專利名稱：一種凈化氯霉素的方法及其專用免疫親和色譜柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凈化氯霉素的方法及其專用免疫親和色譜柱。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)生物體內(nèi)的物質(zhì)及其變化產(chǎn)生了越來(lái)越濃厚的興趣，而生物樣本的分析就成為探索和發(fā)現(xiàn)生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度較低，而且大多數(shù)取樣量很少，這就對(duì)分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity chromatography)是一種將免疫反應(yīng)與色譜分析方法相結(jié)合的分析方法。它的高度選擇性和高親和性無(wú)疑使分析過程簡(jiǎn)化。在獸藥殘留分析中，IAC最簡(jiǎn)單而且最有效的應(yīng)用方式是作為理化測(cè)定技術(shù)(如HPLC，GC)的樣品凈化手段，這種聯(lián)用方法可使免疫學(xué)技術(shù)和理化技術(shù)在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接測(cè)定樣品的諸多不足。目前，該方法在抗體、激素、多肽、酶、重組蛋白、受體病毒及小分子化合物的分析中被廣泛應(yīng)用。
氯霉素(CAP)為廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體、立克氏體均有抑制作用。一直作為治療傷寒、副傷寒、沙門氏菌的首選藥物。氯霉素有較強(qiáng)的副作用和毒性作用，如果氯霉素在食用動(dòng)物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，長(zhǎng)期微量攝入氯霉素，不僅使大腸桿菌、沙門氏菌等產(chǎn)生耐藥性，而且會(huì)引起機(jī)體正常菌群失調(diào)，使人們易感染各種疾病，對(duì)人類的健康造成危害，如長(zhǎng)期攝入可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥，嬰兒長(zhǎng)期食用氯霉素污染的乳汁，可能會(huì)引起“灰嬰綜合征”。許多國(guó)家建立了氯霉素的殘留檢測(cè)方法并作出了殘留限量的規(guī)定。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織于1994年決定禁止使用氯霉素，世界上許多國(guó)家禁止此藥用于生產(chǎn)食品動(dòng)物，并規(guī)定了其在畜產(chǎn)品中最高殘留限量。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。檢測(cè)限問題已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)檢出限的要求越來(lái)越嚴(yán)格。歐盟規(guī)定為0.1μg/kg，美國(guó)FDA規(guī)定為0.3μg/kg，且目前正在研究應(yīng)用更靈敏的方法，可使檢出限達(dá)到0.1μg/kg。因此氯霉素的檢測(cè)方法和檢出限已成為國(guó)際貿(mào)易中的新的技術(shù)壁壘。
目前檢測(cè)氯霉素的方法主要有氣相色譜法(GC-ECD)、高效液相色譜法(HPLC-UV)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC-MS)和酶聯(lián)免疫法ELISA等。這些方法的前處理利用液-液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。免疫親和技術(shù)是90年代在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用的新技術(shù)，但用免疫親和柱凈化基質(zhì)中的氯霉素報(bào)道很少，且檢測(cè)限較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凈化氯霉素的方法及其專用免疫親和吸附劑。
本發(fā)明所提供的凈化氯霉素的免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的氯霉素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述氯霉素多克隆抗體或氯霉素單克隆抗體是以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述氯霉素半抗原是將氯霉素琥珀酸酯溶于蒸餾水中，再加入嗎啉代碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，室溫?cái)嚢韬蟮玫铰让顾氐溺晁嵫苌锛礊槁让顾匕肟乖?br> 氯霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將氯霉素(CAP)用嗎啉代碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺?；映隽艘粋€(gè)含4個(gè)碳的間隔臂形成半抗原，這樣突出了氯霉素半抗原決定簇的特征結(jié)構(gòu)，有助于制出針對(duì)氯霉素抗原特異性較強(qiáng)的多克隆抗體。再將氯霉素采用N-羥基琥珀酸亞胺活性脂法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的結(jié)合摩爾比分別為17∶1和19∶1。
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為Sepharose 4B。
所述氯霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述氯霉素單克隆抗體優(yōu)選為氯霉素鼠單克隆抗體，所述氯霉素多克隆抗體優(yōu)選為氯霉素兔多克隆抗體。
所述氯霉素鼠單克隆抗體優(yōu)選為氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCCNo.1605分泌的單克隆抗體。
所述氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCC No.1605已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液可為甲醇。
所述試劑盒中還包括洗滌液、稀釋液和保存液；所述洗滌液為pH7.4，含10％甲醇的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，100mL甲醇；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4；所述試劑盒中還包括稀釋液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
該免疫親和吸附劑以及裝載有該吸附劑的色譜柱基于免疫反應(yīng)和色譜反應(yīng)，適合從生物樣品(如肌肉、肝、肺、腎、血漿)中凈化氯霉素，便于殘留分析。在該免疫親和色譜柱中，兔多克隆抗體和氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率分別是85.21％±1.5％、88.2±1.5％。動(dòng)態(tài)柱容量為2800-3500ng，在使用了16次后柱容量為總柱容量的58％左右，保存期為1年。
本發(fā)明所提供的凈化氯霉素的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理動(dòng)組織樣品勻漿物以10.0克的量加入20ml乙酸乙酯，渦動(dòng)混勻，靜置10分鐘，3800g離心5分鐘，吸取上清，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5ml質(zhì)量百分含量為4％的NaCl溶液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，冷卻至室溫，加入5ml正己烷，振蕩，棄上層正己烷相，得到樣品溶液；2)將步驟1)得到的樣品溶液過免疫親和色譜柱，然后用洗滌液和水洗滌，再用上述洗脫液洗脫，得到純化的氯霉素溶液。
本發(fā)明的免疫親和吸附劑及色譜柱具有高選擇性，使樣品前處理過程大大簡(jiǎn)化，尤其適用于肌肉、肝和血漿中微量CAP的前處理，分析質(zhì)量得到改善。免疫親和吸附劑的高選擇性使得氯霉素分析方法的檢測(cè)限將主要取決于取樣量，這是單純理化手段難以達(dá)到的；本發(fā)明的免疫親和吸附劑及色譜柱對(duì)待測(cè)組分有很強(qiáng)的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實(shí)測(cè)樣品條件下免疫親和吸附劑對(duì)組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發(fā)明的方法對(duì)組分凈化的同時(shí)還可提供定性信息。本發(fā)明的方法水相操作，操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，免疫親和色譜柱能重復(fù)使用，能節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明的凈化方法結(jié)合色譜法可高效檢測(cè)氯霉素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。


圖1為未添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肌肉組織氣相色譜2為添加0.05μg/kg氯霉素樣品的雞肌肉組織的氣相色譜3為未添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肝臟氣相色譜4為添加0.1μg/kg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肝臟氣相色譜圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、凈化氯霉素的免疫色譜柱的制備1、氯霉素兔多克隆抗血清的制備氯霉素半抗原的合成將氯霉素琥珀酸酯溶于蒸餾水中，再加入嗎啉代碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，室溫?cái)嚢韬蟮玫铰让顾氐溺晁嵫苌锛礊槁让顾匕肟乖?。具體方法如下所述(1)將700mg氯霉素琥珀酸酯(1.6m mol)溶于500ml蒸餾水中。
(2)635mg嗎啉代碳化二亞胺(CMC，1.5m mol)溶于10ml蒸餾水中，與175mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS，1.5m mol)混合加入步驟(1)得到的溶液中，調(diào)節(jié)PH至5.3，在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，得到氯霉素半抗原。
免疫原的制備采用N-羥基琥珀酸亞胺活性脂法，將氯霉素半抗原與蛋白質(zhì)載體牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制成BSA-CAP或OVA-CAP偶聯(lián)物，即免疫原。
動(dòng)物免疫采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，免疫劑量為1mg·ml-1BSA-CAP偶聯(lián)物或1mg·ml-1OVA-CAP偶聯(lián)物。將新西蘭兔子飼養(yǎng)數(shù)周后接種免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐劑乳化，加強(qiáng)免疫用1ml不完全弗氏佐劑乳化。每次免疫間隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐劑直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d后采血檢測(cè)，測(cè)定血清效價(jià)后，頸動(dòng)脈放血，收集血清。
2、氯霉素鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫采用BALA/C小鼠作為免疫動(dòng)物、以上述氯霉素半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)物BSA-CAP為免疫原，免疫劑量為50μg/只(體積為0.1ml)加等體積的完全弗氏佐劑乳化，進(jìn)行首次免疫。一個(gè)月后，取同樣量免疫抗原加不完全弗氏佐劑，乳化，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，再過一個(gè)月后同法再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫，二免后10天采血，測(cè)定抗體效價(jià)，取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合脾細(xì)胞按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株-氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCCNo.1605。氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCC No.1605已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
單克隆抗體大量生長(zhǎng)及提純采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605 5×105-106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。
單克隆抗體的保存在液氮-20℃下保存，使用時(shí)37℃水浴快速解凍。
3、IgG的純化采用飽和硫酸胺鹽法(SAS)和DEME纖維素離子交換層析法純化抗血清或腹水。其具體步驟如下(1)SAS鹽析1)50％飽和度鹽析取上述制備的兔抗血清和注射氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605得到的鼠腹水各5ml，加等量0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)混勻，然后逐漸滴加等體積的飽和硫酸銨(pH7.4)溶液，邊加邊攪拌，室溫放置30min，3000g離心30min，棄上清液留沉淀。2)33％飽和度鹽析在步驟1)得到的沉淀中分別加入5ml 0.01mol/L PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)溶解沉淀，再加飽和硫酸銨溶液達(dá)到33％飽和度，邊加邊攪拌，室溫放置30min，棄上清液留沉淀。重復(fù)操作2次。3)脫鹽取0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)溶解步驟2)得到的沉淀，裝于透吸袋中，懸于盛有0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)的燒杯中脫鹽，放置于4℃，每天換液3-4次，1％BaCl2檢測(cè)直至透析液中無(wú)硫酸根離子為止。4)透析完畢，3000g離心5min，取上清液置-20℃冰箱保存，進(jìn)行DEME-纖維素離子交換層析。
(2)DEME-纖維素離子交換層析1)DE-52纖維素的處理稱取2g DE-52纖維素粉末，置于盛有重蒸餾水的燒杯中，充分?jǐn)嚢?，靜置后去掉多余溶液，然后加入0.5mol/LNaOH溶液，攪拌均勻，1h后布氏漏斗抽濾，接著用重蒸水充分洗滌至中性。再用0.5mol/L HCl溶液以同樣的方法處理。最后換用0.5mol/L NaOH溶液處理一次，充分水洗至中性。2)平衡將經(jīng)步驟1)處理的DE-52纖維素浸泡于0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中，充分洗滌，靜置后去掉多余溶液，如此反復(fù)2-3次，直至上清液pH達(dá)到7.4為止。3)裝柱將平衡后的DE-52纖維素用滴管連續(xù)加入層析柱中，用洗脫液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，pH7.4)連續(xù)洗脫，充分流洗，直到流出液pH值與洗脫液的pH值相同為止。4)加樣將經(jīng)步驟(1)SAS鹽析得到的抗體用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g))稀釋，然后沿層析柱壁緩慢加入，打開層析柱出口，讓IgG稀釋液流入柱床內(nèi)，再用磷酸鹽緩沖液沖洗柱壁。5)洗脫和收集加入洗脫液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，pH7.4)，每管2ml收集，邊收集邊用20％磺基水楊酸檢測(cè)IgG洗脫情況。6)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定IgG溶液在280nm和260nm處的0D值，得到純化的氯霉素兔多克隆抗體和氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體，純化后的IgG在-20℃冰箱保存。
4、免疫色譜柱(IAC)的制備基質(zhì)的準(zhǔn)備取溴化氰活化的Sepharose 4B干凍粉，在盛有1.0mmol l-1HCl的G3漏斗中膨脹。
抗體IgG的準(zhǔn)備用0.1mol/L的NaHCO3溶液將純化的兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體稀釋，調(diào)溶液的pH值為8.4。
偶聯(lián)反應(yīng)將膨脹的溶膠用0.1mol/L的NaHCO3溶液平衡后，轉(zhuǎn)入上述單克隆抗體溶液中，混合，4℃下緩慢攪拌20-24hr。偶聯(lián)率的檢測(cè)結(jié)果表明，兔多克隆抗體和氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率分別是85.21％±1.5％、88.2±1.5％。
活化位點(diǎn)的封閉將上述偶聯(lián)后的凝膠轉(zhuǎn)入盛有0.1mol/L、pH4.0的Tris-HCl緩沖液中，混合，4℃下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)。
洗滌凝膠用5倍體積的0.1mol/L、pH4.0醋酸鹽緩沖液和0.1mol/L、pH8.0 Tris-HCl緩沖液交替沖洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡后，抽干的凝膠轉(zhuǎn)入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN31g)中，4℃下存放備用。
裝柱將偶聯(lián)有氯霉素兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCCNo.1605分泌的單克隆抗體的免疫吸附劑轉(zhuǎn)入到含G3濾板的柱里，制成偶聯(lián)有兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的確定將步驟4制備的偶聯(lián)有兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱，用10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)、5ml純水、和5ml甲醇洗柱，輕輕上下晃動(dòng)IAC柱，趕走柱里的氣泡，再以10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS平衡。將含有500ng·ml-1氯霉素(CAP)的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)連續(xù)加到IAC柱，自然重力下流出。當(dāng)柱達(dá)到飽和后(流出液中CAP和加樣液濃度相同)，用10ml PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g、100ml甲醇)、5ml純水洗滌IAC柱，除去提取液中干擾雜質(zhì)。最后用6ml甲醇將CAP洗脫，自然重力下流出，收集，吹干，然后加入40μl衍生化試劑sylon BFT渦動(dòng)混勻，用封口膜封口，60℃衍生化30分鐘，冷卻至室溫，然后加入450μl甲苯并迅速加入150μl純水，渦動(dòng)30s，靜置分層后，吸取上層甲苯相3μl進(jìn)行GC分析。計(jì)算出動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量。動(dòng)態(tài)柱容量(dynamic columncapacity)是指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對(duì)待測(cè)物的最大吸收值。絕對(duì)柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗體對(duì)待測(cè)物的最大結(jié)合容量。結(jié)果表明偶聯(lián)有兔多克隆抗體的免疫色譜柱的動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量分別為3100ng/ml、690ng/mg；偶聯(lián)有雜交瘤細(xì)胞株氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCCNo.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量分別為3500ng/ml、850ng/mg。
實(shí)施例2、偶聯(lián)有兔多克隆抗體或鼠單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒的制備及其對(duì)氯霉素的凈化效果1、凈化氯霉素的試劑盒的制備該試劑盒由免疫色譜柱(IAC柱)，標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑，稀釋液，洗滌液，洗脫液，保存液，海綿托架所組成，海綿托架上設(shè)有孔和凹槽。海綿托架的凹槽內(nèi)有裝有標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑，稀釋液，洗滌液，洗脫液，保存液的試劑瓶，海綿托架的孔內(nèi)裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實(shí)施例1制備的偶聯(lián)有兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱。
洗滌液為磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，100mL甲醇。
洗脫液為色譜級(jí)的甲醇。
保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
稀釋液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
將含有偶聯(lián)有兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCCNo.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒分別放在4℃，有效期為12個(gè)月。
2、氯霉素的提取效果實(shí)驗(yàn)IAC提取原理是，將特異性抗體氯霉素兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體和惰性基質(zhì)偶聯(lián)，制備免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)含氯霉素的混合物流過IAC柱時(shí)，固定抗體選擇性地結(jié)合氯霉素，其它不被識(shí)別的樣品雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱，經(jīng)洗滌后，將抗原-抗體復(fù)合物解離洗脫，氯霉素得到凈化或分離。IAC柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用。
檢測(cè)樣品的處理分別取雞肌肉和雞肝臟組織置于勻漿機(jī)中，于10000rpm下勻漿3分鐘。置于-20℃保存?zhèn)溆谩７謩e稱取10.0克已勻漿的雞肌肉和雞肝臟組織樣品，置于100ml聚丙烯離心管中，雞肌肉樣本按0.05μg/kg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加氯霉素、雞肝臟組織樣品按0.1μg/kg濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加氯霉素，再加入20ml乙酸乙酯，渦動(dòng)混勻1分鐘，靜置10分鐘，3800g離心5分鐘，吸取上清置于100ml雞心瓶中，50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加入質(zhì)量百分含量為4％的NaCl溶液5ml，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5分鐘，冷卻至室溫，加入5ml正己烷，振蕩，棄上層正己烷相，收集下層(4％ NaCl層)即得樣品溶液。
將偶聯(lián)有兔多克隆抗體或氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，用10ml的試劑盒中的洗滌液沖洗，然后將上述的樣品溶液過柱，用10ml洗滌液、5ml純水洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質(zhì)。用4ml洗脫液洗脫，在50℃ N2氣流下吹干，然后加入40μl衍生化試劑sylonBFT渦動(dòng)混勻，用封口膜封口，60℃衍生化30分鐘，冷卻至室溫，然后加入450μl甲苯并迅速加入150μl純水，渦動(dòng)30s，靜置分層后，吸取上層甲苯相3μl進(jìn)行氣相色譜GC分析，測(cè)定氯霉素的含量，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液稀釋。其中，進(jìn)樣口溫度260℃；檢測(cè)器溫度300℃。柱溫采用程序升溫，初溫150℃(0.5min)，升溫速率30℃/min。終溫270℃保持5分鐘。平均線速度50cm/sec；恒壓無(wú)分流模式；μECD檢測(cè)器；載氣高純氮；進(jìn)樣體積3μl。IAC柱用20ml的保存液平衡保存于4℃?zhèn)溆?。結(jié)果表明，用IAC進(jìn)行樣品凈化，不干擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說(shuō)明制備的IAC非特異性吸附極小，其中偶聯(lián)有氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫親和色譜柱對(duì)于雞肌肉的凈化效果如圖1和圖2所示；偶聯(lián)有氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體的免疫親和色譜柱對(duì)于雞肝臟的凈化效果如圖3和圖4所示，其中圖2和圖4中的箭頭示氯霉素。
權(quán)利要求
1.一種凈化氯霉素的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯(lián)的氯霉素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述氯霉素多克隆抗體或氯霉素單克隆抗體是以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述氯霉素半抗原是將氯霉素琥珀酸酯溶于蒸餾水中，再加入嗎啉代碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，室溫?cái)嚢韬蟮玫铰让顾氐溺晁嵫苌锛礊槁让顾匕肟乖?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠，優(yōu)選為Sepharose 4B；所述氯霉素單克隆抗體為氯霉素鼠單克隆抗體；所述氯霉素多克隆抗體為氯霉素兔多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吸附劑，其特征在于所述氯霉素鼠單克隆抗體為氯霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-3 CGMCC No.1605分泌的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.以權(quán)利要求1-4任一所述的免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱。
6.含有權(quán)利要求1-4任一所述的免疫親和吸附劑的試劑盒或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液為甲醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液和稀釋液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，100mL甲醇；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN3O.2g，pH7.4；所述稀釋液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
9.一種凈化氯霉素的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理動(dòng)物組織樣品勻漿物以10.0克的量加入20ml乙酸乙酯，渦動(dòng)混勻，靜置10分鐘，3800g離心5分鐘，吸取上清，50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加入5ml質(zhì)量百分含量為4％的NaCl溶液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5分鐘，冷卻至室溫，加入5ml正己烷，振蕩，棄上層正己烷相，得到含有樣品的溶液；2)將步驟1)得到的樣品溶液過權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱，然后用權(quán)利要求8所述的洗滌液洗滌，再用權(quán)利要求7所述的洗脫液洗脫，得到純化的氯霉素溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物組織樣品包括肌肉、肝、肺、腎和血漿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凈化氯霉素的方法及其專用免疫親和色譜柱。該色譜柱的填料為凈化氯霉素的免疫親和吸附劑，該免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的氯霉素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述氯霉素多克隆抗體或氯霉素單克隆抗體是以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述氯霉素半抗原是將氯霉素琥珀酸酯溶于蒸餾水中，再加入嗎啉代碳化二亞胺和N－羥基琥珀酰亞胺混合后，得到氯霉素的琥珀酸衍生物即為氯霉素半抗原。本發(fā)明的凈化方法結(jié)合色譜法高效檢測(cè)氯霉素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。
文檔編號(hào)C07C233/00GK1807402SQ20061000722
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者沈建忠, 張素霞, 史為民, 周金慧, 何方洋, 吳聰明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)