專利名稱：：白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜類化合物單體的提取、分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及從白花蛇舌草中提取、分離純度在90%以上的環(huán)烯醚萜類化合物單體，即E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯的方法。
背景技術(shù)：
：白花蛇舌草(^eoy"^W/Yksa)為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的全草，主產(chǎn)分布于廣東、廣西、福建等地，其化學(xué)成分主要為E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯等環(huán)烯醚萜類、齊墩果酸等三萜類和蘆丁等黃酮類。白花蛇舌草以全草入藥，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛的功能，廣泛用于治療扁桃體炎、咽喉炎、尿路感染、盆腔炎、闌尾炎、肝炎、菌痢、毒蛇咬傷和腫瘤。但是白花蛇舌草及其制成的各種藥品在質(zhì)量控制方面研究較少；白花蛇舌草藥材及其制劑多用定量齊墩果酸作為質(zhì)量控制的指標(biāo)；白花蛇舌草注射液用總黃酮(蘆丁計(jì))的含量作為質(zhì)量控制的指標(biāo)。到目前為止沒有報(bào)道以白花蛇舌草中含量最高的環(huán)烯醚萜類化合物E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯作為白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜類化合物的質(zhì)量控制的指標(biāo)。關(guān)于E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯制備方法的報(bào)道有0.5Kg白花蛇舌草用甲醇提取、提取液濃縮后加水溶解，先后用氯仿、正丁醇萃取，正丁醇萃取物上硅膠柱層析兩次，再上活性碳柱，得到0.97gE-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯，得率為O.194%(Y.Nishihamaetal.,P/朋toMW.，1981，Vol43，28-33);另一種方法是吳孔松用409&乙醇提取6Kg白花蛇舌草、提取液濃縮后加水溶解，分別經(jīng)大孔樹脂柱，聚酰胺柱，S印hadexLH-20柱層析，聚酰胺柱，硅膠柱層析，S印hadexLH-20柱層析分離，得到O.48gE-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯，得率為0.008%(吳孔松，中國藥學(xué)雜志2005年6月第40巻第11期)。以上分離方法，均應(yīng)用三步以上柱層析，且采用大量不易回收利用的有機(jī)溶劑，方法繁鎖，成本高，產(chǎn)品得率低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種簡單可行，成本較低，得率較高且適合工業(yè)化從白花蛇舌草中提取、分離純度在90%以上的環(huán)烯醚路類化合物單體，即E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯的方法。本發(fā)明所述的白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜類化合物單體是指E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酉旨(C26H30O13，6畫0-p-coumaroylscandosidemethylester)，其結(jié)構(gòu)式如下本發(fā)明所述的一種從白花蛇舌草中提取、分離得純度為90%以上的環(huán)烯醚萜類化合物單體，即E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯的方法，該方法包含如下步驟(1)將粉碎的白花蛇舌草放到第一醇水溶液中加熱回流提取，濾過，濃縮得浸膏(I)，加適量水溶解，濾過，濃縮得浸膏(II);(2)步驟(1)濃縮后的浸膏(II)加入第二醇水溶液中溶解，大孔樹脂桂分離，用第三醇水溶液洗脫，冼脫液濃縮，得到初品；(3)步驟(2)所得到的初品以第四醇水溶液溶解后，用S印hadexLH-20柱層析，用第五醇水溶液梯度洗脫，濃縮，結(jié)晶。本發(fā)明所述方法中，步驟(1)中所述第一醇水溶液中醇的體積濃度為30%95%，白花蛇舌草與提取用第一醇水溶液的重量比為1:110,優(yōu)選比例為l:310。提取次數(shù)為15次，提取時(shí)間為0.54小時(shí)。所述浸膏(I)的相對密度為1.11.3(60°C)，浸膏(II)的相對密度為l.l1.3(60°C)。本發(fā)明步驟(2)中所述大孔樹脂柱中使用的大孔樹脂可為苯乙烯類樹脂、甲基丙烯酸酯類樹脂，優(yōu)選為苯乙烯類樹脂。步驟(2)所述第二醇水溶液中醇的體積濃度為0%40%;浸膏(II)與第二醇水溶液的重量比為h120;優(yōu)選為1:210;浸膏(II)與大孔樹脂的重量比為1:16;步驟(2)中醇水溶液洗脫可采用梯度洗脫方式，選脫用的第三醇水溶液中醇的體積濃度為20100%。在本發(fā)明步驟(3)中溶解初品用的第四醇水溶液中醇的體積濃度為20%100%;初品與第四醇水溶液的重量比為1:18，優(yōu)選為1:24;所述的第五醇水溶液中醇的體積濃度為20%100%。結(jié)晶用第六醇水溶液，第六醇水溶液中醇的體積濃度為20%~95%。上述第一醇水溶液，第二醇水溶液，第三醇水溶液，第四醇水溶液，第五醇水溶液，第六醇水溶液中所用的醇為甲醇或乙醇。經(jīng)本發(fā)明所述的方法提取、分離得到的五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯，實(shí)驗(yàn)證實(shí)對肝癌SMMC-7721細(xì)胞有抑制效應(yīng)。經(jīng)本發(fā)明所述的方法提取、分離得到的純度90%以上￡-6-0-香豆酰雞屎6藤次苷甲酯可作為白花蛇舌草藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的對照品。采用本發(fā)明所述的方法不僅可在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備，而且可工業(yè)化大量分離得到f-6-0-莕豆酰雞屎藤次苷甲酯化合物，其含量在90。/。以上。該方法所用柱材料及溶劑可反復(fù)利用，不污染環(huán)境，成本較低，得率較高，易于控制和操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式結(jié)合下面實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1粉碎的白花蛇舌草lKg,用乙醇的體積濃度為95%的乙醇水溶液加熱回流提取2次，每次提取2小時(shí)，所述的白花蛇舌草與乙醇水溶液的重量比為1:1.5，濾過，濃縮得浸膏(I)(相對密度1.197，60°C)，加水溶解，濾過，濾液減壓濃縮得浸膏(II)(相對密度1.156，60°C)。浸膏(II)用乙醇的體積濃度為20%的乙醇水溶液溶解，浸膏(II)與乙醇水溶液重量比為l:5;上MCIgelCHP20P(苯乙烯類)大孔樹脂柱層析，浸膏(II)和大孔樹脂MCIgelCHP20P的重量比為1:1;以20%、30%、40%、50%、60%乙醇梯度洗脫，薄層層析跟蹤檢測，在50%乙醇洗脫部位有一較大斑點(diǎn)，收集該斑點(diǎn)濃縮后，用甲醇的體積濃度為20%甲醇水溶液溶解，濃縮后得初品。初品用甲醇的體積濃度為40%的甲醇水溶液溶解，初品與甲醇水溶液的重量比為h1.5;溶解后上SephadexLH-20柱分離，先用甲醇的體積濃度為20%甲醇水溶液1000毫升洗脫，再用甲醇1000毫升洗脫。甲醇洗脫液濃縮后，以體積濃度為20%甲醇水溶液結(jié)晶，即得產(chǎn)物E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯，純度為99.4%,得率0.35%。薄層層析條件硅膠G薄層板；展開劑氯仿-甲醇-水(v:v:v)=25:5:0.5;顯色吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105'C烘至斑點(diǎn)清晰HPLC純度分析色譜柱ZorbaxXDB-C8，5p，4.6X150mm流動相體積比為10-90%MeOH/H20,15分鐘流速lmL/min;檢測溫度3(TC;檢測器UV254nm結(jié)果保留時(shí)間10.049min，含量99.4%產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定NMR(300MHz，CD3OD，3):7.28(1H，d，16.2Hz，H-a)，7.16(1H，d，1.2Hz,H-3),7.12(2H，d，8.7Hz，H-2"，6")，6.46(2H，d，8.7Hz，H-3"，5")，5.99(1H，d，16.2Hz,H-卩)，5.50(1H，m，H國7)，5.32(1H，m，H-6)，4.96(1H，d，6.0Hz，H-l)，4.34(1H，d，7.8Hz，H-l')，4.04(1H，d，15.6Hz，H-IO)，3.87(1H，d，15.6Hz，H-IO)，3.54(1H，d，12.3Hz，H-6')，3.102.80(6H，m，H畫5，2'，3'，4'，5'，6')，2.93(3H，s，H-12),2.74(1H，瓶6.3，6.7Hz，H-9)。13CNMR(75MHz，CD3OD，S):169.2(11)，169.0(力，161.4(4")，154.2(3)，150.5(8)，146.7(a)，131.3(2"，6")，127.3(l")，127.3(7)，117.0(3"，5")，115.6(卩)，110.1(4)，100.4(r)，98.0(1),83.7(6)，78.5(3')，78.0(5')，74.9(2')，71.6(4'),62.8(6'),61.1(10),52.1(12),47.0(9)，42.4(5)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Y.Nishihama，etal.,尸/aw/aMW.，1981，43，28-33;H.Wu,etal.，尸ra^，54，254-256.)報(bào)道一致，確證該化合物為￡-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯。實(shí)施例2-6實(shí)施例2-6提取、分離步驟參見實(shí)施例1，實(shí)施例中所采用的是粉碎的白花蛇舌草1kg，各例的提取、分離條件見下表1表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>61用乙醇的體積濃度為70%的乙醇水溶液加熱回流提取3次，每次提取2小時(shí)，白花蛇舌草與所用的乙醉水溶液的重量比為l:7;產(chǎn)物純度91.2%，得率0.42%。2浸膏(II)用甲醇的體積濃度為0%醇水溶液溶解，所加入醇水溶液與浸膏(II)的重量比為1:20;上MCIgelCHP20P大孔樹脂柱層析，以20%、30%、40%、50%、80%甲醇梯度洗脫；浸膏(II)和大孔樹脂MCIgelCHP20P的重量比為1:2;3初品用乙醇的體積濃度為75%乙醇水溶液溶解，初品與乙醇水溶液的重量比為1:5.5;溶解后上SephadexLH-20柱分離，先用乙醇的體積濃度為75%乙醇水溶液、再用純乙醇洗脫；結(jié)晶用體積濃度為95%的乙醇水溶液。實(shí)施例7對癌細(xì)胞株的抑制作用試驗(yàn)受試物E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯陽性對照5-氟尿嘧啶(5-FU)細(xì)胞株肺癌A549和肝癌SMMC-7721(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)實(shí)驗(yàn)方法E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯用培養(yǎng)液配成母液(10"mol/L),臨用前再以培養(yǎng)液稀釋成不同濃度。8MTT(噻唑藍(lán))試驗(yàn)將A549和SMMC-7721細(xì)胞分別以每孔3000和5000個(gè)接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后吸棄上清液，每孔加入含不同濃度藥物培養(yǎng)液100pL，濃度分別為10-4，10-5,IO'6，10-7,10-8mol/L，以相同濃度的5-說明書第9/10頁氟尿嘧啶(5-FU)作為陽性對照，另以完全培養(yǎng)液作為對照組，并預(yù)留空孔作為空白對照，作用2d后，除空白外，每孔加入10濃度為5mg/mLMTT溶液，37。C保溫4h后，吸棄上清液，每孔(包括空白)加入150jaLDMSO，振蕩15min后用酶標(biāo)儀在570nm處測定OD(吸光度值)，并按照以下公式計(jì)算抑制率(對照組OD-給藥組OD)inno/押制率=(對照組OD-空白組OD)x100/0統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)輸入Excel表，采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下列表2。表2.MTT法測定E-6-O-香豆酰雞屎藤次苷甲酯對A549和SMMC-7721細(xì)胞的影響(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*P〈0.05與對照組相比；從表2中可以看出E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯在10-W劑量時(shí)對S畫C-7721細(xì)胞有一定的抑制作用。實(shí)施例8以實(shí)施例l的產(chǎn)物五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯作為白花蛇舌草藥材及飲片質(zhì)量控制指標(biāo)的對照品。通過定性定量五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯可有效控制白花蛇舌草藥材及飲片產(chǎn)品的質(zhì)量。環(huán)烯醚萜苷類成分五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯為白花蛇舌草指標(biāo)性成分，可直接用于該藥材的定性鑒定。采用HPLC對其含量進(jìn)行分析測定，可作為白花蛇舌草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。通過對江蘇吳江、江蘇昆山、江西樟樹等3個(gè)不同產(chǎn)地，5批不同原藥材樣品，以￡-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯含量為測定指標(biāo)，用HPLC法進(jìn)行測試，測試結(jié)果表明，以上產(chǎn)地的白花蛇舌草原藥材樣品均含￡-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯，其中江蘇吳江樣品五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯含量較高且穩(wěn)定。五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯含量不低于0.30%,可以作為飲片標(biāo)準(zhǔn)化研究原藥材。依據(jù)《上海市中藥炮制規(guī)范》1994年版，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐進(jìn)行生產(chǎn)工藝研究，以五-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯含量等為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)確定了炮制工藝，并按優(yōu)選工藝連續(xù)生產(chǎn)10批樣品進(jìn)行工藝驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明，￡-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯含量穩(wěn)定，不少于0.30%，白花蛇舌草飲片質(zhì)量可靠。權(quán)利要求1.一種從白花蛇舌草提取、分離環(huán)烯醚萜類化合物單體，即E-6-O-香豆酰雞屎藤次苷甲酯的方法，其特征在于該方法包含如下步驟(1)將粉碎的白花蛇舌草放到第一醇水溶液中加熱回流提取，濾過，濃縮得浸膏(I)，加水溶解，濾過，濃縮得浸膏(II)；所述第一醇水溶液中醇的體積濃度為30～95％，白花蛇舌草與第一醇水溶液的重量比為1∶1～10；(2)浸膏(II)加入第二醇水溶液中溶解，大孔樹脂柱分離，用第三醇水溶液梯度洗脫，洗脫液濃縮，得到初品，所述第二醇水溶液中醇的體積濃度為0～40％，浸膏(II)與第二醇水溶液的重量比為1∶1～20；(3)初品用第四醇水溶液溶解后，用SephadexLH-20柱層析，用第五醇水溶液梯度洗脫，濃縮，結(jié)晶，所述第四醇水溶液中醇的體積濃度為20～100％，初品與第四醇水溶液的重量比為1∶1～8。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(1)中所述白花蛇舌草與第一醇水溶液的重量比為i:310。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(1)中所述的提取次數(shù)為15次，每次提取時(shí)間為0.54小時(shí)。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(2)中所述浸膏(n)與第二醇水溶液的重量比為1:210。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(2)中所述大孔樹脂柱中使用的大孔樹脂是苯乙烯類樹脂或甲基丙烯酸酯類樹脂。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于在步驟(2)中所述大孔樹脂柱中使用的大孔樹脂是苯乙烯類樹脂。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(2)中所述浸膏(II)與大孔樹脂的重量比為1:16。8.如權(quán)利要求1所迷的方法，其特征在于在步驟(2)中所迷冼脫用的第三醇水溶液中醇的體積濃度為20100%。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(3)中所述初品與第四醇水溶液的重量比為1:24。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在步驟(3)中所述洗脫用的第五醇水溶液中醇的體積濃度為20100%。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在步驟(3)中所述結(jié)晶用的第六醇水溶液中醇的體積濃度為2095%。12.如權(quán)利要求1，2，4,8，9,10，11中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述第一醇水溶液、第二醇水溶液、第三醇水溶液、第四醇水溶液、第五醇水溶液、第六醇水溶液中所述的醇為甲醇或乙醇。全文摘要本發(fā)明涉及一種從白花蛇舌草中提取、分離純度為90％以上的環(huán)烯醚萜類化合物單體的方法，所述的白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜類化合物單體是E-6-O-香豆酰雞屎藤次苷甲酯。該方法包含如下步驟(1)將粉碎的白花蛇舌草放到第一醇水溶液中加熱回流提取，濾過，濃縮得浸膏(I)，加水溶解，濾過，濃縮得浸膏(II)；(2)浸膏(II)用第二醇水溶液溶解，大孔樹脂柱分離，用第三醇水溶液洗脫，洗脫液濃縮，得到初品；(3)初品用第四醇水溶液溶解后用SephadexLH-20柱層析，用第五醇水溶液梯度洗脫，濃縮，結(jié)晶，即得產(chǎn)物E-6-0-香豆酰雞屎藤次苷甲酯。該方法所用柱材料及溶劑可反復(fù)利用，不污染環(huán)境，成本較低，得率較高，易于掌握，不僅適合于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模提取分離，也適合于工業(yè)化提取分離生產(chǎn)。文檔編號C07H1/00GK101096378SQ200610028468公開日2008年1月2日申請日期2006年6月30日優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日發(fā)明者斌孫,孫全忠,偉陳申請人:上海開拓者化學(xué)研究管理有限公司