專利名稱：γ－L－谷氨酰－L－半胱氨酸的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(γ-GC)的合成方法，屬于化學(xué)合成領(lǐng)域。
二、技術(shù)背景γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸可以用作制備改善食物味道的食品添加劑[中國(guó)專利CN 1550157A]，它還是生物合成還原型谷胱甘肽(glutathione)的重要前體。還原型谷胱甘肽是一種小分子自由基清除劑，能清除O2、H2O2。它是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的一種小分子肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，是多種酶的底物，能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷。還在動(dòng)脈硬化、冠心病、防衰老、抗腫瘤和老年癡呆癥等疾病治療過程中起重要作用。
雖然可通過化學(xué)或生物合成的方法制備谷胱甘肽，目前化學(xué)合成需要經(jīng)過基團(tuán)保護(hù)、縮合、脫保護(hù)等眾多步驟，收率低、產(chǎn)品質(zhì)量不高、成本高等不足，制約了工業(yè)化生產(chǎn)；生物合成主要是利用動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母合成谷胱甘肽，生物合成谷胱甘肽的酶有γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(GSH 1)與谷胱甘肽合成酶(GSH 2)組成。產(chǎn)物谷胱甘肽對(duì)GSH 1有抑制作用，因此一般的生物合成方法難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
為了解決工業(yè)化生產(chǎn)谷胱甘肽的難題，本發(fā)明采用化學(xué)結(jié)合生物的方法合成谷胱甘肽。即首先用化學(xué)合成的方法制備γ-GC，具體是以苯酐作為保護(hù)基，與L-谷氨酸反應(yīng)生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酸，其在醋酐中回流制備鄰苯二甲酰L-谷氨酸酐，鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐在水溶液中與胱氨酸鈉鹽縮合生成二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸，經(jīng)水合肼去保護(hù)、電解還原制備γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(γ-GC)；再利用具有高活性谷胱甘肽合成酶(GSH 2)的基因工程菌將γ-GC與甘氨酸縮合成谷胱甘肽。此合成路線優(yōu)點(diǎn)在于化學(xué)法合成谷胱甘肽前體γ-GC收率高、成本低，無需γ-GC合成酶GSH 1參與生物合成過程，也就不存在產(chǎn)物抑制問題。因此具有很好的工業(yè)化前景。
目前報(bào)道制備γ-GC的方法很少，僅有Harington等[Harington，C.A.；Mead，T.H.Biochem.J.1935，29，1602]采用N-芐氧基-L-谷氨酸的α甲酯與L-胱氨酸乙酯縮合后，經(jīng)鋅粉還原、皂化反應(yīng)得N-芐氧基-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸，在冰醋酸中用碘化磷還原為γ-GC，收率低且實(shí)驗(yàn)不易重復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供生物合成還原型谷胱甘肽的前體物質(zhì)γ-GC的一種合成新方法，該方法具有原料價(jià)格低廉、生產(chǎn)成本低、選擇性高、反應(yīng)速度快、收率高的特點(diǎn)。
2.技術(shù)方案一種γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(γ-GC)的合成方法，其方法步驟為(1)由L-谷氨酸與鄰苯二甲酸酐在熔融條件下生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酸；(2)由鄰苯二甲酰-L-谷氨酸與醋酸酐回流產(chǎn)生鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐；(3)由鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐與L-胱氨酸鹽的水溶液直接作用生成二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸鹽；(4)二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸鹽經(jīng)酸酸化后得二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；(5)由二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸直接與水合肼溶液反應(yīng)脫除鄰苯二甲?；@得γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；(6)γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸經(jīng)電解還原制備γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
在上述步驟(1)中鄰苯二甲酸酐與L-谷氨酸的摩爾比為1.0～2.0，反應(yīng)溫度為120～180℃，反應(yīng)時(shí)間為20-180分鐘。
在上述步驟(2)中醋酸酐與鄰苯二甲酰-L-谷氨酸的摩爾比為1.0～10.0，回流時(shí)間為3～20分鐘。
在上述步驟(3)中L-胱氨酸鹽是通過L-胱氨酸與堿反應(yīng)制備，其堿包括碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉和氫氧化鉀，其中鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐與L-胱氨酸鹽的摩爾比為2.0～4.0，L-胱氨酸鹽溶液的百分比濃度為1～20wt％，反應(yīng)溫度為-10～35℃。
在上述步驟(3)中L-胱氨酸鹽與鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐的反應(yīng)液pH為7～11。
在上述步驟(4)中所述的酸包括無機(jī)酸中的鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸等或有機(jī)酸中的甲酸、乙酸和草酸，其濃度為1.0～10.0mol/L。
在上述步驟(5)中所述的水合肼溶液為水合肼的水溶液，或水合肼的乙醇溶液，或水合肼的乙醇與水的混合溶液，反應(yīng)溫度為-10～35℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，所用水合肼溶液的百分比濃度為1～10wt％。
在上述步驟(6)中所述的電解還原所用的電流為10-100A。
3.有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的顯著特點(diǎn)(1)本發(fā)明采用價(jià)格低廉的鄰苯二甲酰基作為L(zhǎng)-谷氨酸-α-氨基的保護(hù)基合成γ-GC，每步反應(yīng)產(chǎn)物易結(jié)晶分離，具有生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢(shì)；(2)利用電解還原L-胱氨酸的二硫鍵為巰基，可避免金屬還原的效率低、污染環(huán)境的缺陷；(3)在室溫下，直接用L-胱氨酸鹽水溶液與鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐反應(yīng)，反應(yīng)速度快、選擇性好、收率高。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1L-谷氨酸147克、鄰苯二甲酰酐148克加入500ml燒瓶中，控制油浴溫度150±5℃、熔融后反應(yīng)45分鐘，趁熱傾入沸水中，冷卻結(jié)晶得到鄰苯二甲酰-L-谷氨酸224.4克(收率81％)；鄰苯二甲酰-L-谷氨酸55.4克在醋酸中煮沸5分鐘產(chǎn)生鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐46.6克(收率90％)；將該酸酐31.0克在室溫下與12.0克L-胱氨酸、氫氧化鈉4.0克、水100ml溶液反應(yīng)，通過滴加10wt％碳酸鈉溶液維持反應(yīng)液pH8～10，8小時(shí)后用6mol/L的鹽酸酸化得到30.3克二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸(收率80％)；將二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸22.7克在室溫下直接溶于150毫升的3％的水合肼的水溶液中放置二天，用6mol/L硫酸酸化，調(diào)pH至2，過濾除去鄰苯二甲酰肼沉淀，清液減壓濃縮，滴加4mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至5.5，用95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸12.6克(收率84％)；10.0克γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸，在電解電流90A條件下，電解還原制得9.4克γ-GC(總收率46％)。
實(shí)施例2鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐的制備方法同實(shí)施例1，將該酸酐31.0克在室溫下與12.0克胱氨酸、碳酸鈉10.6克、水100ml溶液反應(yīng)，通過滴加10mol/L氫氧化鈉溶液維持反應(yīng)液pH 8～10，8小時(shí)后用6mol/L硫酸酸化得到31.1克二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸(收率83％)；以下步驟同實(shí)施例1，得9.7克γ-GC(總收率47％)。
實(shí)施例3以實(shí)施例2相同的操作步驟合成二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；稱取二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸16克在室溫下直接溶于100毫升的3％水合肼的水和乙醇溶液中放置二天，用6mol/L甲酸酸化，調(diào)pH至3，過濾除去鄰苯二甲酰肼沉淀，濾液減壓濃縮，滴加4mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.0，用95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸8.9克(收率88％)；以實(shí)施例1相同的操作步驟制備γ-GC(總收率48％)。
實(shí)施例4以實(shí)施例1相同的操作步驟合成二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；稱取二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸16克在室溫下直接溶于100毫升的3％水合肼的水和甲醇溶液中放置二天，用20％(w/v)草酸水溶液酸化，調(diào)pH至3，過濾除去鄰苯二甲酰肼沉淀，濾液減壓濃縮，滴加4mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.5，用95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸8.4克(收率84％)；以實(shí)施例1相同的操作步驟制備γ-GC(總收率47％)。
權(quán)利要求
1.一種γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其方法步驟為(1)由L-谷氨酸與鄰苯二甲酸酐在熔融條件下生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酸；(2)由鄰苯二甲酰-L-谷氨酸與醋酸酐回流產(chǎn)生鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐；(3)由鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐與L-胱氨酸鹽的水溶液直接作用生成二鄰苯二甲酰-L-谷氨酰-L-胱氨酸鹽；(4)二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸鹽經(jīng)酸酸化后得二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；(5)由二鄰苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸直接與水合肼溶液反應(yīng)脫除鄰苯二甲?；@得γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；(6)γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸經(jīng)電解還原制備γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于在步驟(1)中鄰苯二甲酸酐與L-谷氨酸的摩爾比為1.0～2.0，反應(yīng)溫度為120～180℃，反應(yīng)時(shí)間為20～180分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于在步驟(2)中醋酸酐與鄰苯二甲酰L-谷氨酸的摩爾比為1.0～10.0，回流時(shí)間為3～20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成γ-GC的方法，其特征在于在步驟(3)中L-胱氨酸鹽是通過等摩爾比的L-胱氨酸與無機(jī)堿反應(yīng)制備，其堿包括碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于在步驟(3)中鄰苯二甲酰L-谷氨酸酐與L-胱氨酸鹽的摩爾比為2.0～4.0，L-光氨酸鹽溶液的百分比濃度為1～20wt％，反應(yīng)溫度為-10～35℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于在步驟(3)中L-胱氨酸鹽與鄰苯二甲酰L-谷氨酸酐的反應(yīng)液的pH為7～11。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成的方法，其特征在于在步驟(4)中所述的酸包括無機(jī)酸中的鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸或有機(jī)酸中的甲酸、乙酸和草酸，其濃度為1.0～10.0mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于在步驟(5)中所述的水合肼溶液為水合肼的水溶液，或水合肼的乙醇溶液，或水合肼的乙醇與水的混合溶液，反應(yīng)溫度為-10～35℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，所用水合肼溶液的百分比濃度為1～10wt％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，其特征在于步驟(6)中所述的電解還原所用的電流為10-100A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種γ－L－谷氨酰－L－半胱氨酸(γ－GC)合成方法，它是將鄰苯二甲酸酐與L－谷氨酸在120～180℃下反應(yīng)，生成鄰苯二甲酰－L－谷氨酸，與醋酐共沸3～20分鐘形成鄰苯二甲酰－L－谷氨酸酐，在室溫下將其直接與L－胱氨酸鈉水溶液作用生成二鄰苯二甲酰－γ－L－谷氨酰－L－胱氨酸，加入水合肼溶液中放置二天除去保護(hù)基，得到γ－L－谷氨酰－L－胱氨酸，電解還原制備γ－L－谷氨酰－L－半胱氨酸。該合成方法具有原料價(jià)格低廉、生產(chǎn)成本低、反應(yīng)速度快、選擇性高、收率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07C231/00GK1810769SQ20061003843
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日
發(fā)明者焦慶才, 錢紹松, 王先斌, 曾慶群, 陳然, 肖國(guó)安 申請(qǐng)人:南京大學(xué), 湖北新生源生物工程股份有限公司