID NO5，非必需地在SEQ ID NO5的N端或者C端或者兩端可添加有一個(gè)或者多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，1-20個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))另外的氨基酸殘基，該氨基酸殘基優(yōu)選來源于含有序列SEQ ID NO5的天然序列?；蛘?，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽由SEQ ID NO5和所述在SEQ ID NO5的N端或者C端或者兩端非必需地添加的氨基酸殘基組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽包含SEQ ID NO7，非必需地在SEQ ID NO7的N端或者C端或者兩端可添加有一個(gè)或者多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))另外的氨基酸殘基，該氨基酸殘基優(yōu)選來源于含有序列SEQ ID NO7的天然序列?；蛘?，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽由SEQ ID NO7和所述在SEQ ID NO7的N端或者C端或者兩端非必需地添加的氨基酸殘基組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽包含(或者由如下序列組成)下列序列之一SEQ ID NO1-7的序列，優(yōu)選SEQ ID NO1-4的序列；或者它們在對應(yīng)于SEQ ID NO1第6位的苯丙氨酸(F)突變成纈氨酸(V)、和/或在對應(yīng)于SEQ ID NO1第7位的纈氨酸(V)突變成天冬氨酸(D)、和/或在對應(yīng)于SEQ ID NO1第14位的亮氨酸(L)突變成蛋氨酸(M)之后的相應(yīng)序列。
在另一方面，本發(fā)明還涉及數(shù)個(gè)(1-10個(gè)如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)，或者15、20個(gè)或者更多)本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物(融合蛋白)，例如氨基酸序列HSKTF FVLPL RGKLSFWEAG(SEQ ID NO15)。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物的核酸分子。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸分子的載體。
在另一方面，本發(fā)明還涉及用本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主的免疫原性組合物，其中優(yōu)選地所述免疫原性組合物是疫苗，所述免疫原性組合物還可包含可藥用載體，所述免疫原性組合物優(yōu)選地還包含佐劑，所述佐劑優(yōu)選是弗氏完全佐劑或鋁佐劑。
在另一方面，本發(fā)明還涉及人工抗原，其包含本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物和與該T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物共價(jià)偶聯(lián)或融合的目標(biāo)抗原。
優(yōu)選地，目標(biāo)抗原可以是蛋白質(zhì)抗原例如非顆粒蛋白抗原，或者糖抗原；當(dāng)目標(biāo)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選該T細(xì)胞表位目標(biāo)抗原融合構(gòu)成融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是一個(gè)或者數(shù)個(gè)B細(xì)胞表位。優(yōu)選地，所述B細(xì)胞表位優(yōu)選是待針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目標(biāo)抗原的B細(xì)胞表位。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤抗原，例如HEV抗原或者AIV抗原，優(yōu)選地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其變體或片段。
在另一方面，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的人工抗原的免疫原性組合物，其中優(yōu)選地所述免疫原性組合物是疫苗，所述免疫原性組合物還可包含可藥用載體，所述免疫原性組合物優(yōu)選地還包含佐劑，所述佐劑優(yōu)選是弗氏完全佐劑或鋁佐劑。
在另一方面，本發(fā)明還涉及聯(lián)合制劑或者試劑盒，其包含(a)本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主、或本發(fā)明的免疫原性組合物，和(b)本發(fā)的人工抗原或本發(fā)明的免疫原性組合物，所述(a)和(b)組分混合在一起或者彼此分開放置。
在另一方面，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位例如本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主、或本發(fā)明的免疫原性組合物、或本發(fā)明的人工抗原、或本發(fā)明的免疫原性組合物在制備抗體或者免疫動物或者提高目標(biāo)抗原免疫原性或者提高抗體產(chǎn)生的速度或者提高產(chǎn)生抗體的滴度或者預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病的方法中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位例如本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主、或本發(fā)明的免疫原性組合物、或本發(fā)明的人工抗原、或本發(fā)明的免疫原性組合物在制備免疫原性制劑或者藥物中的用途，所述免疫原性制劑或者藥物用于制備抗體或者免疫動物或者提高目標(biāo)抗原免疫原性或者提高抗體產(chǎn)生的速度或者提高產(chǎn)生抗體的滴度或者預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病。
在另一方面，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位例如本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主、或本發(fā)明的免疫原性組合物在制備本發(fā)明的人工抗原中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及T細(xì)胞表位例如本發(fā)明所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或本發(fā)明的核酸分子、或本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的宿主、或本發(fā)明的免疫原性組合物、或本發(fā)明的人工抗原、或本發(fā)明的免疫原性組合物在制備本發(fā)明的聯(lián)合制劑或者試劑盒中的用途。
本發(fā)明還涉及與這里公開的序列SEQ ID NO1-8和14-16中的任何一個(gè)具有至少70％，優(yōu)選80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。同源性的確定可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
為了更清楚的理解本發(fā)明，給出以下術(shù)語的定義。
由抗原導(dǎo)致或參與的疾病在本文中指由于抗原在宿主中引起的疾病或病癥或者抗原所參與的疾病或病癥，包括但不限于，由外來抗原引起的疾病，例如細(xì)菌和真菌感染、寄生蟲疾病、變態(tài)反應(yīng)，由內(nèi)源抗原引起的疾病，例如自身免疫病。罹患抗原性疾病的個(gè)體將得以于本發(fā)明采用所述抗原所包含的T細(xì)胞表位進(jìn)行的免疫。
蛋白質(zhì)在本文中僅就蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)而言，而不旨在指其長度，因此，在本文中，如果適當(dāng)?shù)脑?，“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用。
核酸序列在本文中不僅包括脫氧核糖核酸序列、核糖核酸序列，也包括其類似物，例如包含天然核苷的類似物和/或磷酸二酯鍵的類似物。
作為本發(fā)明的一個(gè)非限制性的實(shí)例，本發(fā)明人從戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239(ORF2AA368-AA606，氨基酸序列為IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVALAPPPR；SEQ ID NO18)中篩選鑒定到兩個(gè)H-2d限制性優(yōu)勢Th表位P34(ORF2 AA532-AA546)和P35(ORF2 AA537-AA551)。P34與P35雖然重疊10個(gè)氨基酸，它們識別具有不同TCR受體的T細(xì)胞群，即P34和P35為兩個(gè)獨(dú)立的T細(xì)胞表位。以P34或P35肽初免BALB/c小鼠后可提高與P34或P35偶聯(lián)的多肽或蛋白的免疫原性，縮短抗體產(chǎn)生的時(shí)間并提高抗體的滴度。


圖1顯示不同肽庫刺激HEV 239免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ-ELISPOT分析結(jié)果。
圖2顯示不同肽段刺激HEV 239免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ-ELISPOT分析結(jié)果圖3顯示剔除CD4+或CD8+細(xì)胞后的脾細(xì)胞對P34肽刺激的ELISPOT分析。
圖4顯示P34(圖A)或P2(圖B)免疫小鼠脾細(xì)胞對HEV 239及P34應(yīng)答的IFN-γ-ELISPOT分析。
圖5顯示IFN-γ-ELISPOT分析P34截短肽對免疫小鼠脾細(xì)胞的刺激效果。
圖6顯示IFN-γ-ELISPOT分析P35與P34-10對免疫小鼠脾細(xì)胞的刺激效果代表圖。
圖7顯示P34、P35肽對P34、P35肽免疫小鼠脾細(xì)胞的刺激效果。
圖8顯示混合CFA的P34、P35初免對E2免疫原性的影響。圖中“●”代表P34-CFA初免小鼠；“▲”代表P 35-CFA初免小鼠；“○”代表P18-CFA初免小鼠；其中每一條曲線為同一只小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的抗體滴度變化曲線。
圖9顯示Al佐劑吸附的P34同時(shí)或隨后免疫對E2免疫原性的影響。
圖10顯示P34-P35-CFA預(yù)免誘導(dǎo)多肽抗體的快速產(chǎn)生。
圖11顯示239突變蛋白的SDS-PAGE圖。其中A239(PBS復(fù)性)；Bls-ms(PBS復(fù)性)；Cls-ms(AMS復(fù)性)；Dv-d(PBS復(fù)性)；Ev-d(AMS復(fù)性)；Ff-v(PBS復(fù)性)；Gf-v(AMS復(fù)性)圖12顯示W(wǎng)estern-Blotting檢測239突變蛋白與8C11抗體的反應(yīng)性。其中A239(PBS復(fù)性)；Bls-ms(PBS復(fù)性)；Cls-ms(AMS復(fù)性)；DV-d(PBS復(fù)性)；Ev-d(AMS復(fù)性)；Ff-v(PBS復(fù)性)；Gf-v(AMS復(fù)性)。其中，8C11抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備的HEV E2蛋白的單克隆抗體，是針對E2中和表位的單抗，該表位在HEV239中亦存在。
圖13顯示ELISA檢測239突變蛋白的免疫反應(yīng)性。
圖14顯示239免疫小鼠脾細(xì)胞對239突變蛋白應(yīng)答的IFN-γ-ELISPOT分析。
序列說明


實(shí)施例實(shí)施例1HEV 239的H-2d限制性T細(xì)胞表位的篩選1)肽庫的合成合成覆蓋HEV 239蛋白(氨基酸序列為IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR；SEQ ID NO18)全長的15氨基酸肽庫(西安美聯(lián)公司，70％純度)，相鄰肽相互重疊10個(gè)氨基酸，即從N端的-1位開始(注在重組表達(dá)HEV 239蛋白時(shí)在該蛋白質(zhì)的N端之前額外添加了甲硫氨酸殘基，此-1位指的是該甲硫氨酸)，每隔5個(gè)氨基酸起始合成一條肽，共46條肽。各肽自N端開始依次被命名為P1-P46，以DMSO溶解各多肽，分別配置濃度為10mg/mL的儲存液。其中每4-7條肽混合在一起組成子肽庫，共組成14個(gè)子肽庫(表1)。
表1肽庫的組成

2)小白鼠無特殊病原體(SPF)級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，并在該中心飼養(yǎng)。
3)疫苗及免疫將純化的HEV 239蛋白(北京萬泰生物藥業(yè)有限公司提供)與等體積完全弗氏佐劑(CFA，Sigma公司)混合，制備成0.5mg/mL濃度的疫苗(239-CFA)，以100μL/鼠的劑量腹股溝以及頸部皮下免疫小鼠，兩周后加強(qiáng)一次，加強(qiáng)后第10天取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞檢測。以生理鹽水與CFA混合的疫苗(NS-CFA)作為陰性對照疫苗。
4)小鼠脾臟細(xì)胞分離取免疫后小鼠脾臟，2mL注射器研磨，200目篩網(wǎng)過濾，5％PBS(磷酸緩沖液)洗滌后離心，3mL紅細(xì)胞裂解液(含0.15M NH4Cl；10mMKHCO3；0.1mM Na2EDTA；pH 7.2-7.4)室溫處理3min，加入50mL PBS，離心，PBS洗滌后將脾細(xì)胞重懸于10％1640(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、50μmoL/L β-巰基乙醇、2mmoL/L谷氨酰胺、1mmoL/L丙酮酸鈉、10mmoL/L Hepes、100U/mL青霉素鈉、100U/mL硫酸鏈霉素)，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL。
5)IFN-γ-ELISPOT檢測按照試劑盒(BDTMELISPOT SET)說明書進(jìn)行。簡言之(a)以抗-鼠IFN-γ抗體100μL/孔(5μg/mL)包被ELISPOT 96孔板。(b)4℃孵育12小時(shí)后，各孔以含10％FBS的1640培養(yǎng)液室溫封閉兩小時(shí)；(c)每孔接種小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)/200μL，刺激抗原分別采用10μg/mL HEV239蛋白，A-G肽庫(其中每種肽的終濃度為5μg/mL)，10μg/mL單獨(dú)肽或10μg/mL BSA，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。陽性或陰性對照孔則分別加入2μg/mL ConA或單純培養(yǎng)液。37℃靜置培養(yǎng)24h；(d)各孔洗滌后加入生物素化抗鼠IFN-γ抗體，100μL/孔(2.5ug/mL)，室溫反應(yīng)2h；(e)各孔洗滌后加入鏈霉親合素-HRP，100μL/孔(5μg/mL)，室溫反應(yīng)2h；(f)洗滌后加入HRP底物AEC，避光顯色，以水沖洗終止，晾干；(7)以ImmunoSpot(Cellular Technolgy Ltd.公司)進(jìn)行計(jì)數(shù)和數(shù)據(jù)處理。以斑點(diǎn)數(shù)/106脾細(xì)胞(Spots/106spleen cells)為單位，陰性孔＜10Spots/106脾細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)孔大于2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)者為陽性。
6)篩選結(jié)果239-CFA免疫鼠對肽庫E、M反應(yīng)強(qiáng)烈，每106個(gè)脾細(xì)胞中的斑點(diǎn)數(shù)超過300個(gè)；對肽庫A、B、F、H、I、K、N有中等強(qiáng)度的反應(yīng)(50～150Spots/106脾細(xì)胞)；對肽庫C、D、G、J、L幾乎無反應(yīng)(＜20Spots/106脾細(xì)胞)(圖1)。將具有中等程度以上反應(yīng)的肽庫內(nèi)包含的肽單獨(dú)刺激239-CFA免疫鼠脾細(xì)胞，結(jié)果表明肽P34的刺激效果最好(413Spots/106脾細(xì)胞)，為HEV 239的優(yōu)勢H-2d限制性(因?yàn)樵摫砦坏拇碳ばЧ@著強(qiáng)于其它肽端)T細(xì)胞表位；肽P35的刺激效果較好(76.5Spots/106脾細(xì)胞)，為HEV 239的另一優(yōu)勢H-2d限制性T細(xì)胞表位(圖2)。
實(shí)施例2HEV 239優(yōu)勢H-2d限制性T細(xì)胞表位的T細(xì)胞限制性分析1)疫苗制備、免疫BALB/c鼠方法同實(shí)施例1。
2)剔除小鼠脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞
參照Miltenyi公司產(chǎn)品130-049-201和產(chǎn)品130-049-401的操作手冊，取107新鮮分離的小鼠脾細(xì)胞，洗滌后重懸于90μL染色緩沖液中，加入10μL與抗鼠CD4或抗鼠CD8抗體連接的磁珠，通過磁場分離，得到剔除CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。
3)IFN-γ-ELISPOT檢測方法同實(shí)施例1，不同之處僅在于(c)步驟每孔接種小鼠脾細(xì)胞或剔除CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)/200μL，刺激抗原采用10μg/mL P34，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。陽性或陰性對照孔則分別加入2μg/mL ConA或10μg/mL P2肽。
4)檢測結(jié)果當(dāng)CD8+細(xì)胞被剔除之后，脾細(xì)胞對P34的反應(yīng)沒有發(fā)生明顯變化；而當(dāng)CD4+細(xì)胞被剔除之后，脾細(xì)胞對P34的反應(yīng)顯著下降，說明P34表位為CD4+T細(xì)胞表位(Th表位)(圖3)。以10μg/mL P2肽作為陰性對照，結(jié)果均顯示為陰性。
實(shí)施例3P34免疫BALB/c鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答1)疫苗及免疫將70％純度的P34或P2肽與等體積完全弗氏佐劑(CFA，Sigma公司)混合，制備成1mg/mL濃度的疫苗，以100μL/鼠的劑量腹股溝以及頸部皮下免疫小鼠，兩周后加強(qiáng)一次，加強(qiáng)后第10天取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞檢測。
2)剔除小鼠脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞、IFN-γ-ELISPOT檢測方法同實(shí)施例2。
3)檢測結(jié)果
經(jīng)P34-CFA免疫可激活大量P34肽特異性T細(xì)胞，體外經(jīng)P34或HEV239蛋白刺激可產(chǎn)生大量IFN-γ。將CD4+T細(xì)胞從脾細(xì)胞中剔除后，脾細(xì)胞經(jīng)P34或HEV 239蛋白刺激的反應(yīng)下降到本底水平，而剔除CD8+T細(xì)胞的脾細(xì)胞則幾乎保持剔除前的應(yīng)答水平，說明該抗原特異性T細(xì)胞基本上都是CD4+Th細(xì)胞。P2-CFA免疫的小鼠對P34或HEV 239蛋白刺激及P34-CFA免疫小鼠對P2肽均無反應(yīng)，說明該應(yīng)答的特異性(圖4)。實(shí)施例4P34肽表位中MHC II分子結(jié)合區(qū)域的分析1)多肽合成合成分別從N端逐個(gè)氨基酸截短的P34肽(表2，西安美聯(lián)公司，95％純度)，以DMSO溶解多肽配置濃度為10mg/mL的儲存液。
表2 P34截短肽的序列

2)疫苗制備、免疫BALB/c小鼠方法同實(shí)施例1。
3)IFN-γ-ELISPOT檢測方法同實(shí)施例1，不同之處僅在于(c)步驟每孔接種小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)/200μL，刺激抗原分別采用10μg/mL表2中的各肽，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。
4)檢測結(jié)果當(dāng)P34肽從N端截至第5個(gè)氨基酸時(shí)，即P34-11肽的刺激活性開始下降，約為原始活性的90％；截至第6個(gè)氨基酸時(shí)，P34-10肽活性則明顯減少，約占P34活性的26％(圖5)，該結(jié)果表明P34肽中與MHC II分子結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域在于其C端的12個(gè)氨基酸，即“TF FVLPLRGKLS”。P34-10肽即為P34肽與P35肽相互重疊的10個(gè)氨基酸，然而與P35肽的刺激效果相比，雖然產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)差不多，但經(jīng)P35刺激后T細(xì)胞產(chǎn)生的斑點(diǎn)較大(圖6)。
實(shí)施例5P34肽與P35肽識別不同的TCR受體1)疫苗及免疫將70％純度的P34或P35肽與等體積完全弗氏佐劑(CFA，Sigma公司)混合，制備成1mg/mL濃度的疫苗(239-CFA)，以100μL/鼠的劑量腹股溝以及頸部皮下免疫小鼠，兩周后加強(qiáng)一次，加強(qiáng)后第10天取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞檢測。
2)疫苗制備、免疫BALB/c小鼠方法同實(shí)施例1。
3)IFN-γ-ELISPOT檢測方法同實(shí)施例1，不同之處僅在于(c)步驟每孔接種小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)/200μL，刺激抗原分別采用10μg/mL P34或P35，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。
4)檢測結(jié)果P34肽免疫小鼠的脾細(xì)胞對P35肽反應(yīng)微弱(12Spots/106脾細(xì)胞)，P35肽免疫小鼠的脾細(xì)胞對P34肽反應(yīng)也很微弱(23.5Spots/106脾細(xì)胞)(圖7)，說明P34和P35肽盡管重疊10個(gè)氨基酸，它們分別識別帶有不同TCR受體的T細(xì)胞群。
實(shí)施例6與CFA混合的P34、P35肽可增強(qiáng)E2蛋白的免疫原性1)疫苗及免疫將70％純度的P34、P35或P18肽與等體積完全弗氏佐劑(CFA，Sigma公司)混合，制備成1mg/mL濃度的疫苗，以100μL/鼠的劑量腹股溝以及頸部皮下免疫小鼠，四周后免疫鋁佐劑吸附的HEV E2蛋白(為從N端截短26個(gè)氨基酸的HEV 239，序列為QLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR；SEQ ID NO19)(北京萬泰生物藥業(yè)有限公司提供)，每只小鼠腹腔免疫5μg、10μg或20μg E2蛋白，分別于E2免疫后的第0、1、2、3、4周采血檢測抗HEV抗體滴度。
2)ELISA方法檢測抗HEV抗體滴度以HEV 239蛋白包板，4℃過夜，加入100μL系列稀釋的血清，37℃半小時(shí)后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，顯色，檢測450nm的吸光度。
3)檢測結(jié)果與HEV 239相比，E2的N端短缺26個(gè)氨基酸而C端相同。E2為多聚體，其免疫原性比HEV 239低240倍。P34和P35肽分別位于HEV ORF2的AA533-AA547和AA538-AA552，均包含于E2蛋白內(nèi)。結(jié)果表明在5μgE2組，P34初免的5只小鼠中有2只(40％)鼠可于E2免疫后的第2周檢測到抗體，而P35和P18初免的小鼠均無抗體產(chǎn)生(圖8A)；在10μgE2組，P34初免的全部4只小鼠(100％)均可于E2免疫后的第2周檢測到抗體，而P35初免的5只小鼠中有1只(20％)鼠可檢測到低滴度抗體，P18初免的小鼠均無抗體產(chǎn)生(圖8B)；在20μg E2組，P34初免的全部5只小鼠(100％)均可于E2免疫后的第2周檢測到抗體，而P35初免的5只小鼠中有3只(60％)鼠可檢測到抗體，P18初免的小鼠均無抗體產(chǎn)生(圖8C)。在相同劑量E2組內(nèi)，P34初免小鼠的抗體滴度高于P35初免的小鼠。
實(shí)施例7鋁佐劑吸附的P34可增強(qiáng)E2蛋白的免疫原性1)疫苗及免疫
向每只小鼠腹腔免疫20μg鋁佐劑吸附的E2蛋白(北京萬泰生物藥業(yè)有限公司提供)，同時(shí)(P34-E2組)或12小時(shí)后(E2-P34組)將1mg/mL鋁佐劑吸附的70％純度的P34疫苗，以100μL/鼠的劑量皮下免疫小鼠，分別于E2免疫后的第0、2周采血檢測抗HEV抗體滴度。
2)抗HEV抗體滴度檢測方法同實(shí)施例6。
3)檢測結(jié)果在免疫后的第2周，E2-P34組的6只小鼠中有3只(50％)可檢測到抗體，P34-E2組的6只小鼠中有5只(83.3％)可檢測到抗體，單純免疫E2的6只小鼠無一產(chǎn)生抗體(圖9)，說明鋁佐劑吸附的P34可增強(qiáng)E2蛋白的免疫原性。
實(shí)施例8P34-P35-CFA預(yù)免快速誘導(dǎo)抗多肽抗體的產(chǎn)生1)多肽的合成噬菌體9肽庫中篩選出來的模擬禽流感病毒(AIV)B細(xì)胞表位的9肽(序列為CHGMLPVYC)(SEQ ID NO14)，在其N端融合P34肽和P35肽共20個(gè)氨基酸“HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG”(SEQ ID NO15)，由此構(gòu)成的29肽(序列為HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG CHGMLPVYC)(SEQ ID NO16)由西安美聯(lián)公司合成(粗品未純化)。
2)疫苗及免疫將CFA吸附的70％純度的“HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG”(SEQ ID NO15)制備成1mg/mL濃度的疫苗，以100μL/鼠的劑量皮下免疫小鼠。3周后，同樣的方法將合成的29肽制備成1mg/mL濃度的疫苗，以100μL/鼠的劑量皮下免疫小鼠。分別于29肽免疫后的第0、3周采血檢測抗9肽抗體滴度。
3)抗9肽抗體滴度檢測
利用HEV239類病毒顆粒系統(tǒng)，表面融合展示噬菌體9肽庫中篩選出來的模擬AIV表位的9肽，即在HEV239的C端通過連接肽與9肽融合表達(dá)，將此蛋白命名為8H5A(序列為IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPRGGGGSGGGGSCHGMLPVYC；SEQ ID NO17)。以8H5A蛋白包板(5μg/ml)，ELISA方法檢測抗9肽抗體。
4)檢測結(jié)果在29肽免疫后的第3周，免疫的4只小鼠中有3只(75％)檢測到抗體的滴度較高(圖10)。圖10中圖例代表血清稀釋度。
實(shí)施例9定點(diǎn)突變239內(nèi)T表位對T表位活性及239蛋白抗原反應(yīng)性的影響1)定點(diǎn)突變239蛋白針對239蛋白中的T細(xì)胞表位進(jìn)行3引物2輪PCR定點(diǎn)突變。分別是239(SEQ ID NO18)的第178個(gè)氨基酸(相對于P34的第14位)亮氨酸(L)突變成蛋氨酸(M)(ls-ms)；第170個(gè)氨基酸(相對于P34的第6位)苯丙氨酸(F)突變成纈氨酸(V)(f-v)；第171個(gè)氨基酸(相對于P34的第7位)纈氨酸(V)突變成天冬氨酸(D)(v-d)。
I.PCR引物設(shè)計(jì)upper-primer(SEQ ID NO9)5′-CAT ATG ATA GCG CTT ACC CTG Tm57.9lower-primer(SEQ ID NO10)5′-GAA TTC TTA GCG CGG AGG GGG G Tm67.4
mid-primer(ls-ms)(SEQ ID NO11)5′-G CCG CTC CGC GGT AAG ATG TCC TTT TGG GAG GCAGGTmid-primer(f-v)(SEQ ID NO12)5′-C CAG CAG CAT TCA AAG ACC TTC GTT GTC CTG CCG CTmid-primer(v-d)(SEQ ID NO13)5′-T CAA AGA CCT TCT TTG ACC TGC CGC TCC GII.100μL PCR體系第一輪PCR1μL templete-239(即用于表達(dá)HEV 239疫苗的質(zhì)粒DNA)；1μL rTaq；1μL dNTP；10μL 10×PCR buffer；2.5μL Mid-primer；2.5μLlower-primer；82μL ddH2O。
12循環(huán)，OMEGATM柱回收。
第二輪PCR1μL templete-239；1μL rTaq；1μL dNTP；10μL 10×PCR buffer；4μL第一輪PCR產(chǎn)物作為引物；2.5μL upper-primer；80.5μL ddH2O。
12循環(huán)，膠回收，按OMEGATM試劑盒。
III.包涵體洗滌方法20mL裂解液(10mM Tris-Cl，pH 7.2；10mM EDTA，Ph 8.0；300mM NaCl)重懸菌體；冰水浴超聲5分鐘，打2秒停5秒，功率750W；8000g 10℃離心10分鐘；以buffer I(20mMTris-Cl，pH8.5；5mM EDTA，pH 8.0；100mMNaCl)+2％triton重懸；37℃ 225rpm搖床搖30分鐘；8000g 10℃離心10分鐘；buffer I重懸；37℃ 225rpm搖床搖30分鐘；8000g 10℃離心10分鐘重復(fù)2次。
以buffer I+2M尿素重懸；37℃225rpm搖床搖30分鐘；8000g 10℃離心10分鐘；收集上清；buffer I+4M尿素重懸；37℃225rpm搖床搖30分鐘；8000g 10℃離心10分鐘；收集上清；buffr I+8M尿素重懸；37℃225rpm搖床搖30分鐘；8000g 10℃離心10分鐘；收集上清。以SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白洗于哪一梯度尿素中。
IV.包涵體復(fù)性方法方法a)PBS復(fù)性方法包涵體置于透析袋4℃以PBS透析復(fù)性；每6小時(shí)換液一次，共3次。透析中止后以12000g 10℃離心10分鐘，收集上清。
方法b)AMS(硫酸銨)復(fù)性方法將包涵體與4M尿素+1M硫酸銨+1×buffer I等體積混合，裝入透析袋中；在2M尿素+0.5M硫酸銨+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小時(shí)；在1M尿素+0.5M硫酸銨+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小時(shí)；在0.5M硫酸銨+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小時(shí)；在1×PBS 4℃透析，每6小時(shí)換液一次，共3次。
V.所得蛋白性質(zhì)a)SDS-PAGE出現(xiàn)明顯單體帶和雙體帶(圖11)b)Western-Blotting檢測發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性與239蛋白相似(圖12)2)雙抗體夾心ELISA法檢測239突變蛋白的免疫反應(yīng)性a)1mg/mL抗體用10mM PB稀釋300倍后于聚苯乙烯板中每孔包被100μL。37℃孵育12～16小時(shí)。PBST洗一次。
b)加封閉液200μL，37℃孵育2小時(shí)。
c)加入一定稀釋度的待測抗原樣品100μL，37℃孵育1小時(shí)。PBST洗5次。
d)加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘，PBST洗5次。
e)每孔加入顯色液A(H2O2)，B(TMB)各一滴，37℃避光顯色10分鐘。
f)每孔加入一滴終止液(2M硫酸)終止反應(yīng)。
在酶標(biāo)儀上450nm，620nm雙波長處測各孔OD值。
g)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)f-v和ls-ms免疫反應(yīng)性與239蛋白相似(圖13A、B)3)疫苗制備、免疫BALB/c鼠方法同實(shí)施例14)IFN-γ-ELISPOT檢測方法同實(shí)施例1，不同之處僅在于(c)步驟每孔接種小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)/200μL，刺激抗原分別采用10μg/mL 239、239fv、239vd、或239ls-ms，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。
5)檢測結(jié)果239fv和239vd的T表位活性明顯降低，239ls-ms的T表位活性基本不變(圖14)。
序列表<110>廈門大學(xué)<120>用于免疫或制備單克隆抗體的方法和組合物<130>IDC060045<160>19<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>1His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser1 5 10 15<210>2<211>14<212>PRT<213>人工序列<400>2Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<400>3Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<400>4Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>5Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser
1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>6Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser1 510<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>7Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly1 5 10 15<210>8<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>8Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg1 5 10 15<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>9catatgatag cgcttaccct g 21<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10gaattcttag cgcggagggg gg22<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>11gccgctccgc ggtaagatgt ccttttggga ggcaggt 37
<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>12ccagcagcat tcaaagacct tcgttgtcct gccgct36<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>13tcaaagacct tctttgacct gccgctccg29<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>14Cys His Gly Met Leu Pro Val Tyr Cys1 5<210>15<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>15His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe1 5 10 15Trp Glu Ala Gly20<210>16<211>29<212>PRT<213>人工序列<400>16His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe1 5 10 15Trp Glu Ala Gly Cys His Gly Met Leu Pro Val Tyr Cys20 25<210>17
<211>258<212>PRT<213>人工序列<400>17Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu1 5 10 15Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg20 25 30Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser35 40 45Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile50 55 60Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His65 70 75 80Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser85 90 95Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu100 105 110Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser115 120 125Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala130 135 140Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser145 150 155 160Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly165 170 175Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr180 185 190Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala195 200 205Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly210 215 220
Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg Gly225 230 235 240Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys His Gly Met Leu Pro Val245 250 255Tyr Cys<210>18<211>239<212>PRT<213>HEV<400>18Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu1 5 10 15Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg20 25 30Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser35 40 45Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile50 55 60Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His65 70 75 80Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser85 90 95Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu100 105 110Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser115 120 125Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala130 135 140Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser145 150 155 160Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly165 170 175
Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr180 185 190Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu VAl Glu Asn Ala Ala195 200 205Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly210 215 220Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg225 230 235<210>19<211>213<212>PRT<213>HEV<400>19Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr1 5 10 15Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile20 25 30Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln35 40 45Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala50 55 60Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu65 70 75 80Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr85 90 95Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr100 105 110Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu115120 125Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe130 135 140Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr
145 150 155 160Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu165 170 175Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr180 185 190Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu195 200 205Ala Pro Pro Pro Arg210
權(quán)利要求
1.一種制備抗體或者免疫動物或者提高目標(biāo)抗原免疫原性或者提高抗體產(chǎn)生的速度或者提高產(chǎn)生抗體的滴度的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體，其中，優(yōu)選地，使用T細(xì)胞表位肽的免疫發(fā)生在目標(biāo)抗原免疫之前，其中，所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，且其中，優(yōu)選地，所述T細(xì)胞表位肽免疫可以增強(qiáng)共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該表位肽的目標(biāo)抗原的免疫原性，和/或縮短抗所述抗原的抗體產(chǎn)生的時(shí)間和/或提高所述抗體的滴度。
2.一種增強(qiáng)免疫的方法，其中在個(gè)體接觸目標(biāo)抗原之前、同時(shí)、和/或之后，用目標(biāo)抗原中所含的T細(xì)胞表位肽免疫個(gè)體，其中，所述免疫優(yōu)選發(fā)生在個(gè)體接觸目標(biāo)抗原之前。
3.一種預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病的方法，其中以T細(xì)胞表位肽免疫動物或人體，隨后、同時(shí)或預(yù)先用天然含有T細(xì)胞表位的目標(biāo)抗原或者共價(jià)偶聯(lián)或融合表達(dá)該T細(xì)胞表位肽的目標(biāo)抗原免疫同一動物或人體，其中優(yōu)選地，使用T細(xì)胞表位肽的免疫發(fā)生在目標(biāo)抗原免疫之前。
4.權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞表位肽為不超過大約15個(gè)(例如5-10個(gè)，例如10、11、12、13、14、15個(gè))氨基酸的多肽，或數(shù)個(gè)(2-20個(gè)，如2-10個(gè)，包括2、3、4、5、6、7、8、9個(gè))此類多肽的共價(jià)偶聯(lián)或者融合產(chǎn)物，該類多肽可以特異性地激活宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述免疫采用的T細(xì)胞表位肽和目標(biāo)抗原是蛋白質(zhì)形式或者是編碼此蛋白質(zhì)的核酸形式，其中優(yōu)選地所述目標(biāo)抗原是戊型肝炎病毒或者AIV抗原，更優(yōu)選地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其變體或片段，其中優(yōu)選地所述抗原性疾病由戊型肝炎病毒引起。
6.T細(xì)胞表位肽，其包含(或者由如下序列組成)(a)SEQ ID NO1或者7所示的序列；(b)SEQ ID NO1或者7所示序列的保守性變異體，其中，所述保守性變異體的氨基酸序列與SEQ ID NO1或者7之氨基酸序列相比，存在一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))保守性氨基酸的替換、添加和/或刪除；或(c)(a)或者(b)所述序列的活性片段；其中，所述保守性變異體和活性片段能保持與H-2d型主要組織相容性復(fù)合物分子的特異性結(jié)合，或者能夠特異性地激活宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答，優(yōu)選地，所述表位肽優(yōu)選長大約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地所述表位肽來源于含有選自SEQ ID NO1-7的序列的天然序列，例如不超過15個(gè)氨基酸的多肽。
7.權(quán)利要求6的T細(xì)胞表位肽，其包含SEQ ID NO5，非必需地在SEQ ID NO5的N端或者C端或者兩端可添加有一個(gè)或者多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，1-20個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))另外的氨基酸殘基，該氨基酸殘基優(yōu)選來源于含有序列SEQ ID NO5的天然序列。
8.權(quán)利要求6的T細(xì)胞表位肽，其包含SEQ ID NO7，非必需地在SEQ ID NO7的N端或者C端或者兩端可添加有一個(gè)或者多個(gè)(優(yōu)選地，1-10個(gè)，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè))另外的氨基酸殘基，該氨基酸殘基優(yōu)選來源于含有序列SEQ ID NO7的天然序列。
9.權(quán)利要求6的T細(xì)胞表位肽，其包含(或者由如下序列組成)下列序列之一SEQ ID NO1-7的序列，優(yōu)選SEQ ID NO1-4的序列；或者它們在對應(yīng)于SEQ ID NO1第6位的苯丙氨酸(F)突變成纈氨酸(V)、和/或在對應(yīng)于SEQ ID NO1第7位的纈氨酸(V)突變成天冬氨酸(D)、和/或在對應(yīng)于SEQ ID NO1第14位的亮氨酸(L)突變成蛋氨酸(M)之后的相應(yīng)序列。
10.數(shù)個(gè)(1-10個(gè)如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)，或者15、20個(gè)或者更多)權(quán)利要求6的T細(xì)胞表位肽的共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物(融合蛋白)，例如氨基酸序列HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG(SEQID NO15)。
11.一種包含編碼權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物的核酸分子。
12.一種包含權(quán)利要求11所述核酸分子的載體。
13.一種用權(quán)利要求12所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
14.一種包含權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主的免疫原性組合物，其中優(yōu)選地所述免疫原性組合物是疫苗，所述免疫原性組合物還可包含可藥用載體，所述免疫原性組合物優(yōu)選地還包含佐劑，所述佐劑優(yōu)選是弗氏完全佐劑或鋁佐劑。
15.人工抗原，其包含權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物和與該T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物共價(jià)偶聯(lián)或融合的目標(biāo)抗原；優(yōu)選地，目標(biāo)抗原可以是蛋白質(zhì)抗原例如非顆粒蛋白抗原，或者糖抗原；當(dāng)目標(biāo)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選該T細(xì)胞表位目標(biāo)抗原融合構(gòu)成融合蛋白。
16.權(quán)利要求15的人工抗原，其中所述目標(biāo)抗原是一個(gè)或者數(shù)個(gè)B細(xì)胞表位，優(yōu)選地，所述B細(xì)胞表位優(yōu)選是待針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目標(biāo)抗原的B細(xì)胞表位。
17.權(quán)利要求15-16任一項(xiàng)的人工抗原，其中所述目標(biāo)抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤抗原，例如HEV抗原或者AIV抗原，優(yōu)選地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其變體或片段。
18.含有權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原的免疫原性組合物，其中優(yōu)選地所述免疫原性組合物是疫苗，所述免疫原性組合物還可包含可藥用載體，所述免疫原性組合物優(yōu)選地還包含佐劑，所述佐劑優(yōu)選是弗氏完全佐劑或鋁佐劑。
19.聯(lián)合制劑或者試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主、或權(quán)利要求14的免疫原性組合物，和(b)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原或權(quán)利要求18的免疫原性組合物，所述(a)和(b)組分混合在一起或者彼此分開放置。
20.T細(xì)胞表位例如權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主、或權(quán)利要求14的免疫原性組合物、或權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原、或權(quán)利要求18的免疫原性組合物在制備抗體或者免疫動物或者提高目標(biāo)抗原免疫原性或者提高抗體產(chǎn)生的速度或者提高產(chǎn)生抗體的滴度或者預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病的方法中的用途。
21.T細(xì)胞表位例如權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主、或權(quán)利要求14的免疫原性組合物、或權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原、或權(quán)利要求18的免疫原性組合物在制備免疫原性制劑或者藥物中的用途，所述免疫原性制劑或者藥物用于制備抗體或者免疫動物或者提高目標(biāo)抗原免疫原性或者提高抗體產(chǎn)生的速度或者提高產(chǎn)生抗體的滴度或者預(yù)防或治療由抗原導(dǎo)致或參與的疾病。
22.T細(xì)胞表位例如權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主、或權(quán)利要求14的免疫原性組合物在制備權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原中的用途。
23.T細(xì)胞表位例如權(quán)利要求6-10之任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞表位或者共價(jià)偶聯(lián)物或串聯(lián)物、或權(quán)利要求11的核酸分子、或權(quán)利要求12的載體、或權(quán)利要求13的宿主、或權(quán)利要求14的免疫原性組合物、或權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的人工抗原、或權(quán)利要求18的免疫原性組合物在制備權(quán)利要求19的聯(lián)合制劑或者試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用T細(xì)胞表位增強(qiáng)免疫的方法和T細(xì)胞表位、編碼核酸、載體、宿主細(xì)胞、藥物組合物、人工抗原及其用途。
文檔編號C07K14/435GK1850855SQ20061008155
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者吳婷, 伍小路, 羅文新, 張軍, 夏寧邵 申請人:廈門大學(xué)