專利名稱：分離人抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了分離人抗體的方法。
背景技術(shù)：
單克隆抗體已經(jīng)成為重要的藥物，這主要是由于應(yīng)用單克隆可能實(shí)現(xiàn)高親和性和高選擇性。自從20世紀(jì)70年代首次開發(fā)出單克隆抗體以來(lái)，特異于感興趣的疾病靶標(biāo)的單克隆抗體的應(yīng)用提供了治療多種疾病的新的治療選擇，所述疾病包括但不限于癌癥和自身免疫病。
雖然產(chǎn)生和應(yīng)用單克隆抗體的方法隨時(shí)間得到了改進(jìn)，但是用于鑒定新的單克隆抗體的方法不是強(qiáng)大的、并且不可靠。例如，對(duì)人Ig轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫不能保證產(chǎn)生高親和力的抗體。進(jìn)一步地，雜交瘤的生成和篩選冗長(zhǎng)繁重并且耗費(fèi)時(shí)間。此外，雖然抗體噬菌體展示提供了優(yōu)于應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠的許多益處，但篩選努力是令人沮喪的。在這些方法中，對(duì)文庫(kù)大小的要求和以它們的原始構(gòu)象讓重鏈和輕鏈基因進(jìn)行配對(duì)的需要是費(fèi)時(shí)的、并且是得不到保證的。因此，需要有助于可靠地進(jìn)行抗體分離和鑒定的簡(jiǎn)單方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了分離人抗體的方法，包括純化B細(xì)胞；使B細(xì)胞與至少一種處于許多靶標(biāo)濃度的標(biāo)記靶標(biāo)接觸，以便鑒定出少量B細(xì)胞與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)的濃度；收集與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞；和區(qū)分、分離并鑒定抗體，B細(xì)胞結(jié)合靶標(biāo)于所述抗體。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞分離和純化自人供體血液或骨髓。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)被熒光標(biāo)記，通過FACS(熒光激活細(xì)胞分選)進(jìn)行收集。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞和靶標(biāo)在許多靶標(biāo)濃度下被組合起來(lái)，因此可以測(cè)定抗體的結(jié)合親和力。
在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction(PCR))鑒定抗體。在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，單個(gè)B細(xì)胞被培養(yǎng)，從而增加克隆群體。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)具有低濃度。在在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，低靶標(biāo)濃度是約1微摩(1e-6M)和約1皮摩(1e-12M)之間，而在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，低靶標(biāo)濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，抗原選自癌癥抗原Muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括確認(rèn)抗體。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，確認(rèn)通過產(chǎn)生scFv-酶融合實(shí)現(xiàn)。在一些更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，scFv-酶融合是scFv-BLA融合。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，確認(rèn)通過頭孢硝基噻吩試驗(yàn)(nitrocefin assay)進(jìn)行。
本發(fā)明也提供了分離人抗體的方法，包括下列步驟使B細(xì)胞與至少一種處于許多靶標(biāo)濃度的標(biāo)記靶標(biāo)接觸，以便鑒定出少量B細(xì)胞與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)的濃度；收集與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞；和區(qū)分、分離并鑒定抗體，B細(xì)胞結(jié)合靶標(biāo)于所述抗體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，B細(xì)胞分離和純化自人供體血液或骨髓。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)被熒光標(biāo)記，通過FACS進(jìn)行收集。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方案中，B細(xì)胞和靶標(biāo)在許多靶標(biāo)濃度下結(jié)合，因此可以測(cè)定抗體的結(jié)合親和力。
在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定抗體。在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，單個(gè)B細(xì)胞被培養(yǎng)，從而增加克隆群體。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)具有低濃度。在在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，低靶標(biāo)濃度是約1微摩(1e-6M)和約1皮摩(1e-12M)之間，而在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，低靶標(biāo)濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，抗原選自癌癥抗原Muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括確認(rèn)抗體。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，確認(rèn)通過產(chǎn)生scFv-酶融合蛋白實(shí)現(xiàn)。在一些更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，scFv-酶融合蛋白是scFv-BLA融合蛋白。在一些更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，確認(rèn)通過頭孢硝基噻吩試驗(yàn)進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了曲線圖，示出了B細(xì)胞(P1和P2)之間的競(jìng)爭(zhēng)，所述B細(xì)胞的濃度都是1-10M，與靶標(biāo)結(jié)合的P1和P2(分別是TP1和TP2)的濃度被繪制為靶標(biāo)濃度(T0)的函數(shù)。P1和P2的解離常數(shù)是Kd1＝1-10M，Kd2＝1-7M。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，y軸表示與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞的濃度(摩爾濃度)。如本圖所表明，被結(jié)合的B細(xì)胞量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。本圖基于應(yīng)用本文所提供的方法進(jìn)行計(jì)算。
圖2提供了曲線圖，示出了文庫(kù)(每種B細(xì)胞結(jié)合物的濃度是1-10M)中每種結(jié)合的B細(xì)胞TPi的濃度作為靶標(biāo)濃度的函數(shù)，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-12M；10種結(jié)合物(P2)，Kd＝1-11M；100種結(jié)合物(P3)，Kd＝1-10M；1000種結(jié)合物(P4)，Kd＝1-9M；10,000種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M(with 1 binder(P1)Kd＝Kd＝1-12M，10 binders(P2)at Kd＝1-11M，100 binders(P3)at Kd＝1-10M，1000 binders(P4)at Kd＝1-9M，and10,000 binders(P5)at Kd＝1-8M)。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，y軸表示與靶標(biāo)結(jié)合的成員的濃度(摩爾濃度)。如本圖中所示，對(duì)于成員P1至P5，所結(jié)合的B細(xì)胞的量是解離常數(shù)和文庫(kù)中的靶標(biāo)濃度的函數(shù)。本圖基于應(yīng)用本文提供方法進(jìn)行的計(jì)算。
圖3提供了曲線圖，示出了文庫(kù)(每種B細(xì)胞結(jié)合物的濃度是1-10M)中每種結(jié)合成員TPi的濃度作為靶標(biāo)濃度的函數(shù)，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-12M；10種結(jié)合物(P2)，Kd＝1-11M；100種結(jié)合物(P3)，Kd＝1-10M；1000種結(jié)合物(P4)，Kd＝1-9M；10,000種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M。所有條件與圖2所示相同，除了Kd＝1-8M的1種附加的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物(P6)以濃度1-4M被加入。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，y軸表示與靶標(biāo)結(jié)合的成員的濃度(摩爾濃度)。如本圖中所示，所結(jié)合的B細(xì)胞成員P1至P5的量是解離常數(shù)和文庫(kù)中的靶標(biāo)濃度的函數(shù)。本圖基于應(yīng)用本文提供方法進(jìn)行的計(jì)算。
圖4提供了曲線圖，示出了結(jié)合的B細(xì)胞濃度對(duì)靶標(biāo)濃度。本圖示出了文庫(kù)(每種成員的濃度是1-13M)中每種結(jié)合的B細(xì)胞結(jié)合物TPi的濃度，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-10M；5種結(jié)合物(P2)，Kd＝5-10M；25種結(jié)合物(P3)，Kd＝2.5-9M；50種結(jié)合物(P4)，Kd＝5-9M；100種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M(沒有其它結(jié)合物)。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，y軸表示與靶標(biāo)結(jié)合的成員的濃度(摩爾濃度)。本圖示出了，對(duì)具有成員P1至P5的典型文庫(kù)，所結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。本圖基于應(yīng)用本文提供方法進(jìn)行的計(jì)算。
圖5提供了曲線圖，示出了結(jié)合的B細(xì)胞濃度對(duì)靶標(biāo)濃度。本圖示出了文庫(kù)(每種成員的濃度是1-13M)中每種結(jié)合的B細(xì)胞結(jié)合物TPi的濃度，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-10M；5種結(jié)合物(P2)，Kd＝5-10M；25種結(jié)合物(P3)，Kd＝2.5-9M；50種結(jié)合物(P4)，Kd＝5-9M；100種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M(沒有其它結(jié)合物)。所有試驗(yàn)條件與圖4所示相同，除了1種附加的競(jìng)爭(zhēng)性非結(jié)合物(P6)以1-4M(1-8M Kd)存在。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，y軸表示與靶標(biāo)結(jié)合的成員的濃度(摩爾濃度)。本圖示出了，對(duì)具有成員P1至P5和一種加入的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的典型文庫(kù)，所結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。本圖基于應(yīng)用本文提供方法進(jìn)行的計(jì)算。
圖6提供了基于洗脫對(duì)保留、表示競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用的曲線圖。圖6A示出了在溶液中懸浮的B細(xì)胞結(jié)合物，而圖6B示出了與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞結(jié)合物，圖6C示出了與靶標(biāo)結(jié)合的一些B細(xì)胞結(jié)合物。描繪了三種不同類型的結(jié)合物，所有這三種需要相同的時(shí)間來(lái)粘合靶標(biāo)，所述時(shí)間約10秒，但是三種結(jié)合物中的每一種具有不同的解離速率(off rate)。解離速率為1分鐘的結(jié)合物由八邊形表示；示出了30個(gè)這樣的結(jié)合物。解離速率為10分鐘的結(jié)合物由三角形表示；示出了10個(gè)這樣的結(jié)合物。解離速率為100分鐘的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；示出了5個(gè)這樣的結(jié)合物。靶標(biāo)作為“X”顯示在圖底部。圖6示出了三類結(jié)合物與固定化靶標(biāo)的結(jié)合。本圖基于貫穿本發(fā)明申請(qǐng)文件中提供和進(jìn)行的計(jì)算。
圖7示出了降低靶標(biāo)濃度的效應(yīng)。圖7A示出了在溶液中懸浮的B細(xì)胞結(jié)合物。圖7B示出了與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞結(jié)合物；具有最慢的解離速率的分子(具有最低濃度的兩種類型的分子)被結(jié)合。圖7C示出了一些B細(xì)胞結(jié)合物，僅具有最慢解離速率(處于最低濃度)的結(jié)合物與靶標(biāo)結(jié)合。描繪了三種不同類型的結(jié)合物，所有這三種需要相同的時(shí)間來(lái)粘合靶標(biāo)，所述時(shí)間約10秒，但是三種結(jié)合物中的每一種具有不同的解離速率。解離速率為1分鐘的結(jié)合物由八邊形表示；示出了30個(gè)這樣的結(jié)合物。解離速率為10分鐘的結(jié)合物由三角形表示；示出了10個(gè)這樣的結(jié)合物。解離速率為100分鐘的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；示出了5個(gè)這樣的結(jié)合物。靶標(biāo)作為“X”顯示在圖底部。本圖示出了靶標(biāo)量有限時(shí)，三類結(jié)合物與固定化靶標(biāo)的結(jié)合。本圖基于貫穿本說(shuō)明書提供和實(shí)施的計(jì)算進(jìn)行。
圖8示出了向文庫(kù)中加入競(jìng)爭(zhēng)性B細(xì)胞結(jié)合物的效應(yīng)。圖8A示出了在溶液中懸浮的B細(xì)胞結(jié)合物。圖8B示出了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，和以高濃度和低解離速率與靶標(biāo)粘合的結(jié)合物。文庫(kù)中有四鐘不同類型的結(jié)合物，所有這四種需要相同的時(shí)間來(lái)粘合靶標(biāo)，所述時(shí)間約10秒，但是三種所描繪的結(jié)合物中的每一種具有不同的解離速率。解離速率為1分鐘的結(jié)合物由八邊形表示；示出了30個(gè)這樣的結(jié)合物。解離速率為10分鐘的結(jié)合物由等邊三角形和長(zhǎng)三角形表示；有10個(gè)表示為等邊三角形的結(jié)合物和50個(gè)表示為長(zhǎng)三角形的結(jié)合物。解離速率為100分鐘的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；示出了5個(gè)這樣的結(jié)合物。靶標(biāo)作為“X”顯示在圖底部。本圖示出了當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物是有限的情況下，三類結(jié)合物與固定化靶標(biāo)的結(jié)合作用。本圖基于應(yīng)用本文提供的方法進(jìn)行的計(jì)算。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了分離人抗體的方法。
如果本文沒有另外限定，本文應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。例如，Singleton and Sainsbury，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology，2d Ed.，John Wiley and Sons，NY(1994)；和Hale and Margham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù)語(yǔ)的一般釋義。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的其它參考文獻(xiàn)包括Sambrook et al，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York ，和Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene-Publishing & Wiley Interscience NY(1987；1999年增刊)。
雖然與本文所述的方法和材料相似或等價(jià)的各種方法和材料在本發(fā)明的實(shí)施中均有用處，但本文提供了優(yōu)選的方法和材料。因此，通過將說(shuō)明書作為整體參考，下文所定義的術(shù)語(yǔ)被更加充分地描述。同樣，如本文所用，如果上下文沒有另外的明確指定，單數(shù)“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“那個(gè)(the)”包括復(fù)數(shù)。
一般地，所應(yīng)用的名稱和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、和核酸化學(xué)及雜交，是公知的并且在本領(lǐng)域中普遍應(yīng)用。應(yīng)用重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成和化學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般地，根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化和/或分離步驟。
B細(xì)胞對(duì)其靶標(biāo)的結(jié)合親和力可以以如下術(shù)語(yǔ)描述其解離常數(shù)(Kd)、50％有效結(jié)合所需的濃度(EC50)、和/或50％抑制與靶標(biāo)結(jié)合的另一化合物的結(jié)合所需的濃度(IC50)?！癒o”定義為kOff/kon。koff值定義了復(fù)合物分開或分離的速率，而kon值描述了B細(xì)胞和靶標(biāo)結(jié)合形成復(fù)合物的速率。在本領(lǐng)域中，術(shù)語(yǔ)結(jié)合親和力有時(shí)指代復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性或反映結(jié)合親和力比值的任何其它可測(cè)定量的比值。選擇性被定義為結(jié)合親和力的比值或解離速率的比值(例如，靶標(biāo)分子Kd/抗靶標(biāo)分子Kd)。根據(jù)情況，需要增加kon，降低koff，或者增加kon并降低koff，這取決于用途。因此，預(yù)期所有這些修改將在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)有用。
如本文所用，詞語(yǔ)“類型(type)”是指由結(jié)合親和力(Kd)區(qū)分開的B細(xì)胞的類型，以其結(jié)合親和力與B細(xì)胞的另一類型相區(qū)分。例如，在包括三種不同類型的結(jié)合物的本發(fā)明的一些方法中，包含大概具有三種不同結(jié)合親和力的三類試劑?！邦愋汀痹趫D7中闡述，其中有三種不同類型的結(jié)合物1)解離速率為1秒的結(jié)合物；2)解離速率為10秒的結(jié)合物；和3)解離速率為100秒的結(jié)合物。
如本文所用，“蛋白質(zhì)”是指含有氨基酸并且被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是蛋白質(zhì)的任何組分。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“肽”和多肽在本文中可以交換使用。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本術(shù)語(yǔ)在文中的應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括蛋白質(zhì)的成熟形式以及相關(guān)蛋白質(zhì)的原形式(pro-forms)和前原形式(prepro-forms)。蛋白質(zhì)的前原形式(prepro forms)包括該蛋白質(zhì)的成熟形式、具有與該蛋白質(zhì)的氨基端可操作連接的原序列、并且具有與原序列的氨基端可操作連接的“前”序列或“信號(hào)”序列。這些術(shù)語(yǔ)也意圖包括這樣的序列，如抗體的序列。
本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。本文應(yīng)用如本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的三字母或單字母氨基酸縮寫。權(quán)利要求范圍中可以包含等價(jià)替換(例如，一種氨基酸替換為同一組中的另一種氨基酸)。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)包括一種或多種非經(jīng)典氨基酸?！胺墙?jīng)典氨基酸(Non-classical amino acids)”包括但不限于普通氨基酸的D異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸(4-aminobutyric acid(4-Abu))、2-氨基丁酸(2-aminobutyric acid(2-Abu))、6-氨基己酸(6-amino hexanoic acid(Ahx))、2-氨基異丁酸(2-aminoisobutyric acid(2-Aib))、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸?！霸O(shè)計(jì)(designer)”氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸類似物。
如本文所用，“抗體(Antibody)(Ab)”和“免疫球蛋白(immunoglobulin)(Ig)”是指定義為由人和其它動(dòng)物的B細(xì)胞和漿細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，其以高特異性與引起其產(chǎn)生的抗原(通常但不總是肽)或結(jié)構(gòu)上相似的抗原結(jié)合?？贵w可以通過已知方法學(xué)中的任意一種方法產(chǎn)生，可以是多克隆或單克隆抗體。該術(shù)語(yǔ)也包括嵌合抗體、人源化抗體、免疫球蛋白或抗體或與抗原結(jié)合的抗體功能片段。這種功能實(shí)體的例子包括完整抗體分子，抗體片段如Fv、單鏈Fv、互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining regions(CDRs))、VL(light chain variableregion(輕鏈可變區(qū)))、VH(heavy chain variable region(重鏈可變區(qū)))，和這些的任意組合或者能夠與靶抗原結(jié)合的免疫球蛋白肽的任何其它功能部分。
可以應(yīng)用多種免疫原制備本發(fā)明中應(yīng)用的抗體?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域已知的多種過程產(chǎn)生多克隆抗體。在產(chǎn)生抗體的一些實(shí)施方式中，通過注射相應(yīng)于本發(fā)明中感興趣靶的肽來(lái)免疫各種宿主動(dòng)物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，使肽與免疫原性載體(例如，白喉類毒素、牛血清白蛋白(bovine serumalbumin(BSA))或匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin[KLH]))偶聯(lián)。根據(jù)宿主種類，可以用各種佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、和潛在有用的人佐劑如BCG(Bacille Calmette-Guerin(卡介苗))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
為了制備單克隆抗體，提供用來(lái)由培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)都可以應(yīng)用(參見，例如，Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。這些包括但不限于最初由Khler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Khler and Milstein，Nature 256495-497 )，以及三系雜交瘤技術(shù)(trioma techique)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見例如Kozbor et al.Immunol.Today 472 )，和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(參見例如，Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96 )。在本發(fā)明一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了IgG類的單克隆抗體。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，單克隆抗體在無(wú)菌動(dòng)物中產(chǎn)生(參見例如，PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明，人抗體具有用處并且可以應(yīng)用人雜交瘤得到(參見例如，Cote et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030 )或通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞得到(參見例如，Cole et al，見上文(supra))。
描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778；并入本文作為參考)在產(chǎn)生特異地識(shí)別感興趣分子的單鏈抗體中具有用處。在一些實(shí)施方式中，應(yīng)用描述用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(參見例如，Huse et al，Science 2461275-1281 )使得能夠快速和容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
可以用已知技術(shù)產(chǎn)生含有抗體分子獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段。例如，這樣的片段包括但不限于可以通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab′)2片段；可以通過使F(ab′)2片段的二硫鍵還原而產(chǎn)生的Fab′片段，和可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸(oligonucleotide)”被定義為含有兩個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。精確大小取決于許多因素，這又取決于寡核苷酸的最終功能或應(yīng)用。寡核苷酸可以通過任意合適方法制備，包括，例如，克隆和限制適當(dāng)?shù)男蛄幸约巴ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適方法直接化學(xué)合成，例如磷酸三酯法(參見，Naranget al.，Meth.Enzymol，6890-99 )；磷酸二酯法(參見例如，Brown etal.，Meth.Enzymol.，68109-15l )；二乙基亞磷酰胺法(參見，Beaucage et al，Tetrahedron Lett.221859-1862 )，和固相支持法(參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,458,066)。對(duì)合成方法的多個(gè)有用綜述是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如，Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry1(3)165-187 )。上述參考文獻(xiàn)并入本文作為參考。
術(shù)語(yǔ)“低濃度(low concentration)“是指靶的濃度是從比B細(xì)胞結(jié)合物與靶的期望解離常數(shù)高約1,000倍至低約10倍。低濃度可以是如此濃度，例如，處于或低于文庫(kù)成員與靶標(biāo)結(jié)合的期望解離常數(shù)的10倍。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選濃度是約1微摩爾(1e-6M)至約1皮摩爾(1e-12M)之間，優(yōu)選地是約1e-7和約1e-11之間的任何濃度。
術(shù)語(yǔ)“正常(normal)”是指實(shí)體處于沒有可觀察到的和/或可檢測(cè)的異常或缺陷的狀態(tài)。因此，正常細(xì)胞是符合或遵守典型的、標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)方式、表達(dá)水平，符合其本身類型的未改變細(xì)胞的表型和基因型的細(xì)胞。相反地，“異常(abnormal)”是指不典型的(即，非典型)、不通常或非常規(guī)的、不正常的。因此，患病細(xì)胞是“異?！奔?xì)胞類型。
術(shù)語(yǔ)“靶(target)”是指由B細(xì)胞識(shí)別的物質(zhì)。任何適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)表面或非生物學(xué)表面在本發(fā)明中都有用。
在其它實(shí)施方式中，生物學(xué)表面是器官表面，而在可選的實(shí)施方式中，生物學(xué)表面是細(xì)胞或組織表面。在一些進(jìn)一步實(shí)施方式中，生物學(xué)表面是患病器官、組織或細(xì)胞的表面，而在一些可選實(shí)施方式中，生物學(xué)表面是正?；蚪】灯鞴?、組織或細(xì)胞的表面。
在再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，表面是組織間隙中的大分子。在另外的實(shí)施方式中，生物學(xué)表面是微生物的表面，包括但不限于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(蠕蟲、原生動(dòng)物等)。在一些實(shí)施方式中，微生物是動(dòng)物病原體，而在其它實(shí)施方式中，微生物對(duì)人和/或其它動(dòng)物而言是非病原性的。細(xì)胞和/或組織的來(lái)源包括人、非人動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和植物。
因此，預(yù)期任何生物學(xué)表面(例如細(xì)胞、組織、皮膚、指甲、內(nèi)部器官、外部器官和/或毛發(fā))作為本發(fā)明的靶是有用的。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是人的，而在可選的實(shí)施方式中，細(xì)胞是非人動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、或真菌細(xì)胞。本術(shù)語(yǔ)也包括含有病毒和/或病毒顆粒的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是造血細(xì)胞、癌細(xì)胞或反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
在可選的實(shí)施方式中，靶是血細(xì)胞，包括造血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞，以及紅細(xì)胞系、血小板系、白細(xì)胞系的各種不成熟細(xì)胞?！把?xì)胞(Blood cells)”包括但不限于造血細(xì)胞、紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，靶是異常血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，HSC靶具有表面抗原表達(dá)譜CD34+Thy-1+或CD34+Thy-1+Lin-(“Lin-”是指根據(jù)至少一種譜系特異性標(biāo)記的表達(dá)缺乏而選擇的細(xì)胞群)。分離和選擇HSCs的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,061,620、5,677,136和5,750,397，每一專利以整體并入本文)。
在其它實(shí)施方式中，靶標(biāo)是分子。在一些實(shí)施方式中，該分子是有機(jī)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該分子是生物分子。在其它實(shí)施方式中，生物分子是細(xì)胞相關(guān)分子。在再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞相關(guān)分子與細(xì)胞的外表面相連。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞相關(guān)分子是細(xì)胞外基質(zhì)的一部分。在一些其它實(shí)施方式中，細(xì)胞相關(guān)分子是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是受體。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞相關(guān)分子特異于特定細(xì)胞類型。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞是患病細(xì)胞和/或異常細(xì)胞。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，患病細(xì)胞是癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患病細(xì)胞是被感染的細(xì)胞。在本發(fā)明中用作靶標(biāo)的其它分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、糖類、脂類、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、毒性物質(zhì)、代謝物、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明包含的蛋白質(zhì)和化學(xué)靶標(biāo)的非限制性例子包括趨化因子和細(xì)胞因子及其受體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子(cytokine)”是指對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出多種效應(yīng)(例如，包括生長(zhǎng)、分化和/或增殖)的眾多因子中的任意一個(gè)。非限制性例子包括白介素(interleukins(IL))如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、EL-14和IL-16；可溶性IL-2受體；可溶性IL-6受體；促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin(EPO))；血小板生成素(thrombopoietin(TPO))；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF))；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stem cell factor(SCF))；白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor(LIF))；干擾素(例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)；制瘤素M(oncostatinM(OM))；免疫球蛋白超家族；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor(TNF))家族，特別是TNF-α；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(例如，TGF-α和TGF-β)；和IL-lα；和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor(VEGF))家族，特別是VEGF(本領(lǐng)域中也稱作VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor(PLGF))。細(xì)胞因子可以從幾個(gè)賣方商業(yè)得到，包括Amgen(Thousand Oaks，CA)、Immunex(Seattle，WA)和Genentech(South San Francisco，CA)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“組織(tissue)”是指一群或一層類似地專門化的細(xì)胞，它們共同行使一定的專門功能。在一些組織中，存在僅一種類型的細(xì)胞，而在其它組織中，存在不同類型的細(xì)胞。本術(shù)語(yǔ)包括但不限于淋巴組織、淋巴腺樣組織、脂肪組織、骨組織、蜂窩(aerolar)組織、軟骨組織、結(jié)締組織、彈性組織、內(nèi)皮組織、上皮組織、纖維組織、腺組織、腸相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid(GALT))、未分化組織、間質(zhì)組織、網(wǎng)狀組織、間充組織、骨髓組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、骨質(zhì)(osseous)組織、骨骼(skeletal)組織、皮下組織和其它組織類型。如本文所用，本術(shù)語(yǔ)也包括被修飾的組織。
術(shù)語(yǔ)“靶群(target population)”是指感興趣的靶的集合，B細(xì)胞或B細(xì)胞群暴露于所述集合。靶群可以包括單一靶或多種靶的集合，如本文所述。生物學(xué)表面，包括但不限于細(xì)胞、組織、皮膚、指甲、和/或毛發(fā)的任意集合被用作本發(fā)明中的靶群。
在一些實(shí)施方式中，靶群包括一組癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官，與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官有關(guān)的分子，或與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官有關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官。在一些實(shí)施方式中，靶群包括抗原或者抗原集合本身。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，靶是“癌癥相關(guān)靶(cancer-relaedtarget)”。本術(shù)語(yǔ)包括本發(fā)明組分與之結(jié)合的任何靶，所述結(jié)合作為對(duì)生物體中癌癥或癌癥相關(guān)狀態(tài)的診斷或檢測(cè)的一部分。例如，本術(shù)語(yǔ)包括癌細(xì)胞、癌組織和/或癌器官；與癌細(xì)胞、癌組織或癌器官有關(guān)的分子；和/或與癌細(xì)胞、癌組織或癌器官有關(guān)的分子、細(xì)胞、組織或器官(例如，給予對(duì)象的與腫瘤結(jié)合的診斷性分子)以及采自對(duì)象或健康組織(例如，與癌組織相連的脈管系統(tǒng))的活檢樣品。癌癥相關(guān)靶的例子在美國(guó)專利號(hào)6,261,535中提供，其以整體并入本文作為參考。然而，意圖不在于使本發(fā)明受限于任何特定的癌癥相關(guān)靶。癌癥相關(guān)靶可以涉及任何癌癥或癌癥相關(guān)狀態(tài)。癌癥的類型的例子包括，但不限于癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合類型的癌癥。
在一些實(shí)施方式中，癌癥是骨癌。例子包括，但不限于尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤和其它軟組織肉瘤。在其它實(shí)施方式中，癌癥是神經(jīng)系癌癥，包括但不限于腦瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜細(xì)胞瘤、腦膜瘤、淋巴瘤、神經(jīng)鞘瘤、和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。在另外的實(shí)施方式中，癌癥是乳腺癌(例如，乳腺中的原位導(dǎo)管癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是前列腺癌。在再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥(例如，腎上腺、胰腺、甲狀旁腺、垂體和甲狀腺)。在其它實(shí)施方式中，癌癥是消化系統(tǒng)癌癥(例如，肛門癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、口腔癌、舌癌、食道癌、胃(stomach)癌、膽囊癌、胃(gastric)癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌、和小腸癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是婦產(chǎn)科癌癥(例如，子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、輸卵管癌、妊娠期滋養(yǎng)層疾病(gestational trophoblastic disease)、絨毛膜癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是頭頸癌(例如，喉癌、口咽癌、甲狀旁腺癌和甲狀腺癌)。在其它實(shí)施方式中，癌癥是白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛細(xì)胞白血病和/或骨髓增生障礙)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是肺癌(例如，間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌)。在其它實(shí)施方式中，癌癥是淋巴瘤(例如，AIDS相關(guān)淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、何杰金病和非何杰金病)。在其它實(shí)施方式中，癌癥是骨髓瘤(例如，多發(fā)性骨髓瘤)。在再其它實(shí)施方式中，癌癥是兒科癌癥(例如，腦瘤、尤因肉瘤、白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病或急性骨髓性白血病)、肝癌、淋巴瘤(例如，何杰金淋巴瘤或非何杰金淋巴瘤)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)和維爾姆斯腫瘤。在再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是雄性生殖系統(tǒng)癌癥，包括但不限于前列腺癌、睪丸癌、附睪癌和陰莖癌。在其它實(shí)施方式中，癌癥是皮膚癌(例如，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、卡波西肉瘤、皮下腫瘤或黑色素瘤)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是甲狀腺癌(例如，乳頭狀甲狀腺癌、濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌或間變性(anaplastic)癌或未分化(undifferentiated)癌)。在其它實(shí)施方式中，癌癥是泌尿道癌癥(例如，膀胱癌、腎癌和尿道癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥或癌癥相關(guān)疾病是共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia-telangiectasia)、未知原發(fā)來(lái)源的癌癥、利弗勞梅尼綜合癥(Li-Fraumeni綜合癥)或胸腺瘤。在再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥是轉(zhuǎn)移癌。
在其它實(shí)施方式中，癌癥相關(guān)靶標(biāo)是與癌細(xì)胞或癌組織有關(guān)的分子。在一些實(shí)施方式中，分子是腫瘤抗原或腫瘤血管/腫瘤間質(zhì)抗原，例如，CD20、CD19、CD30、CD3、GD2、Lewis-Y、72kd糖蛋白(gp72、衰變加速因子(decay-accelerating factor)、CD55、DAF、C3/C5轉(zhuǎn)化酶)、CO17-1A(EpCAM、17-1A、EGP-40)、TAG-72、CSAg-P(CSAp)、45kd糖蛋白、HT-29ag、NG2、A33(43kd gp)、38kd gp、MUC-1、CEA、EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4、HN-1配體、CA125、黏結(jié)蛋白聚糖-1(syndecan-1)、Lewis X、FAP基質(zhì)Ag(成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein))、EDG受體(內(nèi)皮糖蛋白受體(endoglinreceptors))、ED-B、層粘連蛋白-5(γ2)、cox-2(+LN-5)、PgP(P-糖蛋白)、αVβ3整聯(lián)蛋白、αVβ5整聯(lián)蛋白、uPAR(尿激酶纖溶酶原激活劑受體(urokinase plasminogen activator receptor))、內(nèi)皮糖蛋白(CD 105)、GD2、氨基肽酶、生腱蛋白-C、NG-2、TEM1、TEM8、膜聯(lián)蛋白、葉酸受體骨橋蛋白(EDG 1，3)、p97(黑素運(yùn)鐵蛋白(melanotransferrin))、法尼基轉(zhuǎn)移酶或凋亡通路中的分子(例如，死亡受體、fas、胱天蛋白酶或bcl-2)或凝集素。
本發(fā)明也利用寬范圍的分子靶。合適的靶分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、糖類、脂類、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質(zhì)、代謝物、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞或組織。
其它蛋白質(zhì)和化學(xué)靶標(biāo)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)調(diào)制蛋白質(zhì)(immunoregulation modulating proteins)如可溶性人白血病抗原(HLA，I類和/或II類，和非經(jīng)典的I類HLA(E、F和G))；表面蛋白如可溶性T細(xì)胞或B細(xì)胞表面蛋白；人血清白蛋白；花生四烯酸代謝物如前列腺素、白三烯、凝血烷和前列環(huán)素；IgE，用于自身免疫或同種異型免疫或異種免疫的自身抗體或同種異型抗體；Ig Fc受體或Fc受體結(jié)合因子；G蛋白偶聯(lián)受體；細(xì)胞表面糖類；血管生成因子；粘附分子；離子如鈣、鉀、鎂、鋁和鐵；纖維蛋白如朊病毒和微管蛋白；酶如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酶、DNA酶、RNA酶、脂酶、酯酶、脫氫酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧化酶、脫羧酶、超氧化物歧化酶及它們的天然底物或類似物；激素及其相應(yīng)受體，如促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、甲狀腺素(T4和T3)、脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、氫化可的松、醛固酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、睪酮、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone(DHBA))及其硫酸鹽(DHEA-S)；肽激素如腎素、胰島素、降鈣素、甲狀旁腺素(PTH)、人生長(zhǎng)激素(hGH)、血管加壓素和抗利尿激素(AD)、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、LHRH、促甲狀腺激素釋放激素(THRH)、血管活性腸肽(vasoactive intestinalpeptide(VIP))、緩激肽和相應(yīng)的激素原；兒茶酚胺如腎上腺素和代謝物；輔因子包括atrionatriutic factor(AdF)、維生素A、B、C、D、E和K及5-羥色胺；凝血因子如凝血酶原、凝血酶、纖維蛋白、纖維蛋白原、因子VIII、因子IX、因子XI和馮·威利布蘭德因子；纖溶酶原因子如纖溶酶、補(bǔ)體活化因子、LDL及其配體和尿酸；調(diào)節(jié)凝血的化合物如水蛭素(hirudin)、重組水蛭素(hirulog)、裂纖酶(hementin)、肝素和組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator(TPA))；用于基因治療的核酸；酶拮抗劑；與配體結(jié)合的化合物，如炎性因子和受體；以及與一種或多種前述分子結(jié)合的其它蛋白質(zhì)。
其它化學(xué)靶包括而非限制于藥物，特別是受到濫用的藥物如大麻、海洛因和其它阿片制劑、苯環(huán)利定(phencyclidine(PCP))、巴比妥類、可卡因及其衍生物和苯二氮類；毒素，如重金屬如汞和鉛、砷以及放射性化合物；化療劑如撲熱息痛、地高辛和自由基；細(xì)菌毒素如脂多糖(lipopolysaccharides(LPS))和其它革蘭氏陰性毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)毒素、毒素A，破傷風(fēng)毒素，白喉毒素，和百日咳毒素；植物和海產(chǎn)毒素；蛇毒及其它毒液，毒力因子如aerobactins、毒素、蛋白質(zhì)等；感染性病毒如肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus(CMV))、單純皰疹病毒(herpes simplex viruses)(例如HSV 1型、2型和6型)、EB病毒(Epstein-Barr virus(EBV))、水痘帶狀皰疹病毒(varicellazoster virus(VZV))、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency viruses)(例如HIV-1、HIV-2)和其它反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、輪狀病毒、流感病毒、鼻病毒、細(xì)小病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、副粘病毒、乳多空病毒、痘病毒、蟲媒病毒、黃病毒(flaviviruses)、沙粒病毒、狂犬病病毒、杯狀病毒、星狀病毒、輪狀病毒和小RNA病毒；朊病毒；瘧原蟲組織因子，原生動(dòng)物，包括阿米巴(例如，溶組織內(nèi)阿米巴Entamoeba histolytica)、絲蟲屬(例如，吳策線蟲(Wuchereria))、瘧原蟲(Plasmodium)、賈第鞭毛蟲(Giardia)、利什曼原蟲(Leishmania)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、肉孢子蟲(Sarcocystis)、巴貝蟲(Babesia)、錐蟲(Trypanosoma)、和弓形體(Toxoplasma)；蠕蟲(例如吸蟲、絳蟲和線蟲)；細(xì)菌包括引起敗血癥的需氧菌、厭氧菌和兼性細(xì)菌，醫(yī)院感染和其它感染(例如，大腸桿菌E.coli、不動(dòng)桿菌Acinetobacter、假單胞菌Pseudomonas、變形菌Proteus、克雷伯菌Klebsiella、葡萄球菌Staphylococcus、鏈球菌Streptococcus、奈瑟菌Neisseria、分支桿菌mycobacteria、軍團(tuán)桿菌屬Legionnella、梭狀芽胞桿菌Clostridium、支原體Mycoplasma、密螺旋體Treponema、衣原體Chlamydia、立克次氏體Rickettsia、巴爾通體Bartonella等)和真菌(例如，念珠菌Candida、肺孢子蟲Pneumocystis、曲霉菌Aspergillus、毛孢子菌屬Trichosporum、小孢子菌Microsporum、畢赤酵母屬Pichnia、球孢子菌Coccidioides、芽生菌Blastomyces、組織胞漿菌Histoplasma、隱球菌Cryptococcus等)。事實(shí)上，本發(fā)明不意圖于受限于任何特定的靶，因?yàn)槟軌蚪Y(jié)合的任何靶(即，形成結(jié)合靶)在本發(fā)明中都有作用。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，靶是植物或植物來(lái)源材料。在一些實(shí)施方式中，靶是木材，而在其它實(shí)施方式中，靶是非木本植物。本發(fā)明意圖包括任何植物和/或植物來(lái)源材料。
在一些實(shí)施方式中，靶是酶如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酶、DNA酶(DNAses)、RNA酶(RNAases)、脂酶、酯酶、脫氫酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、纖維素酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧化酶、脫羧酶、超氧化物歧化酶和它們的天然底物或類似物。特別優(yōu)選的酶包括水解酶，特別是α/β水解酶；絲氨酸蛋白酶如枯草蛋白酶，和糜蛋白酶絲氨酸蛋白酶；纖維素酶和脂酶。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分子”是指靶分子(例如，抗原或配體)。合適的制劑、靶分子和抗靶分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、糖類、脂類、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質(zhì)、代謝物、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞或組織。
本發(fā)明提供了分離人抗體的方法，包括步驟純化B細(xì)胞；使B細(xì)胞與至少一種處于許多靶標(biāo)濃度的標(biāo)記靶標(biāo)接觸，目的是鑒定出少量B細(xì)胞與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)的濃度；收集與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞；和區(qū)分、分離并鑒定B細(xì)胞與之結(jié)合的靶標(biāo)。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞分離和純化自人類供體血液或骨髓。在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)被熒光標(biāo)記，并且結(jié)合的B細(xì)胞和靶標(biāo)(即，B細(xì)胞/靶標(biāo)復(fù)合物)的收集是應(yīng)用方法如FACS(熒光激活的細(xì)胞分選法)進(jìn)行的。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，在可以觀察抗體的結(jié)合親和力的條件下，B細(xì)胞和靶標(biāo)在多個(gè)靶標(biāo)濃度下結(jié)合。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的靶標(biāo)濃度被計(jì)算，如實(shí)施例中所述和圖中所闡述。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)具有低濃度。在這些優(yōu)選實(shí)施方式中的一些中，低濃度是約1微摩爾濃度(1e-6M)和約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間。在一些更加特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法來(lái)鑒定靶標(biāo)/B細(xì)胞復(fù)合物。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了增加克隆群，培養(yǎng)單一種類的B細(xì)胞。
如上所指出，任何適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)或靶標(biāo)群在本發(fā)明中都有用。此外，任何適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)表面或非生物學(xué)表面在本發(fā)明中都有用。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些方法還包括確認(rèn)被鑒定抗體的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，確認(rèn)是通過產(chǎn)生scFv-酶融合物、使融合物接受應(yīng)用原始靶標(biāo)的結(jié)合試驗(yàn)、和隨后分析融合物的酶活性實(shí)現(xiàn)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法，任何適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)在本發(fā)明中都有作用。然而，在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，酶是β-內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase(“BLA”))。如本文所用，“β-內(nèi)酰胺酶”是指使β-內(nèi)酰胺環(huán)(即，含有三個(gè)碳原子和一個(gè)氮原子的雜芳環(huán)結(jié)構(gòu))斷裂的任何酶。β-內(nèi)酰胺環(huán)是幾種殺菌劑的組成部分，包括但不限于青霉素、頭孢菌素和其它相關(guān)化合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明中的β-內(nèi)酰胺酶是天然的酶，而在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶是重組的。在一些其它的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶是被修飾的。
在本發(fā)明中有用的具體BLAs的例子包括但不限于，A類、B類、C類或D類β-內(nèi)酰胺酶和β-半乳糖苷酶(參見，例如，Benito et al.，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.123107 )。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，通過測(cè)定融合物抗體結(jié)合后的β-內(nèi)酰胺酶活性來(lái)證實(shí)結(jié)合。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域已知的頭孢硝基噻吩試驗(yàn)測(cè)定活性(參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/022,097，并入本文作為參考)。
本發(fā)明也提供了分離人抗體的方法，包括步驟使B細(xì)胞與處于許多靶標(biāo)濃度下的至少一種標(biāo)記的靶標(biāo)接觸，以便鑒定出少量B細(xì)胞與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)的濃度；收集與靶標(biāo)結(jié)合的B細(xì)胞；和區(qū)分、分離并鑒定B細(xì)胞與之結(jié)合的抗體。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞分離和純化自人類供體血液或骨髓。在一些其它優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)被熒光標(biāo)記，結(jié)合的B細(xì)胞和靶標(biāo)(即，B細(xì)胞/靶標(biāo)復(fù)合物)的收集是應(yīng)用方法如FACS(fluorescence-activated cell sorting(熒光激活的細(xì)胞分選法))進(jìn)行的。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，在可以觀察到抗體的結(jié)合親和力的條件下，B細(xì)胞和靶標(biāo)在多個(gè)靶標(biāo)濃度下結(jié)合。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的靶標(biāo)濃度被計(jì)算，如實(shí)施例中所述和圖中所闡述。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)具有低濃度。在這些優(yōu)選實(shí)施方式中的一些中，低濃度是約1微摩(1e-6M)和約1皮摩(1e-12M)之間。在一些更加特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法來(lái)鑒定靶/B細(xì)胞復(fù)合物。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了增加克隆群體，培養(yǎng)單一種類的B細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn) 下面的實(shí)施例提供用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式和方面，不能解釋為構(gòu)成對(duì)其范圍的限制。
在下面的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中，應(yīng)用下列縮寫sd和SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)；M(摩)；mM(毫摩)；μM(微摩)；nM(納摩)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；LF(lethal factor(致死因子))；℃(攝氏度)；cDNA(DNA拷貝或互補(bǔ)DNA)；DNA(脫氧核糖核酸)；ssDNA(單鏈DNA)；dsDNA(雙鏈DNA)；dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸鹽緩沖液)；g(重力加速度(gravity))；OD(光密度)；CPM和cpm(每分鐘次數(shù))；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(DPBS)；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES緩沖鹽)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris-HCl(三[羥甲基]氨基甲烷-鹽酸)；2-ME(2-巰基乙醇)；EGTA(乙二醇-雙(β-氨基乙基醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；Abbott(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)；Ambion(Ambion，Austin，TX)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心American Type Culture Collection，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Pharmingen(Pharmingen，SanDiego，CA)；Roche(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)；SynPep(SynPep，Corp.，Dublin，CA)；Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)；Bachem(Bachem Biosciences，King ofPrussia，PA)；DNA 2(DNA 2，Menlo，Park，CA)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；和Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA)。
在下面的實(shí)驗(yàn)中，所應(yīng)用的B細(xì)胞是應(yīng)用MACS分離系統(tǒng)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)(人CD19 MicroBeads；Miltenyi Biotec)，分離自人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的原代人CD19+B細(xì)胞。
應(yīng)用EZ-Label Fluorescein Isothiocyanate Protein LabelingKit，根據(jù)制造商的指導(dǎo)(Pierce，Rockford，IL，U.S.A)，用FITC標(biāo)記靶蛋白。
應(yīng)用PE偶聯(lián)抗CD19抗體(Pharmingen)和多個(gè)濃度(0.1-10nM)的FITC偶聯(lián)的靶蛋白對(duì)被磁性分離的B細(xì)胞染色30分鐘或4℃過夜，利用FACS，選擇靶特異性B細(xì)胞。通過FACS，CD19-PE和靶-FITC雙陽(yáng)性細(xì)胞被分選入含有細(xì)胞裂解緩沖液(Ambion)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度是每孔一個(gè)細(xì)胞。如本領(lǐng)域已知，使被分選的細(xì)胞接受RT-PCR克隆程序，或者保存在-80℃用于進(jìn)一步使用。
實(shí)施例1Vh和Vl引物組的設(shè)計(jì) 在本實(shí)施例中，描述了設(shè)計(jì)Vh和Vl引物組的方法。根據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)和公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增所有功能性人可變區(qū)(Vh和Vl)的兩組簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(參見，表1；也參見Sblattero andBradbury，ImmunotechnoL，3271-278 )。
正向(5′)引物(BPF168-187)位于V基因的框架1的起始20-23個(gè)核苷酸中(參見Sblattero and Bradbury，見上文)。
反向(3′)引物(BPF 154-BPF 167)位于恒定區(qū)的5′端，并且根據(jù)來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的序列而設(shè)計(jì)。
表1.序列序列名稱 序列 SEQ ID NOBPF154hukappaC rt GTTATTCAGCAGGCACACAACAG SEQ ID NO1425-403 J00241BPF155huKappaC CAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGSEQ ID NO2rev 375-352 J00241BPF156hIGLC rt AGTGTGGCCTTGTTGGCTTGSEQ ID NO3BPF157hIGLC rev AGCTCCTCAGAGGAGGGYGGGAACSEQ ID NO4BPF158hIGCL rev2AGGAGGGYGGGAACAGAGTGACCGSEQ ID NO5BPF159huIgGC1rt AGTCCTTGACCAGGCAGCCCAG SEQ ID NO6
引物91-70BPF160huIgGC1 revGCSGCTGTGCYCYCRGAGGTGCTCSEQ ID NO768-45BPF161huIgGC1 revAGGGGGAAGACSGATGGGCCCTTGSEQ ID NO829-6BPF162huIgM rt CAACGGCCACGCTGCTCGTATC SEQ ID NO978-57BPF163huIgM rev CGGGGAATTCTCACAGGAGACGAGSEQ ID NO1053-30BPF164huIgM rev GGAAAAGGGTTGGGGCGGATGCACSEQ ID NO1127-4BPF165huIgD rt CCATGTACCAGGTGACAGTCSEQ ID NO12232-213 K02875BPF166huIgDC1 revTTTGGGTGTCTGCACCCTGATATGSEQ ID NO13155-132 K02875BPF167huIgDC1 revGAACACATCCGGAGCCTTGGTGGGSEQ ID NO14126-103 K02875BPF168VH4BACKCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG SEQ ID NO15BPF169VH5BACKCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA SEQ ID NO16BPF170VH6BACKCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG SEQ ID NO17BPF171VH10BACK GAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY SEQ ID NO18BPF172VH12BACK CAGGTCCAGCTKGTRCAGTCTGG SEQ ID NO19BPF173VH14BACK CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG SEQ ID NO20BPF174VH22BACK CAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG SEQ ID NO21BPF175VK1BACKGACATCCRGDTGACCCAGTCTCC SEQ ID NO22BPF176VK2BACKts GAAATTGTRWTGACRCAGTCTCC SEQ ID NO23BPF177VK9BACKGATATTGTGMTGACBCAGWCTCC SEQ ID NO24BPF178VK12B ACK GAAACGACACTCACGCAGTCTC SEQ ID NO25BPF179VLIBACKCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC SEQ ID NO26BPF180VL3BACKTCCTATGWGCTGACWCAGCCAC SEQ ID NO27BPF181VL38BACK TCCTATGAGCTGAYRCAGCYACC SEQ ID NO28BPF182VL4BACKCAGCCTGTGCTGACTCARYCSEQ ID NO29BPF183VL78BACK CAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC SEQ ID NO30BPF184VL9BACKCAGCCWGKGCTGACTCAGCCMCC SEQ ID NO31BPF185VL11BACK TCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC SEQ ID NO32BPF186VL13BACK CAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT SEQ ID NO33BPF187VL15BACK AATTTTATGCTGACTCAGCCCC SEQ ID NO34huβ肌動(dòng)蛋白revTGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG SEQ ID NO35huβ肌動(dòng)蛋白forGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG SEQ ID NO36
實(shí)施例2通過RT-PCR，從來(lái)自被分選的靶標(biāo)特異性B細(xì)胞克隆Vh和Vl cDNA 在本實(shí)施例中，描述了克隆Vh和Vl cDNA的方法。首先，應(yīng)用帶有隨機(jī)六聚體的Cells-to-cDNATMII試劑盒(Ambion)，用RT-PCR從選擇的抗原特異性單一B細(xì)胞制備cDNA。隨后，用表1中的序列作為模板，用Vh和Vl引物組將Vh和Vl基因各自擴(kuò)增出來(lái)。
實(shí)施例3scFv-BLA融合構(gòu)建物的產(chǎn)生 在本實(shí)施例中，描述了產(chǎn)生scFv-BLA融合構(gòu)建物的方法。通過對(duì)凝膠純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到Vh和Vl基因的氨基酸序列。將合成的scFvs設(shè)計(jì)為在Vh和Vl之間帶有標(biāo)準(zhǔn)的(G4S)3(15個(gè)氨基酸(15aa))接頭Vh-15aa-Vl，側(cè)翼是用于克隆目的的限制性酶切位點(diǎn)。在一些試驗(yàn)中，構(gòu)建物訂購(gòu)自商業(yè)上的供應(yīng)商(例如DNA 2.0)，他們可以合成分子并將其克隆入一種或多種合適的載體(例如，pDriveCloning Vector(Qiagen))。構(gòu)建物中的scFv基因通過限制性酶消化而分離、凝膠純化并亞克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，使scFv在β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白中表達(dá)。
實(shí)施例4融合蛋白的確認(rèn) 在本實(shí)施例中，提供了確認(rèn)融合蛋白的方法。應(yīng)用合適的ELISA方法和試劑確認(rèn)候選scFvs，如本領(lǐng)域已知。將含有scFv-BLA融合構(gòu)建物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。培養(yǎng)之后，用B-Per試劑(Pierce)裂解細(xì)菌細(xì)胞。將裂解物加入預(yù)先包被有原始靶蛋白的96孔板。用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)篩選陽(yáng)性BLA融合蛋白(例如，頭孢硝基噻吩(BLA底物)試驗(yàn))。
實(shí)施例5文庫(kù)中的結(jié)合物之間的競(jìng)爭(zhēng) 在本實(shí)施例中，提供了計(jì)算文庫(kù)中結(jié)合物之間的競(jìng)爭(zhēng)的方法。本文中應(yīng)用下列指定對(duì)具有n個(gè)成員的文庫(kù)L，使To＝靶的總量，T＝未結(jié)合的靶，Pi＝未結(jié)合的文庫(kù)成員I，Pio＝文庫(kù)成員I的總量，KiD＝Pi和T的解離常數(shù)，TPi＝Pi和T的復(fù)合物，kion＝二級(jí)締合速率常數(shù)，kioff＝一級(jí)解離速率常數(shù)。
如果我們假設(shè)1)達(dá)到穩(wěn)態(tài)結(jié)合；2)每一靶具有僅結(jié)合一個(gè)成員的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；和3)每一成員具有相同的二級(jí)締合速率常數(shù)，則下列等式代表文庫(kù)成員之間的競(jìng)爭(zhēng)——結(jié)合速率(on rate)可以如下計(jì)算d(TPi)/dt＝kion(T)(Pi)——解離速率(off rate)可以如下計(jì)算-d(TPi)/dt＝kioff(TPi)——在穩(wěn)態(tài)下，適用下列式子d(TPi)/dt＝-d(TPi)/dtkion(T)(Pi)＝kioff(TPi)kioff(TPi)/kion＝(T)(Pi)/(TPi)＝KiD——在一個(gè)具有n個(gè)與靶結(jié)合的成員的文庫(kù)中，游離靶的濃度是T＝T0-TP1-TP2-TP3...-TPn——對(duì)于每一成員PiKiD＝(T)(Pi)/(TPi)T＝(TPi/Pi)KiD——在文庫(kù)L中，將有一個(gè)最緊密的結(jié)合成員——稱作成員P1。結(jié)合的P1與游離的P1的比例作為T的函數(shù)是T＝(TP1/P1)K1D——由于T是游離靶的濃度，對(duì)文庫(kù)的任何其它成員Pi，T＝(TPi/Pi)KiD——對(duì)文庫(kù)的每一成員Pi，結(jié)合比游離的比值(TPi/Pi)相對(duì)于最緊密結(jié)合物的比值(TP1/P1)如下(TPi/Pi)KiD＝(TP1/P1)K1D(TPi/Pi)＝(TP1/P1)K1D/KiD——對(duì)文庫(kù)的任一成員i，結(jié)合比游離的比值(TPi/Pi)相對(duì)于P1的比值與兩個(gè)解離常數(shù)的比值成正比例使X＝(TP1/P1)；r1i＝K1D/KiDTP1/P1o＝(TP1/P1)/(1+(TP1/P1))＝x/(1+x)TPi/Pio＝(TPi/Pi)/(1+(TPi/Pi))TPi/Pio＝r1i*x/(1+r1i*x)——結(jié)合成員i(TPi)與結(jié)合成員1(TP1)的比值是TPi/TP1＝(1+x)*r1i*x*Pio/x*(1+r1i*x)*P1o＝(1+x)*r1i*Pio/(1+r1i*x)*P1o＝(1+x)*Pio/((1/r1i*)+x)*P1oTPi/TP1＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1oT＝(TP1/P1)K1D＝(x)K1D當(dāng)T0接近0時(shí)，T接近0并且x接近0當(dāng)T0接近∞時(shí)，T接近∞并且x接近∞TPi/TP1＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1o當(dāng)T0接近0時(shí)，TPi/TP1接近(1)*Pio/((1/r1i)+x)*P1o接近(r1i)*Pio/P1o當(dāng)T0接近∞時(shí)，TPi/TP1接近(x)*Pio/(x)*P1o接近Pio/P1o 因此，當(dāng)靶是有限的時(shí)，每一結(jié)合物相對(duì)于最緊密結(jié)合物的量與解離常數(shù)的比值成正比例。當(dāng)靶處于高濃度時(shí)，每一成員結(jié)合至相同的程度。這種關(guān)系在圖4中說(shuō)明。為了僅鑒定文庫(kù)中的最緊密結(jié)合物，靶濃度必須是有限的。為了鑒定文庫(kù)中的所有結(jié)合物，靶應(yīng)該過量存在。這種關(guān)聯(lián)在圖5中說(shuō)明。為了增加測(cè)定到的緊密結(jié)合物的比例1)增加文庫(kù)濃度；2)降低文庫(kù)的多樣性(增加成員濃度)；3)降低靶濃度；或4)加入能夠與其它結(jié)合物區(qū)分開來(lái)的一種過量的弱結(jié)合物(即，因而可以使其不被檢測(cè)系統(tǒng)看見)。這種關(guān)聯(lián)在圖6中說(shuō)明。
實(shí)施例6計(jì)算B細(xì)胞文庫(kù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差 在本實(shí)施例中，提供了計(jì)算B細(xì)胞文庫(kù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法。為了得到所需親和力的結(jié)合物，根據(jù)FACS數(shù)據(jù)計(jì)算B細(xì)胞文庫(kù)的期望均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。假設(shè)結(jié)合能的二項(xiàng)分布，通過測(cè)定作為靶濃度的函數(shù)的結(jié)合的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，可以估計(jì)B細(xì)胞文庫(kù)中結(jié)合能的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。下面的表2示出了對(duì)兩個(gè)未知數(shù)——均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算，得自以兩個(gè)不同靶濃度(例如，1×10-9M和5×10-9M)結(jié)合的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。如果為了觀察到信號(hào)，需要占用50％的細(xì)胞受體，則觀察到的每一細(xì)胞的結(jié)合能將好于或等于-12.27Kcal/M(1×10-9M)和-11.32Kcal/M(5×10-9M)。以二項(xiàng)分布，可以用具有信號(hào)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)估計(jì)出距離結(jié)合能所表示的均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此，存在帶兩個(gè)未知數(shù)的兩個(gè)等式等式1均值-3.71標(biāo)準(zhǔn)偏差＝-12.27等式2均值-3.19標(biāo)準(zhǔn)偏差＝-11.32。
對(duì)這些等式的解答給出了對(duì)該性質(zhì)的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值，(解答因子D結(jié)合物的例子)
上文說(shuō)明書中提及的所有出版物和專利并入本文作為參考。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)本發(fā)明的描述方法和系統(tǒng)的各種修改和變化將是顯而易見的，這不背離本發(fā)明范圍和精神。雖然本發(fā)明相關(guān)于特定的優(yōu)選實(shí)施方式而描述，應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不恰當(dāng)?shù)厥芟抻谶@些特定實(shí)施方式。事實(shí)上，用于實(shí)施本發(fā)明的對(duì)所述方式的各種修改意圖于包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，所述修改對(duì)分子生物學(xué)、試驗(yàn)開發(fā)、免疫學(xué)、制劑和/或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
本領(lǐng)域術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很容易意識(shí)到，本發(fā)明很適合于實(shí)施目標(biāo)并獲得所提到的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)，以及其中所固有的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)。此處所述的分子復(fù)合物和方法、程序、處理、分子、特定化合物代表了目前優(yōu)選實(shí)施方案，是示范性的，不意圖于成為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。事實(shí)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地知道，在不背離本發(fā)明范圍和精神的情況下，可對(duì)此處公開的本發(fā)明做出替代和修改。本文中適當(dāng)?shù)乩C性地描述的發(fā)明可以在缺少本文未具體公開的任一元素或許多元素、限定或許多限定的情況下被實(shí)施。已使用的術(shù)語(yǔ)和表述是作為描述性術(shù)語(yǔ)而不是限定性的，并且不意圖于在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)排除顯示和描述的特征或其部分的等同物，而是認(rèn)識(shí)到在要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)各種修改是可能的。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過優(yōu)選的實(shí)施方案和任選的特征被具體地公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本文公開的概念進(jìn)行修改和變化，而這些修改和變化被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如所附權(quán)利要求所限定的。
本發(fā)明已以寬范的和一般性的方式被描述。落入該概括性公開內(nèi)容中的每一較窄的種類和亞類也形成本發(fā)明的一部分。這包括發(fā)明的這樣的概括性描述，其帶有附加條件或從該類中除去任何主題的否定限定，不論刪除的該物質(zhì)是否在本文中被具體地?cái)⑹觥?br> 權(quán)利要求
1.分離人抗體的方法，包括a)得到B細(xì)胞；b)純化所述B細(xì)胞，提供純化的B細(xì)胞；c)使所述純化的B細(xì)胞與處于許多靶濃度的至少一種標(biāo)記的靶接觸，以便鑒定出少量所述純化的B細(xì)胞與所述靶結(jié)合時(shí)的濃度；d)收集與所述靶結(jié)合的所述B細(xì)胞；和e)區(qū)分、分離并鑒定所述B細(xì)胞的、于其上結(jié)合所述靶的抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞得自選自人供體血液和人供體骨髓的來(lái)源。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶被熒光標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述收集是應(yīng)用熒光激活的細(xì)胞分選方法進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞和所述靶，在許多不同的靶濃度下和所述抗體的結(jié)合親和力被確定的條件下，被組合起來(lái)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定所述抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞在群體被克隆增加的條件下被培養(yǎng)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶具有低濃度。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述標(biāo)記的靶的低濃度是約1微摩(1e-6M)和約1皮摩(1e-12M)之間。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述標(biāo)記的靶的低濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織和癌器官。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶是抗原。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原選自癌癥抗原Muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
14.權(quán)利要求1的方法，還包括確認(rèn)所述抗體的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述確認(rèn)包括創(chuàng)建scFv-酶融合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述scFv-酶融合是scFv-BLA融合。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述確認(rèn)應(yīng)用頭孢硝基噻吩試驗(yàn)完成。
18.分離人抗體的方法，包括步驟a)得到B細(xì)胞；b)使所述B細(xì)胞與處于許多靶濃度下的至少一種標(biāo)記的靶接觸，以便鑒定出少量所述B細(xì)胞與所述靶結(jié)合的濃度；c)收集與所述靶結(jié)合的所述B細(xì)胞；和d)區(qū)分、分離并鑒定所述B細(xì)胞的、于其上結(jié)合所述靶的抗體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述B細(xì)胞得自人供體血液或骨髓。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述B細(xì)胞，在得自所述人供體血液或骨髓后，被純化。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述靶被熒光標(biāo)記。
22.權(quán)利要求21的方法，其中應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分選方法進(jìn)行所述收集。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述B細(xì)胞和所述靶，在許多不同的靶濃度下和所述抗體的結(jié)合親和力被確定的條件下，被組合起來(lái)。
24.權(quán)利要求18的方法，其中應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定所述抗體。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述B細(xì)胞是在群體被克隆增加的條件下被培養(yǎng)。
26.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶具有低濃度。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述標(biāo)記的靶的低濃度是約1微摩(1e-6M)和約1皮摩(1e-12M)之間。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述標(biāo)記的靶的低濃度是約1e-7M和約1e-11M之間。
29.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織和癌器官。
30.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種標(biāo)記的靶是抗原。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗原選自癌癥抗原Muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
32.權(quán)利要求18的方法，還包括確認(rèn)所述抗體的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述確認(rèn)包括創(chuàng)建scFv-酶融合。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述scFv-酶融合是scFv-BLA融合。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述確認(rèn)應(yīng)用頭孢硝基噻吩試驗(yàn)完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離人抗體的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101048426SQ200580035287
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者Y·陳, D·陳, A·G·戴, D·A·埃斯特爾, W·耿 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司