專(zhuān)利名稱(chēng)：有取代的有機(jī)硫化合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)硫化合物及其使用方法。
本發(fā)明的背景癌癥目前仍然是危害人類(lèi)生命健康的最主要疾病之一。治療癌癥的現(xiàn)有手段包括手術(shù)切除，放射療法，化學(xué)療法，或這些方法的任何合并使用。在所有這些方法中，化學(xué)療法是應(yīng)用最廣而且已經(jīng)用于多種不同的癌癥，尤其是那些用其他方法幾乎無(wú)法治療，或已轉(zhuǎn)移的癌癥。盡管不少具有化學(xué)治療作用的化合物已經(jīng)用于臨床，大多數(shù)化學(xué)療法都只限于延緩癌癥的惡化而并非治愈。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，腫瘤及其轉(zhuǎn)移常常無(wú)法用化學(xué)療法治療。有些腫瘤對(duì)一些種類(lèi)的化療藥物具有內(nèi)在的抗藥性。在另一些情況下，腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性是在治療過(guò)程中逐漸產(chǎn)生的。因此，現(xiàn)有的化療藥物在治療不同種類(lèi)的腫瘤時(shí)的效果受到極大的限制。進(jìn)而，很多不同種類(lèi)治療癌癥的化療藥物都產(chǎn)生很?chē)?yán)重的副作用，從而導(dǎo)致化學(xué)治療不能繼續(xù)進(jìn)行下去。所以，尋找新的而且有效的化學(xué)抗癌藥物對(duì)維護(hù)人類(lèi)健康仍然是迫切需要的。從亞熱帶灌木植物(Petiveria alliacea L.(Phytolaccaceae))中提取出來(lái)的天然產(chǎn)物二芐基三硫醚(DBTS)是具有生物活性的多硫二級(jí)代謝物。據(jù)報(bào)道，二芐基三硫醚具有免疫調(diào)節(jié)功能(“Petiveria alliacea的免疫調(diào)節(jié)活性”，Williams，L.A.D.，Gardner，T.L.，F(xiàn)letcher，C.K.，Naravane，A.，Gibbs，N.，F(xiàn)leischhacker，R.Phytother.Res.，vol.11，pages 251-253，1997；“二芐基三硫醚的磺酰酐衍生物及其農(nóng)業(yè)化學(xué)活性”，Williams，L.A.D.，Vasquez，E.，Klaiber，I.，Kraus，W.，Rosner，H.Chemosphere，vol.51，pages 701-706，2003)。在研究二芐基三硫醚在細(xì)胞分子機(jī)理水平上的免疫調(diào)節(jié)活性時(shí)，Rosner及其合作者報(bào)道，二芐基三硫醚傾向于結(jié)合到BSA的芳香區(qū)，而且減弱在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中MAP激酶erk1/erk2上酪氨酰殘基的去磷酸化作用(“Disassembly of microtubules and inhibition of neuriteoutgrowth，neuroblastoma cell proliferation，and MAP kinase tyrosinedephosphorylation by dibenzyl trisulphide”，by Rosner，H.，Williams，L.A.D.，Jung，A.and Kraus，W.Biochim.Biophy.Acta，2001，1540，166-177)。此文還報(bào)道，二芐基三硫醚引起微管可逆性的分解，而且不影響在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y和人肺Wistar 38成纖維母細(xì)胞中肌動(dòng)原的動(dòng)態(tài)。該文還進(jìn)而報(bào)道，二芐基三硫醚還抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞繁殖和由脊髓外肢體中神經(jīng)纖維突出的延伸。Mata-Greenwood與其合作者還研究了大量天然萃取物的抗增生和變異作用(“Discovery of novel inducers of cellulardifferentiation using HL-60 promyeolocytic cells”，by Mata-Greenwood，E.，Ito A.，Westernburg，H.，Cui，B.，Mehta，R.G.，Kinghorn，A.D.and Pezzuto，J.M.Anticancer Res.2001，21，1763-1770)。文中報(bào)道，Petiveria alliacea L.植物根部的親脂性萃取物及其中的活性組分對(duì)HL-60前髓細(xì)胞具有抗增生和變異活性。該作者還從該活性組分中分離出來(lái)了兩種活性有機(jī)硫化合物2-[(苯基甲基)二硫代]乙醇和二芐基三硫醚。這兩種有機(jī)硫化合物誘導(dǎo)類(lèi)似于單核白細(xì)胞的變異并引起較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但這兩種化合物對(duì)HL-60細(xì)胞不具有抗增生活性。
本發(fā)明的簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明涉及有機(jī)硫化合物，藥物組合物，方法及其應(yīng)用。更具體的講，本發(fā)明涉及有取代二硫、三硫、四硫和五硫化合物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽及其部分氧化所形成的砜衍生物。本發(fā)明所述化合物具有抗腫瘤，抗癌，抗炎，抗傳染和/或抗增生等方面的活性。本發(fā)明還涉及有機(jī)硫化合物的制備及制劑方法。一方面，本發(fā)明提供具有下列結(jié)構(gòu)通式(1)或(2)的化合物
或 其中，A和B相同或不同，并且獨(dú)立地是任選取代的芳基，雜芳基或一種5～14員、可以是單環(huán)或多環(huán)的而且任選地含有雜原子的環(huán)；每一個(gè)S都任選地呈氧化物的形式；S1和S2獨(dú)立地是S，SO或SO2；每一個(gè)R是H，鹵素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，氨基酸，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每一個(gè)R1是烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)基或雜環(huán)，而且其中每一個(gè)都任選地有取代且可含有雜原子；m，n和p獨(dú)立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 其中，A，B，R，S，n和p定義如上；或有下述通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p定義如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中”q”是0-3，而“*”代表碳碳雙鍵C＝C可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任選地有取代的芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中，A和B一起可以形成環(huán)狀系統(tǒng)；及其藥物上可接受鹽、酯、藥物前體或代謝物；先決條件是所述化合物不是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氯芐基)三硫醚，(對(duì)-氯芐基)芐基三硫醚，二(對(duì)-硝基芐基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(對(duì)-叔丁基苯基)三硫醚。在上述通式1-5中，每一個(gè)Z均可是 或 其中，每個(gè)W均獨(dú)立地為一個(gè)健，CR，N，NR，S或O；每個(gè)R均如以上定義。上述通式1-5中，每個(gè)R均可是H，鹵素，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或R是C1-10烷基，C3-10環(huán)烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)或雜環(huán)，其中每一個(gè)都可以含雜原子。在上述通式1-5中，每個(gè)A和B都可以是苯，吡啶，噠嗪，嘧啶，吡嗪，三嗪，異唑，異噻唑，惡二唑，[1，2，4]二唑，三唑，噻二唑，吡唑，咪唑，噻唑，惡唑，苯并唑，吡咯，呋喃，噻吩，中氮茚，吲哚，異吲哚，二氫吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，吲唑，苯并咪唑，苯并噻唑，嘌呤，喹喔啉，喹啉，異喹啉，噌啉，2，3-二氮雜萘，喹唑啉，喹喔啉，1，5-二氮雜萘，蝶啶，吖啶，吩嗪，吩噻嗪，茚，萘，苯并二唑，或苯并[1，2，5]二唑。另一方面，每個(gè)A和B都獨(dú)立地是
或 其中，X和W獨(dú)立地是S，O，NR7，CR7；或者在六員的單環(huán)或雙環(huán)中一個(gè)W可以是一個(gè)鍵；并且每個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7都是氫原子，鹵素原子，羧基，氰基，氨基，氨基酸，酰胺基，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每個(gè)R1均為烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、碳環(huán)基或雜環(huán)基，并且其中每一個(gè)均是任選地有取代的且可含有雜原子。例如，每個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可是氫原子，鹵素原子，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或每個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可是C1-10烷基，C3-10環(huán)烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)均可含有雜原子。芳基、雜芳基或雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于哌嗪基，哌啶基，嗎啉基，硫代嗎啉基，苯基，呋喃基，噻吩基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，喹喔啉基，噻唑基，唑基，咪唑基，喹啉基，萘基，噠嗪基，吡唑并嘧啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并噻吩基，吡唑基，吡咯基，吲哚基，異吲哚基，喹嗪基，喹啉基，異喹啉基，喹唑啉基等；其中每個(gè)基團(tuán)都任選地有一個(gè)選自N、O、S和鹵素的雜原子取代，或有C1-10烷基、C3-10環(huán)烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、或雜環(huán)基取代，而且每個(gè)都任選地含有雜原子。上述通式1-5中，每個(gè)S均可是一氧化物或二氧化物。另一方面，本發(fā)明還包括通式(6)所代表的化合物 其中每個(gè)n是1-3；而且R是氫，鹵素，烷基或鹵代烷基。又另一方面，本發(fā)明還包括通式(7)所代表的化合物 其中，Ar是任選地有取代的噻吩、苯并噻吩、吡啶或吡嗪。通式1-5的化合物的實(shí)例包括但不限于二(氟芐基)三硫醚，二(鄰-氯芐基)三硫醚，二(甲基芐基)三硫醚，二(三氟甲基芐基)三硫醚，二(2-苯基乙基)三硫醚，二(噻吩-2-甲基)三硫醚，二(吡啶-4-乙基)三硫醚，二(嘧啶-2-乙基)三硫醚，或二(苯并噻吩-3-甲基)三硫醚。二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(間-甲基芐基)三硫醚或二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚是其中最典型的實(shí)例。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含上述通式1-5的化合物的組合物的制造方法，也提供按照這樣的方法制備的組合物。本發(fā)明所提供的組合物制造方法包含a)將權(quán)利要求1的化合物溶解到水溶性有機(jī)溶劑，非離子性的溶劑，水溶性類(lèi)脂，各種環(huán)糊精，維生素，脂肪酸，脂肪酸酯，磷脂或其組合溶劑中，提供一種溶液；b)加入食鹽水或含有1-10％碳水化合物的溶液的緩沖劑。所述有機(jī)溶劑包括聚乙二醇(PEG)，乙醇，丙二醇，N-甲基-2-吡咯酮，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲亞砜或這些溶劑的組合溶劑。在以上方法中，非離子型表面活性劑可以是聚氧乙烯甘油蓖麻醇酸酯35、PEG-琥珀酸酯、polysorbate 20、polysorbate 80、聚乙二醇-660 12-羥基硬脂酸酯、失水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(poloxamer)、乙氧基化杏核油、辛基-己酰macrogol-8-甘油酯、甘油酯、PEG-6辛酸甘油酯、甘油、glycol-polysorbate、或其組合。非離子型表面活性劑的具體實(shí)例是聚乙二醇改性CREMOPHOR(聚氧乙烯甘油三菌麻醇酸酯35)、CREMOPHOREL、氫化CREMOPHORRH40、氫化CREMOPHORRH60、SOLUTOLHS(聚乙二醇-660 12-羥基硬脂酸酯)、LABRAFIL(乙氧基化杏核油)、LABRASOL(辛基-己酰macrogol-8-甘油酯)、GELUCIRE(甘油酯)、和SOFIGEN(PEG-6辛酸甘油酯)。上述方法中所述類(lèi)脂包括菜籽油，甘油三酸酯，植物油，或其組合。其中包括蓖麻油，聚氧乙烯基化蓖麻油，玉米油，橄欖油，棉子油，花生油，薄荷油，紅花油，芝麻油，大豆油，氫化菜籽油，氫化豆油，椰子油甘油三酸酯，棕櫚籽油以及其氫化油，或這些油的組合。上述維生素可以是生育酚(也叫維生素E)。脂肪酸和脂肪酸酯可以是油酸，單酸甘油酯，二酸甘油酯，聚乙二醇的單或二脂肪酸酯，或它們的組合。上述環(huán)糊精指α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精，羥丙基化的β-環(huán)糊精，或磺基丁基醚化的β-環(huán)糊精。磷脂可以是大豆磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰甘油及它們的氫化物，或它們的組合。進(jìn)而，碳水化合物包括葡萄糖。在又另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述通式1-2化合物的制備方法，包含a)N-三甲基甲硅烷基咪唑和二鹵化硫在鹵代溶劑中反應(yīng)制得二咪唑基硫化物；然后b)上述二咪唑基硫化物與相應(yīng)的硫醇反應(yīng)。二氯甲烷是所用典型的鹵代溶劑之一。一個(gè)方面，N-三甲基甲硅烷基咪唑在己烷中的溶液與二氯化硫在二氯甲烷中的溶液反應(yīng)。而另一個(gè)方面，純態(tài)二氯化硫與N-三甲基甲硅烷基咪唑在己烷和二氯甲烷中的溶液反應(yīng)。在又另一個(gè)方面，上述方法進(jìn)一步包含該三硫化物/的重結(jié)晶。作為例子，所述三硫化物用正己烷，混合己烷，庚烷，石油醚或其組合溶劑重結(jié)晶。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含上述通式1-5的化合物以及醫(yī)藥上可接受賦形劑的組合物。這樣的化合物及其醫(yī)藥組合物可用來(lái)治療和緩解神經(jīng)母細(xì)胞瘤。所以，本發(fā)明也提供治療和緩解神經(jīng)母細(xì)胞瘤的方法，包含，將有效量的通式1-5的化合物或其醫(yī)藥組合物及任選地與一種抗增殖劑一起給藥于有其需要的體系或?qū)ο?，從而所述神?jīng)母細(xì)胞瘤可以得到治療或緩解。本發(fā)明也提供疾病的緩解和治療方法，包含對(duì)有其需要的對(duì)象成體系給藥任何一種有式1-5的化合物或其醫(yī)藥組合物，其中所述化合物可以是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(對(duì)-氯芐基)三硫醚，二(對(duì)-硝基芐基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙炔基)三硫醚，二苯基三硫醚，或二(對(duì)-叔丁基苯基)三硫醚。該對(duì)象可以是人體或動(dòng)物體例如哺乳動(dòng)物。該體系可以是細(xì)胞或組織，或化合物可以離體給藥的其他體系。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供除神經(jīng)母細(xì)胞瘤外各種細(xì)胞增殖紊亂的治療和緩解方法包含對(duì)有其需要的體系或?qū)ο蠼o藥有效量的任何一種有式1-5的化合物或其醫(yī)藥組合物及任選地一種抗增殖劑，從而使所述體系或?qū)ο笾械乃黾?xì)胞增生紊亂得到治療和緩解。本發(fā)明同時(shí)提供減緩或抑制細(xì)胞增生或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明方法中使用的化合物是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚或二(間-甲基芐基)三硫醚，且任選地與一種抗增殖劑聯(lián)合使用。另一方面，減緩細(xì)胞增殖，或誘導(dǎo)所述細(xì)胞死亡。細(xì)胞增殖紊亂可以是一種腫瘤或癌癥，包括但不限于白血病，淋巴瘤，肺癌，結(jié)腸癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥，黑色素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，頭頸部癌，胰腺癌等。在另一方面，細(xì)胞凋亡得到誘導(dǎo)；在另一方面，可中斷微管蛋白的聚合和解聚過(guò)程，或抑制細(xì)胞分裂周期的G2/M過(guò)程或細(xì)胞有絲分裂，或兩者兼而有之。在另一方面，還抑制了內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管形成、或其組合。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供血管再狹窄的緩解或治療方法，包含對(duì)其需要的對(duì)象給藥有效量的任何一種有式1-5的化合物或其醫(yī)藥組合物，從而使所述對(duì)象中的血管現(xiàn)狹窄得到緩解或治療。該血管狹窄癥可伴隨新內(nèi)膜增生。該化合物可以口服，或非腸道途徑給藥，或通過(guò)血管支架給藥。在又另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療細(xì)胞增生性紊亂的醫(yī)藥組合物，包含任何一種有式1-5的化合物和醫(yī)藥上可接受賦形劑。


圖1A-C顯示人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460分別對(duì)不同濃度DBTS、乙酰甲基秋水仙堿、和紫杉醇的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖2顯示人肺癌細(xì)胞株MV522對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖3顯示人乳腺癌細(xì)胞株MCF7對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖4顯示人肺癌細(xì)胞株A549對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖5顯示人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3對(duì)不同濃度DBTS(圖6A)和5氟脲嘧啶(圖6B)的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖6顯示人表皮細(xì)胞癌細(xì)胞株A431對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖7顯示人成纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HT1080對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖8顯示人乳腺癌細(xì)胞株MDA231對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖9顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖10顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞株HC-2998對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖11顯示人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR4對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖12顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞株A2780對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖13顯示人肝癌細(xì)胞株HepG2對(duì)不同濃度DBTS的反應(yīng)，該反應(yīng)采用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)(RT-CES系統(tǒng))檢測(cè)。
圖14顯示DBTS處理的小鼠體內(nèi)抗S180皮下實(shí)體移植肉瘤的效果。
圖15顯示DBTS處理的小鼠體內(nèi)抗Lewis肺癌皮下實(shí)體移植瘤的效果。
圖16顯示ACEA100108化合物處理的在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)抗人乳腺癌Bcap-37皮下移植腫瘤的效果。
圖17顯示ACEA100108化合物處理的免疫缺陷裸鼠體內(nèi)抗人乳腺癌Bcap-37皮下移植腫瘤的動(dòng)態(tài)效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)，裸鼠移植瘤由人乳腺癌Bcap-37皮下接種免疫缺陷裸鼠產(chǎn)生。
圖18顯示ACEA100108化合物處理的有人乳腺癌Bcap-37株移植腫瘤的裸鼠體重動(dòng)態(tài)變化。
圖19顯示ACEA100108化合物處理的免疫缺陷裸鼠體內(nèi)抗人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞皮下移植腫瘤效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)。
圖20顯示ACEA100108化合物在裸鼠體內(nèi)抗人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞移植瘤的動(dòng)態(tài)效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)，裸鼠移植瘤由人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞株皮下接種免疫缺陷裸鼠產(chǎn)生。
圖21顯示ACEA100108化合物治療人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞裸鼠移植瘤時(shí)小鼠體重變化。
圖22顯示ACEA100108化合物在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)抗人卵巢癌AO 10/17細(xì)胞移植瘤的動(dòng)態(tài)效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)，裸鼠移植瘤由人卵巢癌AO 10/17細(xì)胞株皮下接種免疫缺陷裸鼠產(chǎn)生。
圖23顯示ACEA100108化合物在裸鼠體內(nèi)抗人卵巢癌AO 10/17細(xì)胞移植瘤的動(dòng)態(tài)效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)，裸鼠移植瘤由人卵巢癌AO 10/17細(xì)胞株皮下接種免疫缺陷裸鼠后獲得。
圖24顯示ACEA100108化合物治療人卵巢癌AO 10/17細(xì)胞裸鼠移植瘤時(shí)小鼠體重變化。
圖25顯示ACEA100108化合物治療后人乳腺癌Bcap-37皮下移植腫瘤的動(dòng)態(tài)效果(腫瘤體積隨時(shí)間的變化)，裸鼠移植瘤由皮下接種人乳腺癌Bcap-37后所產(chǎn)生。
圖26顯示ACEA100108對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株作用效果，該作用由RT-CES系統(tǒng)檢測(cè)。
圖27顯示HT1080細(xì)胞在體外對(duì)DBTS不同衍生化合物的反應(yīng)。細(xì)胞化合物反應(yīng)采用RT-CES系統(tǒng)檢測(cè)。
圖28顯示未經(jīng)任何藥物處理的對(duì)照COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖29顯示不同濃度紫杉醇(Paclitaxel)處理4小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖30顯示不同濃度紫杉醇(Paclitaxel)處理24小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖31顯示不同濃度長(zhǎng)春花堿處理4小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖32顯示不同濃度長(zhǎng)春花堿處理24小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖33顯示不同濃度DBTS處理4小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖34顯示不同濃度DBTS處理24小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖35顯示不同濃度ACEA100108處理4小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖36顯示不同濃度ACEA100108處理24小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖37顯示不同濃度ACEA100116處理4小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖38顯示不同濃度ACEA100116處理24小時(shí)的COS細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖。
圖39a顯示DBTS抑制純化的微管蛋白的體外聚合結(jié)果。
圖39b顯示未經(jīng)任何藥物處理的體外微管蛋白聚合電子顯微鏡結(jié)構(gòu)圖。
圖39c顯示在3μM DBTS處理后體外微管蛋白聚合電子顯微鏡結(jié)構(gòu)圖。
圖40顯示ACEA100108抑制純化微管蛋白(無(wú)MAP)體外聚合結(jié)果。
圖41顯示ACEA100116抑制純化微管蛋白(無(wú)MAP)體外聚合結(jié)果。
圖42顯示人肺癌細(xì)胞A549在分別用1μMACEA100108、50nM紫杉醇、10nM長(zhǎng)春新堿、或DMSO處理24小時(shí)后采用6-CFDA(上圖)和AnnexinV(下圖)染色后的圖象。
圖43顯示人肺癌細(xì)胞A549在用25μM ACEA100108，7.8nM紫杉醇，或DMSO處理24小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞分裂周期分布圖。
本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明 為了清晰起見(jiàn)但并非限制本發(fā)明，本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明由下述幾部分組成。
A.定義 除另外說(shuō)明之外，本發(fā)明中使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)和在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)科技專(zhuān)家常使用和理解的意義相同。本發(fā)明中引用的專(zhuān)利、申請(qǐng)、已發(fā)表的申請(qǐng)及其他出版物均以參考文獻(xiàn)的方式整合到本專(zhuān)利申請(qǐng)中。如本節(jié)中所述定義與列為本文參考文獻(xiàn)的其他文獻(xiàn)和專(zhuān)利上的定義不一致，則以本節(jié)中所述定義為準(zhǔn)。
本發(fā)明中所用“一”或“一個(gè)”或“一種”或“一類(lèi)”意指至少一個(gè)/種/類(lèi)或一個(gè)/種/類(lèi)或一個(gè)/種/類(lèi)以上。
本發(fā)明中所用“烷基”指各種直鏈的、帶支鏈的或環(huán)狀的飽和烴基，特別包括含有十個(gè)或十個(gè)碳以下的低級(jí)烷基。例如，甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，異戊基，己基等僅為本定義中的一些典型例子。所用“烯基”或“烯烴基”與上述“烷基”定義相同但其中必須有最少一個(gè)碳碳雙鍵(C＝C)，所以本發(fā)明所用的烯基包括含有兩個(gè)到十個(gè)碳原子的直鏈的、帶支鏈的或環(huán)狀的并含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的烴基，如乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基等。以此類(lèi)推，本發(fā)明所用的“炔基”或“炔烴基”為上述烷基或烯基并含有至少一個(gè)碳碳三鍵。所以，炔基包括含有兩個(gè)到十個(gè)碳原子并含有至少一個(gè)碳碳三鍵的直鏈的、帶支鏈的或環(huán)狀的炔烴基或炔基，如乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基等。
本發(fā)明所用“環(huán)烷基”為環(huán)狀的烷烴基團(tuán)并優(yōu)先選用含有三到八個(gè)碳的環(huán)烷基。因此，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基和環(huán)辛基均為本定義下的典型例子。環(huán)烷基中含有一個(gè)或兩個(gè)碳碳雙鍵即形成“環(huán)烯基”。環(huán)烷基上還可以有烷基、烯基、炔基、鹵原子和其他基團(tuán)取代。
本發(fā)明所使用的“芳基”或“芳香族片斷”為芳香族環(huán)系并可在環(huán)中含有一個(gè)或一個(gè)以上的非碳原子(除碳以外的其他雜原子如氮，硫，磷等)如苯基，萘基和吡啶基等。這些芳基還可通過(guò)兩個(gè)共價(jià)鍵與其他五員或六員芳基或雜環(huán)基團(tuán)相稠合而形成“稠合芳基”。
本發(fā)明中還常用到的“雜環(huán)基”，“雜環(huán)烷基”和“雜環(huán)片斷”可互換使用且系指任何多個(gè)原子通過(guò)共價(jià)鍵構(gòu)成的環(huán)狀基團(tuán)和化合物并且含有至少一個(gè)非碳原子。特指雜環(huán)基團(tuán)包括含有氮、硫或氧作為非碳原子的五員和六員環(huán)狀系統(tǒng)如咪唑，吡咯，三唑，二氫嘧啶，吲哚，吡啶，噻唑，四唑等。這些雜環(huán)基團(tuán)進(jìn)而與單環(huán)或雙環(huán)或雜環(huán)稠合而成“稠合雜環(huán)基”或“稠合雜環(huán)堿基”或“稠合雜環(huán)片斷”。
本發(fā)明中的“烷氧基”指與氧原子連接的直鏈或帶支鏈的烷基，也稱(chēng)為烷氧化物或醇鹽。本基團(tuán)中烴部分可含有任何數(shù)目的碳原子并可包括一個(gè)或兩個(gè)氧、硫或氮原子，還可含有雙鍵或三鍵。此類(lèi)烷氧基團(tuán)的例子包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，甲氧乙氧基等。同樣“烷硫基”指與硫原子連接的直鏈或帶支鏈的烷基，也稱(chēng)為烷硫化物或硫醇鹽。本基團(tuán)中烴部分可含有任何數(shù)目的碳原子并可包括一個(gè)或兩個(gè)氧、硫或氮原子，還可含有雙鍵或三鍵。此類(lèi)烷硫基團(tuán)的例子包括甲硫基，乙硫基，丙硫基，異丙硫基，甲氧乙硫基等。
同樣“烷胺基”指直鏈或帶支鏈的烷基胺，其中氨基氮原子可以有一個(gè)或兩個(gè)烷基取代，其中烴部分可含雙鍵或三鍵，且可含有任何數(shù)目的碳原子并可包括一個(gè)或兩個(gè)氧、硫或氮原子。此類(lèi)烷胺基的例子包括甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基等。
本發(fā)明所用的“芳氧基”指與氧原子連接的芳基，其中芳環(huán)可以有進(jìn)一步取代，苯氧基即是常用的例子之一?！胺剂蚧笔桥c硫原子連接的芳基，而且芳環(huán)可以有進(jìn)一步取代。苯硫基即是實(shí)例之一。
本發(fā)明中的“鹵素”為氟，氯，溴，碘。
本發(fā)明中的“氨基酸”指取代的天然和非天然的氨基酸，純的L-或D-構(gòu)型或外消旋混合物，其中氨基和羧基用來(lái)衍生所期待的化合物。
應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到的是，上述所定義的各種取代基還可以有一個(gè)或多個(gè)取代基進(jìn)一步取代，其中這些新的取代基也可以有取代。例如，烷基或芳香基上的氫原子被氨基、鹵素或其他基團(tuán)取代即成為新的屬于上述各定義中的基團(tuán)。
本發(fā)明中所用的“取代”系指一個(gè)原子或化學(xué)基團(tuán)(如H，NH2或OH等)由一個(gè)官能團(tuán)取代。特別期待的官能團(tuán)包括親核基團(tuán)(如-NH2，-OH，-SH，-NC等)，親電基團(tuán)(如C(O)OR，C(X)OH等)，極性基團(tuán)(如-OH)，非極性基團(tuán)(如雜環(huán)，芳基，烷基，烯烴基，炔烴基等)，離子型基團(tuán)(如-NH3+)，鹵素(如氟，氯等)，NHCOR，NHCONH2，OCH2COOH，OCH2CONH2，OCH2CONHR，NHCH2COOH，NHCH2CONH2，NHSO2R，OCH2-雜環(huán)，PO3H，SO3H，氨基酸以及業(yè)內(nèi)已知的各種組合。本發(fā)明中的“取代”還指多取代，即有多個(gè)本發(fā)明中所選定的取代基，而且該有取代的化合物還可分別且獨(dú)立地有一個(gè)或更多個(gè)所選的取代基。
本發(fā)明中所用的“有機(jī)硫衍生物”或“有機(jī)硫化合物”指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上“S”原子的有機(jī)化合物。本發(fā)明所用“二硫化物”或“二硫醚”、“三硫化物”或“三硫醚”、“四硫化物”或“四硫醚”或“五硫化物”或“五硫醚”指兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)硫原子連在一起構(gòu)成的多硫片斷，而且其中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)硫原子可被氧化成S＝O或SO2。這些二硫、三硫、四硫或五硫化物或醚的衍生物是由兩個(gè)官能團(tuán)、芳基、雜環(huán)基團(tuán)或其他取代基在其兩端取代而成(R-S-(S)0-3-S-R)。兩個(gè)或三個(gè)三硫化物或醚單元(-S-S-S-)用芳環(huán)或線性鏈連在一起也稱(chēng)之為三硫化物或三硫醚或有機(jī)硫化物。一個(gè)或兩個(gè)三硫化物單元亦可連在一起構(gòu)成環(huán)狀多硫化物。
B.有取代的有機(jī)硫衍生物及其醫(yī)藥組合物 本發(fā)明提供有下式的化合物 或 其中，A和B相同或不同，并且獨(dú)立地是任選取代的芳基、雜芳基或一種5～14員、可以是單環(huán)或多環(huán)的而且任選地含有雜原子的環(huán)；每一個(gè)S任選地呈氧化物的形式；S1和S2獨(dú)立地是S，SO或SO2；每一個(gè)R是H，鹵素，羰基，氰基，氨基，酰胺基，氨基酸，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每一個(gè)R1是烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)都任選地有取代且可含有雜原子；m，n和p獨(dú)立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p定義如上；或有下述通式(5)的化合物
其中，A，B，S，n和p定義如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中“q”是0-3，而“*”代表的碳碳雙鍵(C＝C)可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任選地有取代的芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中，A和B可以一起形成環(huán)狀系統(tǒng)；及其藥物上可接受鹽、酯、藥物前體或代謝物；先決條件是所述化合物不是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氯芐基)三硫醚，(對(duì)-氯芐基)芐基三硫醚，二(對(duì)-硝基芐基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(對(duì)-叔丁基苯基)三硫醚。
在其它實(shí)施方案中，在上述通式1-5中，每個(gè)R均可是非干擾基團(tuán)。本發(fā)明中的非干擾基團(tuán)定義為在一個(gè)化合物中該基團(tuán)的存在并不破壞此化合物作為醫(yī)學(xué)治療劑所使用的性能，而且可能緩解藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)或降低毒性。適宜的非干擾基團(tuán)包括鹵素，硝基，羰基，烷基，烯基，炔基，芳基，芳烷基，芳烯基，烷氧基，烷硫基，芳炔基，各種不同雜環(huán)，氨基酸等，而且每個(gè)基團(tuán)均可有一個(gè)或更多個(gè)非干擾基團(tuán)取代。非干擾基團(tuán)還包括COOR，SR，OR，其中，R也是如上定義的非干擾取代基。
在上述通式1-5中，A和B可獨(dú)立地是
或 其中，X和W獨(dú)立地是S，O，NR7，CR7；或在六員單環(huán)或雙環(huán)中一個(gè)W可以是一個(gè)??；并且每一個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7同上述定義。
在其它實(shí)施方案中，每個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可為極性或非極性的取代基。在其他例子中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7是親核性或親電性的非干擾性基團(tuán)。
本發(fā)明還涵蓋通式1-5中的化合物及其鹽和藥物前體。此類(lèi)鹽可以是由化合物上帶正電荷的基團(tuán)(如A和/或B上的氨基)與醫(yī)藥上適用的陰離子形成的。適宜的陰離子包括但并不限于氯根，溴根，碘根，硫酸根，硝酸根，磷酸根，檸檬酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，馬來(lái)酸根，乙酸根等。醫(yī)藥上可接受鹽還可以由化合物上帶負(fù)電荷取代基(如A和/或B上的羧基)與陽(yáng)離子形成。有眾多帶正電荷離子可以用于本目的，比如鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，和有機(jī)銨離子如四甲銨離子，四丁銨離子及其他的有機(jī)陽(yáng)離子。
該三硫醚化合物可按照流程1中所示程序合成。例如，芳香環(huán)或雜環(huán)亞甲基鹵(X＝I或Br或Cl)與硫脲反應(yīng)。所得到的異硫脲鹵化物中間體再與氫氧化鈉反應(yīng)而得到相應(yīng)的硫醇衍生物(Furniss，B.S.；Hannaford，A.J.；Rogers，V.；Smith，P.W.G.；Tatchell，A.R.Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry，Longman GroupLimited，London，1978，pp 582-83)。
硫醇衍生物合成 方法A對(duì)稱(chēng)三硫化物合成 方法B不對(duì)稱(chēng)或?qū)ΨQ(chēng)三硫化物合成 流程1對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)三硫化物的合成方法 對(duì)稱(chēng)的三硫醚化合物可用方法A來(lái)合成。在方法A中，N-三甲基甲硅烷基咪唑與二氯化硫反應(yīng)。所生成的硫化二咪唑中間產(chǎn)物隨后與硫醇反應(yīng)而生成相應(yīng)的三硫化物。在方法B中，一個(gè)硫醇分子先在低溫下與二氯化硫發(fā)生定量反應(yīng)。所生成的氯化二硫化合物中間體(R-S-S-Cl)再與第二分子的硫醇反應(yīng)，根據(jù)第二步所用相同或不同的硫醇，而生成相對(duì)應(yīng)的對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的三硫醚化合物。
典型的芳香族亞甲基硫醇1-6(流程2)可以用《Vogel’s實(shí)用有機(jī)化學(xué)》第582-583頁(yè)所描述的類(lèi)似程序合成。對(duì)稱(chēng)三硫醚化合物7-32(流程2)是用方法A來(lái)合成的。此方法與所報(bào)道的方法類(lèi)似(Banerii，A.；Kalena，G.P.Tetrahedron Letters 1980，21，3003-3004)。合成本類(lèi)三硫醚化合物的通用過(guò)程如下在室溫和攪拌下，將二氯化硫(14毫摩爾)的無(wú)水己烷或二氯甲烷溶液滴加到含有N-三甲基甲硅烷基咪唑(28毫摩爾)的己烷溶液中。攪拌所得反應(yīng)混合物30分鐘后冷卻到0℃。在攪拌下，在大約30分鐘內(nèi)將相應(yīng)硫醇(28毫摩爾)的無(wú)水己烷溶液慢慢滴加到反應(yīng)混合物中。繼續(xù)攪拌30分鐘并使溫度升到室溫。過(guò)濾出沉淀的咪唑副產(chǎn)品。用水和飽和食鹽水在分液漏斗中洗滌上述濾液。用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相。除去溶劑后所得粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離提純。用己烷-乙酸乙酯100∶1到20∶1洗脫劑淋洗。所得產(chǎn)品7-32的收率為60-90％。芳香族三硫醚化合物33-39是用類(lèi)似方法從相應(yīng)的芳香族或雜環(huán)硫酚合成的，其收率為30-70％。
二(對(duì)-氟芐基)三硫醚(8)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色針狀晶體8，收率77％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.46(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振譜(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振譜(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES質(zhì)譜m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3計(jì)算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；實(shí)驗(yàn)值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
二(對(duì)-氯芐基)三硫醚(9)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體9，收率90％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.45(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ3.98(s，4H)，7.22(d，4H，J＝8.4Hz)，7.29(d，4H，J＝8.4Hz)。
流程2用方法A合成對(duì)稱(chēng)三硫化合物 二(間-三氟甲基芐基)三硫醚(12)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體12，收率99％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.33(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ4.04(s，4H)，7.41-7.49(m，4H)，7.51-7.58(m，4H)。
二(苯并[B]噻吩-3-甲基)三硫醚(22)硅膠色譜柱提純后得到白色固體22，收率45％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.45(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ3.74(s，4H)，7.01(s，2H)，7.34-7.45(m，4H)，7.75(d，2H，J＝7.4Hz)，7.85(dd，2H，J＝7.8，1.1Hz)；ES質(zhì)譜m/z 391(M+H)+，413(M+Na)+。
二(對(duì)-溴芐基)三硫醚(25)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體25，收率84％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.55(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ3.96(s，4H)，7.17(d，4H，J＝8.3Hz)，7.45(d，4H，J＝8.3Hz)。
二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚(26)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體26，收率99％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.66(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ2.33(s，6H)，4.01(s，4H)，7.14(d，4H，J＝8.0Hz)，7.21(d，4H，J＝8.0Hz)。
二(對(duì)-叔丁基芐基)三硫醚(28)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體28，收率96％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.50(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ1.30(s，18H)，4.02(s，4H)，7.25(d，4H，J＝8.3Hz)，7.35(d，4H，J＝8.3Hz)。
二(鄰-氯芐基)三硫醚(30)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體30，收率77％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.44(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ4.17(s，4H)，7.23-7.28(m，4H)，7.35-7.43(m，4H)。
流程3用方法B合成對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)三硫化合物 二(2，4，6-三甲基芐基)三硫醚(32)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體32，收率59％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.65(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ2.27(s，6H)，2.42(s，12H)，4.23(s，4H)，6.87(s，4H)。
二(對(duì)-甲氧基苯基)三硫醚(33)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體33，收率98％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.32(20∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ3.80(s，4H)，6.81(d，4H，J＝8.8Hz)，7.47(d，4H，J＝8.8Hz)。
二(4-三氟甲基吡啶-2-基)三硫醚(34)硅膠色譜柱提純后并用己烷重結(jié)晶得到白色晶體34，收率53％；硅膠薄板層析色譜分析(TLC)Rf＝0.61(10∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ 7.70(d，4H，J＝8.4Hz)，7.84(dd，4H，J＝8.4，2.4Hz)，8.73(s，2H)。
表1-8中所列的不對(duì)稱(chēng)有機(jī)三硫醚化合物可以遵照化合物41-68的類(lèi)似方法，由相應(yīng)的硫醇來(lái)合成。
表1各種代表性的二取代三硫衍生物
表2各種代表性的二取代三硫衍生物 表3各種代表性的二取代三硫衍生物
表4各種代表性的二取代三硫衍生物 表5各種代表性的二取代三硫衍生物
表6各種代表性的二取代三硫衍生物
表7各種代表性的二取代三硫衍生物
表8各種代表性的二取代三硫衍生物 流程4和5中所列的二取代三硫醚衍生物可以通過(guò)與方法B類(lèi)似的程序合成。典型的合成過(guò)程如下將二氯化硫(20毫摩爾)的無(wú)水乙醚(80mL)溶液冷卻到-78℃。在攪拌下向該溶液中在三十分鐘內(nèi)滴加1，3-苯二甲基二硫醇或2-丁烯基-1，4-二硫醇(10毫摩爾)和無(wú)水吡啶(20毫摩爾)的乙醚(30毫升)溶液。繼續(xù)攪拌三十分鐘。在三十分鐘內(nèi)將第二個(gè)相應(yīng)的硫醇(20毫摩爾)和吡啶(20毫摩爾)在40毫升乙醚中的溶液滴加到反應(yīng)液中。繼續(xù)保持反應(yīng)液溫度在-78度并繼續(xù)攪拌三十分鐘。所得反應(yīng)混合物用水洗滌的兩次，用1N的氫氧化鈉水溶液洗滌兩次，再用水洗滌兩次直到水溶液呈中性。所得有機(jī)相用二氯化鈣或無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾出干燥劑，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。所得粗產(chǎn)品通過(guò)一個(gè)短的硅膠色譜柱提純，己烷-乙酸乙酯作為洗脫劑，所得產(chǎn)品收率為40-90％。
流程4雙三硫衍生物的合成
流程5雙三硫衍生物的合成 流程6三，四，五硫衍生物的合成 流程6所述方法也用來(lái)合成了有機(jī)三硫醚衍生物。四硫醚和五硫醚衍生物是用基于文獻(xiàn)報(bào)道的程序的類(lèi)似戰(zhàn)略合成的[Sinha，P.；Jundu，A.；Roy，S.；Prabhakar，S.；Vairamani，M.；Sankar，A.R.；Kunwar，A.C.Organometallics 2001，20，157-162]。
流程7次磺酸-磺酸硫代酐，硫代磺酸酯和二磺酸硫代酐衍生物的合成 對(duì)稱(chēng)的或不對(duì)稱(chēng)的次磺酸-磺酸硫代酐衍生物(流程7)可以根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的程序合成[Karpp，D.N.；Gleason，J.G.；Ash，D.K.J.Org.Chem.1971，36，322-326；和Harpp，D.N.；Ash，D.K.；Smith，R.A.J.Org.Chem.1979，44，4135-4140]。
本發(fā)明也提供的藥劑配伍包含有效劑量的通式1-5化合物。該藥劑配伍可任選地含有一種有效的抗增生化學(xué)成份和醫(yī)藥上可接受賦形劑。此處的“有效劑量“指的是對(duì)于所治療對(duì)象能產(chǎn)生治療效果所需要該化合物的用量。該有效量或劑量可以像業(yè)內(nèi)技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的那樣因情況而異。比如，所治療的腫瘤種類(lèi)不同，給藥途徑不同，是否與其它治療方法如其他抗腫瘤藥物或放射治療共用等，劑量均可發(fā)生改變。
此處所用“抗細(xì)胞增生劑”指可以用來(lái)治療或緩解腫瘤或癌癥這樣的細(xì)胞增生病變的治療劑?？辜?xì)胞增生藥物的實(shí)例包括但并不限于抗腫瘤劑、烷基化劑、植物生物堿、抗微生物劑、磺酰胺類(lèi)藥物、抗病毒藥、鉑類(lèi)藥物及業(yè)內(nèi)已知的其它抗癌藥物。具體的抗細(xì)胞增生藥物包括但不限于順鉑，卡鉑，白消安，甲氨蝶呤，柔紅霉素，多柔比星，環(huán)磷酰胺，甲胺蝶呤片(mephalan)，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，苯丁酸氮芥，紫杉醇(paclitaxel)，吉西他濱及業(yè)內(nèi)已知的其它藥物(見(jiàn)例如，Goodman&Gilman′s，The Pharmacological Basis of Therapeutics(9th Ed)(Goodman，et al.，eds.)(McGraw-Hill)(1996)；和1999Physician′s Desk Reference(1998))。
本發(fā)明化合物可以制成任何適用配方。如果某些化合物具有足夠的堿性或酸性并生成無(wú)毒性的酸加成鹽或堿加成鹽，可以使用該化合物的鹽的形式。醫(yī)藥上可接受的有機(jī)酸鹽包括生理上可接受的陰離子鹽，如對(duì)甲苯磺酸鹽，甲磺酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，丙二酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，苯甲酸鹽，抗壞血酸鹽，α-酮戊二酸鹽及α-甘油磷酸鹽等。可使用的無(wú)機(jī)鹽包括鹽酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，碳酸氫鹽，和碳酸鹽等。這些鹽可以通過(guò)業(yè)內(nèi)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序制成，如具有像胺這樣充分堿性的化合物與合適的酸可以制成所述的鹽的形式。羧酸類(lèi)的化合物可以與堿金屬或堿土金屬形成可使用的鹽。
本發(fā)明通式1-5的化合物一般可溶于有機(jī)溶劑例如氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇，異丙醇，乙氰，甘油，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲亞砜等中。本發(fā)明化合物可以與醫(yī)藥上可接受載體混合而制成配方。制劑通過(guò)包含下列步驟的方法制得a)將權(quán)利要求1的化合物溶解于水溶性有機(jī)溶劑，非離子性溶劑，水溶性類(lèi)脂，環(huán)糊精，生育酚等維生素，脂肪酸，脂肪酸酯，磷脂或這些溶劑的組合溶劑中而制得藥物溶液；b)再加入生理鹽水或含1-10％碳水化合物如葡萄糖的水溶液。由此而制得的配方穩(wěn)定并可用于動(dòng)物和臨床用途。
本方法中所用的典型水溶性溶劑包括但不限于聚乙二醇，醇類(lèi)，乙氰，N-甲基-2-吡咯啉酮，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲基亞砜以及其組合。醇類(lèi)的例子包括但不限于甲醇，乙醇，異丙醇，丙三醇或丙二醇。
本方法中所用的典型的水溶性非離子性表面活性劑包括但不限于三蓖麻醇酸聚氧乙烯甘油酯35，琥泊酸聚乙二醇酯，polysorbates 20，polysorbates 80，12-羥基硬脂酸聚乙二醇660酯，失水山梨醇單油酸酯，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，乙氧基化杏核油，辛基己酰macrogol-8-甘油酯，甘油酯，PEG 6辛酸甘油酯，甘油，乙二醇失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚(glycol-polysorbate)或其合用。典型的非離子性表面活性劑包括聚乙二醇改性CREMOPHOR(三蓖麻醇酸聚氧乙烯甘油酯35)，CREMOPHOREL，氫化CREMOPHORRH40，氫化CREMOPHORRH60，SOLUTOLHS(12-羥基硬脂酸聚乙二醇660酯)，LABRAFIL(乙氧基化杏核油)，LABRASOL(辛基己酰macrogol-8-甘油酯)，GELUCIRE(甘油酯)，和SOFTIGEN(PEG 6辛酸甘油酯)。
本方法中所用的典型非水溶性類(lèi)脂包括但不限于菜籽油，甘油三酸酯，植物油或其合用。類(lèi)脂油類(lèi)包括但不限于蓖麻油，聚烴氧基蓖麻油，玉米油，橄欖油，棉子油，花生油，薄荷油，紅花油，芝麻油，大豆油，氫化菜籽油，氫化大豆油，椰子油三酸甘油酯，棕櫚籽油以及其氫化形式或其合用。
本方法中所用的典型脂肪酸和脂肪酸酯包括但不限于油酸，各種甘油單酸酯，甘油二酸酯，PEG的單或二脂肪酸酯，或其合用。
本方法中所用的典型環(huán)糊精包括但不限于α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精，羥丙基-β-環(huán)糊精，磺基丁基醚-β-環(huán)糊精等。
本方法中所用的典型磷脂包括但不限于大豆卵磷脂，二硬酯酰磷脂酰甘油及其氫化形式或其合用。
業(yè)內(nèi)普通技術(shù)人員可以在本說(shuō)明書(shū)教誨之內(nèi)改進(jìn)該配方以提供適用于特定給藥途徑的眾多配方。這些化合物還可以進(jìn)一步改性以使其更易溶解到水或其他溶劑中。為了使這些化合物具有好的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)從而在患者身上具有最好的效果，業(yè)內(nèi)普通技術(shù)人員也可以改進(jìn)特定化合物的給藥途徑和劑量方案。
C.有取代有機(jī)硫衍生物及其醫(yī)藥組合物的使用方法 本文中所述的化合物可用來(lái)作為細(xì)胞毒劑和/或細(xì)胞分裂抑制劑，從而用于治療癌癥或其它細(xì)胞增生性疾病。這些化合物可通過(guò)以下任何一種機(jī)理來(lái)起作用。例如，該化合物可抑制細(xì)胞分裂周期的G2/M期，從而最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。(見(jiàn)如Weung，et al.Biochim.Biophys.Res.Comm.1997，263，398-404)。其中一些化合物可破壞微管蛋白聚合，另一些化合物則可破壞微管蛋白解聚。這些化合物可抑制細(xì)胞有絲分裂及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(見(jiàn)如Panda，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94，10560-10564)。這些化合物也可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，和血管形成效應(yīng)(見(jiàn)如Witte，et al.Cancer Metastasis Rev.1998，17，155-161)。
本發(fā)明同時(shí)提供治療細(xì)胞增生紊亂的醫(yī)藥組合物，包含任何一種有上述通式1-5的化合物，其中包括但不限于二芐基三硫醚，二(對(duì)-氯芐基)三硫醚，對(duì)氯芐基芐基三硫醚，二(對(duì)硝基芐基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚，或二(對(duì)叔丁基苯基)三硫醚。
為實(shí)施本發(fā)明方法，有通式1-5的化合物及其醫(yī)藥組合物可以經(jīng)口或非腸道途徑給藥。同時(shí)也可以通過(guò)霧化吸入，或經(jīng)局部，經(jīng)直腸，經(jīng)鼻，經(jīng)頰，經(jīng)陰道給藥。同時(shí)也可通過(guò)體內(nèi)移植藥物源(泵)以及其他方法給藥。此處所指的非腸道途徑給藥是指皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、心房?jī)?nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、創(chuàng)傷部位內(nèi)、顱內(nèi)注射或滴注技術(shù)。
無(wú)菌注射組合物，例如無(wú)菌注射水性或油脂性懸浮液可采用常規(guī)使用的膠體劑，親水性制劑和懸液制劑來(lái)配方。無(wú)菌注射制劑的制備可采用無(wú)毒性非腸道途徑給藥用的稀釋劑或溶劑。在這些可采用的媒介質(zhì)和溶媒包括甘露醇，水，生理食鹽水，等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌固定油也通常可被用于溶劑或懸浮液(例如合成的甘油單或雙酸酯)。藥用植物油，脂肪酸如油酸及甘油衍生物，也可用于注射劑的配制，以及其他藥用植物油如橄欖油，蓖麻油。特別是在這些植物油的聚氧乙基化后使用。這些油溶液或懸浮液可以同時(shí)含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑或羥甲基纖維素，或類(lèi)似分散劑。商業(yè)中常用來(lái)產(chǎn)生固體、液體或其他藥用制劑的各種乳化劑或生物有效度增強(qiáng)劑也可用于配方。
本化合物可制作成口服制劑，其劑型可包括但不限于片劑，膠囊劑，乳狀液劑，或水懸浮液、分散液和溶液。口服片劑的常用配料為乳糖和玉米淀粉。諸如硬酯酸鎂類(lèi)的潤(rùn)滑劑，也可用于口服片劑的制備?？诜z囊的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)制備口服用乳狀液或水懸浮液時(shí)，可在油相中結(jié)合乳化劑或懸浮劑在一起，加入一種活性成份，按需可同時(shí)加入一些增甜劑，香料，或色素。鼻腔霧化吸入給藥制劑成份可以用目前常規(guī)運(yùn)用的藥用制劑技術(shù)制備。制劑溶液中可含鹽，防腐劑(如芐醇)、吸收增強(qiáng)劑來(lái)促進(jìn)生物吸收，以及其他已知的促溶或分散劑。
此外，在對(duì)不同腫瘤的治療中，通式1-5中的化合物可單獨(dú)給藥，也可以與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥。本發(fā)明所指的聯(lián)合用藥治療過(guò)程中，包括運(yùn)用至少一種本發(fā)明所例舉的化合物以及其活性衍生物。聯(lián)合用藥時(shí)，不同的活性成份或藥用成份可以同時(shí)使用也可以分別使用。聯(lián)合用藥時(shí)的藥量和給藥時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同的情況下所取得的最合理治療效果而定。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用治療有效量的通式1-5中的化合物治療或緩解某一組織或器官的癌癥的方法。所指癌癥包括但不限于白血病，淋巴瘤，肺癌，結(jié)腸癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，黑素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，及其它類(lèi)型增生疾病。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明涉及使用通式1-5中的化合物例如二芐基三硫醚以及其他硫代衍生物來(lái)治療冠狀動(dòng)脈病病人因冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后的血管狹窄癥。冠狀動(dòng)脈病病人在冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后所患的血管狹窄癥主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)增生所致的血管內(nèi)膜增生。(見(jiàn)例如“Pathology of acute and chronic coronarystenting in humans”，by Farb，A.，Sangiorgi，G.，Certer，A.J.，et al.Circulation，1999，99，44-52)。合理應(yīng)用具有抗細(xì)胞增生活性的化合物有降低臨床病人血管性狹窄的危險(xiǎn)(見(jiàn)例如“A polymer-based，paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”，byStone，G.W.，Ellis，S.G.，Cox，D.A，et al.New Engl.J.Med.，2004，350，221-231)。因此，DBTS(二芐基三硫醚)和在通式中所列的其他化合物也可以被用來(lái)抑制血管內(nèi)膜增生，從而降低血管內(nèi)膜增生和血管狹窄。
可用不同的方法來(lái)有效地輸送通式1-5的化合物到治療靶位，如細(xì)胞。例如，包含DBTS(二芐基三硫醚)或其他通式1-5中的化合物的制劑可以通過(guò)口服，非腸道途徑或移植藥源(泵)等方法給藥。另一種情況下，在下面的參考文獻(xiàn)中所例舉的方法也可以用于本發(fā)明所例舉的化合物的給藥方法“A polymer-based，paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”，by Stone，G.W.，Ellis，S.G.，Cox，D.A.et al.New Engl.J.Med.2004，350，221-231；“A randomized comparison of a sirolimus-eluting stent with astandard stent for coronary revascularization”，by Morice，M.-C.，Serruys，P.W.，Sousa，J.E.，et al.New Engl.J.Med.2002，346，1773-1780；“Sirolimus-eluting stents versus standard stents in patientswith stenosis in a native coronary artery”，by Moses，J.W.，Leon，M.B.，Popma，J.J.，et al，New Engl.J.Med.2003，349，1315-1323。
DBTS(二芐基三硫醚)和其硫代化合物的衍生物的抗腫瘤效果可以用傳統(tǒng)的體外腫瘤細(xì)胞系和終端細(xì)胞存活檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定。同時(shí)也可以用實(shí)時(shí)微電子細(xì)胞傳感器系統(tǒng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)的方法來(lái)測(cè)定?，F(xiàn)用的幾種終端細(xì)胞檢測(cè)方法已廣泛用于抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)。例如，美國(guó)國(guó)家腫瘤研究所提供的終端檢測(cè)方法對(duì)60種腫瘤細(xì)胞系的檢測(cè)。該方法可提供大范圍細(xì)胞水平的抗腫瘤藥物的篩選。(見(jiàn)例如Monks，A.，et al.J Natl.Cancer Inst.1991，83，757-766；Alley，M.C.，et al.Cancer Res.1988，48，589-601；Shoemaker，R.H.，etal.Proc.Clin.Biol.Res.1988，276，265-286；和Stinson，et al.Proc.Am.Asso.Cancer Res.1989，30，613)。
這種篩選方法包括，將含有上千或上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液100微升加入96孔微孔板的一個(gè)微孔中，每孔中所加入的特定細(xì)胞數(shù)因不同細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞體積、細(xì)胞生長(zhǎng)特性而異。細(xì)胞板內(nèi)的細(xì)胞在37℃，飽和濕度和5％二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入倍數(shù)稀釋后的所測(cè)化合物。例如，連續(xù)倍數(shù)稀釋的倍數(shù)可以是10倍，2，3，4倍或5倍(或6-10倍)不等，以達(dá)到最高和最低化合物濃度差為10,000。也可運(yùn)用另一種倍數(shù)稀釋方法或不同的稀釋濃度。典型的稀釋例子為，最高化合物濃度為10-4M。在細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入約100微升測(cè)試溶液，并作復(fù)孔對(duì)照?；衔锟捎糜袡C(jī)溶媒DMSO溶解。100微升被測(cè)溶液可以是有機(jī)相，懸浮液相，以及水相溶液的混合液。
加入化合物后，細(xì)胞可在37℃，飽和濕度，5％二氧化碳條件下連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。細(xì)胞的存活率可用不同的方法來(lái)檢測(cè)。例如，用磺基若丹明B檢測(cè)方法(如Rubinstein，L.V.，et al.J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1113-1118；和Skehan，P.，et al.J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112中所述)。細(xì)胞存活可用微孔板計(jì)數(shù)器測(cè)定的光密度來(lái)確定。化合物引起50％細(xì)胞抑制的濃度IC50可通過(guò)不同化合物濃度處理細(xì)胞的光密度值來(lái)計(jì)算(或用GI50值，即用細(xì)胞在給化合物前的細(xì)胞的光密度值來(lái)校正給化合物后測(cè)得的數(shù)值)。因此，GI50用來(lái)測(cè)定所測(cè)化合物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。見(jiàn)Boyd，et al，Cytotoxic AnticancerDrugsModels and Concepts for Drug Discovery and Development；Vleriote，F(xiàn).A.，Corbett T.H.，Baker L.H.(Eds.)；Kluwer AcademicHingham，Mass.，1992，pp 11-34。
另一種檢測(cè)方法用終端分析法檢測(cè)化合物對(duì)特定腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞毒性作用和/或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。采用NCI所例舉的腫瘤細(xì)胞株用于檢測(cè)。細(xì)胞在經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后(如8小時(shí)或24小時(shí))，加入被測(cè)連續(xù)倍數(shù)稀釋的化合物，(例如5個(gè)連續(xù)的10倍稀釋)。加化合物后24小時(shí)和/或48小時(shí)(或一個(gè)給定的處理時(shí)間)，化合物的計(jì)量依賴性細(xì)胞毒及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，可用MTT方法檢測(cè)[例如，如Boyd所述的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)試驗(yàn)方法](In Principle of Practice of Oncology，Devita，J.T.，Hellman，S.and Rosenberg S.A.(Eds)，1989，Vol，3，PPO Update，No.10)。
另一種體外檢測(cè)方法可用于評(píng)估化合物對(duì)細(xì)胞分裂周期的抑制作用。具體來(lái)說(shuō)，向不同濃度的被測(cè)化合物加入細(xì)胞中，然后培養(yǎng)一段時(shí)間，化合物處理過(guò)的細(xì)胞用propidium iodide染色，并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)。處在不同細(xì)胞周期，如亞G0/G1，G0/G1，S期和G2/M期的細(xì)胞亞群數(shù)可被流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀定量。諸如所有上述的體外檢測(cè)方法是細(xì)胞水平的、單一時(shí)間點(diǎn)及終端數(shù)據(jù)分析方法。
被檢測(cè)化合物也同時(shí)可以用一種基于細(xì)胞電極間電阻抗檢測(cè)的新的細(xì)胞檢測(cè)方法。不同于常規(guī)終端檢測(cè)法，這種新的檢測(cè)系統(tǒng)可對(duì)化合物的抗腫瘤效果進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，而且檢測(cè)是非標(biāo)記性的。這種方法被用于大規(guī)模的抗腫瘤化合物篩選。這種方法集細(xì)胞分子生物學(xué)和微電子學(xué)為一體，是一個(gè)基于電子信號(hào)檢測(cè)的生物學(xué)分析方法。
有關(guān)這一新的實(shí)時(shí)微電子傳感器細(xì)胞監(jiān)測(cè)方法技術(shù)(RT-CES)和其相關(guān)的器件，系統(tǒng)和應(yīng)用方法已在以下美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中描述US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/397,749.申請(qǐng)日2002年7月26日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/435,400，申請(qǐng)日2002年12月20日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/469,572，申請(qǐng)日2003年5月9日；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US03/22557，申請(qǐng)日2003年7月18日；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US03/22537，申請(qǐng)日2003年7月18日；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/37696，申請(qǐng)日2004年11月12日；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US05/04481，申請(qǐng)日2005年2月9日；US專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/705,447，申請(qǐng)日2003年11月10日；US專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/705,615，申請(qǐng)日2003年11月10日；US專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?0/987,732，申請(qǐng)日2004年11月12日；US專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)?1/055,639，申請(qǐng)日2005年2月9日。
以上專(zhuān)利申請(qǐng)都以參考文獻(xiàn)的方式整合到本申請(qǐng)中。有關(guān)RT-CES技術(shù)進(jìn)一步相關(guān)資料例舉在以下專(zhuān)利及專(zhuān)利申請(qǐng)中。
US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/519,567，申請(qǐng)日2003年11月12日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/542,927，申請(qǐng)日2004年2月9日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/548,713，申請(qǐng)日2004年2月底27日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/598,608，申請(qǐng)日2004年8月4日；
US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/598,609，申請(qǐng)日2004年8月4日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/613,749，申請(qǐng)日2004年9月27日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/613,872，申請(qǐng)日2004年9月27日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/614,601，申請(qǐng)日2004年9月29日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/630,071，申請(qǐng)日2004年11月22日；US臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/630,131，申請(qǐng)日2004年11月22日。
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采用RT-CES技術(shù)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞電極間阻抗測(cè)定，在微孔板底部安置了特定幾何形狀的微電極，該微電極是面向測(cè)試孔。當(dāng)細(xì)胞加入帶有微電極的微孔時(shí)，細(xì)胞便粘附在微電極表面。細(xì)胞是否粘附在電極表面以及粘附在電極表面的細(xì)胞特性改變均會(huì)影響通過(guò)電極表面的電子流或離子流。測(cè)定電極間的電阻抗變化提供了反映生長(zhǎng)在電子傳感器上細(xì)胞的生物狀態(tài)重要信息。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)改變時(shí)，這些微電子信號(hào)可直接、實(shí)時(shí)和自動(dòng)地檢測(cè)到，并同時(shí)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)進(jìn)行處理和分析。RT-CES系統(tǒng)采用細(xì)胞指數(shù)作測(cè)量單位。細(xì)胞指數(shù)指將所測(cè)得的電極電阻抗自動(dòng)轉(zhuǎn)化成的一個(gè)參數(shù)。在給定一個(gè)微孔中的細(xì)胞指數(shù)提示(1)該微孔中粘附在電極表面的細(xì)胞數(shù)量；(2)該微孔中粘附在電極表面的細(xì)胞的粘附質(zhì)量。因此，具同一類(lèi)型且同一生理特性的細(xì)胞及細(xì)胞數(shù)決定細(xì)胞指數(shù)的大小。即細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞指數(shù)就越大。另外，細(xì)胞粘附力越強(qiáng)(如細(xì)胞伸展覆蓋電極表面大或粘著力強(qiáng))，其相應(yīng)的細(xì)胞指數(shù)就越大。
通過(guò)應(yīng)用RT-CES，DBTS(二芐基三硫醚)顯示出抗多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特性。曾經(jīng)用常規(guī)的終端檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)DBTS(二芐基三硫醚)抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但所得出的結(jié)論是該化合物不具有抗增生效果。(“Discovery of novel inducers of cellular differentiation using HL-60 promyelocytic cells”，Mata-Greenwood，E.，Ito，A.，Westernburg，H.，Cui，B.，Mehta，R.G.，Kinghorn，A.D.and Pezzuto，J.M.Anticancer Res.2001，21，1763-1770)。
采用與10種作用機(jī)理不同的化合物以及測(cè)試12種腫瘤細(xì)胞株來(lái)比較DBTS(二芐基三硫醚)，從而評(píng)估其抗腫瘤效果和預(yù)測(cè)可能的作用機(jī)理。從時(shí)間依賴性的細(xì)胞反應(yīng)圖譜來(lái)看，DBTS(二芐基三硫醚)具有和紫杉醇、長(zhǎng)春堿或秋水仙素相同的作用機(jī)理。也不排除同時(shí)DBTS(二芐基三硫醚)具有和紫杉醇、長(zhǎng)春新堿或秋水仙素不同的作用機(jī)理。
除了體外細(xì)胞模型，各種檢測(cè)方法所得出的該化合物的抗腫瘤特性外，該化合物的體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)也提示其抗腫瘤效果。所指的動(dòng)物體內(nèi)模型指小鼠動(dòng)物模型。
使用實(shí)時(shí)細(xì)胞微電子傳感系統(tǒng)(RT-CES)進(jìn)行基于細(xì)胞的體外篩選 RT-CES系統(tǒng)包含三個(gè)部分一個(gè)電子傳感器分析儀，一個(gè)檢測(cè)臺(tái)，和一個(gè)16X或96X微滴定板。應(yīng)用光蝕微刻技術(shù)(lithographical micro fabrication method)將微電極傳感器陣列制成微電極玻片，在此電極玻片上裝配酶標(biāo)板成為帶電極的孔。每個(gè)RT-CES系統(tǒng)所使用的16X或96X微滴定板都包含16個(gè)(或96個(gè))這樣帶電極的孔。檢測(cè)臺(tái)可與16X或96X微滴定板連接，并可將每個(gè)孔開(kāi)關(guān)選接到傳感器分析儀進(jìn)行電阻抗測(cè)量。實(shí)際操作時(shí)，在各個(gè)孔中加有細(xì)胞的檢測(cè)板放置在檢測(cè)臺(tái)上，并與檢測(cè)臺(tái)一同置于二氧化碳培養(yǎng)箱中。在檢測(cè)臺(tái)與分析儀之間有電纜線連接。在RT-CES軟件的操作下，分析儀可自動(dòng)選擇所需測(cè)量的孔并持續(xù)測(cè)量電阻值。由分析儀所測(cè)得的電阻抗數(shù)據(jù)傳輸至計(jì)算機(jī)并由軟件系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
各個(gè)孔中電極之間阻抗的測(cè)量取決于電極的形狀、孔中的離子濃度、以及孔中是否有細(xì)胞貼附于電極上。當(dāng)電極上無(wú)細(xì)胞貼附時(shí)，電極阻抗主要取決于在電極/溶液接觸面的和溶液中的離子環(huán)境。當(dāng)有細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞貼附于電極傳感器表面，改變電極/溶液接觸面的離子環(huán)境，引起阻抗的增高。貼附于電極的細(xì)胞越多，細(xì)胞-電極的阻抗越大。而且，阻抗的改變還依賴于細(xì)胞的形狀和貼附在電極上的細(xì)胞的伸展?fàn)顟B(tài)。
為基于測(cè)量到的細(xì)胞-電極阻抗量化細(xì)胞狀態(tài)，推導(dǎo)了一個(gè)稱(chēng)為細(xì)胞指數(shù)(Cell Index，CI)的參數(shù)，由下式計(jì)算出CI=maxl=1,···,N(Rcell(f1)Rb(f1)-1)]]>其中Rb(f)和Rcell(f)分別表示有細(xì)胞貼附和無(wú)細(xì)胞貼附時(shí)的相應(yīng)頻率的電極電阻(阻抗的一個(gè)成分)。N為測(cè)量阻抗時(shí)的頻率點(diǎn)數(shù)。因此，細(xì)胞指數(shù)是帶有電極的孔中的細(xì)胞狀態(tài)的定量測(cè)量。在相同的生理狀態(tài)下，貼附于電極上的細(xì)胞越多，則Rcell(f)值越大，細(xì)胞指數(shù)也就越大。而且，當(dāng)孔中有相同的細(xì)胞數(shù)目時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)改變(如細(xì)胞形態(tài)改變)會(huì)引起細(xì)胞指數(shù)的變化。例如，細(xì)胞貼附或細(xì)胞伸展增加會(huì)引起細(xì)胞-電極接觸面積增加，而引起Rcell(f)值增大，因此，細(xì)胞指數(shù)的值變大。細(xì)胞指數(shù)也可用另外的公式來(lái)計(jì)算。其余基于阻抗測(cè)量細(xì)胞指數(shù)的計(jì)算方法見(jiàn)PCT申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US04/37696，遞交于2004年11月12日；PCT申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US05/04481，遞交于2005年2月9日；US專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/987,732，遞交于2004年11月12日和US專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/055,639，遞交于2005年2月9日。
不同類(lèi)型的人體腫瘤細(xì)胞，包括NCI-H460(非小細(xì)胞肺癌)，MV522SW(非小細(xì)胞肺癌)，MCF7(乳腺癌)，A549(非小細(xì)胞肺癌)，PC3(前列腺癌)，A431(表皮癌)，HT1080(纖維肉瘤)，MDA.MB2321(乳腺癌)，HT29(結(jié)腸癌)，HCC2998(結(jié)腸癌)，OVCAR4(卵巢癌)，A2780(卵巢癌)，HepG2(肝癌)，將上述各個(gè)細(xì)胞以不同的細(xì)胞數(shù)(4000到20,000細(xì)胞每孔)接種到16X或96X微滴定板上，并以RT-CESTM系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。在加入溶于DMSO的DBTS(二芐基三硫醚)溶液前讓細(xì)胞在板上生長(zhǎng)24小時(shí)，(DMSO的終濃度0.2％，DBTS的終濃度1.5625μM和100μM之間)。經(jīng)持續(xù)測(cè)量細(xì)胞-電極的阻抗，即可獲得時(shí)間-細(xì)胞指數(shù)曲線，并被記錄下來(lái)。
圖1-5，6A和7-12顯示一定細(xì)胞數(shù)時(shí)，在加入不同濃度的DBTS之前和加入DBTS之后的時(shí)間-細(xì)胞指數(shù)曲線。如圖所示，DBTS對(duì)腫瘤細(xì)胞增生呈現(xiàn)抑制作用。DBTS對(duì)不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞作用不同。對(duì)于某些細(xì)胞類(lèi)型，較低劑量的二芐基三硫醚已經(jīng)明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增生，而對(duì)于另一些細(xì)胞類(lèi)型，則需較高劑量才能獲得相似的抑制腫瘤的結(jié)果。
在一個(gè)實(shí)例中，圖1B和1C顯示H460細(xì)胞(非小細(xì)胞肺癌)在加入不同濃度的秋水仙素和紫杉醇之前和之后的時(shí)間-細(xì)胞指數(shù)曲線。如圖1B和1C所示，秋水仙素和紫杉醇在不同濃度梯度時(shí)都可抑制A431細(xì)胞增生。而且，如圖所示，在加入藥物(秋水仙素或者紫杉醇)后，H460的細(xì)胞指數(shù)隨時(shí)間先下降然后升高，顯示H460對(duì)于秋水仙素或者紫杉醇有復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。值得一提的是，圖1A中細(xì)胞在濃度為25μM以上的二芐基三硫醚(DBTS)的影響下，與圖1B和1C(即加入25μM以上的二芐基三硫醚(DBTS)中的曲線相似，H460的細(xì)胞指數(shù)也是首先隨時(shí)間降低然后升高。
在另一個(gè)實(shí)例中，圖6B顯示A431(上皮癌)在加入不同濃度的5-氟尿嘧啶之前和之后的時(shí)間-細(xì)胞指數(shù)曲線。如圖6B所示，5-氟尿嘧啶在濃度為12.5μM以上抑制A431細(xì)胞增生。圖6A顯示的時(shí)間-細(xì)胞指數(shù)曲線與圖6B顯示的有顯著不同。
在另一個(gè)實(shí)例中，圖13顯示HepaG-2細(xì)胞在DBTS作用下的細(xì)胞指數(shù)。圖13中DBTS未顯示有抑制HepG-2細(xì)胞增生的能力。
抗腫瘤活性的體內(nèi)檢測(cè) 為了評(píng)測(cè)化合物DBTS以及ACEA100108(DBTS的一種衍生物，見(jiàn)表33)的體內(nèi)抗腫瘤活性，使用了多種小鼠動(dòng)物模型，包括小鼠肉瘤S180模型，小鼠Lewis肺癌模型，P388白血病模型，以及三種人體腫瘤在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的異種移植模型Bcap-37乳腺癌，HCT-8結(jié)腸癌，ao12/17卵巢癌。被測(cè)化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性詳述如下。
化合物DBTS以及ACEA100108的急性毒性作用的評(píng)估 為評(píng)估DBTS以及ACEA100108(DBTS的一種衍生物，見(jiàn)表33)在靜脈注射后體內(nèi)的急性毒性反應(yīng)，試驗(yàn)在無(wú)腫瘤狀態(tài)下進(jìn)行。正常昆明小鼠單劑量靜脈注射(i.v.)一次劑量的DBTS或ACEA100108，并觀察急性毒性反應(yīng)。觀察用藥后所死亡的小鼠數(shù)量并作記錄。計(jì)算這些化合物的LD50值。詳細(xì)記錄如下。
下述實(shí)例用以舉例說(shuō)明，但不限定本發(fā)明。
例1DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤活性 為了評(píng)價(jià)被測(cè)化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性，使用兩個(gè)移植腫瘤模型進(jìn)行體內(nèi)評(píng)測(cè)一個(gè)是小鼠肉瘤S180模型，另一個(gè)是小鼠Lewis肺癌模型。試驗(yàn)用小鼠飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(Pharmacology Labof Shanghai Pharmaceutical Industry Institute)。小鼠來(lái)源與規(guī)格如下所述。小鼠為C57BL/6昆明種，由Academic Sinica動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，證書(shū)號(hào)Academic Sinica實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證書(shū)，5號(hào)。小鼠體重介于18-20g。所用小鼠雌雄皆有。但同一次試驗(yàn)所用動(dòng)物的性別是相同的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量如下被測(cè)化合物組(test compound group)小鼠30只，其中10只為高劑量組(high dose group)，10只為中等劑量組(middle dosegroup)，10只為低劑量組(low dose group)；化合物陽(yáng)性對(duì)照組(positivecontrol group)10只小鼠；陰性對(duì)照組(negative control group)20只小鼠，其中10只為生理鹽水(Saline)組，10只為溶劑(溶劑)組。所用高、中、低劑量的DBTS分別為50、25和12.5mg/kg/d。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陰性對(duì)照組分為兩組給予溶劑的對(duì)照組，和給予生理鹽水的對(duì)照組。在給予溶劑的對(duì)照組中，每只小鼠每天靜脈注射與高劑量DBTS組相同體積相同濃度(鼠肉瘤S180模型10％DBTS；小鼠Lewis肺癌模型5％DBTS)的溶劑，連續(xù)給藥7到10天。生理鹽水對(duì)照組每只小鼠每天給予0.5ml生理鹽水，連續(xù)7到10天。陽(yáng)性對(duì)照組，使用抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)30mg/kg每天靜脈注射，連續(xù)7到10天。
被測(cè)化合物制備和使用。用于腫瘤模型中檢測(cè)其抗腫瘤作用的化合物按照下述方法配制。小鼠肉瘤S180模型中，200mgDBTS首先溶解于10ml蓖麻油(氫化蓖麻油)中，再加入90ml生理鹽水。DBTS在溶液中的濃度是0.2％，最終溶劑濃度是10％。每只小鼠分別靜脈注射0.5ml(高劑量)，0.3ml(中等劑量)和0.15ml(低劑量)藥物溶液。
小鼠Lewis肺癌模型中，200mgDBTS溶解于5ml蓖麻油(氫化蓖麻油)中。每次使用前，此溶液用生理鹽水稀釋DBTS至終濃度分別為0.2％(高劑量)，0.1％(中等劑量)，0.05％(低劑量)。在本例中，每只小鼠(重約20g)靜脈注射0.5ml所需劑量的藥物溶液。靜脈注射速度為0.5ml/0.5min。
被測(cè)化合物的給藥劑量和方法依據(jù)藥理學(xué)常規(guī)。例如，被測(cè)藥物靜脈注射每天兩次，連續(xù)7天?；蛘?，靜脈注射每天一次，連續(xù)10天。
移植用腫瘤細(xì)胞的制備和藥效的確定。腫瘤細(xì)胞的制備，將快速生長(zhǎng)的腫瘤從被移植了腫瘤的小鼠中取出(小鼠肉瘤S180模型和小鼠Lewis肺癌模型)，將腫瘤組織切碎，制成腫瘤細(xì)胞濃度為2-4×107/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液(約4-8百萬(wàn)腫瘤細(xì)胞)經(jīng)皮下注射移植到試驗(yàn)小鼠。腫瘤細(xì)胞移植24小時(shí)后，小鼠經(jīng)靜脈注射一定劑量的DBTS，生理鹽水或者溶劑作為陰性對(duì)照組，或者腹膜下注射50mg/kg CTX作為陽(yáng)性對(duì)照組。腫瘤移植兩周后，處死小鼠取出移植的腫瘤組織。稱(chēng)取每次取出的固體腫瘤重量，經(jīng)DBTS處理的實(shí)驗(yàn)組的和CTX處理的對(duì)照組的抑瘤率由下列算式得出。
抑瘤率％＝(陰性對(duì)照組的腫瘤平均重量-藥物治療組腫瘤平均重量)/陰性對(duì)照組的腫瘤平均重量×100(2) 小鼠肉瘤S180模型，每只小鼠皮下注射約5百萬(wàn)S180細(xì)胞。移植后24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠每天分別靜脈注射DBTS 50、25、或12.5mg/kg，連續(xù)7到10天。陽(yáng)性對(duì)照組每天每只小鼠經(jīng)腹膜注射環(huán)磷酰胺(CTX)50mg/kg，連續(xù)7天。陰性對(duì)照組每只小鼠每天靜脈注射生理鹽水或DBTS中相同濃度的所用溶劑，連續(xù)7天。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠數(shù)量都為10只。
小鼠Lewis肺癌模型，每只小鼠Lewis皮下注射約5百萬(wàn)肺癌細(xì)胞。移植后24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠每天分別靜脈注射DBTS50、25、或12.5mg/kg，連續(xù)7到10天。陽(yáng)性對(duì)照組每天每只小鼠經(jīng)腹膜注射CTX 50mg/kg，連續(xù)10天。陰性對(duì)照組每只小鼠每天靜脈注射生理鹽水或DBTS中相同濃度的所用溶劑，連續(xù)7天。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠數(shù)量都為10只。
結(jié)果。小鼠肉瘤S180模型顯示，給藥劑量為50，25和12.5mg/kg的DBTS平均腫瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分別是63.30％，54.68％和48.69％(相對(duì)生理鹽水對(duì)照組)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表9和圖1，顯示0.2％DBTS在小鼠肉瘤S180模型中體內(nèi)藥效。在圖14中顯示，此7行(分別為1-7)顯示下列給藥成分(iv×7qd)1)陰性對(duì)照組；2)生理鹽水組；3)DBTS(25ml/kg)；4)DBTS(15ml/kg)；5)DBTS(7.5ml/kg)；6)溶劑對(duì)照組(15ml/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組CTX(30mg/kg)。
在靜脈注射DBTS后立刻可見(jiàn)小鼠呈現(xiàn)一些一過(guò)性非正常反應(yīng)，包括跳躍、呼吸加速，隨后活動(dòng)減少并臥倒。如此反應(yīng)常持續(xù)10-15分鐘。在靜脈注射溶劑的小鼠中也可觀察到相同的非正常反應(yīng)。因此，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)此類(lèi)非正常反應(yīng)的原因?yàn)樽⑸涞乃俣纫约叭軇舛容^高而不是DBTS。
小鼠Lewis肺癌模型顯示，給藥劑量為50，25和12.5mg/kg的DBTS平均腫瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分別是67.05％，51.34％和45.21％(相比于生理鹽水對(duì)照組)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表10和圖15，顯示0.2％DBTS Lewis肺癌模型中體內(nèi)藥效。在圖15中顯示，此7行(分別為1-7)顯示如下給藥成分1)陰性對(duì)照組；2)生理鹽水組；3)DBTS(25ml/kg)；4)DBTS(15ml/kg)；5)DBTS(7.5ml/kg)；6)溶劑對(duì)照組(15ml/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組CTX(30mg/kg)。DBTS和溶劑對(duì)照組的給藥時(shí)間為iv×10 qd；陽(yáng)性對(duì)照組的給藥時(shí)間為ip×7qd.相對(duì)小鼠肉瘤S180試驗(yàn)，在本試驗(yàn)中靜脈注射DBTS或者溶劑的小鼠都未顯示明顯的一過(guò)性異常反應(yīng)。
當(dāng)使用溶劑作為陰性對(duì)照時(shí)，如表11顯示，給藥劑量為50、25和12.5mg/kg的DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180的體內(nèi)腫瘤抑制率分別為50.25％，38.58％和30.46％。如表12顯示，給藥劑量為50、25和12.5mg/kg的DBTS對(duì)小鼠Lewis肺癌的體內(nèi)腫瘤抑制率分別為62.28％，44.30％和37.38％。
由上述兩種腫瘤移植模型所得出結(jié)果可見(jiàn)，靜脈注射DBTS對(duì)所移植的腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)有特異性抑制作用。當(dāng)靜脈注射高劑量DBTS(50mg/kg/d，連續(xù)7到10天)，當(dāng)使用生理鹽水為對(duì)照組時(shí)，在兩個(gè)腫瘤模型中腫瘤抑制率都可達(dá)65％。DBTS所用溶劑在小鼠腫瘤移植模型中顯示微弱抑制作用，靜脈注射此溶劑也可能引起小鼠的一些一過(guò)性異常反應(yīng)。
表9DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植肉瘤)

p＜0.01，相比于陰性對(duì)照。
表10DBTS對(duì)小鼠Lewis肺癌模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)

p＜0.01，相比于陰性對(duì)照。
表11DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下肉瘤移植)

p＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照溶劑組(10％)。
表12DBTS對(duì)小鼠Lewis肺癌模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)

p＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照溶劑組(10％)。
例2DBTS在小鼠Lewis肺癌中的抗腫瘤作用 本實(shí)驗(yàn)是二芐基三硫醚(DBTS)在小鼠Lewis肺癌模型的體內(nèi)抗腫瘤作用的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用小鼠飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(Pharmacology Lab of Shanghai Pharmaceutical IndustryInstitute)。實(shí)驗(yàn)所用小鼠種類(lèi)為C57BL/6，由Academic Sinica動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，證書(shū)號(hào)SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠重量為18-20g。使用小鼠性別皆為雌性。試驗(yàn)用小鼠數(shù)量如下每個(gè)劑量組10只，陽(yáng)性對(duì)照組10只，陰性對(duì)照組10只(10只為生理性對(duì)照組，10只為溶劑對(duì)照組)。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。陰性對(duì)照組分為兩組一組為給予溶劑對(duì)照組，另一組為給予生理鹽水對(duì)照組。對(duì)于溶劑對(duì)照組，每只小鼠靜脈注射與高劑量組DBTS中相同體積相同濃度(5％溶劑溶于生理鹽水中)，每日一次，連續(xù)7-10天。對(duì)于生理鹽水組，每只小鼠給予0.5ml生理鹽水，每日一次，連續(xù)10天。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，使用抗腫瘤藥物CTX(腹膜內(nèi)注射)腹膜內(nèi)注射每日30mg/kg，連續(xù)7天。另外，作為參考組，使用抗腫瘤藥物紫杉醇(Taxol)，分別給予靜脈注射每天15、10和7.5mg/kg，連續(xù)給藥5天。
被測(cè)化合物制備和使用。400mg DBTS溶解于10mL蓖麻油(溶劑)中，使DBTS在溶劑中的濃度達(dá)到40mg/ml。每次使用時(shí)，將此溶液用生理鹽水稀釋以達(dá)到所需濃度，分別為0.2％(高劑量)、0.1％(中等劑量)和0.05％(低劑量)。每只小鼠靜脈注射藥物溶液0.5mL，注射速度為0.5ml/0.5min。腫瘤移植24h后，將藥物溶液靜脈注射到帶瘤小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)7或10天。
移植腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)備和藥效確定。腫瘤細(xì)胞的制備，將快速生長(zhǎng)的腫瘤從被移植了腫瘤的小鼠中取出(小鼠肉瘤S180模型和小鼠Lewis肺癌模型)，將腫瘤組織切碎，制成腫瘤細(xì)胞濃度為2-4×107/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液(約4-8百萬(wàn)腫瘤細(xì)胞)經(jīng)皮下注射移植到試驗(yàn)小鼠。腫瘤細(xì)胞移植24小時(shí)后，小鼠經(jīng)靜脈注射一定劑量的DBTS，生理鹽水或者溶劑作為陰性對(duì)照組，或者腹膜下注射50mg/kg CTX作為陽(yáng)性對(duì)照組。腫瘤移植兩周后，處死小鼠取出移植的腫瘤組織。稱(chēng)取每次取出的固體腫瘤重量，各個(gè)劑量組的腫瘤抑制率由實(shí)例1種算式(2)求得。(例1DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤活性)。
小鼠Lewis肺癌模型，Lewis肺癌細(xì)胞經(jīng)皮下注射約6百萬(wàn)細(xì)胞到每只小鼠。移植后24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠每天分別靜脈注射DBTS 50、25或12.5mg/kg，連續(xù)10天。陽(yáng)性對(duì)照組每天每只小鼠經(jīng)腹膜注射CTX 30mg/kg，連續(xù)7天。陰性對(duì)照組每只小鼠每天靜脈注射生理鹽水或DBTS中相同濃度的所用溶劑，連續(xù)7或10天。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠數(shù)量都為10只。紫杉醇(Taxol)參照組(reference group)，每只小鼠每天靜脈注射紫杉醇(Taxol)15、10或7.5mg/kg，連續(xù)5天。
結(jié)果。小鼠Lewis肺癌模型，給藥劑量為50，25和12.5mg/kg的DBTS平均腫瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分別是65.77％、51.61％和43.10％(相對(duì)生理鹽水對(duì)照組)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表13。當(dāng)使用溶劑作為陰性對(duì)照時(shí)，相應(yīng)劑量DBTS的體內(nèi)腫瘤抑制率分別為61.02％，46.94％和35.10％(如表14顯示)。在靜脈注射DBTS后立刻可見(jiàn)小鼠呈現(xiàn)一些一過(guò)性非正常反應(yīng)，包括跳躍、呼吸加速，隨后活動(dòng)減少并臥倒。如此反應(yīng)常持續(xù)10-15分鐘。在靜脈注射溶劑的小鼠中也可觀察到相同的非正常反應(yīng)。
在參照實(shí)驗(yàn)組中，注射紫杉醇劑量為15、10和7.5mg/kg的小鼠紫杉醇(Taxo)的平均抑制腫瘤率為48.94％、36.97和30.28％(相對(duì)于生理鹽水組)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表15。
由小鼠Lewis肺癌腫瘤移植模型所得出結(jié)果可見(jiàn)，靜脈注射DBTS對(duì)所移植的腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)有特異性抑制作用。相比較于生理鹽水對(duì)照組靜脈注射高劑量DBTS(50mg/kg/d，連續(xù)10天)，在腫瘤模型中的腫瘤抑制率可達(dá)65％。此數(shù)據(jù)具可重復(fù)性。DBTS所用溶劑在小鼠抑制腫瘤模型中顯示微弱抑制作用，靜脈注射此溶劑也可能引起小鼠的一些一過(guò)性異常反應(yīng)。因此DBTS的結(jié)構(gòu)在將來(lái)的體內(nèi)研究中將會(huì)被進(jìn)一步改良。
表13DBTS對(duì)小鼠Lewis肺癌模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)

***P＜0.01，相比于陰性對(duì)照。
表14DBTS對(duì)小鼠Lewis肺癌模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)

***P＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照溶劑組(10％)。
表15紫杉醇(Taxol)對(duì)小鼠Lewis肺癌模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)本數(shù)據(jù)在此作為參考

***P＜0.01，相比于陰性對(duì)照組。
注意紫杉醇(Taxo1)常在抗腫瘤能力檢測(cè)中用于陽(yáng)性對(duì)照。
劑量為10mg/kg/d，iv×7qd。
例3ACEA100108對(duì)小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人體乳腺癌和HCT-8人體結(jié)腸癌模型的體內(nèi)抗腫瘤活性 采用小鼠體內(nèi)移植腫瘤模型以檢測(cè)化合物ACEA100108(DBTS的一種衍生物，見(jiàn)表33)的體內(nèi)抗腫瘤活性。小鼠體內(nèi)腫瘤移植模型包括小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，以及用免疫缺陷的裸鼠做的兩種人體腫瘤異體移植模型Bcap-37人體乳腺癌和HCT-8人體結(jié)腸癌模型。所有小鼠模型都在上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理實(shí)驗(yàn)室(Pharmacology Lab of Shanghai Pharmaceutical IndustryInstitute)進(jìn)行。人體腫瘤異體移植模型，腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)傳代兩次后被移植到裸鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。也就是說(shuō)，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人體腫瘤細(xì)胞首先被異體移植到裸鼠體內(nèi)，直至腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)成為一定體積的腫瘤后，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將其切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)(人體腫瘤異體移植模型中腫瘤細(xì)胞的二次傳代)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至一定體積后，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將腫瘤組織切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液用于在此描述的人體腫瘤異體移植模型。
實(shí)驗(yàn)用小鼠類(lèi)型為C57BL/6，DBF1和BALB/c裸鼠。由Academic Sinica動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，證書(shū)號(hào)SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠體重18-22g。所用小鼠雌雄皆有。但是，同一次試驗(yàn)所用動(dòng)物的性別是相同的。小鼠腫瘤移植模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量如下每個(gè)劑量組各10只，陽(yáng)性對(duì)照組10只，陰性對(duì)照組20只。人體腫瘤異體移植模型的數(shù)量為每個(gè)劑量組各6只，陽(yáng)性對(duì)照組6只，陰性對(duì)照組12只。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。陰性對(duì)照組，小鼠靜脈注射每只小鼠靜脈注射與高劑量組ACEA100108中相同體積相同濃度的溶劑，每日一次，連續(xù)7天。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，使用抗腫瘤藥物紫杉醇(Taxol)靜脈注射每日10mg/kg，連續(xù)7天。使用DBTS靜脈注射每天50mg/kg，連續(xù)給藥7天，作為參考組。
待測(cè)化合物的制備和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶劑)中，使ACEA100108在溶劑中的濃度達(dá)到20mg/ml。每次使用前，將此溶液用生理鹽水稀釋以達(dá)到所需濃度。每只小鼠(重約20g)靜脈注射藥物溶液0.5mL，注射速度為0.5ml/0.5min。腫瘤移植24h后，將藥物溶液靜脈注射到帶瘤小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)7或10天。所使用的ACEA100108劑量減遞梯度由100mg/kg到6.25mg/kg。
移植腫瘤細(xì)胞的制備和藥效確定。腫瘤細(xì)胞的制備，將快速生長(zhǎng)的腫瘤從被移植了腫瘤的小鼠中取出(小鼠Lewis肺癌模型，異體移植人體乳腺癌和人體結(jié)腸癌模型)，將腫瘤組織切碎，制成腫瘤細(xì)胞濃度為2-4×107/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液(約4-8百萬(wàn)腫瘤細(xì)胞)在右側(cè)腋下經(jīng)皮下注射被移植到試驗(yàn)小鼠。腫瘤細(xì)胞移植24小時(shí)后，小鼠經(jīng)靜脈注射一定劑量的ACEA10010，或者溶劑作為陰性對(duì)照組，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作為陽(yáng)性對(duì)照組，或者50mg/kg DBTS作為參照組。腫瘤移植兩周到四周內(nèi)，處死小鼠取出移植的腫瘤組織。稱(chēng)取每次取出的固體腫瘤重量，各個(gè)劑量組的腫瘤抑制率由實(shí)例1中算式(2)求得(DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤活性)。
人體異體移植腫瘤模型中，所有使用的物品，包括動(dòng)物食物，動(dòng)物飼養(yǎng)籠，支持物，以及所有接觸動(dòng)物的器具，都經(jīng)過(guò)高壓消毒。裸鼠飼養(yǎng)于SPF條件下的層流環(huán)境中。腫瘤移植后，動(dòng)態(tài)測(cè)量每個(gè)劑量組的小鼠重量和腫瘤體積，并繪圖。測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸(a)和短軸(b)，腫瘤的體積由下式得出腫瘤體積＝a×b2/2(3) P388鼠類(lèi)白血病模型的腫瘤細(xì)胞制備。在無(wú)菌條件下取出獲得白血病小鼠的腹水，用生理鹽水稀釋至所需細(xì)胞濃度(腹水與生理鹽水比為1∶6)。將細(xì)胞懸浮液0.2ml腹膜注射。腫瘤細(xì)胞移植至小鼠體內(nèi)24小時(shí)后，給小鼠注射給定劑量的ACEA100108或者注射溶劑作為陰性對(duì)照組，或者10mg/kg紫杉醇(Taxol)以及注射2mg/kgMMC(mitomycin C)作為陽(yáng)性對(duì)照組，或者注射50mg/kg DBTS作為參照組。攜瘤小鼠的存活時(shí)間控制在30天內(nèi)。各個(gè)用藥組的存活率與陰性對(duì)照組相比的計(jì)算方法如下存活時(shí)間率％＝藥物治療組平均存活率/陰性對(duì)照組平均存活率×100％(4) 結(jié)果。Lweis肺癌腫瘤模型顯示，ACEA100108的平均體內(nèi)抑瘤率在不同給藥劑量組100mg/kg(因毒性作用注射次數(shù)僅為5次)、25mg/kg和12.5mg/kg分別為60.15％、55.35％和34.32％(相比較于溶劑對(duì)照組)。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，DBTS的平均體內(nèi)抑瘤率在不同劑量組100mg/kg(因毒性作用注射次數(shù)僅為5次)、25mg/kg分別為63.10％和57.93％；紫杉醇(Taxol)的體內(nèi)抑瘤率在常規(guī)劑量為10mg/kg時(shí)為43.91％。結(jié)果見(jiàn)表16。
在鼠類(lèi)白血病模型中，藥物ACEA100108劑量組為50、25mg/kg和12.5mg/kg治療平均延長(zhǎng)壽命時(shí)間分別為106.18％、107.22％和109.28％。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用藥物劑量為50mg/kg的DBTS治療后平均延長(zhǎng)壽命時(shí)間為109.28％，用藥物劑量為10mg/kg的紫杉醇(Taxol)治療后平均延長(zhǎng)壽命時(shí)間為109.28％。詳細(xì)記錄見(jiàn)表17。
Bcap-37人體乳腺癌裸鼠異體移植模型中，藥物ACEA100108劑量組為50、25mg/kg和8mg/kg體內(nèi)平均抑制腫瘤率分別為64.13％、56.10％和31.40％。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用藥物劑量為50mg/kg的DBTS治療后體內(nèi)平均抑制腫瘤率為66.98％，用藥物常規(guī)劑量為10mg/kg的紫杉醇(Taxol)治療后平均抑制腫瘤率為48.84％。詳細(xì)記錄見(jiàn)表18，圖16，表明化合物DBTS和ACEA100108對(duì)Bcap-37人體乳腺癌裸鼠異體移植模型的藥效。在圖16中，此7行(分別為1-7)顯示了下列成分的使用結(jié)果1)陰性對(duì)照組；2)溶劑組；3)ACEA100108組(50mg/kg)；4)ACEA100108組(20mg/kg)；5)ACEA100108組(8mg/kg)；6)DBTS組(50mg/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用藥物和對(duì)照藥物為靜脈注射，共7天。腫瘤尺寸的動(dòng)態(tài)改變見(jiàn)表19和圖17。攜帶腫瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)表20和圖18。
在裸鼠HCT-8人腸癌異體移植模型中，ACEA100108顯示體內(nèi)平均腫瘤抑制率在劑量濃度為50、25和8mg/kg時(shí)分別為45.62％、28.10％和15.03％。在相同的實(shí)驗(yàn)中，DBTS顯示體內(nèi)平均腫瘤抑制率在劑量濃度為50mg/kg時(shí)為46.08％；紫杉醇(Taxol)顯示體內(nèi)平均腫瘤抑制率在常規(guī)劑量濃度為10mg/kg時(shí)為33.33％。詳細(xì)記錄見(jiàn)表21，圖19，描述了在裸鼠HCT-8人肺癌異體移植模型中DBTS和ACEA100108的作用效果。圖19中，此7行(分別為1-7)顯示使用下列藥物的結(jié)果1)陰性對(duì)照組；2)溶劑組；3)ACEA100108組(50mg/kg)；4)ACEA100108組(20mg/kg)；5)ACEA100108組(8mg/kg)；6)DBTS組(50mg/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用藥物和對(duì)照藥物為靜脈注射，共7天。腫瘤尺寸的動(dòng)態(tài)改變見(jiàn)表22和圖20。攜帶腫瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)表23和圖21。
基于上述兩個(gè)小鼠腫瘤模型和兩種人體腫瘤異體移植模型的體內(nèi)評(píng)估，ACEA100108在使用劑量為50mg/kg，iv.7天時(shí)有明顯效果。另外，ACEA100108在Lewis小鼠肺癌和Bcap37人體乳腺癌模型中的抗腫瘤作用強(qiáng)于HCT-8人腸癌異體移植模型中的抗腫瘤作用。但是，ACEA100108在P388小鼠白血病模型中無(wú)明顯抗腫瘤作用。而且，對(duì)于使用相同時(shí)間和相同劑量的藥物，上述各模型中ACEA100108和DBTS的抗腫瘤作用相似，且優(yōu)于常規(guī)使用方法的紫杉醇(TAXOL)的抗腫瘤作用。
表16化合物ACEA100108對(duì)小鼠Lewis肺癌皮下接種模型的體內(nèi)抗腫瘤活性

***P＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。
表17化合物ACEA100108對(duì)小鼠P388白血病模型體內(nèi)抗腫瘤活性(腫瘤腹膜注射移植至宿主小鼠)

***p＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。
注意一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)經(jīng)化合物處理后的攜瘤小鼠的存活率超過(guò)125％即可認(rèn)為此化合物有抗腫瘤能力。
表18化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植Bcap-37人乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤活性

***P＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。
表19化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植Bcap-37人乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試腫瘤大小的動(dòng)態(tài)變化

10/12在12只小鼠中，有10只小鼠的腫瘤足夠大至手可觸及腫瘤。
表20化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植Bcap-37人乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試攜瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化

表21化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植HCT-8人結(jié)腸癌的體內(nèi)抗腫瘤活性

***P＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。
表22化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植HCT-8人結(jié)腸癌的體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試及腫瘤體積的動(dòng)態(tài)變化

4/6在6只小鼠中，有4只小鼠的腫瘤足夠大至手可觸及腫瘤。
表23化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體皮下移植HCT-8人結(jié)腸癌的體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試攜瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化

例4ACEA100108在裸鼠ao10/17人體卵巢腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性 使用免疫缺陷的裸鼠ao10/17人體卵巢腫瘤異體移植模型檢測(cè)ACEA100108的體內(nèi)抗腫瘤活性。細(xì)胞株和小鼠被存放于上海藥物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室(Pharmacology Lab of Shanghai PharmaceuticalIndustry Institute)。ao10/17人體卵巢腫瘤異體移植模型，腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)傳代兩次后被移植到裸鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。也就是說(shuō)，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人體腫瘤細(xì)胞首先被異體移植到裸鼠體內(nèi)，直至腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)成為一定體積的腫瘤后，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將其切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)(即腫瘤細(xì)胞在人體腫瘤異體移植模型中的二次傳代)。至腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至一定體積，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將腫瘤組織切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液用于在此描述的人體腫瘤異體移植模型。
實(shí)驗(yàn)用小鼠類(lèi)型為C57BL/6，DBF1和BALB/c裸鼠。由Academic Sinica動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，證書(shū)號(hào)SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠體重18-22g。所用小鼠為雌性。人體腫瘤異體移植模型的試驗(yàn)裸鼠數(shù)量為每個(gè)劑量組各6只，陽(yáng)性對(duì)照組6只，陰性對(duì)照組12只。ACEA100108的高中低劑量分別為50mg/kg/d、25mg/kg/d和8mg/kg/d。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陰性對(duì)照組，每只小鼠靜脈注射與高劑量組ACEA100108中相同體積相同濃度的溶劑，每日一次，連續(xù)7天。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，使用抗腫瘤藥物紫杉醇(Taxol)靜脈注射每日10mg/kg，連續(xù)7天。作為參考組，使用DBTS靜脈注射每天50mg/kg，連續(xù)給藥7天。
待測(cè)化合物的制備和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶劑)中，使ACEA100108在溶劑中的濃度達(dá)到20mg/ml。每次使用前，將此溶液用生理鹽水稀釋以達(dá)到所需濃度。每只小鼠(重約20g)靜脈注射藥物溶液0.5mL，注射速度為0.5ml/0.5min。腫瘤移植24h后，將藥物溶液靜脈注射到帶瘤小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)7天。ACEA100108的高中低劑量分別為50、25和8mg/kg/d。
腫瘤移植細(xì)胞的制備和藥效確定。人體卵巢腫瘤異體移植模型中腫瘤細(xì)胞的制備，將快速生長(zhǎng)的腫瘤從被移植了腫瘤的小鼠中取出，將腫瘤組織切碎，腫瘤組織中加入生理鹽水(腫瘤組織體積和生理鹽水體積比1∶6)制成腫瘤細(xì)胞懸液。0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液在右側(cè)腋下經(jīng)皮下注射移植到試驗(yàn)小鼠。腫瘤細(xì)胞移植24小時(shí)后，小鼠經(jīng)靜脈注射一定劑量的ACEA100108，或者溶劑作為陰性對(duì)照組，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作為陽(yáng)性對(duì)照組，或者50mg/kg DBTS作為參照組。腫瘤移植兩周到四周內(nèi)，處死小鼠取出移植的腫瘤組織。稱(chēng)取每次取出的固體腫瘤重量，各個(gè)劑量組的腫瘤抑制率由例1中算式(2)求得(例1DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤活性)。
人體卵巢腫瘤異體移植模型中，所有使用的物品，包括動(dòng)物食物，動(dòng)物飼養(yǎng)籠，支持物，以及所有接觸動(dòng)物的器具，都經(jīng)過(guò)高壓消毒。裸鼠飼養(yǎng)于SPF條件下的層流環(huán)境中。腫瘤移植后，各個(gè)劑量組的小鼠重量和腫瘤體積都被動(dòng)態(tài)測(cè)量，并繪圖。腫瘤體積大小由測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸(a)和短軸(b)，由例三中等式(3)得出(ACEA100108對(duì)小鼠Lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人體乳腺癌和HCT-8人體結(jié)腸癌模型的體內(nèi)抗腫瘤活性)。
結(jié)果。裸鼠Ao10/17人體卵巢腫瘤異體移植模型顯示，ACEA100108的平均體內(nèi)抑瘤率在不同劑量組50、25和8mg/kg分別為53.40％、46.67％和33.19％。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，DBTS的平均體內(nèi)抑瘤率在劑量組50mg/kg為57.30％；紫杉醇(Taxol)的體內(nèi)抑瘤率在常規(guī)劑量為10mg/kg時(shí)為45.39％。詳細(xì)記錄見(jiàn)表24，圖22，描述了在裸鼠人體卵巢腫瘤異體移植模型DBTS和ACEA100108的作用效果。圖22中，7行(分別為1-7)顯示使用下列藥物的結(jié)果1)陰性對(duì)照組；2)溶劑組；3)ACEA100108組(50mg/kg)；4)ACEA100108組(20mg/kg)；5)ACEA100108組(8mg/kg)；6)DBTS組(50mg/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用藥物和對(duì)照藥物為靜脈注射，共7天。
腫瘤體積的動(dòng)態(tài)改變見(jiàn)表25和圖23。攜帶腫瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)表26和圖24。當(dāng)使用相同時(shí)間和相同劑量的藥物，ACEA100108在ao10/17人體卵巢腫瘤異體移植模型中的抗腫瘤作用與化合物ACEA100101的抗腫瘤作用相似，且優(yōu)于常規(guī)使用方法的紫杉醇(TAXOL)的抗腫瘤作用。
表24化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體移植ao10/17人卵巢癌的體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)

***P＜0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。
表25化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體移植ao10/17人卵巢癌體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試腫瘤體積的動(dòng)態(tài)改變(皮下移植腫瘤)

7/12在12只小鼠中，有7只小鼠的腫瘤足夠大至手可觸及腫瘤。
表26化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體移植ao10/17人卵巢癌體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試攜瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化(皮下移植腫瘤)

例5ACEA100108對(duì)裸鼠Bcap37人體乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤活性 使用免疫缺陷的裸鼠Bcap37人體乳腺癌異體移植模型檢測(cè)ACEA100108的體內(nèi)抗腫瘤活性。細(xì)胞株和小鼠被存放于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理實(shí)驗(yàn)室(Pharmacology Lab of ShanghaiPharmaceutical Industry Institute)。Bcap37人體乳腺癌異體移植模型，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)傳代兩次后被移植到裸鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。也就是說(shuō)，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人體Bcap37腫瘤細(xì)胞首先被異體移植到裸鼠體內(nèi)，直至乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)成為一定體積的腫瘤后，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將其切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)(即腫瘤細(xì)胞在人體腫瘤異體移植模型中的二次傳代)。至腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至一定體積，將腫瘤組織從體內(nèi)取出，并將腫瘤組織切碎。從切碎的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞懸浮液用于在此描述的人體腫瘤異體移植模型。
實(shí)驗(yàn)用小鼠類(lèi)型為BALB/c裸鼠。由Academie Sinica動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，證書(shū)號(hào)SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠體重18-22g。所用小鼠為雌性。人體腫瘤異體移植模型的試驗(yàn)裸鼠數(shù)量為每個(gè)劑量組各6只，陽(yáng)性對(duì)照組6只，陰性對(duì)照組12只。ACEA100108的高中低劑量分別為50mg/kg/d、25mg/kg/d和8mg/kg/d。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陰性對(duì)照組每只小鼠靜脈注射與高劑量組ACEA100108中相同體積相同濃度的溶劑，每日一次，連續(xù)7天。陽(yáng)性對(duì)照組，使用抗腫瘤藥物紫杉醇(Taxol)靜脈注射每日10mg/kg，連續(xù)7天。
待測(cè)藥物的制備和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶劑)中，使ACEA100108在溶劑中的濃度達(dá)到20mg/ml。每次使用前，將此溶液用生理鹽水稀釋以達(dá)到所需濃度。每只小鼠(重約20g)靜脈注射藥物溶液0.5mL，注射速度為0.5ml/0.5min。腫瘤移植24h后，將藥物溶液靜脈注射到帶瘤小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)7天或10天。ACEA100108的高中低劑量分別為50，20和8mg/kg/d。
移植腫瘤細(xì)胞的制備和藥效確定。人體乳腺癌異體移植模型中腫瘤細(xì)胞的制備，將快速生長(zhǎng)的腫瘤從被移植了腫瘤的小鼠中取出，將腫瘤組織切碎，腫瘤組織中加入生理鹽水(腫瘤組織體積和生理鹽水體積比1∶6)制成2-4×107細(xì)胞/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液在右側(cè)腋下經(jīng)皮下注射移植到試驗(yàn)小鼠。腫瘤移植7天后，小鼠體內(nèi)的腫瘤體積長(zhǎng)至足夠大至用手觸摸動(dòng)物時(shí)能夠觸及腫瘤。從此時(shí)起，小鼠經(jīng)靜脈注射一定劑量的ACEA100108，或者溶劑作為陰性對(duì)照組，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作為陽(yáng)性對(duì)照組。腫瘤移植三周到四周內(nèi)，處死小鼠取出移植的腫瘤組織。稱(chēng)取每次取出的固體腫瘤重量，各個(gè)劑量組的腫瘤抑制率由例1中算式(2)求得(DBTS對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤活性)?；谀[瘤體積，用下式計(jì)算另一參數(shù)，即腫瘤體積抑制率T/C(％)＝藥物作用組腫瘤的平均體積/陰性對(duì)照組腫瘤的平均重量×100％(5) 人體乳腺癌異體移植模型中，所有使用的物品，包括動(dòng)物食物，動(dòng)物飼養(yǎng)籠，支持物，以及所有接觸動(dòng)物的器具，都經(jīng)過(guò)高壓消毒。裸鼠飼養(yǎng)于SPF條件下的層流環(huán)境中。腫瘤移植后，每個(gè)劑量組的小鼠重量和腫瘤體積都被動(dòng)態(tài)測(cè)量，并繪圖。腫瘤體積大小由測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸(a)和短軸(b)，由例三中等式(3)得出(ACEA100108對(duì)小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人體乳腺癌和HCT-8人體結(jié)腸癌模型的體內(nèi)抗腫瘤活性)。
結(jié)果。裸鼠Bcap37人體乳腺癌異體移植模型顯示，ACEA100108的平均體內(nèi)抑瘤率在不同劑量組50mg/kg，20mg/kg和8mg/kg，iv×7 qd中，分別為52.24％、47.31％和28.21％。另外，顯示藥物劑量為50mg/kg，連續(xù)使用10天，體內(nèi)腫瘤平均抑制率為56.92％。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，紫杉醇(Taxol)的體內(nèi)抑瘤率在常規(guī)劑量為10mg/kg，使用10天時(shí)為44.33％。詳細(xì)記錄見(jiàn)表27，圖25，描述了在裸鼠Bcap37人體乳腺癌異體移植模型DBTS和ACEA100108的作用效果。圖25中，此7行(分別為1-7)顯示使用下列藥物的結(jié)果1)陰性對(duì)照組；2)溶劑組；3)ACEA100108組(50mg/kg)；4)ACEA100108組(20mg/kg)；5)ACEA100108組(8mg/kg)；6)DBTS組(50mg/kg)；和7)陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。除了ACEA100108組50mg/kg以外的被測(cè)化合物和對(duì)照藥物為靜脈注射，共7天。ACEA100108 50mg/kg使用時(shí)間為靜脈注射10天。腫瘤體積抑制率的結(jié)果見(jiàn)表28。腫瘤大小的動(dòng)態(tài)改變狀況見(jiàn)表26。攜帶腫瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)表27。
裸鼠Bcap37人體乳腺癌異體移植模型中，當(dāng)腫瘤大小可以手觸及時(shí)，經(jīng)藥物療程治療后，ACEA100108的腫瘤抑制率可達(dá)到50％以上。對(duì)裸鼠用藥次數(shù)增加，可見(jiàn)腫瘤抑制率增加，但是對(duì)小鼠的毒性并未增加。而且，對(duì)裸鼠使用中等劑量的ACEA100108與使用常規(guī)劑量的紫杉醇(TAXOL)相比有更好的治療效果。
表27化合物ACEA100108對(duì)免疫缺陷裸鼠Bcap-37人體乳腺癌異體移植模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)(基于腫瘤重量)

***P＜0.01，與陰性對(duì)照組相比。
表28化合物ACEA100108對(duì)免疫缺陷裸鼠Bcap37人體乳腺癌異體移植模型體內(nèi)抗腫瘤活性(皮下移植腫瘤)(基于腫瘤體積)

***P＜0.01，與陰性對(duì)照組相比。
表29化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體移植Bcap-37人乳腺癌體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試及動(dòng)態(tài)腫瘤體積的改變(皮下移植腫瘤)

12/12在12只小鼠中，所有12只小鼠的腫瘤都足夠大至手可觸及腫瘤。
表30化合物ACEA100108對(duì)免疫缺失裸鼠異體移植Bcap-37人乳腺癌體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試攜瘤小鼠體重的動(dòng)態(tài)改變(皮下移植腫瘤)

例6DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用試驗(yàn)確定小鼠靜脈注射的LD50 用小鼠檢測(cè)DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用。試驗(yàn)用小鼠隨機(jī)分為六組(其中五組為給藥組，一組為對(duì)照組)。每組為20只昆明鼠，其中50％為雌性，50％為雄性。當(dāng)靜脈注射(i.v.)單倍劑量的DBTS或化合物ACEA100108后觀察小鼠對(duì)DBTS或化合物ACEA100108的急性反應(yīng)，監(jiān)測(cè)并記錄用藥后前兩周死亡小鼠的數(shù)量。使用Bliss法計(jì)算LD50值。小鼠靜脈注射(i.v.)單倍劑量的DBTS的LD50為258.53mg/kg(234.96至284.46mg/kg)，小鼠靜脈注射(i.v.)單倍劑量的ACEA100108的LD50為316mg/kg(284.26-351.28mg/kg)。
材料和方法。用于檢測(cè)的化合物為DBTS和ACEA100108，溶解于溫?zé)岬募兓吐橛椭?，濃度?0mg/ml。使用時(shí)溶液用生理鹽水稀釋至所需濃度。每只小鼠靜脈注射(i.v.)量0.5ml，注射速度0.5ml/0.5min。
實(shí)驗(yàn)用小鼠為昆明鼠，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(ShanghaiPharmaceutical Industry Institute)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(the ExperimentalAnimal Department)提供。證書(shū)號(hào)為107。小鼠的平均體重為18-20g。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為20只，其中10只為雌性，10只為雄性。使用5組不同的劑量組的化合物，分別為400mg/kg，320mg/kg，256mg/kg，204.8mg/kg和163.8mg/kg。對(duì)照組小鼠給予相同體積的氫化蓖麻油溶劑。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠給與靜脈注射單倍劑量的DBTS和ACEA100108，或者作為對(duì)照用的溶劑，注射速度為0.5ml/0.5min。監(jiān)測(cè)并記錄使用DBTS和ACEA100108后的各種急性反應(yīng)，重量改變，以及使用后兩周內(nèi)的死亡情況。使用Bliss法計(jì)算靜脈注射的LD50值。
結(jié)果。靜脈注射后，小鼠立即顯出行為異常，包括跳躍、奔跑、痙攣、呼吸急促(呼吸加快)等等。高劑量組的一些小鼠在注射后3分鐘即死于痙攣，死亡發(fā)生于1小時(shí)內(nèi)，并在注射后第12小時(shí)達(dá)到高峰。死亡小鼠經(jīng)尸體解剖后未發(fā)現(xiàn)器官的病理異常。存活小鼠未出現(xiàn)明顯的毒性癥狀，但出現(xiàn)了活動(dòng)減少及脫發(fā)現(xiàn)象，這些現(xiàn)象逐漸得到恢復(fù)。經(jīng)14天監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)延遲性的毒性反應(yīng)。雖然存活小鼠的健康狀況和行為顯示正常，但是體重出現(xiàn)了不同程度的下降。小鼠靜脈注射(i.v.)單劑量的DBTS的LD50為258.53 mg/kg(234.96至284.46mg/kg)，小鼠靜脈注射(i.v.)單劑量的ACEA100108的LD50為316mg/kg(284.26-351.28mg/kg)。雌性小鼠和雄性小鼠之間LD50值無(wú)明顯差異(P＞0.05)。DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用結(jié)果見(jiàn)表31和32。為了評(píng)估溶劑對(duì)小鼠的毒性作用，對(duì)照組的小鼠使用相同劑量的溶劑。使用溶劑的小鼠顯示早期的行為異常和體重降低的程度低于使用DBTS和化合物ACEA100108的小鼠。說(shuō)明使用藥物的小鼠所出現(xiàn)的急性毒性反應(yīng)與DBTS和化合物ACEA100108有關(guān)。
表31昆明鼠單倍劑量靜脈注射(intravenous injection)DBTS的急性毒性作用

表32昆明鼠單劑量靜脈注射(intravenous injection)ACEA100108的急性毒性作用

例7DBTS，秋水仙素(Colcemid)和紫杉醇(Paclitaxel抑制細(xì)胞增殖作用 H460細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)以8000細(xì)胞每孔的濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)。之后在孔中加入以不同濃度溶于DMSO中的Dibenzvl trisulfide(DBTS)秋水仙素(Colcemid)，和紫杉醇(Paclitaxel)。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)DBTS和秋水仙素(Colcemid)達(dá)到1.7至1.9之間，紫杉醇(Paclitaxel)達(dá)到1.4至1.9之間時(shí)加入化合物。圖1A-C顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后23小時(shí))。
例8DBTS抑制MV522細(xì)胞增殖的作用 MV522細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到1.0至1.6之間時(shí)加入化合物。圖2顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后23小時(shí))。
例9DBTS抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用 MCF-7細(xì)胞(人體乳腺癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育44小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到1.2至1.5之間時(shí)加入化合物。圖3顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后44.5小時(shí))。
例10DBTS抑制A549細(xì)胞增殖的作用 A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)以8000細(xì)胞每孔的濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育17小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.72至1.26之間時(shí)加入化合物。圖4顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后18小時(shí))。
例11DBTS抑制PC3細(xì)胞增殖的作用 PC3細(xì)胞(人前列腺癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育22.5小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.34至0.54之間時(shí)加入化合物。圖5顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)(normalized cellindex)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后23.5小時(shí))。
例12DBTS和5-氟尿嘧啶抑制A431細(xì)胞增殖的作用 A431(人表皮腫瘤細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育22.3小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)DBTS達(dá)到0.6至1.2之間，5-氟尿嘧啶達(dá)到0.6至1.2之間時(shí)加入化合物。圖6A-B顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后22.6小時(shí))。
例13DBTS抑制HT1080細(xì)胞增殖的作用 HT1080細(xì)胞(人纖維瘤細(xì)胞)以4000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育18.6小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.72至1.45之間時(shí)加入化合物。圖7顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后20小時(shí))。
例14DBTS抑制MDA-231細(xì)胞增殖的作用 MDA-231細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)以5000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronicplates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育18.7小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.65至0.82之間時(shí)加入化合物。圖8顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后19.6小時(shí))。
例15
DBTS抑制HT-29細(xì)胞增殖的作用 HT-29細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育25小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.95至1.13之間時(shí)加入化合物。圖9顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后26小時(shí))。
例16DBTS抑制HC-2998細(xì)胞增殖的作用 HC-2998細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronicplates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育24.7小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.33至0.68之間時(shí)加入化合物。圖10顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后25.7小時(shí))。
例17DBTS抑制OVCAR4細(xì)胞增殖的作用 OVCAR4細(xì)胞(人卵巢癌細(xì)胞)以10000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育27小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到1.4至1.7之間時(shí)加入化合物。圖11顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后28小時(shí))。
例18DBTS抑制A2780細(xì)胞增殖的作用 A2780細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)以20000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育16.4小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到2.2至3.7之間時(shí)加入化合物。圖12顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后17.5小時(shí))。
例19HepG2細(xì)胞對(duì)DBTS的反應(yīng) HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以15000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，并預(yù)先在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下置于培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。各個(gè)孔中的細(xì)胞指數(shù)達(dá)到0.7至0.97之間時(shí)加入化合物。圖13顯示加入化合物之前和加入化合物之后的作為時(shí)間函數(shù)的歸一化細(xì)胞指數(shù)。加入化合物后的時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞指數(shù)歸一化的時(shí)間點(diǎn)(大約接種細(xì)胞后22.7小時(shí))。從細(xì)胞指數(shù)顯示的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，DBTS對(duì)HepG2細(xì)胞的增生無(wú)抑制作用，所使用的劑量范圍對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性作用。
例20DBTS及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 使用RT-CES系統(tǒng)和MTT法檢測(cè)DBTS及其衍生物對(duì)8種不同類(lèi)型的人體腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。這8種腫瘤細(xì)胞株分別為HT1080(人纖維瘤細(xì)胞株)、H460細(xì)胞(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株)、OVCAR4細(xì)胞(人卵巢癌細(xì)胞株)、MCF-7細(xì)胞(人體乳腺癌細(xì)胞)、MDA-MB231(M231，人體乳腺癌細(xì)胞株)、A2780細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)、Jurkat細(xì)胞(人體T細(xì)胞白血病細(xì)胞株)。用于檢測(cè)的DBTS及其衍生物包括ACEA100107，ACEA100108，ACEA100109，ACEA100111，ACEA100115，ACEA100116，ACEA100117，ACEA100118，ACEA100119，和ACEA100120。ACEA100129使用細(xì)胞HT1080和MCF-7測(cè)得IC50值分別為0.82μM，0.42μM和2.3μM。衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表33和表34。
使用RT-CES系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞以從5000到15000細(xì)胞每孔初始濃度范圍接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)，細(xì)胞置于37℃、5％CO2中孵育過(guò)夜，直至細(xì)胞指數(shù)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞指數(shù)介于0.8到1.2之間。將一系列不同稀釋濃度的化合物加入細(xì)胞中，并對(duì)化合物對(duì)細(xì)胞增生影響和毒性作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。各個(gè)化合物時(shí)間依賴性的IC50值經(jīng)由化合物處理后的不同時(shí)間點(diǎn)劑量反應(yīng)的細(xì)胞指數(shù)來(lái)計(jì)算。表35顯示的IC50值是經(jīng)化合物處理后達(dá)到最大抑制作用的時(shí)間點(diǎn)。
對(duì)于MTT法，細(xì)胞以從5000到15000細(xì)胞每孔初始濃度范圍接種于16X或96孔板上的孔中，細(xì)胞置于37℃、5％CO2中孵育過(guò)夜，將一系列不同稀釋濃度的化合物加入細(xì)胞中。孵育48小時(shí)后加入MTT染色劑終止藥物處理。4小時(shí)后，用終止液終止染色，用分光光度計(jì)在兩個(gè)波長(zhǎng)段(650nm和550nm)進(jìn)行測(cè)量。用分光光度計(jì)測(cè)得的待測(cè)衍生物的IC50值見(jiàn)表36。
表33各種三硫衍生物的結(jié)構(gòu) DBTS衍生物 RDBTS(ACBA100101)HACEA100108 p-FACEA10018 p-ClACEA100115 o-ClACEA100116 m-MeACEA100117 m-CF3ACBA100129 p-Me表34各種雙芳香取代三硫化物的結(jié)構(gòu) DBTS衍生物名稱(chēng)ArACEA100111 ACEA100107 ACEA100109 ACEA100120 ACEA100119
表35使用RT-CES system在7種腫瘤細(xì)胞株中測(cè)得的DBTS及其衍生物的IC50值(uM)


表36使用MTT檢測(cè)法在8種腫瘤細(xì)胞株中測(cè)得的DBTS及其衍生物IC50值(uM)


例21ACEA100108對(duì)腫瘤細(xì)胞增生的動(dòng)態(tài)抑制作用 使用RT-CES系統(tǒng)檢測(cè)DBTS衍生物ACEA100108對(duì)7種細(xì)胞株的抗腫瘤活性。細(xì)胞株為HT1080，H460，OVCAR4，MCF7，MDA-MB231，HepG2，和A2780。腫瘤細(xì)胞以從5000到15000細(xì)胞每孔初始濃度范圍接種于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板e(cuò)lectronic plates，即孔中帶有微電子傳感器陣列的檢測(cè)板)中，細(xì)胞置于37℃、5％CO2中孵育。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程與狀態(tài)經(jīng)RT-CES系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀測(cè)，直至細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，共持續(xù)約20小時(shí)。將一系列不同稀釋濃度(濃度范圍50uM到0.38uM之間)的ACEA100108加入細(xì)胞中，RT-CES系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀測(cè)ACEA100108對(duì)腫瘤細(xì)胞增生的抑制作用，及各個(gè)細(xì)胞株對(duì)ACEA100108毒性作用的反應(yīng)。記錄細(xì)胞-化合物相互反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線，見(jiàn)圖26。加入化合物時(shí)的細(xì)胞指數(shù)值經(jīng)歸一化獲得歸一化細(xì)胞指數(shù)曲線(細(xì)胞接種后約18-24小時(shí))。
例22DBTS衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增生的動(dòng)態(tài)抑制作用 使用RT-CES系統(tǒng)檢測(cè)DBTS衍生物對(duì)HT1080腫瘤細(xì)胞增生的抑制作用及其對(duì)HT1080的毒性作用。DBTS衍生物為ACEA100107，ACEA100109，ACEA100111，ACEA100114，ACEA100115，ACEA100116，ACEA100117，ACEA100118，ACEA100119，和ACEA100120。HT1080細(xì)胞(人纖維肉瘤)以5000細(xì)胞每孔的初始濃度接種于16X或96X的微滴定板上的孔中。細(xì)胞置于37℃、5％CO2中孵育20小時(shí)至細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將一系列不同稀釋濃度(濃度范圍50μM到0.38μM之間)的DBTS衍生物加入細(xì)胞中，RT-CES系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀測(cè)和記錄細(xì)胞對(duì)DBTS衍生物的反應(yīng)。記錄細(xì)胞-化合物相互反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線，見(jiàn)圖26。加入化合物時(shí)的細(xì)胞指數(shù)值經(jīng)歸一化獲得歸一化細(xì)胞指數(shù)曲線(大約細(xì)胞接種后18-24小時(shí))。
例23DBTS的衍生物ACEA100108和ACEA100116對(duì)微管動(dòng)力學(xué)抑制作用 微管是細(xì)胞增殖過(guò)程中，如有絲分裂，的重要成分，當(dāng)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞前，染色體復(fù)制成為相同的兩套染色體。微管及其動(dòng)力學(xué)在有絲分裂和細(xì)胞分裂中扮演的重要角色決定了其成為抗腫瘤藥物的作用靶。細(xì)胞在分裂間期時(shí)，微管蛋白與細(xì)胞質(zhì)中單體球蛋白之間交換所需的半衰期為3分鐘至數(shù)小時(shí)。有絲分裂開(kāi)始后，間期微管分解成為紡錘體微管并改變?nèi)旧w。有絲分裂紡錘體微管比分裂間期微管的運(yùn)動(dòng)性高20-50倍，一些紡錘體微管蛋白與單體球蛋白之間交換所需的半衰期達(dá)到15秒。
有絲分裂紡垂體微管的活動(dòng)非常容易被微管活性藥物所控制和破壞。以微管為靶的藥物可以多種方式改變微管的合成和運(yùn)動(dòng)過(guò)程。三種ACEA化合物DBTS，ACEA100108，和ACEA100116的作用機(jī)制為(1)影響培養(yǎng)細(xì)胞的微管網(wǎng)，(2)影響體外微管合成，(3)影響體外微管動(dòng)力學(xué)，見(jiàn)下述。
方法 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞組織免疫化學(xué)COS細(xì)胞生長(zhǎng)于加有非必需氨基酸，10％FBS，抗生素和抗真菌素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37℃、5.5％CO2。在免疫熒光顯微鏡下，細(xì)胞置于多聚賴氨酸包被的板上，并加入不同濃度的三種ACEA化合物、紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春堿(vinblastine)2-4小時(shí)(見(jiàn)各實(shí)驗(yàn)圖中的濃度值)。細(xì)胞用溫PBS沖洗一遍，用冷甲醇(methanol)固定，再用PBS沖洗，置于4℃PBT(PBS，1％BSA，0.5％Triton X-100)中中斷反應(yīng)并過(guò)夜。若非特別指出，所有的染色和沖洗都在室溫下使用PBT。細(xì)胞使用1∶1000抗微管小鼠抗體DM-1染色1小時(shí)，沖洗4次每次15分鐘，在暗室用1∶100 Cy-3接合山羊抗鼠抗體處理1小時(shí)。然后，在暗室用PBT沖洗標(biāo)本4次每次15分鐘，最后用PBS洗15分鐘。標(biāo)本置于激光掃描共焦顯微鏡下觀察。
微管合成(Microtubule Assembly)檢測(cè)微管合成核心(Microtubule seeds)的合成方法如下將純化的牛腦微管蛋白在35℃，含1mM GTP，10％甘油和10％DMSO的溶液中孵浴30分鐘，接著讓合成好的微管通過(guò)一個(gè)27號(hào)測(cè)量針6次。微管合成檢測(cè)在事先加入含純化牛腦微管蛋白的PEM-100緩沖液(100mM Pipes pH＝6.8，1mM EDTA，1mM MgSO4，補(bǔ)加1mM GTP)247.5ul的分光光度計(jì)石英皿(保持35℃)中加入27.5ul微管組裝核心，監(jiān)測(cè)OD4002小時(shí)。由于化合物溶解在DMSO中，而DMSO對(duì)微管的組裝有很大影響，因此在每個(gè)石英皿中加入與最大用藥量相同的DMSO。需要注意的是微管組裝反應(yīng)初始速度的上升相不是總能捕捉到的，因?yàn)闃悠窚?zhǔn)備過(guò)程中這一步驟已發(fā)生。但是所有樣品在加入藥物前的初始光學(xué)密度是相同的。
微管蛋白純化(Tubulin Purification)和微管動(dòng)力學(xué)(Microtubule Dynamics)檢測(cè)微管的純化如此文所述(“Kineticstabilization of microtubule dynamic instability in vitro byvinblastine”，Toso，R.J.，Jordan，M.A.，F(xiàn)arrell，K.W.，Matsumoto，B.and Wilson，L.，Biochemistry，1993，32，1285-1293)。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)三個(gè)合成(assembly)-分解(disassembly)的循環(huán)過(guò)程制備微管相關(guān)富含蛋白牛腦微管蛋白。微管蛋白是使用PEM50(50mMPipes，1mM MgSO4，1mM EGTA，0.1mM GTP)平衡的Whatman P-11磷酸纖維素層析，洗脫其它微管蛋白而純化。純化的微管蛋白(純度＞99％)通過(guò)液氮速凍并保存在-70℃。37℃下，在加有或沒(méi)有加ACEA100101，ACEA100108或者ACEA100116的PMEM緩沖液(87mM Pipes，36mM MES，1.4mM MgCl2，1mM EDTA，pH6.8)以及2mM GTP的體系中，純化的微管蛋白(15μM微管蛋白二聚體)聚合到海膽鞭毛子的端點(diǎn)(Strongylocentrotus purpuratus)axonemal seeds。在37℃，使用相差攝像顯微鏡(differential interference contrastenhanced video microscopy)記錄單個(gè)微管的動(dòng)態(tài)聚合過(guò)程。末端的正負(fù)極是通過(guò)以下因素確定的微管增長(zhǎng)的速率；種子另一端長(zhǎng)出的微管數(shù)；微管的相對(duì)長(zhǎng)度(Panda，D.，Goode，B.L.，F(xiàn)einstein，S.C.andWilson，L.，Kinetic stabilization of microtubule dynamics at steady stateby tau and microtubule-binding domains of tau，Biochemistry，1995，34，11117-11127；WaIker，R.A.，O′Brien，E.T.，Pryer，N.K.，Soboeiro，M.F.，Voter，W.A.，Erickson，H.P.and Salmon，E.D.，Dynamic instability of indiVidual microtubules analyzed by Video lightmicroscopyrate constants and transition frequencies，J.Cell Biol.1988，107，1437-1448)。在微管聚合的穩(wěn)態(tài)(聚合開(kāi)始后大約45分鐘)以10分鐘每片的速度記錄負(fù)極。單個(gè)微管的動(dòng)畫(huà)記錄是按照修改后的由Panda等于1995年創(chuàng)立的方法(Panda，D.，Goode，B.L.，F(xiàn)einstein，S.C.and Wilson，L.，Kinetic stabilization of microtubuledynamics at steady state by tau and microtubule-binding domains oftau，Biochemistry，1995，34 11117-11127)。數(shù)據(jù)點(diǎn)的采集時(shí)間間隔為1-3秒。
如果一根微管的長(zhǎng)度以大于5μm/min的速率增加或減少就認(rèn)為它在增長(zhǎng)或縮短。如果微管以小于0.5μm/min的速率增長(zhǎng)的時(shí)間大于30秒即認(rèn)為其處于衰減狀態(tài)。平均速率、長(zhǎng)度和持續(xù)時(shí)間都是獨(dú)立而不相關(guān)值的平均值。崩解頻率的計(jì)算是以長(zhǎng)度減短的微管數(shù)除以增長(zhǎng)和衰減狀態(tài)的總時(shí)間，新增長(zhǎng)頻率是重新增長(zhǎng)的微管數(shù)除以總的減短時(shí)間。為控制試驗(yàn)誤差，每種條件都使用至少兩種不同的微管蛋白/GTP(每種2-3片)混合物并記錄多天。在給定的條件下，使用不同的混合物沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微管的動(dòng)力學(xué)有差異。在動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性測(cè)試中使用的藥物濃度通過(guò)以下方法確定預(yù)先使用微管組裝測(cè)試中所用藥物濃度的一半，觀察微管的穩(wěn)定性。如果一個(gè)片子上的多數(shù)微管都很穩(wěn)定，藥物濃度就要降低，直至在10分鐘內(nèi)至少觀察到兩個(gè)增長(zhǎng)或縮短的微管。
圖28-38顯示DBTS和有機(jī)硫化合物ACEA100108和ACEA100106對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞微管的作用。圖28顯示對(duì)照組細(xì)胞無(wú)藥物時(shí)微管的圖像。微管顯示正常狀態(tài)。圖29顯示細(xì)胞的微管置于紫杉醇(Taxol)中4小時(shí)的圖像。微管顯示在某些區(qū)域呈束狀；隨著濃度的增加，呈束狀況增加且微管比對(duì)照組細(xì)胞微管短。圖30顯示細(xì)胞的微管置于紫杉醇(Taxol)中24小時(shí)的圖像。隨著劑量的增加，微管損傷增加。正如圖中所示，束狀增多微管持續(xù)縮短。另外，細(xì)胞顯示畸形。
圖31顯示細(xì)胞中的微管置于長(zhǎng)春堿中4小時(shí)。隨著劑量的增加，微管束崩解微管明顯變短。圖32顯示顯示細(xì)胞中的微管置于長(zhǎng)春堿中24小時(shí)。如圖所示，主要的細(xì)胞異常為微管異常。
圖33顯示細(xì)胞中的微管置于DBTS中4小時(shí)。微管被完全破壞；僅有少數(shù)短微管存留，所有的微管蛋白顯著減少。此作用可用非離子去垢劑萃取法和免疫印記法定量。圖34顯示細(xì)胞中的微管置于DBTS中24小時(shí)。在低濃度時(shí)，相比于細(xì)胞置于藥物中4小時(shí)只顯示一些微管恢復(fù)，經(jīng)藥物處理24小時(shí)后在6uM或18μM的DBTS中無(wú)存活細(xì)胞。
圖35顯示細(xì)胞中的微管置于ACEA100108中4小時(shí)。與DBTS相似，所有濃度時(shí)微管都明顯破壞。微管非常短，所有微管都減少。在最高濃度時(shí)，細(xì)胞大多變圓。圖36顯示細(xì)胞中的微管置于ACEA100108中24小時(shí)。在濃度為1μM和3μM時(shí)這些細(xì)胞在4小時(shí)和24小時(shí)期間有一些恢復(fù)。在此兩種情況下微管網(wǎng)顯得相對(duì)正常。然而，在9μM時(shí)，微管顯得短微管網(wǎng)異常。
圖37顯示細(xì)胞中的微管置于ACEA100106中4小時(shí)。當(dāng)濃度為1uM時(shí)，可見(jiàn)殘存微管。在另外兩個(gè)高濃度時(shí)，微管變短并被破壞。細(xì)胞不再呈長(zhǎng)型而隨劑量變圓。圖38顯示細(xì)胞中的微管置于ACEA100106中24小時(shí)。加入1μM ACEA100116的細(xì)胞相對(duì)正常，加入9 uM ACEA100116的細(xì)胞在24小時(shí)后死亡。
圖39-41顯示DBTS和有機(jī)硫化合物ACEA 100108和ACEA 100116體外對(duì)微管合成的作用。如圖39a所示，所有劑量的DBTS都明顯抑制微管的合成。當(dāng)劑量為9μM時(shí)作用尤其顯著。對(duì)照組(圖39b)和藥物組(圖39c)樣品的微管結(jié)構(gòu)置于顯微鏡下觀察。如圖40所示，低劑量ACEA100108對(duì)微管合成的影響非常小。反之，27μM ACEA100108對(duì)微管合成有明顯抑制作用。
如圖41所示，ACEA100116的作用與DBTS和ACEA100108不同。DBTS和ACEA100108抑制微管合成，ACEA100116則促進(jìn)微管合成。此作用在濃度為9μM和27μM時(shí)出現(xiàn)。此圖也顯示了一種常見(jiàn)的但不能理解的現(xiàn)象，稱(chēng)作“邊輻射現(xiàn)象”，即光散射圖樣不呈平臺(tái)狀，而是呈持續(xù)下降狀態(tài)。無(wú)論如何，ACEA100116清楚地呈現(xiàn)體外促進(jìn)微管合成而不是抑制作用。
而且，DBTS，ACEA100108和ACEA100116體外影響微管性能。如表37所示，這三種化合物改變微管動(dòng)力學(xué)模式。DBTS不影響微管生長(zhǎng)速率但是增加了生長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，導(dǎo)致微管增長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)平均長(zhǎng)度增加。相應(yīng)的微管縮短狀態(tài)時(shí)平均長(zhǎng)度減短。
ACEA100108增加微管增長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間和增長(zhǎng)狀態(tài)的平均長(zhǎng)度，對(duì)縮短狀態(tài)的長(zhǎng)度也有明顯作用。此作用比DBTS和ACEA100116更顯著，且呈現(xiàn)與這兩種化和物不同的作用。ACEA100116增加伸長(zhǎng)率，但是對(duì)增長(zhǎng)狀態(tài)的長(zhǎng)度影響不大。它對(duì)縮短率無(wú)作用，但是卻影響縮短狀態(tài)的長(zhǎng)度。因?yàn)榧?xì)胞圖像數(shù)據(jù)無(wú)法區(qū)分藥物所連接的微管蛋白或微管結(jié)合蛋白，因此體外微管合成和體外微管動(dòng)態(tài)檢測(cè)都使用純化無(wú)MAP的微管蛋白。這些觀察結(jié)果證明，這三種化合物直接相互作用與微管蛋白。
表37DBTS及其衍生物ACEA100108和ACEA100116抑制微管動(dòng)力學(xué)

例24ACEA100108引起腫瘤細(xì)胞凋亡 為檢測(cè)化合物ACEA100108誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在A549細(xì)胞中加入1uM ACEA100108和50nM紫杉醇(Paclitaxel)和10nM長(zhǎng)春堿(Vinblastine)。兩種微管活動(dòng)抑制劑紫杉醇(Paclitaxel)和長(zhǎng)春堿(VinblastiHe)作為陽(yáng)性對(duì)照組。A549細(xì)胞以濃度為10000細(xì)胞/孔接種于孔中，18小時(shí)后加入抗有絲分裂所需濃度的化合物ACEA100108，紫杉醇和長(zhǎng)春堿。細(xì)胞在藥物中孵育24小時(shí)然后用PBS洗兩遍，用緩沖液洗3遍(10mM HEPES，pH7.5，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)。細(xì)胞用1ug/mL Annexin V-Cy3 conjugate(開(kāi)始凋亡的細(xì)胞染為紅色)和500uM 6-CFDA(活細(xì)胞染為綠色)染色20分鐘。細(xì)胞用1x緩沖液輕洗3次，在免疫熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，并用CCD照相機(jī)照片。記錄被6-CFDA染綠色的存活細(xì)胞，而壞死細(xì)胞僅被Annexin V-Cy3染為紅色。開(kāi)始凋亡的細(xì)胞被AnnexinV-Cy3和6-CFDA同時(shí)染色。
如圖42顯示，經(jīng)ACEA100108，紫杉醇，和長(zhǎng)春堿處理的細(xì)胞被Annexin V強(qiáng)染色，僅用DMSO處理的對(duì)照細(xì)胞無(wú)Annexin V染色。這說(shuō)明，ACEA100108誘導(dǎo)A549人肺癌細(xì)胞凋亡。
例25ACEA100108引起腫瘤細(xì)胞分裂周期終止在G2/M期 微管在有絲分裂中尤其重要，在此過(guò)程中，在細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞之前，細(xì)胞的染色體復(fù)制并分裂成兩套相同的染色體，作用于微管的藥物如紫杉醇，和長(zhǎng)春堿抑制微管的動(dòng)力作用阻斷有絲分裂的過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞停止于G2/M細(xì)胞周期。為檢測(cè)ACEA100108在腫瘤細(xì)胞分裂過(guò)程中是否影響有絲分裂過(guò)程，A549人肺癌細(xì)胞加入25μM ACEA100108和7.8nM紫杉醇，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞周期的作用。
A549以500000細(xì)胞的濃度接種在60mm的組織培養(yǎng)板中，18小時(shí)后，在細(xì)胞中加入抗有絲分裂所需濃度的化合物并繼續(xù)孵育24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗后，消化并計(jì)數(shù)，用70％冰甲醇固定后儲(chǔ)存于4℃。細(xì)胞用PBS清洗，用propidium iodide染色，置于冰上直至使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
如圖43所示，相比于僅加入了DMSO的細(xì)胞，加入ACEA100108和紫杉醇的細(xì)胞在G2/M期時(shí)的細(xì)胞群明顯增多。
例26二(對(duì)-氯芐基)三硫醚(9)的合成(用二氯化硫溶液) 在室溫下向250毫升干燥的園底燒瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(10.67毫升，97％，d＝0.956，實(shí)際重量＝9.89克，70.54毫摩爾)和70毫升的無(wú)水己烷。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌該溶液。在40-50分鐘內(nèi)將二氯化硫的二氯甲烷溶液(35.3毫升，1.0M，35.3毫摩爾)慢慢滴加到上述攪拌的溶液中。繼續(xù)攪拌反應(yīng)液50分鐘。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將反應(yīng)液冷卻到0℃。在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下并在40-50分鐘內(nèi)將4-氯芐基硫醇(9.5毫升，96％，實(shí)際重量＝11.19克，70.53毫摩爾)在50毫升無(wú)水己烷中的溶液慢慢滴加到反應(yīng)液中。在0℃攪拌反應(yīng)液一小時(shí)，然后在室溫下攪拌三小時(shí)。用放有一層硅藻土的過(guò)濾漏斗過(guò)濾掉反應(yīng)液中的白色到淡黃色固體并用少量己烷濾洗固體。所得濾液在分液漏斗中用水洗滌兩次(200毫升，100毫升)，然后再用飽和食鹽水洗滴一次(200毫升)。所得有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。在減壓下蒸掉濾去干燥劑后所得濾液中的溶劑。
所得白色固體粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱提純。硅膠色譜柱用己烷-乙酸乙酯(60∶1)淋洗劑洗脫。用薄層色譜板(TLC)檢測(cè)(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.45)。收集含產(chǎn)品的部分并蒸去溶劑，所得白色固體產(chǎn)品再用己烷重結(jié)晶得到11.06克白色針狀晶體產(chǎn)品9，收率90％。1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ3.98(s，4H)，7.23(d，4H，J＝8.4Hz)，7.30(d，4H，J＝8.4Hz)；ES質(zhì)譜m/z 345(M-1)-。
例27二(對(duì)-氟芐基)三硫醚(8)的大規(guī)模合成 在室溫下向500毫升干燥的園底燒瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(21.42毫升，97％，d＝0.956，實(shí)際重量＝19.86克，141.6毫摩爾)和140毫升的無(wú)水己烷。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌該溶液。在40-50分鐘內(nèi)將二氯化硫的二氯甲烷溶液(70.8毫升，1.0M，70.8毫摩爾)慢慢滴加到上述攪拌的溶液中。繼續(xù)攪拌反應(yīng)液50分鐘。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將反應(yīng)液冷卻到0℃。在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下并在50分鐘內(nèi)將4-氟芐基硫醇(18.04毫升，96％，實(shí)際重量＝20.0克，140.8毫摩爾)在100毫升無(wú)水己烷中的溶液慢慢滴加到反應(yīng)液中。在0℃攪拌反應(yīng)液一小時(shí)，然后在室溫下攪拌三小時(shí)。用放有一層硅藻土的過(guò)濾漏斗過(guò)濾掉反應(yīng)液中的白色到淡黃色固體并用少量己烷濾洗固體。所得濾液在分液漏斗中用水洗滌兩次(400毫升，300毫升)，然后再用飽和食鹽水洗滌一次(400毫升)。所得有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。在減壓下蒸掉濾去干燥劑后所得濾液中的溶劑。
所得白色固體粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱提純。硅膠色譜柱用己烷-乙酸乙酯(60∶1)淋洗劑洗脫。用薄層色譜板(TLC)檢測(cè)(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.46)。收集含產(chǎn)品的部分并蒸去溶劑，所得白色固體產(chǎn)品再用己烷重結(jié)晶得到14.7克白色針狀晶體產(chǎn)品8，收率67％。熔點(diǎn)61.5-62.1℃；紫外可見(jiàn)光譜(UV-VIS，正己烷)λ＝218nm(ε，63700)，λ＝283nm(ε，12000)；1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振譜(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振譜(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES質(zhì)譜m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3計(jì)算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；實(shí)驗(yàn)值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
例28二(對(duì)-氟芐基)三硫醚(8)的大規(guī)模合成(用純二氯化硫) 在室溫下向3000毫升干燥的園底燒瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(226.6毫升，97％，d＝0.956，實(shí)際重量＝205.7克，1467毫摩爾)，1200毫升用分子篩干燥過(guò)的正己烷和460毫升用分子篩干燥過(guò)的二氯甲烷。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌該溶液。在40-50分鐘內(nèi)將純的二氯化硫(55.9毫升，90.63克，880毫摩爾，0.6eq)慢慢滴加到上述攪拌的溶液中。此時(shí)大量固體產(chǎn)生。繼續(xù)攪拌反應(yīng)液50分鐘。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將反應(yīng)液冷卻到0℃。在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下并在40-50分鐘內(nèi)將4-氟芐基硫醇(176毫升，96％，實(shí)際重量＝200.17克，1408毫摩爾)在250毫升無(wú)水二氯甲烷和100毫升無(wú)水正己烷中的溶液慢慢滴加到反應(yīng)液中。在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)液一小時(shí)，然后在室溫下攪拌三小時(shí)。用放有一層硅藻土的過(guò)濾漏斗過(guò)濾掉反應(yīng)液中的白色到淡黃色固體并用少量正己烷濾洗固體。所得濾液在分液漏斗中用水洗滌兩次(2×1000毫升)，然后再用飽和食鹽水洗滌一次(1000毫升)。所得有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。在減壓下蒸掉濾去干燥劑后所得濾液中的溶劑。所得白色固體粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱提純。硅膠色譜柱用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(80∶1，60∶1，40∶1和20∶1)淋洗劑洗脫。用薄層色譜板(TLC)檢測(cè)(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.46)。收集含產(chǎn)品的部分并蒸去溶劑，所得白色固體產(chǎn)品再用正己烷重結(jié)晶得到131.0克白色針狀晶體產(chǎn)品8，收率59.2％。熔點(diǎn)61.5-62.1℃；紫外可見(jiàn)光譜(UV-VIS，正己烷)λ＝218nm(ε，63700)，λ＝283nm(ε，12000)；1H核磁共振譜(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振譜(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振譜(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES質(zhì)譜m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3計(jì)算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；實(shí)驗(yàn)值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
不對(duì)稱(chēng)的有機(jī)硫衍生物41-68(Scheme 3)是用類(lèi)似于文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成的(Derbesy，G.；Harpp，D.N.Tetrahedron Letters，1994，35，5381-5384)。典型過(guò)程如下將10mmol的二氯化硫溶解到50毫升的五水乙醚中并將該溶液冷卻到-78℃。慢慢地將10mmol的一種芐基硫醇和10mmol的無(wú)水吡啶在25毫升的乙醚中的溶液滴加到上述不斷攪拌的冷卻溶液中。約30分鐘滴加完畢。在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。將10mmol第二種硫醇和10mmol無(wú)水吡啶在25毫升的乙醚中的溶液慢慢的滴加到上述不斷攪拌的冷卻溶液中。約30分鐘滴加完畢。繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。反應(yīng)混合物的溫度升到室溫后用水洗滌兩次，用1N的氫氧化鈉水溶液洗滌兩次，之后再用水洗滌兩次直到水溶液顯示中性為止。用無(wú)水氯化鈣或硫酸鈉干燥有機(jī)相，濾去催化劑并除去溶劑。所得促產(chǎn)品通過(guò)一個(gè)短的硅膠柱提純，用己烷-乙酸乙酯淋洗得純產(chǎn)品41-68，收率在40-100％范圍內(nèi)。
值得一提并需要理解的是，上述具體描述和例子均屬于舉例說(shuō)明而并不限制本發(fā)明專(zhuān)利的范圍。很明顯，上述各實(shí)例均可進(jìn)行改變和修改。這些改變和修飾可無(wú)限制的包括在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的，取代基的，衍生物的，中間體的，合成方面，制劑方面，使用方法上等改變和修飾。任何如此修改后不違反本文的精神和范疇。有關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利以及有關(guān)公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)，在此以參考文獻(xiàn)的方式被整合到本專(zhuān)利申請(qǐng)中。
權(quán)利要求
1.一種具有以下通式的化合物 或 其中，A和B相同或不同，并且獨(dú)立地是任選取代的芳基，雜芳基或一種5～14員、可以是單環(huán)或多環(huán)的而且任選地含有雜原子的環(huán)；每一個(gè)S都任選地呈氧化物的形式；S1和S2獨(dú)立地是S，SO或SO2；每一個(gè)R是H，鹵素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每一個(gè)R1是烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)或雜環(huán)，其中每一個(gè)都任選地有取代且可含有雜原子；m，n和p獨(dú)立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p定義如上；或有下述通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p定義如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中“q”是0-3，而“*”代表碳碳雙鍵C＝C可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任選地有取代的芳基，雜芳基或雜環(huán)基；其中，A和B一起可以形成環(huán)狀系統(tǒng)；及其藥物上可接受鹽、酯、藥物前體或代謝物；先決條件是所述化合物不是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氯芐基)三硫醚，(對(duì)-氯芐基)芐基三硫醚，二(對(duì)-硝基芐基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(對(duì)-叔丁基苯基)三硫醚。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中Z具有下述通式 或 其中，每個(gè)W均獨(dú)立地為一個(gè)健，CR，N，NR，S或O；每個(gè)R均如權(quán)利要求1所定義。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R獨(dú)立地是H，鹵素，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或R是C1-10烷基，C3-10環(huán)烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)或雜環(huán)，其中每一個(gè)都可以含雜原子。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中A和B獨(dú)立地是苯，吡啶，噠嗪，嘧啶，吡嗪，三嗪，異唑，異噻唑，二唑，[1，2，4]二唑，三唑，噻二唑，吡唑，咪唑，噻唑，唑，苯并唑，吡咯，呋喃，噻吩，中氮茚，吲哚，異吲哚，二氫吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，吲唑，苯并咪唑，苯并噻唑，嘌呤，喹喔啉，喹啉，異喹啉，噌啉，2，3-二氮雜萘，喹唑啉，喹喔啉，1，5-二氮雜萘，蝶啶，吖啶，吩嗪，吩噻嗪，茚，萘，苯并二唑，或苯并[1，2，5]二唑。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中A和B獨(dú)立地是 其中，X和W獨(dú)立地是S，O，NR7，CR7；或在一個(gè)六員單環(huán)或雙環(huán)中一個(gè)W可以是一個(gè)鍵；并且每個(gè)R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7是氫原子，鹵素原子，羧基，氰基，氨基，酰胺基，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每個(gè)R1均為烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)均是任選地有取代的且可含有雜原子。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中每個(gè)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7獨(dú)立地是H、鹵素、OR1、SR1、CO2R1、CONR21、C＝O、CN、CF3、OCF3、NO2、NR1R1、OCOR1；或每個(gè)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7是C1-10烷基、C3-10環(huán)烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、雜芳基、碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)都可以含有雜原子。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中所述芳基、雜芳基、或雜環(huán)基是哌嗪基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、苯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹喔啉基、噻唑基、唑基、咪唑基、喹啉基、萘基、噠嗪基、吡唑并嘧啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、吡唑基、吡咯基、吲哚基、異吲哚基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、或喹唑啉基，其中每一個(gè)都任選地有選自O(shè)、N、S和鹵素的雜原子取代，或有C1-10烷基、C3-10環(huán)烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、或雜環(huán)基取代，每一個(gè)都任選地含有雜原子。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中每個(gè)S是一氧化物或二氧化物。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物有通式(6) 其中，每個(gè)n是1-3；而且，R是氫原子，鹵素，烷基，或鹵代烷基。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物有通式(7) 其中，Ar是任選地有取代的噻吩，苯并噻吩，吡啶或吡嗪。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是二(氟芐基)三硫醚，二(鄰-氯芐基)三硫醚，二(甲基芐基)三硫醚，二(三氟甲基芐基)三硫醚，二(2-苯基乙基)三硫醚，二(噻吩-2-甲基)三硫醚，二(吡啶-4-乙基)三硫醚，二(嘧啶-2-乙基)三硫醚或二(苯并噻吩-3-甲基)三硫醚。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(間-甲基芐基)三硫醚，或二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚。
13.一種減緩或治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的方法，包含對(duì)有其需要的系統(tǒng)或?qū)ο蠼o藥有效劑量的權(quán)利要求1化合物或其醫(yī)藥組合物，且任選地與一種抗細(xì)胞增生劑聯(lián)合使用，從而治療或緩解所述神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
14.一種減緩或治療除神經(jīng)母細(xì)胞瘤外的細(xì)胞增生紊亂的方法，包含對(duì)有其需要的系統(tǒng)或?qū)ο蠼o藥有效劑量的下式化合物 或 其中，A和B可以相同或不同，且獨(dú)立地是任選取代的芳基，雜芳基或一種5～14員、可以是單環(huán)或多環(huán)、且任選地含有雜原子的環(huán)；每個(gè)S都任選地呈其氧化物形式；S1和S2獨(dú)立地是S，SO或SO2；每個(gè)R是氫原子，鹵素，羧基，氰基，氨基，酰胺機(jī)，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每個(gè)R1是烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)都任選地有取代且可含有雜原子；m，n和p獨(dú)立地是0-3或有通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p與上述定義相同；或有通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p與上述定義相同；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*其中，q是0-3；并且“*”號(hào)代表C＝C可以代之以炔基，O，S，NR；或Z是任選地有取代的芳基，雜芳基或雜環(huán)基；其中，A和B一起可以形成環(huán)狀基團(tuán)；或其醫(yī)藥組合物，且任選地并用一種抗細(xì)胞增生劑；從而使所述系統(tǒng)或?qū)ο笾械乃黾?xì)胞增生紊亂得到治療或緩解。
15.權(quán)利要求14的方法，其中使所述細(xì)胞增生減少，或誘導(dǎo)所述細(xì)胞死亡。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述對(duì)象是人或動(dòng)物，且所述系統(tǒng)是細(xì)胞或組織。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞增生紊亂病變是腫瘤或癌癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌癥是白血病，淋巴癌，肺癌，結(jié)腸癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌，黑素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，頭頸癌，或胰腺癌。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚，或二(間-甲基芐基)三硫醚。
20.一種減少或抑制細(xì)胞增生或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，包含對(duì)一個(gè)系統(tǒng)或一個(gè)對(duì)象給藥有效劑量的一種權(quán)利要求14中定義的化合物或其醫(yī)藥組合物，且任選地與一種抗細(xì)胞增生劑聯(lián)合使用，從而減少或抑制所述系統(tǒng)或?qū)ο笾械募?xì)胞增殖或誘導(dǎo)所述系統(tǒng)或?qū)ο笾械募?xì)胞死亡。
21.權(quán)利要求20的方法，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
22.權(quán)利要求20的方法，其中破壞微管蛋白的聚合和解聚，或抑制細(xì)胞分裂周期中的G2/M進(jìn)一步發(fā)展、細(xì)胞有絲分裂，或其組合。
23.權(quán)利要求20的方法，其中抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管形成、或其組合。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述對(duì)象是人或動(dòng)物，而所述系統(tǒng)是細(xì)胞或組織。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚，或二(間-甲基芐基)三硫醚。
26.一種緩解或治療血管狹窄的方法，包含對(duì)有其需要的對(duì)象給藥有效劑量的一種權(quán)利要求14中定義的化合物或其醫(yī)藥組合物，從而緩解或治療所述對(duì)象中的血管狹窄癥。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述血管狹窄癥與血管內(nèi)膜增生密切相關(guān)。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述給藥步驟是經(jīng)口或非經(jīng)腸給藥，或通過(guò)血管內(nèi)支架給藥。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述化合物是二芐基三硫醚，二(對(duì)-氟芐基)三硫醚，二(對(duì)-甲基芐基)三硫醚，或二(間-甲基芐基)三硫醚。
30.一種醫(yī)藥組合物，包含權(quán)利要求1的化合物，和醫(yī)藥上可接受賦形劑。
31.治療細(xì)胞增生紊亂的醫(yī)藥組合物，包含如下通式的化合物 或 其中，A和B可以相同或不同，并且獨(dú)立地是任選取代的芳基，雜芳基或一種5～14員、可以是單環(huán)或多環(huán)的而且任選地含有雜原子的環(huán)；每個(gè)S都任選地呈其氧化物的形式；S1和S2獨(dú)立地是S，SO或SO2；每個(gè)R是氫，鹵素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，無(wú)機(jī)取代基，SR1，OR1或R1，其中每個(gè)R1是烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，碳環(huán)基或雜環(huán)基，其中每一個(gè)都任選地有取代且可含有雜原子；m，n和p獨(dú)立地是0-3或有通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p與上述定義相同；或有通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p與上述定義相同；并且Z是(CR12)q，(CR1＝CR1)q*其中，q是0-3；并且，“*”號(hào)代表C＝C可以代之以炔基，O，S，NR；或Z是任選地有取代的芳基，雜芳基或雜環(huán)基；其中，A和B一起可以形成環(huán)狀基團(tuán)；和醫(yī)藥上可接受賦形劑。
32.權(quán)利要求31中的通式1-2的化合物的制備方法，包含a)N-三甲基甲硅烷基咪唑和二氯化硫在鹵代溶劑中反應(yīng)制得硫化二咪唑；b)所述硫化二咪唑與硫醇反應(yīng)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述溶劑是二氯甲烷。
34.權(quán)利要求32的方法，其中讓己烷中的N-三甲基甲硅烷基咪唑與二氯甲烷中的二氯化硫反應(yīng)。
35.權(quán)利要求32的方法，其中讓作為凈相化合物的二氯化硫與己烷和二氯甲烷中的N-三甲基甲硅烷基咪唑反應(yīng)。
36.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包含使所述三硫醚重結(jié)晶。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述三硫醚是用正己烷、己烷、庚烷、石油醚或其組合重結(jié)晶的。
38.一種包含權(quán)利要求1的化合物的組合物的制備方法，包含a)將權(quán)利要求1的化合物溶解到水溶性有機(jī)溶劑、非離子性溶劑、水溶性類(lèi)脂、環(huán)糊精、維生素、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或其組合中，提供一種溶液，之后b)加入食鹽水或含有0-10％碳水化合物溶液的緩沖劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述有機(jī)溶劑是聚乙二醇(PEG)、一種醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、或其組合。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述非離子型表面活性劑是聚氧乙烯甘油三蓖麻醇酸酯35、PEG-琥珀酸酯、多乙氧基醚20、多乙氧基醚80、12-羥基硬脂酸聚乙二醇660酯、脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、乙氧基化杏核油、辛基己酰macrogol-8-甘油酯、甘油酯、PEG6辛酸甘油酯、甘油、乙二醇多乙氧基醚，或其組合。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述類(lèi)脂是一種菜籽油、甘油三酸酯、植物油、或其組合。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述類(lèi)脂是蓖麻油、聚烴氧基蓖麻油、玉米油、橄欖油、棉子油、花生油、薄荷油、紅花油、芝麻油、大豆油、氫化菜籽油、氫化大豆油、甘油三椰子油酸酯、棕櫚籽油、及其氫化形式、或其組合。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述維生素是生育酚。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述脂肪酸是油酸。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述脂肪酸酯是甘油單酸酯、甘油二酸酯、PEG的一或二脂肪酸酯、或其組合。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述環(huán)糊精是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精，或磺丁基醚-β-環(huán)糊精。
47.權(quán)利要求38的方法，其中所述磷脂是大豆卵磷脂膽堿、或二硬脂酰卵磷脂甘油、及其氫化形式或其組合。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述碳水化合物包含葡萄糖。
49.一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包含對(duì)有其需要的對(duì)象或系統(tǒng)給藥有效劑量的權(quán)利要求14中定義的化合物或其醫(yī)藥組合物，且任選地并用一種抗增生劑，從而誘導(dǎo)所述對(duì)象或系統(tǒng)中的細(xì)胞凋亡。
50.權(quán)利要求49的方法，其中誘導(dǎo)細(xì)胞管狀蛋白或微管蛋白。
51.按照權(quán)利要求38的方法制備的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涵蓋有取代的二、三、四和五硫化合物和組合物，和使用這些化合物治療和/或預(yù)防細(xì)胞增生紊亂的方法。本發(fā)明還涵蓋制備三硫化合物及其組合物的方法。
文檔編號(hào)C07D277/00GK1997278SQ200580012460
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者徐曉, 安浩云, 王小波 申請(qǐng)人:美國(guó)艾森生物科學(xué)公司