專利名稱：胰多肽家族基序及含有這些基序的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽化學(xué)，更特別地涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽。
背景技術(shù)：
大量相關(guān)激素組成胰多肽家族(“PPT”)。胰多肽(“PP”)被發(fā)現(xiàn)是胰島素提取物的污染物，是因其器官來(lái)源而不是功能價(jià)值命名的(Kimmel等人，Endocrinology 831323-30(1968))。PP是36個(gè)氨基酸的肽(SEQ ID NO1)，含有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)基序(motif)。后來(lái)在腸的提取物中發(fā)現(xiàn)了一種相關(guān)肽，由于其N-和C-末端酪氨酸，所以命名為YY肽(“PYY”)(SEQ ID NO2)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 792514-8(1982))。第三種相關(guān)肽后來(lái)在腦提取物中被發(fā)現(xiàn)，命名為神經(jīng)肽Y(“NPY”)(SEQ ID NO4)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795485-9(1982)；Tatemoto等人，Nature 296659-60(1982))。
據(jù)報(bào)導(dǎo)這三種相關(guān)肽已經(jīng)發(fā)揮了多種生物學(xué)作用。PP的效應(yīng)包括抑制胰分泌和膽囊舒張。中樞施用PP可以適度增加進(jìn)食，這可以通過(guò)位于下丘腦和腦干的受體來(lái)調(diào)節(jié)(綜述于Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998))。
PYY(SEQ ID NO2)的釋放在餐后發(fā)生。PYY的替代分子形式是PYY(3-36)(SEQ ID NO3)(Eberlein等人，Peptides 10797-803(1989)；Grandt等人，Regul.Pept.51151-9(1994))。該片段組成人和犬科動(dòng)物腸提取物的總PYY-樣免疫反應(yīng)性的大約40％，和禁食狀態(tài)中總血漿PYY免疫反應(yīng)性的大約36％，在餐后略微超過(guò)50％。顯然地，它是PYY的二肽基肽酶-IV(DPP4)裂解產(chǎn)物。PYY(3-36)據(jù)報(bào)導(dǎo)是Y2和Y5受體的選擇性配體，Y2和Y5受體在優(yōu)選N末端截短的NPY類似物(即NPY類似物的C末端片段)中顯示出藥理學(xué)上的獨(dú)特性。PYY的外周施用據(jù)報(bào)導(dǎo)降低了胃酸的分泌、胃的運(yùn)動(dòng)、胰腺外分泌(Yoshinaga等人，Am.J.Physiol.263G695-701(1992)；Guan等人，Endocrinology 128911-6(1991)；Pappas等人，Gastroenterology 911386-9(1986))，膽囊收縮和腸運(yùn)動(dòng)(Savage等人，Gut 28166-70(1987))。中樞注射PYY對(duì)胃排空、胃運(yùn)動(dòng)和胃酸分泌的作用，正如在后腦/腦干中或者其周圍直接注射后所觀察到的作用(Chen和Rogers，Am.J.Physiol.269R787-92(1995)；Chen等人，Regul.Pept.6195-98(1996)；Yang and Tache，Am.J.Physiol.268G943-8(1995)；Chen等人，Neurogastroenterol.Motil.9109-16(1997))，可能與外周注射后觀察到的那些作用不同。例如，中樞施用PYY具有一些與此處針對(duì)外周注射的PYY(3-36)描述的那些作用相反的作用，在針對(duì)外周注射的PYY(3-36)的作用中，胃酸分泌被刺激，沒有受到抑制。只有與TRH刺激結(jié)合在一起時(shí)，胃的運(yùn)動(dòng)才受到抑制，當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)不會(huì)受到抑制；并且通過(guò)與PP受體的假定的相互作用，在較高劑量下才是真正刺激性的。PYY已經(jīng)顯示出在中樞給藥后可以刺激食物和水的攝入(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)；Corp等人，Am.J.Physiol.259R317-23(1990))。
同樣地，最早期報(bào)導(dǎo)的NPY(SEQ ID NO4)的中樞作用之一是增加食物攝取，尤其是在下丘腦(Stanley等人，Peptides 61205-11(1985))。PYY和PP據(jù)報(bào)導(dǎo)可以模擬這些作用，并且PYY更有效，或者與NPY同樣有效(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)；Kanatani等人，Endocrinology 1411011-6(2000)；Nakajima等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2681010-4(1994))。幾個(gè)小組發(fā)現(xiàn)，NPY誘導(dǎo)的進(jìn)食的強(qiáng)度高于以前所測(cè)試的任何藥理學(xué)試劑所誘導(dǎo)的進(jìn)食，并且非常持久。NPY誘導(dǎo)的進(jìn)食刺激已經(jīng)在大量物種中報(bào)導(dǎo)。在三個(gè)基本的常量營(yíng)養(yǎng)物(脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物)中，碳水化合物的攝入被優(yōu)先刺激。沒有發(fā)現(xiàn)針對(duì)NPY的致食欲作用的耐受性，當(dāng)在10天內(nèi)重復(fù)施用該肽時(shí)，觀察到體重增加的比率有顯著增加。在饑餓過(guò)后，下丘腦PVN中NPY的濃度隨著時(shí)間有所增加，在食物攝取后又快速回到了對(duì)照水平。
藥理學(xué)研究和克隆努力已經(jīng)顯示了大量用于PP肽家族的七次跨膜受體，并且這些受體已經(jīng)命名為Y1到Y(jié)6(和一個(gè)推定的PYY優(yōu)先-受體Y7(PYY-preferring receptor))。這些受體的典型的信號(hào)反應(yīng)與其它Gi/G0-偶聯(lián)受體的信號(hào)反應(yīng)類似，即腺苷酸環(huán)化酶的抑制。即使這些受體之間具有相當(dāng)?shù)偷男蛄型葱?，顯而易見，在Y1、Y4和Y6受體之間仍有一簇氨基酸序列相似性，而Y2和Y5定義了其它家族。其它結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)各種肽的效能的等級(jí)次序被鑒別出。NPY優(yōu)先-受體Y7，其尚未被克隆，已經(jīng)被稱作Y3，并且PYY優(yōu)先-受體Y7也已經(jīng)顯示出存在(推定的Y7)(綜述在Michel等人，Pharmacol.Rev.50143-50(1998)；Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998)中)。
Y5和Y1受體已經(jīng)被提示為食物攝取反應(yīng)的主要介質(zhì)(Marsh等人，Nat.Med.4718-21(1998)；Kanatani等人，Endocrinology 1411011-6(2000))。一個(gè)流行的觀點(diǎn)是，通過(guò)這些受體，內(nèi)源NPY增加了進(jìn)食行為。針對(duì)肥胖癥的推薦療法總是針對(duì)NPY受體的拮抗作用，而用于治療厭食的療法是針對(duì)該配體家族的激動(dòng)劑(例如參見美國(guó)專利5,939,462、6,013,622和4,891,357)。一般而言，PYY和NPY據(jù)報(bào)導(dǎo)是等效的，并且在所研究的所有Y1、Y5(和Y2)受體測(cè)定法中是相效的(Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998))。
在藥理學(xué)上，Y2受體通過(guò)表現(xiàn)出針對(duì)神經(jīng)肽Y的C-末端片段的親和力與Y1區(qū)分開來(lái)。Y2受體是最經(jīng)常通過(guò)神經(jīng)肽Y(13-36)的親和力進(jìn)行區(qū)分的，盡管神經(jīng)肽Y和肽YY的3-36片段提供了改進(jìn)的親和力和選擇性(參見Dumont等人，Soc.for Neurosci.Abstracts 19726(1993))。通過(guò)Y1和Y2受體的信號(hào)傳遞被偶聯(lián)于腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用。也發(fā)現(xiàn)結(jié)合于Y2受體可以通過(guò)N型鈣通道的選擇性抑制來(lái)降低突觸中胞內(nèi)鈣水平。此外，Y2受體，像Y1受體一樣，表現(xiàn)出與第二信使的差別偶聯(lián)(參見美國(guó)專利6,355,478)。Y2受體發(fā)現(xiàn)存在于多個(gè)腦區(qū)域中，包括海馬、黑質(zhì)-側(cè)面、丘腦、下丘腦和腦干。人、鼠科動(dòng)物、猴和大鼠Y2受體已經(jīng)被克隆(例如參見美國(guó)專利6,420,352和美國(guó)專利6,355,478)。
推定的Y3受體的主要特征是它們識(shí)別NPY，而PYY至少在效能上低一個(gè)數(shù)量級(jí)。Y3受體代表顯示出優(yōu)先選擇NPY的唯一的結(jié)合位點(diǎn)/受體。
存在一個(gè)額外的結(jié)合位點(diǎn)/受體，其顯示出對(duì)PYY的優(yōu)先性，名為PYY優(yōu)先-受體，該受體在此處被稱作Y7受體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了與該受體結(jié)合的不同的排名次序，或者受體的分類，這表明在該家族中可能有不止一種受體。在大多數(shù)報(bào)道中，描述了對(duì)PYY的效能比對(duì)NPY的效能高3到5倍的受體。國(guó)際藥理聯(lián)合會(huì)對(duì)于NPY、PYY和PP受體的命名法的推薦是，不使用術(shù)語(yǔ)PYY優(yōu)先-受體，除非在PYY和NPY之間觀察到至少20倍的效能差異(Michel等人，Pharmacol.Rev.50143-50(1998))。然而，對(duì)于本公開目的，談及Y7受體，或者PYY優(yōu)先-受體的藥理學(xué)是指對(duì)PYY具有超過(guò)NPY的任何優(yōu)先程度的受體。
肥胖癥及其相關(guān)病癥是常見的，在美國(guó)和全世界是非常嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題。上身肥胖型已知是2型糖尿病的最強(qiáng)的危險(xiǎn)因素，并且是心血管疾病的強(qiáng)危險(xiǎn)因素。肥胖癥是如下疾病的公認(rèn)的危險(xiǎn)因素，即高血壓、動(dòng)脈硬化癥、充血性心力衰竭、中風(fēng)、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、生殖疾病如多囊卵巢綜合征、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌、以及全身麻醉并發(fā)癥的增加的發(fā)生率(例如參見Kopelman，Nature 404635-43(2000))。肥胖癥縮短了壽命，并且有上述疾病共同發(fā)病的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)，也有其它病癥如傳染病、靜脈曲張、黑棘皮癥(acanthosis nigrican)、濕疹、運(yùn)動(dòng)不耐受、胰島素抵抗、高血壓高膽固醇血癥、膽石癥、整形損傷和血栓栓塞疾病的極大風(fēng)險(xiǎn)(Rissanen等人，Br.Med.J.301835-7(1990))。肥胖癥也是稱作胰島素抵抗綜合征或者“綜合征X”的疾病組的一個(gè)危險(xiǎn)因素。對(duì)于肥胖癥和相關(guān)疾病的醫(yī)療費(fèi)用在全世界范圍內(nèi)的最新估計(jì)是1千5百億美元。肥胖癥的發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為是多因素的，但基本的問(wèn)題是，在肥胖對(duì)象中，營(yíng)養(yǎng)物可利用性和能量消耗不平衡，直到出現(xiàn)過(guò)量的脂肪組織。肥胖癥目前是難以治療的、慢性的、基本上難以消除的代謝失調(diào)。用于肥胖人群的體重降低的治療藥物可對(duì)他們的健康存在深遠(yuǎn)的有益影響。
仍然存在開發(fā)其它的PYY類似物多肽的需求。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這樣的PYY類似物多肽，以及用于產(chǎn)生和使用它們的方法。
盡管此處有全面的闡述，但此處所提到的所有文獻(xiàn)被引入本發(fā)明中，作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽，其與PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性，也包括至少兩個(gè)PPF基序，所述基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序，和C末端尾PPF基序。本發(fā)明的其它PPF基序可能與PP家族多肽中的任何多肽的任何基序相對(duì)應(yīng)，PP家族多肽包括PP、PYY和NPY。在某些實(shí)施方案中，PPF多肽不包括非天然氨基酸。在其它實(shí)施方案中，PPF多肽不包括已知的天然存在的物種變體。
一方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PYY類似物多肽。仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的片段，所述片段共價(jià)連接到PP、PYY或者NPY多肽的至少一個(gè)額外的片段上，其中每一個(gè)PP、PYY或者NPY片段包括一個(gè)PPF基序。本發(fā)明的這樣的PPF類似物多肽和PPF嵌合多肽將表現(xiàn)出與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，期望的PPF嵌合多肽包括N末端PP片段，其與C末端PYY片段組合。在其它實(shí)施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端PP片段，其與C末端NPY片段組合。在其它實(shí)施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端PYY片段和C末端PP或者NPY片段。在其它實(shí)施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端NPY，其與C末端PYY或者PP組合。在其它實(shí)施方案中，PPF嵌合多肽可能不包括與C末端NPY片段組合的N末端PP片段。仍然在其它實(shí)施方案中，PPF嵌合多肽可能不包括N末端NPY片段和C末端PYY片段。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于治療或者預(yù)防肥胖癥的方法，其中該方法包括給對(duì)需要治療或者預(yù)防的對(duì)象施用治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的PPF多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)象是肥胖或者超重對(duì)象。盡管“肥胖癥”通常被定義為體重指數(shù)超過(guò)30，為了本公開內(nèi)容的目的，任何對(duì)象，包括其體重指數(shù)低于30，需要或者希望減少體重的那些對(duì)象都包括在“肥胖”的范圍內(nèi)。對(duì)胰島素具有抗性、葡萄糖不耐受或者具有任何類型的糖尿病(例如1、2型或者妊娠糖尿病)的對(duì)象可以從該方法受益。
仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的化合物可以用于減少食物攝取、降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性、引起體重減輕、影響身體組成、改變身體能量含量或者能量消耗、以及改善脂質(zhì)分布(包括降低LDL膽固醇和甘油三酸酯水平、和/或改變HDL膽固醇水平)的方法。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療或者預(yù)防特定狀況或病癥，這些狀況或病癥可以通過(guò)降低有需要的對(duì)象的營(yíng)養(yǎng)物可利用性來(lái)減輕，包括給所述患者施用治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的PPF多肽。這樣的狀況或病癥包括，但不限于高血壓、脂質(zhì)異常血癥(dyslipidemia)、心血管病、進(jìn)食紊亂、胰島素抵抗、肥胖癥、任何類型的糖尿病，包括I型、II型以及妊娠糖尿病。本發(fā)明的化合物也可以用于治療或者預(yù)防與肥胖癥相關(guān)的其它病癥，包括中風(fēng)、癌癥(例如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌)、膽囊疾病、睡眠性呼吸暫停、生殖力降低和骨關(guān)節(jié)炎(參見Lyznicki等人，Am.Fam.Phys.632185，2001)。
本發(fā)明的化合物也可以用于加強(qiáng)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或者恢復(fù)胰島或者細(xì)胞中的葡萄糖反應(yīng)性。這些作用也可以用于治療或者預(yù)防與代謝失調(diào)相關(guān)的狀況，如上面所描述的那些狀況，以及美國(guó)專利US20040228846中描述的狀況。
除了有需要的對(duì)象由于食物攝取減少、體重減輕以及治療肥胖癥所帶來(lái)的高血壓的改善外，本發(fā)明的化合物可以用于治療或者預(yù)防低血壓。
本發(fā)明的化合物也可以用于治療或者預(yù)防任何數(shù)量的與腸電解質(zhì)和水分分泌過(guò)多以及吸收減少有關(guān)的胃腸病癥，例如感染性(例如細(xì)菌或者病毒)腹瀉、炎癥性腹瀉、短腸綜合征、或者通常在外科手術(shù)如回腸造口術(shù)之后發(fā)生的腹瀉(例如參見arrison’s principles ofInternal Medicine，McGraw Hill Inc.，New York，12th ed.)。感染性腹瀉的實(shí)例包括，但不限于，急性病毒性腹瀉、急性細(xì)菌性腹瀉(例如沙門氏菌、彎曲桿菌和梭狀芽孢桿菌)或者由于原生動(dòng)物感染引起的腹瀉、或者旅行者腹瀉(例如諾瓦克病毒或者輪狀病毒)。炎癥性腹瀉的實(shí)例包括，但不限于，吸收不良綜合征、熱帶口炎性腹瀉、慢性胰腺炎、克隆氏疾病、痢疾和腸易激綜合征。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的肽可以被用于治療或者預(yù)防涉及胃腸病癥的緊急狀況或者威脅生命的狀況，例如，在手術(shù)后或者由于霍亂導(dǎo)致的狀況。進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物可以被用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的腸功能紊亂，尤其是在惡病質(zhì)中。本發(fā)明的化合物也可以用于抑制小腸液和電解質(zhì)分泌，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，以及增加胃腸道內(nèi)的細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)例如脂肪組織中的脂解，以及調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的血流。
本發(fā)明的化合物也可以用于通過(guò)它們的胃腸保護(hù)活性治療或者預(yù)防上述狀況。因此，本發(fā)明的化合物可以用于治療胃腸或者粘膜破壞。示例的破壞類型包括，但不限于，炎癥性腸疾病、腸萎縮、以腸粘膜或者腸粘膜功能受損為特征的狀況、以及胃腸道的其它狀況，包括那些可能通過(guò)暴露于細(xì)胞毒性劑、輻射、毒性、感染和/或損傷引起的狀況。而且，本發(fā)明的這些化合物可以與止痛劑、抗炎劑、生長(zhǎng)激素、肝素、或者可能用于治療炎性腸病或者上面所列的其它狀況的任何其它治療法組合。
進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物可以用于治療或者預(yù)防可以通過(guò)它們的抗分泌特性減輕或者改善的疾病或者病癥。這樣的抗分泌特性包括抑制胃分泌和/或胰分泌，并且可以用于治療或者預(yù)防以下疾病和病癥，包括胃炎、胰腺炎、巴雷特食道和胃食道反流疾病。這些疾病也可以通過(guò)本發(fā)明所述化合物的胃腸保護(hù)功能治療或者預(yù)防。
本發(fā)明的化合物也可以用于降低對(duì)象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的鋁濃度，以便治療或者預(yù)防與鋁濃度異常相關(guān)的疾病或者狀況(例如阿爾茨海默病患者，或者存在患阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)的患者，透析性癡呆患者，或者由于職業(yè)保留引起鋁水平增加的患者)。
本發(fā)明也涉及藥物組合物，其包括治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的至少一種PPF多肽，或者其藥學(xué)可接受的鹽，以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或可用于送遞PPF多肽的載體。
參考下述優(yōu)選的實(shí)施方案和詳細(xì)描述，可以更加清楚地理解本發(fā)明的這些和其它方面。
附圖簡(jiǎn)述

圖1證明了本發(fā)明的某些PPF多肽在食物攝取測(cè)定中的活性。
圖2證明了本發(fā)明的其它PPF多肽在食物攝取測(cè)定中的活性。
圖3證明了本發(fā)明的其它PPF多肽在食物攝取測(cè)定中的活性。
圖4證明了本發(fā)明的其它PPF多肽在食物攝取測(cè)定中的活性。
圖5證明了本發(fā)明的某些PPF多肽在DIO小鼠模型中的活性。
圖6證明了本發(fā)明的其它PPF多肽在DIO小鼠模型中的活性。
圖7說(shuō)明了大鼠的體重增加。
圖8證明了與PYY(3-36)相比，本發(fā)明的一種PPF多肽在食物攝取測(cè)定和DIO小鼠模型中的活性。
圖9A-9D證明了與PYY和PYY(3-36)相比，本發(fā)明的PPF多肽對(duì)于心率和血壓的作用。
圖10證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃酸分泌的活性。
圖11證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃酸分泌的活性。
圖12證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖13證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖14證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖15證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖16證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖17證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃排空的活性。
圖18證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)膽囊排空的活性。
圖19證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)膽囊排空的活性。
圖20證明了本發(fā)明的PPF多肽對(duì)胃粘膜保護(hù)的活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽，其與PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。本發(fā)明的PPF多肽也包括至少兩個(gè)PPF基序，所述基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序，和C末端尾PPF基序。本發(fā)明的其它PPF基序可能與PP家族多肽中的任何多肽的基序相對(duì)應(yīng)，包括PP、PYY和NPY，例如PYY的II型-轉(zhuǎn)角區(qū)域基序，或者PYY的C末端上的α-螺旋基序。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽可能不包括任何非天然氨基酸。
本發(fā)明也涉及可以在代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防中有用的PPF多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與天然的人PP、PYY、PYY(3-36)或者NPY相比，本發(fā)明的PPF多肽可能在代謝狀況和紊亂的治療和/或預(yù)防中具有有可比較的或更高的效能?；蛘?，與PP、PYY、PYY(3-36)或NPY相比，本發(fā)明的優(yōu)選的PPF多肽可能表現(xiàn)出較低效能，但可能具有其它期望的特性，如改進(jìn)的制造簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、和/或容易制劑化。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，不受理論的限制，認(rèn)為給對(duì)象外周施用本發(fā)明的新穎PPF多肽可降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性，因此在肥胖癥和相關(guān)的代謝狀況或者紊亂的治療和預(yù)防中有用。同樣地，本發(fā)明提供了PPF多肽組合物，以及使用這些組合物來(lái)降低有需要的對(duì)象的營(yíng)養(yǎng)物可利用性的方法，這些方法用于治療和預(yù)防可以從營(yíng)養(yǎng)物可利用性的降低中獲益的代謝狀況或者紊亂。這些方法可用于治療，例如肥胖癥、糖尿病，包括但不限于2型或者非胰島素依賴型糖尿病、進(jìn)食紊亂、胰島素抵抗綜合征和心血管疾病。
各部分的標(biāo)題在此處僅僅是用于組織目的，不應(yīng)該以任何方式解釋為限制所描述的主題。
本發(fā)明的PPF多肽及PPF基序正如上面所討論的，本發(fā)明至少部分地涉及新穎的PPF多肽，其包括至少兩個(gè)PPF基序，其中至少兩個(gè)PPF基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序。本發(fā)明的PPF多肽與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。本發(fā)明的多肽將優(yōu)選至少部分保留天然的人PP、PYY或者NPY的生物活性，例如本發(fā)明的多肽將通常是PP、PYY和/或NPY激動(dòng)劑或者拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽將在代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防中表現(xiàn)出生物活性。進(jìn)一步，本發(fā)明的PPF多肽可能包括內(nèi)部接頭化合物，可能包括內(nèi)部氨基酸殘基上的化學(xué)修飾，或者可能在N末端或者C末端殘基上進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽僅僅包括天然的L型氨基酸殘基和/或修飾的天然L型氨基酸殘基?；蛘?，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不包括非天然氨基酸殘基。
本發(fā)明的PPF基序可能與天然PP家族多肽，包括PP、PYY和NPY的任何多肽的任何基序相對(duì)應(yīng)?！癙PF基序”通常是天然PP家族多肽的結(jié)構(gòu)組分，即一級(jí)、二級(jí)或者三級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)組分對(duì)于生物活性很重要，即生物活性在不存在所述基序或者破壞基序的情況下被顯著降低。優(yōu)選的PPF基序包括天然PP家族多肽的N末端聚脯氨酸II型基序，天然PP家族多肽的II型β-轉(zhuǎn)角基序，天然PP家族多肽的C末端上的α-螺旋基序，和天然PP家族多肽的C末端尾基序。更特別地，在N末端聚脯氨酸區(qū)域中，對(duì)應(yīng)于天然PP家族多肽的第5殘基和第8殘基的氨基酸一般是保守的，為脯氨酸。II型-轉(zhuǎn)角基序?qū)⑼ǔ０ㄅc天然PP家族多肽的殘基12-14相對(duì)應(yīng)的氨基酸。α-螺旋基序可能通常從對(duì)應(yīng)于天然PP家族多肽的大約14位殘基的氨基酸延伸到任何位點(diǎn)，最多延伸到C末端，包括C末端，只要α-螺旋基序包括足夠數(shù)量的氨基酸殘基，這樣α-螺旋轉(zhuǎn)角就可以在溶液中形成。α-螺旋基序也可以包括天然PP家族序列的氨基酸取代、插入和缺失，只要α-螺旋轉(zhuǎn)角仍然在溶液中形成。C末端尾基序通常包括對(duì)應(yīng)于天然PP家族多肽的大約最后10個(gè)殘基的氨基酸，更優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于天然PP家族多肽的最后7、6或者5個(gè)殘基，更優(yōu)選對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基32-35。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽不包括任何非天然氨基酸殘基，進(jìn)一步的前提是本發(fā)明的PPF多肽不包括任何天然PPF多肽(例如PP，NPY(1-36)，NPY(3-36)，PYY(1-36)，PYY(3-36)，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(3-36)，或者PP(4-36))。本發(fā)明的PPF多肽也優(yōu)選地不包括Tyr1hPP，Lys4hPP，Asn7hPP，Arg19hPP，Tyr21hPP，Glu21hPP，Ala23hPP，Gln23hPP，Gln34hPP，Phe6Arg19hPP，Phe6Tyr21hPP，Phe6Glu21hPP，Phe6Ala23hPP，Phe6Gln23hPP，Pro13Ala14hPP，Ile31Gln34PP，Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP，Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP，Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP(2-36)，Ala1NPY，Tyr1NPY，Ala2NPY，Leu2NPY，Phe2NPY，His2NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Tyr7pNPY，Ala7NPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Gly12NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Gly18NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala20NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Gly23NPY，Ala24NPY，Trp24pNPY，Ala25NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Ala27NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Ala29NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Phe30NPY，Ala31NPY，Trp31pNPY，Ala32NPY，Trp32NPY，Ala33NPY，Lys33NPY，Ala34NPY，Pro34NPY，Leu34NPY，Ala35NPY，Lys35NPY，Ala36NPY，Phe36NPY，His36NPY，Glu4Pro34pNPY，Arg6Pro34pNPY，Phe6Pro34pNPY，Cys6Pro34pNPY，Asn6Pro34pNPY，Phe7Pro34pNPY，Arg7Pro34pNPY，Cys7Pro34pNPY，Asp7Pro34pNPY，Phe8Pro34pNPY，Arg8Pro34pNPY，Cys8Pro34pNPY，Asp8Pro34pNPY，Asn8Pro34pNPY，Pro11Pro34pNPY，Ser13Pro14pNPY，Trp24，31pNPY，Ala31Pro32pNPY，Cys31Pro34pNPY，Leu31Pro34NPY，Phe32Pro34pNPY，Ala21，25Pro34pNPY，Pro11Tyr13Pro14Pro34pNPY，Ahx(9-22)pNPY，Ahx(9-17)pNPY，des-AA(10-20)-Cys7，21Pro34-pNPY，des-AA(10-17)-pNPY，des-AA(10-17)-Cys2，27-pNPY，des-AA(10-17)-Ala7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Cys7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY，des-AA(10-17)Cys7，21Pro34pNPY，des-AA(10-17)Glu7Lys21Pro34pNPY，des-AA(10-17)Cys7，21Leu31Pro34pNPY，des-AA(11-17)Cys7，21Pro34pNPY，Pro34PYY，His34PYY，Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，Leu31Pro34PYY，F(xiàn)MS-PYY，F(xiàn)MS-PYY(3-36)，F(xiàn)moc-PYY，F(xiàn)moc-PYY(3-36)，F(xiàn)MS2-PYY，F(xiàn)MS2-PYY(3-36)，F(xiàn)moc2-PYY，F(xiàn)moc2-PYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(1-17)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP，hPP(1-17)-His34pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(19-23)-hPP，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-His34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6His34hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(21-23)-Pro34-pNPY，cPP(22-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-Pro34-pNPY，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7，20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP，或者cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Ser32hPYY(3-36)，Lys33hPYY(3-36)，Asn34hPYY(3-36)，Lys35hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Ser32hPYY(3-36)，Lys25Lys33hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Lys35hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Ser32hPYY(3-36)，Thr27Lys33hPYY(3-36)，Thr27Asn34hPYY(3-36)，Thr27Lys35hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Ser32hPYY(3-36)，Phe27Lys33hPYY(3-36)，Phe27Asn34hPYY(3-36)，Phe27Lys35hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29ne30hPYY(3-36)，Gln29Ser32hPYY(3-36)，Gln29Leu33hPYY(3-36)，Gln29Asn34hPYY(3-36)，Gln29Leu35hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Ser32hPYY(3-36)，Ile30Lys33hPYY(3-36)，Ile30Asn34hPYY(3-36)，Ile30Lys35hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Ser32hPYY(3-36)，Val30Lys33hPYY(3-36)，Val30Asn34hPYY(3-36)，Val30Lys35hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Ser32hPYY(3-36)，Ile31Lys33hPYY(3-36)，Ile31Asn34hPYY(3-36)，Ile31Lys35hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Ser32hPYY(3-36)，Leu31Lys33hPYY(3-36)，Leu31Asn34hPYY(3-36)，Leu31Lys35hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Ser32Lys33hPYY(3-36)，Ser32Asn34hPYY(3-36)，Ser32Lys35hPYY(3-36)，Ser32Thr36hPYY(3-36)，Ser32Phe36hPYY(3-36)，Lys33Asn34hPYY(3-36)，Lys33Lys35hPYY(3-36)，Lys33Thr36hPYY(3-36)，Lys33Phe36hPYY(3-36)，Asn34Lys35hPYY(3-36)，Asn34Phe36hPYY(3-36)，Lys35Thr36hPYY(3-36)，Lys35Phe36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Ser32hPYY(4-36)，Lys33hPYY(4-36)，Asn34hPYY(4-36)，Lys35hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Ser32hPYY(4-36)，Lys25Lys33hPYY(4-36)，Lys25Asn24hPYY(4-36)，Lys25Lys35hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Ser32hPYY(4-36)，Thr27Lys33hPYY(4-36)，Thr27Asn34hPYY(4-36)，Thr27Lys35hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Ser32hPYY(4-36)，Phe27Lys33hPYY(4-36)，Phe27Asn34hPYY(4-36)，Phe27Lys35hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Ser32，hPYY(4-36)Gln29Leu33hPYY(4-36)，Gln29Asn34hPYY(4-36)，Gln29Leu35hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Ser32hPYY(4-36)，Ile30Lys33hPYY(4-36)，Ile30Asn34hPYY(4-36)，Ile30Lys35hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Ser32hPYY(4-36)，Val30Lys33hPYY(4-36)，Val30Asn34hPYY(4-36)，Val30Lys35hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Ser32hPYY(4-36)，Ile31Lys33hPYY(4-36)，Ile31Asn34hPYY(4-36)，Ile31Lys35hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Ser32hPYY(4-36)，Val31Lys33hPYY(4-36)，Leu31Asn34hPYY(4-36)，Leu31Lys35hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Ser32Lys33hPYY(4-36)，Ser32Asn34hPYY(4-36)，Ser32Lys35hPYY(4-36)，Ser32Thr36hPYY(4-36)，Ser32Phe36hPYY(4-36)，Lys33Asn34hPYY(4-36)，Lys33Lys35hPYY(4-36)，Lys33Thr36hPYY(4-36)，Lys33Phe36hPYY(4-36)，Asn34Lys35hPYY(4-36)，Asn34Phe36hPYY(4-36)，Lys35Thr36hPYY(4-36)，Lys35Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Ser32hPYY(5-36)，Lys33hPYY(5-36)，Asn34hPYY(5-36)，Lys35hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Ser32hPYY(5-36)，Lys25Lys33hPYY(5-36)，Lys25Asn24hPYY(5-36)，Lys25Lys35hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Ser32hPYY(5-36)，Thr27Lys33hPYY(5-36)，Thr27Asn34hPYY(5-36)，Thr27Lys35hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Ser32hPYY(5-36)，Phe27Lys33hPYY(5-36)，Phe27Asn34hPYY(5-36)，Phe27Lys35hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Ser32，hPYY(5-36)Gln29Leu33hPYY(5-36)，Gln29Asn34hPYY(5-36)，Gln29Leu35hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Ser32hPYY(5-36)，Ile30Lys33hPYY(5-36)，Ile30Asn34hPYY(5-36)，Ile30Lys35hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Ser32hPYY(5-36)，Val30Lys33hPYY(5-36)，Val30Asn34hPYY(5-36)，Val30Lys35hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Ser32hPYY(5-36)，Ile31Lys33hPYY(5-36)，Ile31Asn34hPYY(5-36)，Ile31Lys35hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Ser32hPYY(5-36)，Val31Lys33hPYY(5-36)，Leu31Asn34hPYY(5-36)，Leu31Lys35hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Ser32Lys33hPYY(5-36)，Ser32Asn34hPYY(5-36)，Ser32Lys35hPYY(5-36)，Ser32Thr36hPYY(5-36)，Ser32Phe36hPYY(5-36)，Lys33Asn34hPYY(5-36)，Lys33Lys35hPYY(5-36)，Lys33Thr36hPYY(5-36)，Lys33Phe36hPYY(5-36)，Asn34Lys35hPYY(5-36)，Asn34Phe36hPYY(5-36)，Lys35Thr36hPYY(5-36)，或者Lys35Phe36hPYY(5-36)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽不包括任何非天然氨基酸殘基，并且優(yōu)選地包括hPYY的C末端尾基序。C末端尾基序可能優(yōu)選地包括hPYY的氨基酸殘基32-35，例如Thr，Arg，Gln，Arg(SEQID NO351)。在這樣的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽不包括任何天然的PPF多肽(例如NPY(1-36)，NPY(3-36)，PYY(1-36)，PYY(3-36))，NPY(2-36)，PYY(4-36)，PYY(5-36))，(2-36)NPY，(2-36)PYY，Gln34hPP，Ile31Gln34PP，Ala1NPY，Tyr1NPY，Ala2NPY，Leu2NPY，Phe2NPY，His2NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Tyr7pNPY，Ala7NPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Gly12NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Gly18NPYAla19NPY，Lys19NPY，Ala20NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Gly23NPY，Ala24NPY，Trp24pNPY，Ala25NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Ala27NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Ala29NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Phe30NPY，Ala31NPY，Trp31pNPY，Ala36NPY，Phe36NPY，His36NPY，Ahx(9-22)pNPY，Ahx(9-17)pNPY，des-AA(10-17)-pNPY，des-AA(10-17)-Cys2，27-pNPY des-AA(10-17)-Ala7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Cys7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY，Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，F(xiàn)MS-PYY，F(xiàn)MS-PYY(3-36)，F(xiàn)moc-PYY，F(xiàn)moc-PYY(3-36)，F(xiàn)MS2-PYY，F(xiàn)MS2-PYY(3-36)，F(xiàn)moc2-PYY，F(xiàn)moc2-PYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-pNPY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-pNPY，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，或者pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP。
在另一方面，包括hPYY的C末端尾基序的本發(fā)明的這樣的PPF多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽不包括WO 03/026591和WO 03/057235中公開的那些與PPF相關(guān)的多肽，這兩份專利被完整地引入于此作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽的長(zhǎng)度是至少34個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，PPF多肽的長(zhǎng)度可以是至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或者33個(gè)氨基酸。進(jìn)一步，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽僅僅包括天然的L型氨基酸殘基，和/或修飾的天然L型氨基酸殘基?；蛘?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不包括非天然氨基酸殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽可能與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本發(fā)明的這樣的PPF多肽也可能與天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF多肽可能與天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。
更特別地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及新穎的PPF多肽，其包括至少兩個(gè)PPF基序，其中至少兩個(gè)PPF基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序，并且該P(yáng)PF多肽不包括任何非天然氨基酸殘基。本發(fā)明的這樣的PPF多肽與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的PPF多肽具有至少34個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF多肽可與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本發(fā)明的這樣的PPF多肽也可與天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF多肽也可與天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。
另一方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PYY類似物多肽。仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的一個(gè)片段，該片段共價(jià)連接到PP、PYY或者NPY多肽的至少一個(gè)額外的片段上，其中每一個(gè)PP、PYY或者NPY片段包括一個(gè)PPF基序。本發(fā)明的這樣的PPF類似物多肽和PPF嵌合多肽與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF多肽可能與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本發(fā)明的PPF多肽也可與天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF多肽與天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，期望的PPF多肽可能不包括與C末端NPY片段組合的N末端PP片段。
作為背景，PYY、NPY和PP構(gòu)成C末端酰胺化肽家族，參與胃腸功能、血壓和給食行為的調(diào)節(jié)。不受理論的限制，這些肽選擇性地結(jié)合并且激活Y受體亞型的能力被認(rèn)為強(qiáng)烈地依賴于穩(wěn)定的溶液結(jié)構(gòu)，包括所謂的“PP-折疊”。表1(下面)顯示了已知受體上的PP家族配體效能，和多個(gè)配體的效能的排名次序。
表1 PP家族受體的受體藥理學(xué)總結(jié)
研究已經(jīng)建議Y受體親和力的差異與二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。例如參見Keire等人，Biochemistry 2000，39，9935-9942。天然的豬PYY的特征在于，包括兩個(gè)位于殘基17-22和殘基25-33的C末端螺旋狀片段，其通過(guò)一個(gè)位于殘基23、24和25上的結(jié)，一個(gè)圍繞在殘基12-14周圍的轉(zhuǎn)角，和殘基30和31附近折疊的N末端而分離。進(jìn)一步，全長(zhǎng)豬PYY的特征在于，包括PP折疊，其通過(guò)N和C末端上的殘基之間的疏水相互作用穩(wěn)定。參見上文引用的文獻(xiàn)。
“PP”是指，從任何物種獲得或者來(lái)源的胰肽多肽。因此術(shù)語(yǔ)“PP”包括人全長(zhǎng)，如SEQ ID NO1中所示的36個(gè)氨基酸的肽，以及PP的物種變體，包括，例如鼠科動(dòng)物、倉(cāng)鼠、雞、牛、大鼠和狗PP。在這個(gè)意義上，“PP”，“野生型PP”，和“天然PP”，即未修飾的PP，可以互換使用。
“NPY”是指從任何物種獲得或者來(lái)源的神經(jīng)肽Y多肽。因此，術(shù)語(yǔ)“NPY”包括人全長(zhǎng)，如SEQ ID NO4中所示的36個(gè)氨基酸的肽，以及NPY的物種變體，包括例如鼠科動(dòng)物、倉(cāng)鼠、雞、牛、大鼠和狗NPY。在這個(gè)意義上，“NPY”，“野生型NPY”，和“天然NPY”，即未修飾的NPY，可以互換使用。
“PYY”是指從任何物種獲得或者來(lái)源的肽YY多肽。因此，術(shù)語(yǔ)“PYY”包括人全長(zhǎng)，如SEQ ID NO2中所示的36個(gè)氨基酸的肽，以及NPY的物種變體，包括例如鼠科動(dòng)物、倉(cāng)鼠、雞、牛、大鼠和狗PYY。在這個(gè)意義上，“PYY”和“野生型NPY”和“天然NPY”，即未修飾的NPY，可以互換使用。在本發(fā)明的上下文中，參考本發(fā)明的PYY類似物多肽所討論的所有修飾都基于天然的人PYY的36個(gè)氨基酸的序列(SEQ ID NO2)。
“PP激動(dòng)劑”、“PYY激動(dòng)劑”或者“NPY激動(dòng)劑”是指分別引起天然的人PP、PYY或NPY的生物活性的化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)是指，引起營(yíng)養(yǎng)物可利用性降低的生物效應(yīng)的化合物，這與天然的人PP、PYY或NPY引起的生物效應(yīng)類似，例如這樣的化合物(1)在食物攝取、胃排空、胰分泌或者體重減輕測(cè)定中具有與天然的人PP、PYY或NPY類似的活性，和(2)在Y受體測(cè)定中，或者在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定中與來(lái)自某些組織的標(biāo)記的PP、PYY、PYY(3-36)或者NPY特異性地結(jié)合，所述某些組織具有Y受體的冗余，包括例如最后區(qū)的冗余。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，激動(dòng)劑不是PP、PYY、PYY(3-36)和/或NPY。優(yōu)選地，激動(dòng)劑將在這樣的測(cè)定法中以大于1μM的親和力結(jié)合，更優(yōu)選地以大于1-5nm的親和力結(jié)合。這樣的激動(dòng)劑可以包括具有PPF基序的多肽，PP、PYY或NPY的活性片段、或者小化學(xué)分子。
“氨基酸”和“氨基酸殘基”是指，天然氨基酸、非天然氨基酸和修飾的氨基酸。除非有相反的說(shuō)明，提到任何氨基酸，一般地或者特別地通過(guò)名稱提到，包括D型和L型立體異構(gòu)體，前體是它們的結(jié)構(gòu)允許這樣的立體異構(gòu)體形式。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。非天然氨基酸包括，但不限于，高賴氨酸、高精氨酸、鈴蘭氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基異丁酸、鎖鏈素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羥基賴氨酸、別羥賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基纈氨酸、萘丙氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、戊基甘氨酸、六氫吡啶羧酸、硫脯氨酸、肌氨酸和瓜氨酸。其它的非天然氨基酸包括修飾的氨基酸殘基，它們被可逆或者不可逆地化學(xué)阻斷，或者在它們的N末端氨基基團(tuán)或者它們的側(cè)鏈基團(tuán)上被化學(xué)地修飾，例如，N-甲基化D型和L型氨基酸或者殘基，其中側(cè)鏈官能團(tuán)被化學(xué)修飾為另一個(gè)官能團(tuán)。例如，修飾的氨基酸包括甲硫氨酸亞砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲酯)，即天冬氨酸的修飾的氨基酸；N-乙基甘氨酸，即甘氨酸的修飾的氨基酸；或者丙氨酸羧酰胺，即丙氨酸的修飾的氨基酸?？梢员灰氲钠渌鼩埢枋鲈赟andberg等人，J.Med.Chem.412481-91，1998中。
“Ahx”是指6-氨基己酸。
PPF中的肽的某些人序列如下(以傳統(tǒng)的單字母氨基酸代碼表示)PPAPLEPVYPGD NATPEQMAQY AADLRRYINM LTRPRY(SEQ ID NO1)PYYYPIKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY(SEQ ID NO2)PYY(3-36)IKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY(SEQ ID NO3)NPYYPSKPDNPGE DAPAEDMARY YSALRHYINL ITRQRY(SEQ ID NO4)人PYY的物種同源序列包括SEQ ID NOs.7-29的那些氨基酸序列。
正如上面所提及的，當(dāng)在生理上表達(dá)時(shí)，這些肽在C末端被酰胺化，但不需要針對(duì)本發(fā)明的目的。換句話說(shuō)，這些肽的C末端，以及本發(fā)明的PPF多肽，可能具有一個(gè)游離的-OH或者-NH2基團(tuán)。這些肽也可能具有其它翻譯后修飾。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，本發(fā)明的PPF多肽也可以用N末端甲硫氨酸殘基構(gòu)建。
本發(fā)明的優(yōu)選的PPF包括式(I)的PPF多肽(SEQ ID NO30)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28Xaa29Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser，Thr或者不存在；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，Asp，或者不存在；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高Ser；Xaa14是Pro，Ala，高-Pro，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser，或者Thr；
Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Asp，Thr，或者高絲氨酸；Xaa25是Arg，高精氨酸，Lys，高賴氨酸，Orn，或者Cit；Xaa26是His，Ala，Arg，高精氨酸，高賴氨酸，Orn，或者Cit；Xaa27是Tyr或者Phe；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa29是Asn或者Gln；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述PPF多肽不是天然的PPF多肽，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(4-36)，Ala1NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，Tyr1NPY，Ala7NPY或者h(yuǎn)PP(19-23)-pNPY。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式I的PPF多肽也不包括Phe27hPYY(3-36)，Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Gln29hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Lys25Phe27hPYY(3-36)，Lys25Ile28hPYY(3-36)，Lys25Val28hPYY(3-36)，Lys25Gln29hPYY(3-36)，Lys25Val30hPYY(3-36)，Lys25Ile31hPYY(3-36)，Lys25Leu31hPYY(3-36)，Lys25Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile28hPYY(3-36)，Phe27Val28hPYY(3-36)，Phe27Gln29hPYY(3-36)，Phe27Val30hPYY(3-36)，Phe27Ile31hPYY(3-36)，Phe27Leu31hPYY(3-36)，Phe27Phe36hPYY(3-36)，Gln29Val30hPYY(3-36)，Gln29Ile31hPYY(3-36)，Gln29Leu31hPYY(3-36)，Gln29Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到的，式I的多肽可以是游離酸的形式，或者可以在C末端被酰胺化。
本發(fā)明的PYY類似物多肽本發(fā)明的PYY類似物多肽將通常包括至少兩個(gè)PPF基序，其包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序，并且通常將至少部分地保留天然的人PYY的生物活性，例如本發(fā)明的PYY類似物多肽將通常是PYY激動(dòng)劑。而且，PYY類似物多肽將與PYY(3-36)具有至少50％的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽將在代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防中表現(xiàn)出PYY活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括任何非天然氨基酸殘基，并且進(jìn)一步的前提是，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括任何天然PYY多肽或者其1-4N末端缺失(例如PYY(1-36)，PYY(2-36)，PYY(3-36))，PYY(4-36))。本發(fā)明的PYY類似物多肽也優(yōu)選地不包括Pro34PYY，His34PYY Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，Leu31Pro34PYY，F(xiàn)MS-PYY，F(xiàn)MS-PYY(3-36)，F(xiàn)moc-PYY，F(xiàn)moc-PYY(3-36)，F(xiàn)MS2-PYY，F(xiàn)MS2-PYY(3-36)，F(xiàn)moc2-PYY，或者Fmoc2-PYY(3-36)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PYY類似物多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hhPYY(3-36)，Ser32hPYY(3-36)，Lys33hPYY(3-36)，Asn34hPYY(3-36)，Lys35hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Ser32hPYY(3-36)，Lys25Lys33hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Lys35hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Ser32hPYY(3-36)，Thr27Lys33hPYY(3-36)，Thr27Asn34hPYY(3-36)，Thr27Lys35hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Ser32hPYY(3-36)，Phe27Lys33hPYY(3-36)，Phe27Asn34hPYY(3-36)，Phe27Lys35hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Ser32hPYY(3-36)，Gln29Leu33hPYY(3-36)，Gln29Asn34hPYY(3-36)，Gln29Leu35hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Ser32hPYY(3-36)，Ile30Lys33hPYY(3-36)，Ile30Asn34hPYY(3-36)，Ile30Lys35hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Ser32hPYY(3-36)，Val30Lys33hPYY(3-36)，Val30Asn34hPYY(3-36)，Val30Lys35hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Ser32hPYY(3-36)，Ile31Lys33hPYY(3-36)，Ile31Asn34hPYY(3-36)，Ile31Lys35hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Ser32hPYY(3-36)，Leu31Lys33hPYY(3-36)，Leu31Asn34hPYY(3-36)，Leu31Lys35hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Ser32Lys33hPYY(3-36)，Ser32Asn34hPYY(3-36)，Ser32Lys35hPYY(3-36)，Ser32Thr36hPYY(3-36)，Ser32Phe36hPYY(3-36)，Lys33Asn34hPYY(3-36)，Lys33Lys35hPYY(3-36)，Lys33Thr36hPYY(3-36)，Lys33Phe36hPYY(3-36)，Asn34Lys35hPYY(3-36)，Asn34Phe36hPYY(3-36)，Lys35Thr36hPYY(3-36)，Lys35Phe36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Ser32hPYY(4-36)，Lys33hPYY(4-36)，Asn34hPYY(4-36)，Lys35hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Ser32hPYY(4-36)，Lys25Lys33hPYY(4-36)，Lys25Asn24hPYY(4-36)，Lys25Lys35hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Ser32hPYY(4-36)，Thr27Lys33hPYY(4-36)，Thr27Asn34hPYY(4-36)，Thr27Lys35hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Ser32hPYY(4-36)，Phe27Lys33hPYY(4-36)，Phe27Asn34hPYY(4-36)，Phe27Lys35hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Ser32hPYY(4-36)，Gln29Leu33hPYY(4-36)，Gln29Asn34hPYY(4-36)，Gln29Leu35hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Ser32hPYY(4-36)，Ile30Lys33hPYY(4-36)，Ile30Asn34hPYY(4-36)，Ile30Lys35hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Ser32hPYY(4-36)，Val30Lys33hPYY(4-36)，Val30Asn34hPYY(4-36)，Val30Lys35hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Ser32hPYY(4-36)，Ile31Lys33hPYY(4-36)，Ile31Asn34hPYY(4-36)，Ile31Lys35hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Ser32hPYY(4-36)，Val31Lys33hPYY(4-36)，Leu31Asn34hPYY(4-36)，Leu31Lys35hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Ser32Lys33hPYY(4-36)，Ser32Asn34hPYY(4-36)，Ser32Lys35hPYY(4-36)，Ser32Thr36hPYY(4-36)，Ser32Phe36hPYY(4-36)，Lys33Asn34hPYY(4-36)，Lys33Lys35hPYY(4-36)，Lys33Thr36hPYY(4-36)，Lys33Phe36hPYY(4-36)，Asn34Lys35hPYY(4-36)，Asn34Phe36hPYY(4-36)，Lys35Thr36hPYY(4-36)，Lys35Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Ser32hPYY(5-36)，Lys33hPYY(5-36)，Asn34hPYY(5-36)，Lys35hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Ser32hPYY(5-36)，Lys25Lys33hPYY(5-36)，Lys25Asn24hPYY(5-36)，Lys25Lys35hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Ser32hPYY(5-36)，Thr27Lys33hPYY(5-36)，Thr27Asn34hPYY(5-36)，Thr27Lys35hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Ser32hPYY(5-36)，Phe27Lys33hPYY(5-36)，Phe27Asn34hPYY(5-36)，Phe27Lys35hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Ser32，hPYY(5-36)，Gln29Leu33hPYY(5-36)，Gln29Asn34hPYY(5-36)，Gln29Leu35hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Ser32hPYY(5-36)，Ile30Lys33hPYY(5-36)，Ile30Asn34hPYY(5-36)，Ile30Lys35hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Ser32hPYY(5-36)，Val30Lys33hPYY(5-36)，Val30Asn34hPYY(5-36)，Val30Lys35hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Ser32hPYY(5-36)，Ile31Lys33hPYY(5-36)，Ile31Asn34hPYY(5-36)，Ile31Lys35hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Ser32hPYY(5-36)，Val31Lys33hPYY(5-36)，Leu31Asn34hPYY(5-36)，Leu31Lys35hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Ser32Lys33hPYY(5-36)，Ser32Asn34hPYY(5-36)，Ser32Lys35hPYY(5-36)，Ser32Thr36hPYY(5-36)，Ser32Phe36hPYY(5-36)，Lys33Asn34hPYY(5-36)，Lys33Lys35hPYY(5-36)，Lys33Thr36hPYY(5-36)，Lys33Phe36hPYY(5-36)，Asn34Lys35hPYY(5-36)，Asn34Phe36hPYY(5-36)，Lys35Thr36hPYY(5-36)，或者Lys35Phe36hPYY(5-36)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括任何非天然氨基酸殘基，并且優(yōu)選地包括hPYY的C末端尾基序。C末端基序可能優(yōu)選地包括hPYY的氨基酸殘基32-35，例如Thr，Arg，Gln，Arg(SEQ ID NO351)。在這樣的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括任何天然PFF多肽或者其1-4N末端缺失(例如PYY(1-36)，PYY(2-36)，PYY(3-36)和PYY(4-36))。這樣的PYY類似物也優(yōu)選地不包括Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，F(xiàn)MS-PYY，F(xiàn)MS-PYY(3-36)，F(xiàn)moc-PYY，F(xiàn)moc-PYY(3-36)，F(xiàn)MS2-PYY，F(xiàn)MS2-PYY(3-36)，F(xiàn)moc2-PYY，或者Fmoc2-PYY(3-36)。
另一方面，包括hPYY的C末端尾基序的本發(fā)明的這樣的PYY類似物多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，或者Leu31Phe36hPYY(5-36)。
本發(fā)明的PYY類似物多肽的長(zhǎng)度優(yōu)選地也是至少34個(gè)氨基酸。進(jìn)一步，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽僅僅包括天然L氨基酸殘基和/或修飾的天然L氨基酸殘基?；蛘?，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括非天然氨基酸殘基。
更特別地，一方面，本發(fā)明涉及PYY類似物多肽，其包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列修飾。這樣的修飾包括取代、插入和/或缺失，單獨(dú)或者組合都可以。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的PYY類似物多肽包括“非必需”氨基酸殘基的一個(gè)或者多個(gè)修飾。在本發(fā)明的上下文中，“非必需”氨基酸殘基是在天然的人PYY氨基酸序列中可以被改變的氨基酸殘基，即被缺失或者取代，不會(huì)破壞或者顯著降低PYY類似物多肽的PYY激動(dòng)劑活性。優(yōu)選地，關(guān)于降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性，本發(fā)明的PYY類似物多肽保留至少大約25％的天然的人PYY的生物活性，優(yōu)選地是大約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽表現(xiàn)出改進(jìn)的PYY激動(dòng)劑活性。優(yōu)選地，就降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性而言，本發(fā)明的PYY類似物多肽表現(xiàn)出至少大約110％、125％、130％、140％、150％、200％、或更高的天然的人PYY的生物活性。
優(yōu)選的PYY類似物多肽是在此處描述的測(cè)定(優(yōu)選地是食物攝取、胃排空、胰分泌、或者體重減輕測(cè)定)之一中具有效能的PYY類似物多肽，所述效能等于或者大于相同測(cè)定中NPY、PYY或者PYY(3-36)的效能?；蛘撸cPP、NPY、PYY或者PYY(3-36)相比，本發(fā)明的優(yōu)選的PYY類似物多肽可能表現(xiàn)出改進(jìn)的易于制造性、穩(wěn)定性、和/或制劑化簡(jiǎn)單。
取代在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)取代，單獨(dú)地，或者與一個(gè)或者多個(gè)插入或者缺失一起。優(yōu)選地，取代不會(huì)破壞或者顯著降低PYY類似物多肽的PYY激動(dòng)劑活性。一方面，本發(fā)明涉及PYY類似物多肽，其在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中，具有單個(gè)取代、或者多于一個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)的或者不連續(xù)的取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的PYY類似物多肽包括一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)氨基酸取代。
優(yōu)選地，PYY的螺旋C末端區(qū)域上(例如，殘基20，24，25，27和29)的天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基，尾末端殘基(32-36)，和/或5和8位的N末端脯氨酸沒有被取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的32到36位，氨基酸殘基沒有被取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在選自5、7、8、20、24、25、27、29、32、33、34、35、36或者其任意組合的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸序列位置上，天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基沒有被取代。
優(yōu)選的取代包括保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈或者物理化學(xué)特征(例如靜電、氫鍵鍵合、電子等排、疏水特征)的氨基酸殘基取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)，β-支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以包括一個(gè)或者多個(gè)非天然氨基酸和/或非氨基酸的取代，例如氨基酸模擬物，取代到PYY(SEQ ID NO2)的序列中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的非氨基酸可以是β-轉(zhuǎn)角模擬物或者接頭分子，如-NH-X-CO-，其中X＝(CH2)n(其中n可以是2-20)或者-NH-CH2CH2(-O-CH2CH2-O-)m-CH2-CO-(其中m＝1-5)。優(yōu)選的接頭分子包括氨基己酰基(“Aca”)、β-丙氨酰基和8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基。β-轉(zhuǎn)角模擬物可以商購(gòu)獲得(BioQuadrant Inc，Quebec，Canada)，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中有所描述(Hanessian等人，Tetrahedron12789-854(1997)；Gu等人，Tetrahedron Letters 445863-6(2003)；Bourguet等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 131561-4(2003)；Grieco等人，Tetrahedron Letters 436297-9(2002)；Souers等人，Tetrahedron 577431-48(2001)；Tsai等人，Bioorganic & MedicinalChemistry 729-38(1999)；Virgilio等人，Tetrahedron 536635-44(1997))。優(yōu)選的β-轉(zhuǎn)角模擬物包括下面示意性說(shuō)明的模擬物A和模擬物B。
含有氨基酸序列β-轉(zhuǎn)角模擬物取代的優(yōu)選的PYY類似物多肽包括天然的人PYY(SEQ ID NO2)，其中位置x和x+1上的氨基酸被選自模擬物A和模擬物B的β-轉(zhuǎn)角模擬物取代，其中x選自天然的人PYY的8-14位氨基酸上的氨基酸?；蛘?，已知的二肽轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)物可以被取代，例如Ala-Aib和Ala-Pro二肽。
含有氨基酸序列取代的其它優(yōu)選的PYY類似物多肽包括式(II)的PYY類似物多肽(SEQ ID NO88)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10
Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高Ser；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY或者h(yuǎn)PP(1-17)-pNPY。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式II的PYY類似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，式II的多肽可以是游離酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸序列取代的其它優(yōu)選的PYY類似物多肽包括式(III)的PYY類似物多肽(SEQ ID NO348)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；
Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽，NPY(2-36)，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或者h(yuǎn)PP(19-23)-pNPY。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式III的PYY類似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，式III的多肽可以是游離酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸取代的其它優(yōu)選的PYY類似物多肽包括式(IV)的PYY類似物多肽(SEQ ID NO349)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；
Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，或者Val3hPYY(3-36)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式IV的PYY類似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，式IV的多肽可以是游離酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸序列接頭取代的其它優(yōu)選的PYY類似物多肽包括PYY(1-4)氨基己酰基(14-36)(IUPAC[Aca5-13]PYY)(氨基己?；豢s寫為“Aca”)，PYY(1-4)Aca(15-36)，PYY(1-4)Aca(16-36)，PYY(1-4)Aca(22-36)(IUPAC[Aca5-21]PYY)，和PYY(1-4)Aca(25-36)(IUPAC[Aca5-24]PYY)(SEQ ID NOS180-184)。
缺失和截短在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以從天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列缺失一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基，單獨(dú)地，或者與一個(gè)或者多個(gè)插入或者取代一起。一方面，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以從天然的人PYY(SEQ ID NO2)的N末端或者C末端缺失一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基，前提是該多肽不是SEQ ID NO3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以從天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸2到35位缺失一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基。這樣的缺失可以包括天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸2到35位的多于一個(gè)的連續(xù)或者不連續(xù)的缺失。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸24到36位的氨基酸殘基沒有缺失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在式I到V中描述的本發(fā)明的PPF多肽(見上下文)可以包括N或者C-末端截短，或者式I、II、III、IV或者V的2到35位氨基酸的內(nèi)部缺失，只要天然PPF多肽的至少一種生物活性被保留。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，5到8位和24到36位的氨基酸殘基，更優(yōu)選地是5到8位和32到35位的氨基酸殘基沒有缺失。
插入在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以具有一個(gè)或者多個(gè)插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中的氨基酸殘基，單獨(dú)地或者與一個(gè)或者多個(gè)缺失和/或取代一起。一方面，本發(fā)明涉及PYY類似物多肽，其具有插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中的單個(gè)插入，或者多于一個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)或者不連續(xù)的插入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸殘基沒有被插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的24到36位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以包括插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的一個(gè)或者多個(gè)非天然氨基酸和/或非氨基酸的插入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的非天然氨基酸可以是β-轉(zhuǎn)角模擬物或者接頭分子。優(yōu)選的接頭分子包括氨基己酰基(“Aca”)、β-丙氨?；?-氨基-3，6-二氧雜辛?；?。優(yōu)選的β-轉(zhuǎn)角模擬物包括下面示意性說(shuō)明的模擬物A和模擬物B，也包括Ala-Aib和Ala-Pro二肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽可以包括在多肽的任一末端上的聚氨基酸序列的插入(例如聚-his、聚-arg、聚-lys、聚-ala等等)，已知為“延伸”或者“尾”。
含有氨基酸插入序列的優(yōu)選的PYY類似物多肽沿著天然的人PYY的長(zhǎng)度，在每一個(gè)氨基酸位置上包括丙氨酸取代。這樣的PYY類似物多肽包括PYY(+Axa)，其中x選自1’到36(SEQ ID NOS54-87)。
衍生物本發(fā)明也涉及本發(fā)明的PYY類似物多肽的衍生物。這樣的衍生物包括偶聯(lián)到一個(gè)或者多個(gè)水溶性聚合物分子上的PYY類似物多肽，如聚乙二醇(“PEG”)或者各種長(zhǎng)度的脂肪酸鏈(例如硬脂酰、棕櫚酰、辛酰)，這是通過(guò)加入聚氨基酸，如聚組氨酸、聚精氨酸、聚賴氨酸和聚丙氨酸，或者通過(guò)加入包括短烷基和約束烷基(constrainedalkyls)(例如支鏈的、環(huán)狀、融合的金剛烷基)，和芳族基團(tuán)的小分子取代基而實(shí)現(xiàn)的。水溶性聚合物分子的分子量將優(yōu)選地為大約500到大約20,000道爾頓。
這樣的聚合物綴合可以在PYY類似物多肽序列的范圍內(nèi)，在氨基酸殘基的N或者C末端或者側(cè)鏈上單一地發(fā)生?；蛘?，沿著PYY類似物多肽可以有多個(gè)位點(diǎn)的衍生。具有賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者半胱氨酸的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的取代可以提供其它衍生位點(diǎn)。例如參見美國(guó)專利5,824,784和5,824,778。優(yōu)選地，PYY類似物多肽可以綴合到一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)聚合物分子上。
水溶性聚合物分子可以優(yōu)選地連接到氨基、羧基或者硫羥基上，并且可以通過(guò)N或者C末端連接，或者在賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者半胱氨酸的側(cè)鏈上連接?；蛘?，水溶性聚合物分子可以與二胺和二羧酸基團(tuán)連接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽通過(guò)賴氨酸上的ε氨基基團(tuán)綴合到一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)PEG分子上。
本發(fā)明的PYY類似物多肽衍生物也包括PYY類似物多肽，其具有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基的化學(xué)改變。這樣的化學(xué)改變包括酰胺化、糖基化、?；⒘蛩猁}化、磷酸化、乙?；铜h(huán)化?；瘜W(xué)改變可以單一地在PYY類似物多肽序列的范圍內(nèi)，在N或者C末端，或者在氨基酸殘基的側(cè)鏈上發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些肽的C末端可以具有一個(gè)游離的-OH或者-NH2基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N末端可以用異丁基氧羰基基團(tuán)、異丙基氧羰基基團(tuán)、正丁基氧羰基基團(tuán)、乙氧羰基基團(tuán)、異己?；鶊F(tuán)(isocap)、辛酰基團(tuán)、辛基甘氨酸基團(tuán)(G(Oct))、8-氨基辛酸基團(tuán)或者Fmoc基團(tuán)封端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)化可以通過(guò)形成二硫橋?qū)崿F(xiàn)，例如參見SEQ ID NO.171?；蛘?，沿著PYY類似物多肽可以有多個(gè)位點(diǎn)的化學(xué)改變。
優(yōu)選的類似物和衍生物在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，PYY類似物多肽包括上面描述的修飾的組合，即缺失、插入和取代的組合。
舉例說(shuō)明，優(yōu)選的PYY類似物多肽可以包括N末端缺失，其組合了一個(gè)或者多個(gè)氨基酸取代。例如，優(yōu)選的PYY類似物多肽包括PYY(3-36)，其具有一個(gè)或者多個(gè)下述的氨基酸取代Ala3，Leu3，Pro3，Ala4，Gly4，d-Ala4，高Lys4，Glu4，Ala5，Ala6，Val6，d-Ala7，Tyr7，His7，Ala8，Ala9，Ala10，Ala11，d-Ala12，Ala13，高Ser13，Ala14，Ala15，Gln15，Ala16，Ala17，Met17，Ala18，Ser18，正Val18，Ala19，N-Me-Ala19，Lys19，高Arg19，Ala20，Ala21，d-Ala22，Ala23，Ala24，Ala25，Lys25，高Arg25，Ala26，Ala27，Ala28，Ala29，Ala30，Ala31，Ala32，Ala33，Lys33，Ala34，Ala35，Ala36，His36，Trp36，N-Me-Tyr36，和Phe36。優(yōu)選地，PYY類似物多肽包括一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)氨基酸取代。某些優(yōu)選的PYY類似物多肽包括氨基酸缺失以及插入的組合。(例如參見SEQ ID NOS89-174)。
優(yōu)選的PYY類似物多肽包括式(V)的多肽(SEQ ID NO350)Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Tyr Xaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31ThrArg Gln Arg Xaa36其中Xaa3是Ile，Ala，Pro，Ser，Thr，或者正纈氨酸；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Glu，Asp，d-Ala，高賴氨酸，或者高精氨酸；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，或者Ile；Xaa31是Ala或者Val；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，或者Trp；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽。
正如本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到的，式V的多肽可以是游離酸的形式，或者可以是C末端酰胺化的。
其它優(yōu)選的PYY類似物多肽包括SEQ ID NOs31-87，93，95，96，110，114-116，118，120，124-129，131-132，137-141，146-156，158，160-164，167-168，170-171，174-217，221-222，225，228-229，231-239，242-245，247-249，251，255-258，260，264，266-286，和288-347。
式II到V的PYY類似物多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述的氨基酸殘基被化學(xué)修飾或者衍生化(例如通過(guò)脂肪酸衍生化、PEG化、酰胺化、乙二醇化等等)。所述的氨基酸的D-氨基酸殘基也預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的PYY類似物多肽包括具有內(nèi)部缺失的式II到V的多肽，尤其在與C末端尾PPF基序不相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)，正如此處所描述的。
含有非天然氨基酸的取代的優(yōu)選的PYY類似物多肽包括PYY(3-36)，其中x和x+1位的氨基酸用選自模擬物A和模擬物B的β-轉(zhuǎn)角模擬物取代，其中x選自8到14位(例如參見SEQ ID NOS211-217和231-237)。
本發(fā)明的PYY類似物多肽的優(yōu)選衍生物包括聚合物綴合的PYY類似物多肽，其中PYY類似物多肽包括上面描述的插入、缺失、取代的任一種情況，或者其組合，聚合物分子在賴氨酸殘基上綴合。
PYY類似物多肽的其它優(yōu)選的衍生物包括PYY、PYY(3-36)或者PYY(4-36)，具有下述取代和改變[Lys4-脂肪酸鏈]PYY(3-36)；[Lys4-脂肪酸鏈]PYY(4-36)；[Ala2Lys19-脂肪酸鏈]PYY(3-36)；[Ile3-脂肪酸鏈]PYY(3-36)；[Ser13-OAc]PYY(3-36)(Oac是具有脂肪酸或者乙?；腛-酰化)；[Ser23-OAc]PYY(3-36)；[Ile2-辛酰鏈]PYY(3-36)；[Lys19-辛酰鏈]PYY(3-36)；和[Lys19-硬酯酰鏈]PYY(3-36)。(例如參見SEQ IDNOS185-208)。
本發(fā)明PYY類似物多肽的進(jìn)一步的實(shí)例提供在序列表中，在下面的實(shí)施例部分進(jìn)行了討論。
PPF嵌合多肽仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的一個(gè)片段，該片段共價(jià)連接到第二種PP、PYY或者NPY多肽的至少一個(gè)額外的片段上，其中每一個(gè)PP、PYY或NPY片段包括一個(gè)PPF基序?；蛘撸景l(fā)明的PPF嵌合多肽可能包括連接到一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或者四個(gè)多肽片段上的PP家族多肽的一個(gè)片段，其中已連接多肽片段中的至少一個(gè)片段是第二個(gè)PP家族多肽的片段。在某些實(shí)施方案中，PPF多肽不包括具有C末端NPY片段的N末端PP片段。本發(fā)明的PPF嵌合多肽與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF嵌合多肽可能與天然PYY(3-36)的全長(zhǎng)序列具有至少60％、65％、70％、80％或90％的序列同一性。本發(fā)明的這樣的PPF嵌合多肽也可能與天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這樣的PPF嵌合多肽可能與天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。進(jìn)一步，本發(fā)明的PPF嵌合多肽將優(yōu)選地至少包括N-末端聚脯氨酸PPF基序和C-末端尾PPF基序。
而且，本發(fā)明的PPF多肽將通常保留，至少部分地保留，天然的人PP、PPY或NPY的生物活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽將在代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防方面表現(xiàn)出生物活性。
多肽片段可以以本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何方式共價(jià)連接在一起，包括但不限于，直接酰胺鍵或者化學(xué)接頭基團(tuán)。化學(xué)接頭基團(tuán)可以包括肽模擬物，其誘導(dǎo)或者穩(wěn)定多肽構(gòu)象。本發(fā)明的優(yōu)選的PPF嵌合多肽包括PYY-PP、PYY-NPY、PP-PYY、PP-NPY、NPY-PP或者NPY-PYY嵌合體。
本發(fā)明的PPF嵌合多肽的長(zhǎng)度可以是至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或者34個(gè)氨基酸。進(jìn)一步，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽僅僅包括天然L氨基酸殘基和/或修飾的天然L氨基酸殘基?；蛘撸谝粋€(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PYY類似物多肽不包括非天然的氨基酸殘基。
進(jìn)一步，正如上面所提及的，本發(fā)明的PPF嵌合多肽優(yōu)選地不包括hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，hPP(1-17)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP，hPP(1-17)-His34pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(19-23)-hPP，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-His34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6His34hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(21-23)-Pro34-pNPY，cPP(22-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-Pro34-pNPY，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7，20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP，cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32His34-hPP hPP(1-7)-Ala31Aib32-pNPY，hPP(1-17)-Ala31Aib32-pNPY，pNPY(1-7)-Ala31Aib32Gln34-hPP，或者pNPY(1-7，19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽可以包括PP家族類似物多肽的片段。例如，PPF嵌合多肽可以包括此處描述的PPF類似物多肽，以及PP類似物多肽，和NPY類似物多肽。
優(yōu)選的PYY類似物多肽是那些在此處描述的測(cè)定(優(yōu)選地是食物攝取、胃排空、胰分泌或者體重降低測(cè)定)之一中具有效能的多肽，該效能等于或者大于相同測(cè)定中NPY、PYY或PYY(3-36)的效能。或者，與PP、NPY、PYY或PYY(3-36)相比，本發(fā)明的優(yōu)選的PYY類似物多肽可以表現(xiàn)出改進(jìn)的制造簡(jiǎn)易性、穩(wěn)定性和/或易于制劑化。
優(yōu)選地，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物可利用性的降低、食物攝取的減少、體重增加的作用和/或代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防，本發(fā)明的PPF嵌合多肽保留至少大約25％，優(yōu)選地大約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的天然的人PYY的生物活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽表現(xiàn)出改進(jìn)的PYY激動(dòng)劑活性。優(yōu)選地，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物可利用性的降低、食物攝取的減少、體重增加的作用、和/或代謝狀況和紊亂的治療和預(yù)防，本發(fā)明的PPF嵌合多肽表現(xiàn)出天然的人PYY的至少大約110％、125％、130％、140％、150％、200％或更高的生物活性。
更特別地，一方面，PPF嵌合多肽優(yōu)選地包括一個(gè)連接到PYY的片段上的PP的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到PYY或PYY類似物多肽的C末端片段上的PP或PP類似物多肽的N末端片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到PP或PP類似物多肽的C末端片段上的PYY、PYY(3-36)或PYY類似物多肽的N末端片段。
在另一個(gè)方面，PPF嵌合多肽優(yōu)選地包括一個(gè)連接到NPY的片段上的PYY的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到NPY或NPY類似物多肽的C末端片段上的PYY、PYY(3-36)或PYY類似物多肽的N末端片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到PYY或PYY類似物多肽的C末端片段上的NPY或NPY類似物多肽的N末端片段。
仍然在另一個(gè)方面，PPF嵌合多肽優(yōu)選地包括一個(gè)連接到NPY片段上的PP片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到NPY或NPY類似物多肽的C末端片段上的PP或PP類似物多肽的N末端片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括在C末端連接到PP或PP類似物多肽的C末端片段上的NPY或NPY類似物多肽的N末端片段。
PP、PP類似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY類似物多肽、NPY或NPY類似物多肽的片段優(yōu)選地是在任何位置包括PP、PP類似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY類似物多肽、NPY或NPY類似物多肽的4到20個(gè)氨基酸殘基的片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)該片段的長(zhǎng)度進(jìn)行選擇，以便獲得長(zhǎng)度為至少34個(gè)氨基酸的最終PPF嵌合多肽。
本發(fā)明的PPF嵌合多肽也可以包括進(jìn)一步的修飾，包括但不限于，這樣的PPF嵌合多肽的氨基酸序列的取代、缺失和插入，及其組合。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的PPF嵌合多肽包括“非必需”氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)修飾。在本發(fā)明的上下文中，“非必需”氨基酸殘基是在該片段的天然的人氨基酸序列中可以被改變，即可以被缺失或取代的殘基，例如PP家族多肽片段，不會(huì)破壞或者顯著降低PPF嵌合多肽的PYY激動(dòng)劑活性。
本發(fā)明也涉及PPF嵌合多肽的衍生物。這樣的衍生物包括綴合到一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物分子，如聚乙二醇(“PEG”)或者各種長(zhǎng)度的脂肪酸鏈(例如硬酯?；?、棕櫚酰基、辛酰基、油?；鹊?上的PPF嵌合多肽，或者通過(guò)加入聚氨基酸，如聚組氨酸、聚精氨酸、聚-賴氨酸和聚丙氨酸得到的衍生物。對(duì)PPF嵌合多肽的修飾也可以包括小分子取代基，如短烷基和約束烷基(例如支鏈的、環(huán)狀、融合的金剛烷基)和芳族基團(tuán)。水溶性聚合物分子的分子量將優(yōu)選地為大約500到大約20,000道爾頓。
這樣的聚合物-綴合和小分子取代基修飾可以單一地在PPF嵌合多肽的序列內(nèi)，在氨基酸殘基的N或C末端或者側(cè)鏈上發(fā)生?；蛘撸刂鳳PF嵌合多肽可以有多個(gè)位點(diǎn)的衍生化。用賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代一個(gè)或者多個(gè)氨基酸可以提供其它衍生化位點(diǎn)。例如參見美國(guó)專利5,824,784和5,824,778。優(yōu)選地，PPF嵌合多肽可以綴合到一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)聚合物分子上。
水溶性聚合物分子優(yōu)選地連接于氨基、羧基或者硫羥基，并且可以連接于N或C末端，或連接于賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的側(cè)鏈。或者，水溶性聚合物分子可以用二胺和二羧酸基團(tuán)連接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PPF嵌合多肽通過(guò)賴氨酸上的ε氨基基團(tuán)綴合到一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)PEG分子上。
本發(fā)明的PPF嵌合多肽衍生物也包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的化學(xué)改變的PPF嵌合多肽。這樣的化學(xué)改變包括酰胺化、糖基化、?；?、硫酸鹽化、磷酸化、乙?；铜h(huán)化?；瘜W(xué)改變可以單一地在PPF嵌合多肽的序列內(nèi)，在氨基酸殘基的N或C末端或者其側(cè)鏈上發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些肽的C末端可以具有一個(gè)游離的-OH或-NH2基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N末端可以用異丁基氧羰基基團(tuán)、異丙基氧羰基基團(tuán)、正丁基氧羰基基團(tuán)、乙氧基羰基基團(tuán)、異己?；?isocap)、辛?；鶊F(tuán)、辛基甘氨酸(G(Oct))或者8-氨基辛酸基團(tuán)封端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)化可以通過(guò)二硫橋的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘撸刂鳳YY類似物多肽可以有多個(gè)位點(diǎn)的化學(xué)改變。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，PPF嵌合多肽包括那些具有SEQ ID NOs.238-347的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的PPF嵌合多肽的實(shí)例提供在序列表中，并且在下面的實(shí)施例部分進(jìn)行了討論。
PPF多肽在代謝狀況或紊亂的治療或預(yù)防中的用途通常已經(jīng)承認(rèn)，內(nèi)源NPY(綜述在Schwartz等人，Nature 404661-71(2000))和PYY(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)中)，通過(guò)它們的受體，增加了進(jìn)食行為。針對(duì)肥胖癥的治療的方法一直在嘗試拮抗Y受體，而用于治療厭食的方法針對(duì)該配體家族的激動(dòng)劑。然而，正如在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)20020141985中描述和要求保護(hù)的，已經(jīng)驚人的發(fā)現(xiàn)PYY類似物多肽的外周施用對(duì)于降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性具有強(qiáng)效(也參見Batterham等人，Nature 418650-4，2002；WO03/026591；和WO 03/057235)，而不是正如專利和科學(xué)文獻(xiàn)中的報(bào)導(dǎo)所建議的增加了營(yíng)養(yǎng)物可利用性(例如參見美國(guó)專利5,912,227和6,315,203，其公開了PYY受體激動(dòng)劑增加體重的用途)。抑制食物攝取、減緩胃排空、抑制胃酸分泌、和抑制胰酶分泌的作用范圍可以用于在代謝疾病中發(fā)揮臨床作用，如1型、2型或者妊娠糖尿病，肥胖癥和胰島素抵抗綜合征(綜合征X)的其它表現(xiàn)，以及可以在用于降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性的任何其它用途中發(fā)揮臨床作用。
因此，在本方發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了治療或者預(yù)防肥胖癥的方法，其中該方法包括給有需要的對(duì)象施用治療上或者預(yù)防上有效量的PPF多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)象是肥胖或者超重對(duì)象。而“肥胖癥”通常被定義為體重指數(shù)超過(guò)30，對(duì)于本公開內(nèi)容的目的，任何對(duì)象，包括需要或者希望降低體重的那些體重指數(shù)低于30的對(duì)象，也包括在“肥胖”的范圍內(nèi)。對(duì)胰島素有抗性、葡萄糖不耐受或者具有任何類型的糖尿病(例如1型、2型或者妊娠糖尿病)的對(duì)象可以從該方法受益。
在本發(fā)明的其它方面，提供了減少食物攝取、降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性、引起體重減輕、影響身體組成并且改變身體能量含量或者增加能量消耗、治療糖尿病、并且改善脂質(zhì)分布(包括降低LDL膽固醇和三甘油酯水平和/或改變HDL膽固醇水平)的方法，其中這些方法包括給對(duì)象施用有效量的本發(fā)明的PPE多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于治療或者預(yù)防可以通過(guò)降低需要對(duì)象的營(yíng)養(yǎng)物可利用性來(lái)減輕的狀況或者紊亂，這些方法包括給對(duì)象施用治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的PPE多肽。這樣的狀況和紊亂包括，但不限于，高血壓、脂質(zhì)異常血癥、心血管疾病、進(jìn)食紊亂、胰島素抵抗、肥胖癥和任何類型的糖尿病。
不受理論的限制，認(rèn)為外周施用的本發(fā)明的PPF多肽在減少食物攝取、延遲胃排空、降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性和導(dǎo)致體重減輕方面的效果，是通過(guò)與PP家族中一種或者多種獨(dú)特的受體類型或類似于PP家族中一種或者多種獨(dú)特的受體類型的相互作用而確定的。更特別地，似乎涉及與PPY-優(yōu)選(或者Y7)受體類似的一個(gè)受體或者多個(gè)受體。
用于本發(fā)明的其它測(cè)定包括可以確定PPF化合物對(duì)身體組成的影響的那些測(cè)定。實(shí)例的測(cè)定可以涉及利用代謝疾病的飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)的小鼠動(dòng)物模型。在治療期之前，從4周齡開始，給雄性C57BL/6J小鼠喂飼高脂肪飲食(#D12331，來(lái)自脂肪的卡路里是58％；ResearchDiets，Inc.)，給予6周時(shí)間。在研究期間，小鼠可以持續(xù)食用它們的高脂肪食物。在整個(gè)研究期間，可以隨意地提供水。一組類似年齡的非肥胖小鼠被喂飼低脂肪食物(#D12329，來(lái)自脂肪的卡路里是11％)，目的在于與DIO組進(jìn)行代謝參數(shù)的比較。
DIO小鼠被皮下(SC)植入肩胛內(nèi)滲透泵，以便送遞賦形劑(溶解在水中的50％二甲亞砜[DMSO])n＝20，或者送遞本發(fā)明的化合物n＝12。后一組的泵被設(shè)置送遞任意量的本發(fā)明的化合物，例如1000μg/kg/d，送遞7天。
研究期間可以以規(guī)律的時(shí)間間隔測(cè)量體重和食物攝取。呼吸商(RQ，定義為CO2產(chǎn)生量÷O2消耗量)和代謝率可以使用整個(gè)動(dòng)物的間接熱量測(cè)定法(Oxymax，Columbus Instruments，Columbus，OH)來(lái)確定。小鼠可以通過(guò)過(guò)量異氟烷麻醉，并且測(cè)量肥胖指數(shù)(兩側(cè)附睪脂肪墊重量)。而且，在確定附睪重量之前，可以使用雙能X射線吸收測(cè)量?jī)x(DEXA)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(Lunar Piximus，GEImaging System)，分析每一小鼠的身體組成(瘦肉量(lean mass)，脂肪量)。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的優(yōu)選的PPF多肽是那些在此處描述的測(cè)定法(優(yōu)選地是食物攝取、胃排空、胰分泌、體重減輕或者身體組成測(cè)定法)之一中具有效能的多肽，該效能大于相同測(cè)定法中PP、NPY、PYY或PYY(3-36)的效能。
除了由于食物攝取減少、體重減輕或者肥胖癥治療可以導(dǎo)致需要對(duì)象的高血壓有所改善，如此處在實(shí)施例4中的描述，本發(fā)明的化合物可以被用于治療高血壓。
本發(fā)明的化合物也可以用于加強(qiáng)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或者恢復(fù)胰島或者細(xì)胞中的葡萄糖反應(yīng)性。這些作用對(duì)于治療或者預(yù)防與代謝紊亂有關(guān)的疾病有用，如上面描述的和美國(guó)專利US20040228846中描述的代謝疾病。用于確定這樣的活性的測(cè)定法在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。例如，在已公開的美國(guó)專利US20040228846(被完整地引入于此作為參考)中，這些測(cè)定法被描述用于胰島分離和培養(yǎng)，以及確定胎兒胰島成熟。在專利申請(qǐng)US20040228846的實(shí)施例中，腸源激素肽，包括胰多肽(PP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、神經(jīng)肽K(NPK)、PYY、促胰液素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和鈴蟾肽是從Sigma購(gòu)買的。XI型膠原酶是從Sigma獲得的。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清是從Gibco獲得的。含有抗胰島素抗體的放射性免疫測(cè)定試劑盒([125I]-RIA試劑盒)是從Linco，St Louis購(gòu)買的。
產(chǎn)后大鼠胰島是從P-02歲大鼠獲得的。成年大鼠胰島是從6-8周齡的大鼠獲得的。胎鼠胰島如下獲得。將懷孕的雌性大鼠在懷孕第21天(e21)處死。從子宮中取出胎鼠。從每個(gè)幼仔解剖出10-14個(gè)胰腺，在Hanks緩沖液中洗滌兩次。合并胰腺，懸浮在6ml的1mg/ml膠原酶(Type XI，Sigma)中，于37℃溫育8-10分鐘，溫育的同時(shí)不斷地振蕩。通過(guò)加入10體積冰冷的Hanks緩沖液來(lái)終止消化，隨后用Hanks緩沖液洗滌三次。然后通過(guò)Ficoll梯度離心純化胰島，在加入或者不加入1μM IBMX的10％胎牛血清(FBS)/RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在5天的最后時(shí)間，將20個(gè)胰島手工揀入每個(gè)管子中，測(cè)定靜態(tài)胰島素釋放。通常，首先用KRP緩沖液洗滌胰島，然后用1ml含有3mM(低)葡萄糖的KRP緩沖液于37℃溫育30分鐘。在收集上清后，用17mM(高)葡萄糖將胰島于37℃溫育1小時(shí)。通過(guò)放射性免疫測(cè)定(RIA)，使用[125I]-RIA試劑盒來(lái)測(cè)定從低或者高葡萄糖刺激釋放的胰島素。在存在200ng/ml PYY、PP、CCK、NPK、NPY、促胰液素、GLP-1或者鈴蟾肽的情況下，將E21胎胰島培養(yǎng)5天。
也提供了一種例證性的體內(nèi)測(cè)定方法，其中使用Zucker糖尿病肥胖型(ZDF)雄性大鼠，即一種近交(＞F30代)大鼠模型，該模型在給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒食物Purina 5008的所有fa/fa雄性中自發(fā)地表現(xiàn)出糖尿病。在ZDF fa-fa雄性中，高血糖癥在大約7周齡時(shí)開始發(fā)展，到10-11周齡時(shí)，葡萄糖水平(餐后)通常達(dá)到500mg/DL。在糖尿病發(fā)展的過(guò)程中，胰島素水平(餐后)較高。然而，到19周齡時(shí)，胰島素下降到大約瘦對(duì)照同窩幼仔(lean control litter mates)的水平。肥胖大鼠的甘油三酸酯和膽固醇水平通常高于瘦大鼠的甘油三酸酯和膽固醇水平。在測(cè)定中，三組7周齡的ZDF大鼠，每組有6只大鼠，接受ALZA泵的輸注治療14天1)賦形劑對(duì)照，2)和3)，兩種不同劑量的PYY，分別是100pmol/kg/hr和500pmol/kg/hr。在輸注之前和之后第7天和第14天，獲得四個(gè)參數(shù)1)血漿葡萄糖水平，2)血漿胰島素水平，和3)血漿甘油三酸酯(TG)水平，以及口服葡萄糖耐受(OGTT)試驗(yàn)。因此，這些測(cè)定法可以與本發(fā)明的化合物使用，以測(cè)試期望的活性。
對(duì)于PPF多肽能預(yù)期到的其它用途包括降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的鋁(Al)濃度的方法(參見美國(guó)專利6,734,166，完整地引入此處作為參考)，用于治療、預(yù)防或者延遲阿爾茨海默病的發(fā)作。確定對(duì)鋁的影響的測(cè)定法在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的，可以在美國(guó)專利6,734,166中發(fā)現(xiàn)，其中使用了二倍體和Ts小鼠。這些小鼠在Nalgene牌代謝或者聚丙烯籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)之前給予3天時(shí)間來(lái)適應(yīng)籠子。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了安樂(lè)死之前的16個(gè)小時(shí)不提供食物之外，小鼠可以隨意獲得食物(LabDietNIH Rat和Moust/Auto 6F5K52，St.Louis，Mo.)和水。每日給小鼠皮下注射活性化合物或者鹽水。在13天的一輪實(shí)驗(yàn)和3天的另一輪實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死這些小鼠，收集樣品。在清潔的聚四氟乙烯襯墊上稱取小鼠腦樣品的重量，準(zhǔn)備用于通過(guò)微波消化在低微量元素級(jí)硝酸中進(jìn)行的分析。然后使用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜法分析樣品的鋁含量(Nuttall等人，Annals of Clinical and Laboratory Science 25，3，264-271(1995))。分析過(guò)程中所有的組織處理在清潔的室內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行，使用HEPA空氣過(guò)濾系統(tǒng)，以最小化背景污染。
本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出很廣范圍的生物活性，一些活性與它們的抗分泌和抗遷移特性有關(guān)。這些化合物通過(guò)與上皮細(xì)胞直接相互作用，或者可能地，通過(guò)抑制刺激腸分泌的激素或者神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，來(lái)抑制胃腸分泌?？狗置谔匦园ㄒ种莆阜置诤?或胰腺分泌的抑制，在包括胃炎、胰腺炎、巴雷特(Barrett’s)食道和胃食道反流性疾病的疾病和病癥的治療或預(yù)防中有用。
本發(fā)明的化合物在任意數(shù)量的胃腸病癥(例如Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill Inco，New York，12thEd.)的治療中有用，這些病癥與腸電解質(zhì)和水分分泌過(guò)量以及吸收降低有關(guān)，例如感染性腹瀉、炎癥性腹瀉、短腸綜合征、或者通常在外科手術(shù)例如回腸造口術(shù)之后發(fā)生的腹瀉。感染性腹瀉的實(shí)例包括，但不限于，急性病毒性腹瀉、急性細(xì)菌性腹瀉(例如沙門氏菌、彎曲桿菌和梭狀芽孢桿菌或者由于原生動(dòng)物感染)、或者旅行者腹瀉(例如諾瓦克病毒或者輪狀病毒)。炎癥性腹瀉的實(shí)例包括，但不限于，吸收不良綜合征、熱帶口炎性腹瀉、慢性胰腺炎、克隆氏病疾病、痢疾和腸易激綜合征。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的肽可以被用于治療涉及胃腸病癥，例如，在手術(shù)后或者由于霍亂導(dǎo)致的緊急狀況或者威脅生命的狀況。
本發(fā)明的化合物也可以用于治療或者預(yù)防腸損傷，而不是僅僅治療與腸損傷(例如腹瀉)相關(guān)的癥狀。這樣的腸損傷可以是潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、腸萎縮、腸粘膜損失和/或腸粘膜功能損失，或者由潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、腸萎縮、腸粘膜損失和/或腸粘膜功能損失導(dǎo)致(參見WO 03/105763，將其完整地引入于此作為參考)。針對(duì)這樣的活性的測(cè)定法，正如在WO 03/105763中描述的，包括11周齡雄性HSD大鼠，在250-300克之間，以12∶12光暗循環(huán)飼養(yǎng)，允許隨意地食用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物食物(Teklad LM 485，Madison，WI)和水。在實(shí)驗(yàn)之前讓這些動(dòng)物禁食24小時(shí)。Morris GP等人以前已經(jīng)描述了慢性結(jié)腸炎癥的一個(gè)簡(jiǎn)單并且可重復(fù)的大鼠模型，″Hapten-inducedmodel of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.″Gastroenterology.1989；96795-803。其表現(xiàn)出相對(duì)長(zhǎng)的炎癥和潰瘍時(shí)間，為以特定對(duì)照方式研究慢性炎癥性疾病的病理生理學(xué)提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，以及為評(píng)價(jià)潛在地可用于人類炎性腸病的新的治療提供了一個(gè)機(jī)會(huì)。
用3％異氟烷麻醉大鼠，將其放置到設(shè)置在37℃的一個(gè)可調(diào)型電熱墊上。將灌飼針(gavage needle)通過(guò)直腸插入結(jié)腸7cm。將溶解在50％乙醇(v/v)中的半抗原三硝基苯磺酸(TNBS)通過(guò)灌飼針以30mg/kg的劑量送遞到結(jié)腸腔中，總體積為00.4-0.6mL，正如Mazelin等人，″Protective role of vagal afferents in experimentally-inducedcolitis in rats.″Juton Nerv Syst.1998；733845中描述的。對(duì)照組通過(guò)結(jié)腸內(nèi)接受鹽水溶液(NaCl 0.9％)。
在結(jié)腸炎誘導(dǎo)后4天，切除麻醉大鼠的結(jié)腸，然后通過(guò)斷頭法施以安樂(lè)死。測(cè)量所切除的大腸和脾的重量，為結(jié)腸照像，以便計(jì)算總體外形損傷。炎癥被定義為充血和腸壁增厚的區(qū)域。
本發(fā)明的化合物也被用于治療或者預(yù)防胰腺腫瘤(例如抑制胰腺腫瘤的增生)。本發(fā)明的方法包括減少腫瘤細(xì)胞的增生?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明來(lái)治療的良性胰腺腫瘤細(xì)胞的類型包括漿液囊腺瘤、微囊性瘤和實(shí)體-囊性瘤(solid-cystic tumors)。該方法在降低惡性胰腺腫瘤細(xì)胞，如腺管、腺泡或胰島產(chǎn)生的癌的增殖方面也有效。美國(guó)專利5,574,010(其完整地引入于此作為參考)提供了用于檢測(cè)抗增殖特性的實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法。例如，‘010專利提供了PANC-1和MiaPaCa-2是兩種人胰腺癌細(xì)胞系，它們可以從供應(yīng)商如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC(Rockville，Md.)商購(gòu)獲得。將這兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)加了10％胎牛血清、29.2mg/L谷氨酰胺、25mu.g慶大霉素、5ml青霉素、鏈霉素和兩性霉素B溶液(JRHBiosciences，Lenexa，Kans.)，培養(yǎng)溫度為37攝氏度，在用NAPCO水夾套的5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。當(dāng)?shù)玫絽R合的單層腫瘤細(xì)胞時(shí)，將所有細(xì)胞系用0.25％胰蛋白酶(Clonetics，San Diego，Calif.)每周消化分離1到2次。將細(xì)胞以500g在冷凍離心機(jī)中于4攝氏度離心7分鐘，并且重懸于不含胰蛋白酶的加強(qiáng)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在血球計(jì)數(shù)板上用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
將每種類型的10,000、20,000、40,000和80,000個(gè)細(xì)胞加入到96孔微型培養(yǎng)板上(Costar，Cambridge，Mass.)，每孔培養(yǎng)基的總體積為200ul。在加入PYY或者測(cè)試肽之前，允許細(xì)胞貼壁24小時(shí)。在加入肽之前，更換為新鮮培養(yǎng)基。用PYY或者測(cè)試化合物進(jìn)行的胰腺腫瘤細(xì)胞的體外溫育持續(xù)6小時(shí)到36小時(shí)。將PYY以每孔250pmol、25pmol和2.5pmol(N＝14)的劑量加入到細(xì)胞中。測(cè)試化合物以每孔400pmol、40pmol和4pmol的劑量加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。對(duì)照孔接受2ul的0.9％鹽水，以便在貼壁的腫瘤細(xì)胞上模擬體積和物理干擾。每一個(gè)96孔板合有18個(gè)對(duì)照孔，以便允許在實(shí)驗(yàn)期間在每一平板內(nèi)進(jìn)行比較。用不同濃度的PYY和測(cè)試化合物在PANC-1和MiaPaCa-2細(xì)胞中在九十六(96)孔平板上重復(fù)6次。
在溫育結(jié)束的時(shí)候，將3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑，MTT溴化四唑(Sigma，St.Louis，Mo.)以0.5mg/ml加入到新鮮的培養(yǎng)基中。更換培養(yǎng)基，用含MTT溴化四唑的培養(yǎng)基于37攝氏度將腫瘤細(xì)胞溫育4小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，吸出培養(yǎng)基。將甲 結(jié)晶沉淀物溶解在200ul的二甲亞砜(Sigma，St.Louis，Mo.)中。通過(guò)ELISA讀數(shù)器(Molecular Devices，Menlo Park，Calif.)上500nm波長(zhǎng)處的吸光度讀數(shù)來(lái)定量溶解的甲 。MTT測(cè)定法測(cè)量線粒體的NADH依賴性脫氫酶活性，并且該方法是體外定量測(cè)定腫瘤細(xì)胞化療反應(yīng)最敏感和可靠的方法之一。(Alley，M.C.，Scudiero，D.A.，Monk，A.，Hursey，M.L.，Dzerwinski，M.J.，F(xiàn)ine，D.L.，Abbott，B.J.，Mayo，J.G.，Shoemaker，R.H.and Boyd，M.R.，F(xiàn)easibility of drug screening withpanels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assayCancer Res.，48589-601，1988；Carmichael，J.，DeGraff，W.G.，Gazdar，A.F.，Minna，J.D.and Mitchell，J.B.，Evaluation of a tetrazolium-basedsemiautomated colorimetric assayAssessment of chemosensitivitytesting.Cancer Res.，47936-942，1987；McHale，A.P.，McHale，L.，Useof a tetrazolium based colorimetric assay in assessing photoradiationtherapy in vitro.Cancer Lett.，41315-321，1988；and Saxton，R.E.，Huang，M.Z.，Plante D.，F(xiàn)etterman，H.F.，Lufkin，R.B.，Soudant，J.，Castro，D.J.，Laser and daunomycin chemophototherapy of humancarcinoma cells.J.Clin.Laser Med.and Surg.，10(5)331-336，1992.)通過(guò)對(duì)相同測(cè)試條件的孔分組以及對(duì)對(duì)照組和各種不同濃度肽處理的試驗(yàn)組之間的差異進(jìn)行一元方差分析來(lái)分析550nm處的吸光度讀數(shù)。
也提供了一種例證性的體內(nèi)測(cè)定法。通過(guò)肽YY和測(cè)試化合物檢測(cè)人胰管腺癌Mia Paca-2的體內(nèi)生長(zhǎng)抑制。將70,000到100,000個(gè)人MiaPaCa-2細(xì)胞原位移植到48只雄性裸鼠體內(nèi)。1周后，用PYY或者測(cè)試化合物以200pmol/kg/hr通過(guò)微滲透壓泵將動(dòng)物處理4周。配對(duì)的培養(yǎng)物接受鹽水。在處死后，測(cè)量腫瘤大小和重量。組織切片顯示，對(duì)照組小鼠具有顯著的胰腺內(nèi)人癌生長(zhǎng)。在9周時(shí)，百分之九十(90％)的對(duì)照組小鼠具有顯著的腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤重量在所測(cè)試被處理小鼠中減少了60.5％，在PYY處理小鼠中減少了27％。
對(duì)于所有適應(yīng)癥，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的PPF多肽以每天大約0.5μg到大約5mg的劑量外周施用，以單次或者分次或者控制的連續(xù)釋放，或者以每劑大約0.01μg/kg到大約500μg/kg，更優(yōu)選地大約0.05μg/kg到大約250μg/kg，最優(yōu)選地低于大約50μg/kg。這些范圍內(nèi)的劑量將隨著每種類似物或衍生物的效能而改變，當(dāng)然，可以由本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)確定。
在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的PPF多肽可以單獨(dú)地或者與一種或多種其它化合物和組合物一起施用，所述其它化合物和組合物表現(xiàn)出長(zhǎng)期或者短期的降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性的作用，包括，但不限于含有支鏈淀粉或支鏈淀粉類似物激動(dòng)劑、鮭魚降鈣素、縮膽囊素(CCK)或CCK激動(dòng)劑、瘦蛋白(OB蛋白質(zhì))或瘦蛋白激動(dòng)劑、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物激動(dòng)劑、或者GLP-1或GLP-1類似物激動(dòng)劑的其它化合物和組合物。合適的支鏈淀粉激動(dòng)劑包括，例如[25，28，29Pro-]人支鏈淀粉(也已知為“普蘭林肽”，并且描述在美國(guó)專利5,686,511和5,998,367中)。所用的CCK優(yōu)選地是CCK八肽(CCK-8)。瘦蛋白已經(jīng)被討論，例如(Pelleymounter等人，Science 269540-3(1995)；Halaas等人，Science 269543-6(1995)；Campfield等人，Science 269546-9(1995))。合適的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，以及毒蜥外泌肽激動(dòng)劑化合物，包括，例如PCT公開WO 99/07404，WO 99/25727和WO 99/25728中的那些。
多肽的制備和純化此處描述的PPF多肽可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)或化學(xué)肽合成技術(shù)來(lái)制備，例如使用自動(dòng)化或半自動(dòng)化肽合成儀，或者兩者都使用。
本發(fā)明的PPF多肽可以在溶液或者固體載體中根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)來(lái)合成。多種自動(dòng)合成儀可通過(guò)商購(gòu)獲得，并且可以根據(jù)已知步驟使用。例如參見Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2d.ed.，PierceChemical Co.(1984)；Tam等人，J.Am.Chem.Soc.1056442(1983)；Merrifield，Science 232341-7(1986)；and Barany and Merrifield，ThePeptides，Gross and Meienhofer，eds.，Academic Press，New York，1-284(1979)。固相肽合成可以用自動(dòng)多肽合成儀進(jìn)行(例如Model 430A，Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，California)，使用NMP/HOBt(選擇1)系統(tǒng)，和封端的tBoc或者Fmoc化學(xué)(參見Applied BiosystemsUser’s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer，Version 1.3B July1，1988，section 6，pp.49-70，Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，California)。肽也可以使用Advanced ChemTech多肽合成儀(型號(hào)MPS 350，Louisville，Kentucky)組裝。肽也可以通過(guò)RP-HPLC(制備用和分析用)純化，使用，例如Waters Delta Prep 3000系統(tǒng)和C4、C8或者C18制備柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，California)?；钚缘鞍踪|(zhì)易于合成，然后在用于鑒別反應(yīng)肽的篩選試驗(yàn)中篩選。
本發(fā)明的PPF多肽可以替代地通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)制備。例如參見Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor(1989)。通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的這些PYY類似物多肽可以從多核苷酸表達(dá)。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，多核苷酸，包括DNA和RNA，其編碼這樣的被編碼的PYY類似物多肽，可以從野生型PYY cDNA獲得，并考慮到密碼子選擇的簡(jiǎn)并性。這些多核苷酸序列可以整合密碼子，以便有助于微生物宿主內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這樣的操作序列可以容易地根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建，例如參見WO 83/04053。上面的多核苷酸也可以任選地編碼N-末端甲硫氨酰殘基。在本發(fā)明中有用的非肽化合物可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制備。例如，含有磷酸的氨基酸和含有這樣的氨基酸的肽可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制備。例如參見Bartlett and Landen，Bioorg.Chem.14356-77(1986)。
多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可以使用，以包括并表達(dá)PPF多肽編碼序列。這些包括但不限于微生物，如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染或者用細(xì)菌表達(dá)載體(例如Ti或者pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)?？捎糜谥亟M蛋白質(zhì)制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于，VERO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、COS細(xì)胞(例如COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293細(xì)胞。下面描述了蛋白質(zhì)重組表達(dá)的例證性步驟。
同樣地，本發(fā)明提供的多核苷酸序列可用于產(chǎn)生新的和有用的病毒和質(zhì)粒DNA載體、新的和有用的轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)染的原核和真核宿主細(xì)胞(包括在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、以及新的和有用的能表達(dá)本發(fā)明的PPF多肽的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)的方法。編碼此處的PPF多肽的多核苷酸序列可用于基因治療中，包括緩解PP、PYY或者NPY的生產(chǎn)不足，或者提高PP、PYY或者NPY的水平。
本發(fā)明也提供了用于本發(fā)明的PPF多肽的重組DNA生產(chǎn)的方法。提供了一種通過(guò)含編碼這樣的PPF多肽的核酸的宿主細(xì)胞表達(dá)PPF多肽的方法，該方法包括(a)在有利于這樣的DNA分子表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有編碼這樣的PPF多肽的所述宿主細(xì)胞；和(b)獲得這樣的PPF多肽。
宿主細(xì)胞可以是原核或者真核的，并且包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、猴細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、癌細(xì)胞或者其它細(xì)胞)、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員也是熟知的。宿主細(xì)胞株可以針對(duì)可加工已表達(dá)蛋白質(zhì)或者可進(jìn)行某些對(duì)蛋白活性有用的翻譯后修飾的特定能力進(jìn)行選擇。這樣的多肽修飾包括，但不限于，乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。翻譯后加工，其切割蛋白質(zhì)“前原(prepro)”形式，對(duì)于正確的插入、折疊和/或功能也是重要的。不同的宿主細(xì)胞，如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38及其類似細(xì)胞，具有針對(duì)這樣的翻譯后活性的特定細(xì)胞機(jī)制和特征機(jī)理，也可以被選擇以確保被引入的外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。
或者，酵母系統(tǒng)可以被用于制備本發(fā)明的PPF多肽。PPF多肽cDNA的編碼區(qū)通過(guò)PCR擴(kuò)增。編碼酵母前-原-α前導(dǎo)序列的DNA在PCR反應(yīng)中從酵母基因組DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增中使用一個(gè)含有α交配因子基因的核苷酸1-20的引物，和另一個(gè)與該基因的核苷酸255-235互補(bǔ)的引物(Kurjan and Herskowitz，Cell，30933-43(1982))。前-原-α前導(dǎo)編碼序列和PPF多肽編碼序列片段被連接到含有酵母乙醇脫氫酶(ADH2)啟動(dòng)子的質(zhì)粒中，這樣，啟動(dòng)子指導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，所述融合蛋白由與成熟PPF多肽融合的前-原-α因子組成。正如Rose和Broach在Meth.Enz.185234-79，Goeddel ed.，Academic Press，Inc.，San Diego，California(1990)中所指出的，該載體進(jìn)一步包括克隆位點(diǎn)下游的ADH2轉(zhuǎn)錄終止子，酵母“2微米”復(fù)制起點(diǎn)，酵母leu-2d基因，酵母REP1和REP2基因，大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因，和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。β-內(nèi)酰胺酶和leu-2d基因分別用于在細(xì)菌和酵母中提供選擇。leu-2d基因也有助于增加酵母中質(zhì)粒的拷貝數(shù)，以誘導(dǎo)更高的表達(dá)水平。REP1和REP2基因編碼調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)的蛋白質(zhì)。
在先前的段落中所描述的DNA構(gòu)建體使用已知方法，例如乙酸鋰處理(Steams等人，Meth.Enz.185280-97(1990))轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。一旦生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的葡萄糖被消耗，就誘導(dǎo)ADH2啟動(dòng)子(Price等人，Gene 55287(1987))。前-原-α序列影響細(xì)胞中融合蛋白的分泌。伴隨地，酵母KEX2蛋白質(zhì)從成熟的PYY類似物多肽切割前-原序列(Bitter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815330-4(1984))。
本發(fā)明的PPF多肽也可以使用商品化的表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行重組表達(dá)，例如Pichia表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，San Diego，California)。該系統(tǒng)也依賴于前-原-α序列來(lái)指導(dǎo)分泌，但一旦通過(guò)甲醇誘導(dǎo)，插入片段的轉(zhuǎn)錄就可以通過(guò)醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。所分泌的PPF多肽從酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基純化，例如通過(guò)用于從細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清液純化PPF多肽的方法。
或者，編碼PYY類似物多肽的cDNA可以被克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pVL1393(PharMingen，San Diego，California)中。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(PharMingen)使用含有該P(yáng)PF多肽的載體，以感染不含sF9蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞，并且產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。使用肝素-瓊脂糖柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和順序分子分級(jí)柱(Amicon，Beverly，Massachusetts)從培養(yǎng)基中分離并濃縮該蛋白質(zhì)，并且重懸在PBS中。SDS-PAGE分析顯示了單一條帶，并且確認(rèn)了該蛋白質(zhì)的大小，在Proton 2090肽測(cè)序儀(Peptide Sequencer)上通過(guò)Edman測(cè)序法確認(rèn)了其N末端序列。
例如，編碼預(yù)測(cè)的成熟PYY類似物多肽的DNA序列可以被克隆到含有需要的啟動(dòng)子和任選的前導(dǎo)序列(例如參見Better等人，Science2401041-3(1988))的質(zhì)粒中。該構(gòu)建的序列可以通過(guò)自動(dòng)化測(cè)序確認(rèn)。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)的CaCl2共孵育和熱激法處理細(xì)菌(Sambrook等人，見上文)，該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MC1061中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在添加羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如果存在，前導(dǎo)序列將影響成熟PYY類似物多肽的分泌，并且在分泌過(guò)程中被切除。所分泌的重組蛋白質(zhì)通過(guò)下面描述的方法從細(xì)菌培養(yǎng)基純化。
或者，本發(fā)明的PPF多肽可以在昆蟲系統(tǒng)中表達(dá)。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的昆蟲系統(tǒng)對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。在一個(gè)這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)被用作載體，在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中或者粉紋夜蛾幼蟲(Trichoplusialarvae)中表達(dá)外源基因。編碼PPF多肽的序列被克隆到病毒的非必需區(qū)域中，如多角體蛋白基因，并且置于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。PYY類似物多肽的成功插入將使多角體蛋白基因失活，并且產(chǎn)生缺乏衣殼蛋白的重組病毒。然后重組病毒被用于感染草地夜蛾細(xì)胞或者粉紋夜蛾幼蟲，其中PYY類似物多肽被表達(dá)(Smith等人，J.Virol.46584(1983)；Engelhard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-7(1994))。
在另一個(gè)實(shí)例中，編碼PPF多肽的DNA序列可以通過(guò)PCR擴(kuò)增，并且克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，例如，pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)。pGEX載體被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生融合蛋白，該融合蛋白包括由該載體編碼的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)以及由插入到載體的克隆位點(diǎn)上的DNA片段編碼的蛋白。用于PCR的引物可以包括，例如適當(dāng)?shù)那懈钗稽c(diǎn)。然后重組的融合蛋白從融合蛋白的GST部分切割。pGEX-3X/PYY類似物多肽構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞(Stratagene，La Jolla，California)中，分離各個(gè)轉(zhuǎn)化體，并且于37℃在LB培養(yǎng)基(添加羧芐青霉素)中生長(zhǎng)，至波長(zhǎng)600nm處的光密度為0.4，隨后在存在0.5mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)的情況下進(jìn)一步溫育4小時(shí)。純化來(lái)自各個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，使用自動(dòng)化測(cè)序儀部分地測(cè)序，以確認(rèn)期望的PPF多肽基因以正確的方向插入質(zhì)粒DNA。
預(yù)期在細(xì)菌中形成不可溶的包含體的融合蛋白可以如下純化。離心收集細(xì)胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH 8，1mM EDTA中洗滌；用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)在室溫下處理15分鐘。溶菌液通過(guò)超聲波降解法清除，細(xì)胞碎片以12,000xg離心10分鐘沉淀。將含有融合蛋白的團(tuán)狀沉淀重懸在50mM Tris，pH 8，和10mM EDTA中，在50％甘油上分層，以6000xg離心30分鐘。將團(tuán)狀沉淀重懸在不含Mg++和Ca++的標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖液(PBS)中。融合蛋白通過(guò)在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠(Sambrook等人，supra)中分級(jí)分離重懸的團(tuán)狀沉淀而進(jìn)一步純化。將凝膠浸入0.4M KCl中，以便使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)，切除該蛋白質(zhì)，并且在無(wú)SDS的凝膠電泳緩沖液中電洗脫。如果GST/PYY類似物多肽融合蛋白在細(xì)菌中以可溶的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，那么其可以使用GST純化組件(Module)(Pharmacia Biotech)純化。
融合蛋白可以進(jìn)行消化以便從成熟的PYY類似物多肽切割GST。消化反應(yīng)(20-40μg融合蛋白，20-30單位人凝血酶(4000U/mg，在0.5mL PBS中(Sigma))在室溫下溫育16-48小時(shí)，上樣到變性SDS-PAGE凝膠上，以便分級(jí)分離反應(yīng)產(chǎn)物。將凝膠浸入0.4M KCl以使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)。與預(yù)期的PYY類似物多肽分子量相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶的鑒別可以使用自動(dòng)化測(cè)序儀(Applied Biosystems Model 473A，F(xiàn)oster City，California)通過(guò)部分氨基酸序列分析來(lái)確定。
在本發(fā)明的PPF多肽的重組表達(dá)的特別優(yōu)選的方法中，可以用在pCMV載體(5’CMV啟動(dòng)子，3’HGH poly A序列)中含有PYY類似物多肽cDNA的質(zhì)粒和含有pSV2neo(含有neo抗性基因)的質(zhì)粒，通過(guò)磷酸鈣方法，共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。優(yōu)選地，這些載體應(yīng)該使用ScaI在轉(zhuǎn)染之前線性化。類似地，通過(guò)類似pCMV載體構(gòu)建的序列可替代地被使用，該類似的pCMV載體整合了neo基因。通過(guò)在含有0.5mg/mLG418(新霉素樣抗生素)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中有限稀釋10-14天，從單細(xì)胞克隆中選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系。通過(guò)ELISA或Western印跡法篩選表達(dá)PYY類似物多肽的細(xì)胞系，高表達(dá)細(xì)胞系被擴(kuò)充以進(jìn)行大規(guī)模生長(zhǎng)。
優(yōu)選地，已轉(zhuǎn)化細(xì)胞被用于長(zhǎng)期、高產(chǎn)率的蛋白生產(chǎn)，同樣地，穩(wěn)定表達(dá)是期望的。一旦這樣的細(xì)胞用含有選擇標(biāo)記的載體以及期望的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞被轉(zhuǎn)換到選擇性培養(yǎng)基之前，允許在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天。選擇標(biāo)記被設(shè)計(jì)以便賦予選擇抗性，其存在允許成功表達(dá)被引入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性細(xì)胞簇可以通過(guò)適合于細(xì)胞的組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)增殖。
大量選擇系統(tǒng)可以用于回收已經(jīng)被轉(zhuǎn)化用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞。這樣的選擇系統(tǒng)包括，但不限于，HSV胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中。而且，抗代謝物抗性可以被用作選擇的基礎(chǔ)dhfr，賦予抗氨甲蝶呤抗性；gpt，賦予抗霉酚酸抗性；neo，賦予抗氨基糖苷抗性，G418，賦予抗chlorsulfuron抗性，和hygro，賦予抗潮霉素抗性?？赡苡杏玫钠渌蛇x擇基因包括trpB，其允許細(xì)胞使用吲哚來(lái)代替色氨酸，或者h(yuǎn)isD，其允許細(xì)胞使用histinol來(lái)代替組氨酸。對(duì)于轉(zhuǎn)化體的鑒別給出直觀指示的標(biāo)記物包括花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物、GUS和熒光素酶及其底物螢光素。
本發(fā)明的許多PPF多肽可以使用自動(dòng)化肽合成以及重組技術(shù)的組合來(lái)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的PPF多肽可以含有包括通過(guò)聚乙二醇化進(jìn)行的缺失、取代和插入的許多修飾。這樣的PPF多肽可以分階段產(chǎn)生。在第一階段，含有缺失、取代、插入及其任意組合的修飾的中間產(chǎn)物PPF多肽可以通過(guò)所描述的重組技術(shù)產(chǎn)生。然后在下面描述的任選的純化步驟后，中間產(chǎn)物PPF多肽通過(guò)用適當(dāng)?shù)腜EG化試劑的化學(xué)修飾PEG化(例如來(lái)自NeKtar Therapeutics，San Carlos，California)，以產(chǎn)生目標(biāo)PPF多肽。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，上面描述的方法可以被推廣用于含有選自缺失、取代、插入、衍生的各種修飾的組合的PPF多肽，以及本技術(shù)領(lǐng)域熟知的和本發(fā)明所預(yù)期到的其它修飾方法。
可能需要純化本發(fā)明所產(chǎn)生的PPF多肽。肽純化技術(shù)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。這些技術(shù)涉及，在一個(gè)水平上，細(xì)胞內(nèi)容物(cellular milieu)粗分級(jí)分離為多肽和非多肽組分。從其它蛋白質(zhì)分離出多肽后，感興趣的多肽可以進(jìn)一步使用色譜和電泳技術(shù)來(lái)純化，以便獲得部分或者完全的純化(或者純化到均質(zhì))。特別適合于制備純肽的分析方法是離子交換色譜、排阻色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦。純化肽的一個(gè)特別有效的方法是反相HPLC，隨后通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜分析法(LC/MS)和基質(zhì)輔助的激光解吸附電離(MALDI)質(zhì)譜技術(shù)表征純化的產(chǎn)物。純度的另一種確認(rèn)通過(guò)確定氨基酸分析來(lái)獲得。
本發(fā)明的某些方面涉及編碼的蛋白或肽的純化，并且在特別的實(shí)施方案中，涉及已編碼蛋白或肽的基本上純化。術(shù)語(yǔ)“已純化的肽”在此處被用于指組合物，可以從其它組分分離，其中該肽被純化到與其天然可獲得狀態(tài)相關(guān)的任何程度。因此已純化的肽也指，脫離其可能天然存在的環(huán)境的肽。
一般地，“已純化的”指肽組合物，該肽組合物經(jīng)分級(jí)分離法去除多種其它組分，并且該組合物基本上保留了其表達(dá)的生物活性。在使用術(shù)語(yǔ)“基本上純化”的情況下，該名稱指其中主要組分為肽的組合物，例如肽占組合物中大約50％、大約60％、大約70％、大約80％、大約90％、大約95％或更多。
適合在肽純化中使用的各種技術(shù)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將是熟知的。這些技術(shù)包括，例如硫酸銨、PEG、抗體沉淀及其相似技術(shù)；熱變性，然后離心；層析步驟如離子交換、凝膠過(guò)濾、反相、羥磷灰石和親和層析；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術(shù)和其它技術(shù)的組合。正如在本技術(shù)領(lǐng)域通常已知的，各種純化步驟的次序可以改變，或者某些步驟可以被忽略，并且仍然可以產(chǎn)生基本上純化的蛋白質(zhì)或肽的合適的制備方法。
通常不要求肽總是以它們最純化的形態(tài)提供。實(shí)際上，應(yīng)該預(yù)期到?jīng)]有充分純化的產(chǎn)物在某些實(shí)施方案中將有用。部分純化可以通過(guò)組合使用較少的純化步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)使用相同的一般純化方案的不同形式來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，應(yīng)該意識(shí)到所進(jìn)行的陽(yáng)離子交換柱層析，使用了HPLC儀器，通常將導(dǎo)致比使用了低壓層析系統(tǒng)的相同技術(shù)更大的“-倍數(shù)”純化。表現(xiàn)出較低水平的相對(duì)純化的方法在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的總體回收中有優(yōu)勢(shì)，或者在維持已表達(dá)蛋白質(zhì)的活性中有優(yōu)勢(shì)。
可以從該方法中獲得的其它組分中任選地純化并且分離這樣的PPF多肽。用于純化多肽的方法可以在美國(guó)專利5,849,883中發(fā)現(xiàn)。這些文件描述了用于分離和純化G-CSF組合物的特定的例證性方法，所述G-CSF組合物在本發(fā)明的PPF多肽的分離和純化中有用。給出這些專利的公開內(nèi)容后，本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將了解用于從給定來(lái)源純化PPF多肽的多種純化技術(shù)。
也可以預(yù)期到，陰離子交換和免疫親和層析的組合可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的純化的PPF多肽組合物。
藥物組合物本發(fā)明也涉及藥物組合物，其包括治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的至少一種PPF多肽，或者其藥學(xué)可接受的鹽，以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體，它們?cè)赑PF多肽的送遞中有用。這樣的組合物可以包括具有不同的緩沖液內(nèi)容物(例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、TRIS)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋物；添加劑，如表面活性劑和增溶劑(例如失水山梨糖醇單油酸酯、卵磷脂、Pluronics、Tween 20&80、Polysorbate 20&80、丙二醇、乙醇、PEG-40、十二烷基硫酸鈉)，抗氧化劑(例如一硫代甘油，抗壞血酸，乙酰半胱氨酸，亞硫酸鹽(二亞硫酸鹽和偏亞硫酸氫鹽)，防腐劑(例如苯酚、間甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯(甲酯、丙酯、丁酯)，苯扎氯銨，氯丁醇，硫柳汞，苯基汞鹽，(醋酸鹽、硼酸鹽、硝酸鹽)，和滲透壓調(diào)節(jié)劑/填充劑(甘油，氯化鈉，甘露醇，蔗糖，海藻糖，右旋糖)；將材料引入到聚合化合物的顆粒制劑中，如聚乳酸，聚乙醇酸等等，或者與脂質(zhì)體締合。這樣的組合物將影響本發(fā)明的PYY類似物多肽的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率，以及體內(nèi)清除率。例如參見Remington’s Pharmaceutical Sciences 1435-712，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990)。
通常，從藥理學(xué)性質(zhì)考慮，本發(fā)明的PPF多肽與PP、PYY或者NPY以同樣的方式起作用。一個(gè)優(yōu)選的用途是外周施用這樣的PPF多肽，用于治療或者預(yù)防代謝狀況和紊亂。尤其是，本發(fā)明的化合物具有作為降低營(yíng)養(yǎng)物可利用性、減少食物攝取以及影響體重減輕的活性試劑。
本發(fā)明的PPF多肽可以被制劑化用于外周施用，包括用于注射、口服施用、經(jīng)鼻施用、肺部施用、局部施用或本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它施用類型的制劑。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用可以通過(guò)任何普通途徑進(jìn)行，只要可通過(guò)該途徑達(dá)到目標(biāo)組織。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物可以通過(guò)任何傳統(tǒng)的外周方法引入對(duì)象，例如通過(guò)靜脈、皮內(nèi)、肌內(nèi)、乳腺內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、球后、肺內(nèi)(例如定期釋放)；通過(guò)口服、舌下、鼻、肛門、陰道或者經(jīng)皮送遞或者通過(guò)在特定位置外科植入。在一定時(shí)期內(nèi)可以進(jìn)行單劑或者多劑處理。也可以預(yù)期到本發(fā)明的組合物的受控連續(xù)釋放。
制劑可以是液體或者可以是固體，如凍干制劑，用于重配。本發(fā)明的水性組合物包括有效量的PPF多肽，其溶解或者分散在藥學(xué)可接受的載體或者水性介質(zhì)中。短語(yǔ)“藥學(xué)或者藥理學(xué)可接受的”是指，當(dāng)施用于動(dòng)物或者人時(shí)，不產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、或者其它不適反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。正如此處所用的，“藥學(xué)可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲劑及其類似物。這些介質(zhì)和試劑用作藥學(xué)上有活性的物質(zhì)，這在本技術(shù)領(lǐng)域是熟知的。除了任何傳統(tǒng)介質(zhì)或者試劑與活性成分不相容的情況之外，其在治療組合物中的用途是可以預(yù)期到的。附加活性成分也可以被引入組合物中。在一些情況下，可以方便地將PPF多肽和另一種減少食物攝取、減少血漿葡萄糖或改變血漿脂質(zhì)的試劑，如支鏈淀粉或支鏈淀粉激動(dòng)劑類似物、CCK或CCK激動(dòng)劑、或瘦蛋白或消蛋白激動(dòng)劑、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽肽激動(dòng)劑類似物，和小分子大麻素(cannabinoid)CB1受體拮抗劑、β-羥基類固醇脫氫酶-1抑制劑、西布他明(sibutramine)和其它所出售的用于治療肥胖癥的藥物提供在單一組合物或用于一起施用的容易中。在其它情況下，與所述PPF多肽分開施用其它試劑可能更有利。
本發(fā)明的PPF多肽可以制備為不含堿的溶液、或者藥理學(xué)可接受的鹽來(lái)施用，其在水中合適地與表面活性劑(例如失水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80)、卵磷脂、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Pluronics)、羥丙基纖維素)或者配位劑(例如羥丙基-b-環(huán)糊精、硫丁醚-b-環(huán)糊精(Captisol)、聚乙烯吡咯烷酮)混合。藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(用蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，用無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸或磷酸形成的鹽，或者有機(jī)酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及其類似的有機(jī)酸形成的鹽。用游離羧基形成的鹽也可以來(lái)源于無(wú)機(jī)堿，如鈉、鉀、銨、鈣、或者氫氧化鐵，和這樣的有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因及其類似物。這樣的產(chǎn)物可以容易地通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員熟知的方法制備。分散體也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物中制備，以及在油中制備。在一般的存儲(chǔ)和使用條件下，這些制劑含有防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物被制劑化，以便適合于腸胃外施用，例如通過(guò)注射或者輸注。優(yōu)選地，PPF多肽被懸浮在含水載體中，例如，在pH為大約3.0到大約8.0的緩沖溶液中，pH優(yōu)選地為大約3.5到大約7.4，大約3.5到大約6.0，大約3.5到大約5.0，或者大約3.7到大約4.7。有用的緩沖液包括乙酸鈉/乙酸、乳酸鈉/乳酸、抗壞血酸、檸檬酸鈉-檸檬酸、碳酸氫鈉/碳酸、琥珀酸鈉/琥珀酸、組氨酸、苯甲酸鈉/苯甲酸，和磷酸鈉，和Tris(羥甲基)氨基甲烷。可以使用一種儲(chǔ)藏或者“儲(chǔ)存”緩釋制劑的形式，以便治療上有效量的制劑在經(jīng)皮注射或者送遞后的許多個(gè)小時(shí)或者許多天之內(nèi)被緩慢釋放到血流中。
適合于可注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液或者分散體，以及用于無(wú)菌可注射溶液或分散體的臨時(shí)配制的無(wú)菌粉末。在所有情況下，該形式應(yīng)該是無(wú)菌的，并且應(yīng)該具有易于注射的流動(dòng)性。要求本發(fā)明的PPF多肽在制備和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的，并且必須保護(hù)其不受微生物，如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或者分散介質(zhì)，含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，山梨糖醇、甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，及其類似物)，二甲基乙酰胺、cremorphor EL、其合適的混合物，以及油(例如大豆油、芝麻油、蓖麻油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、glycofurol、玉米油)。可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如通過(guò)使用包衣，如卵磷脂，通過(guò)在分散情況下維持所要求的顆粒大小，以及通過(guò)使用表面活性劑。微生物作用的預(yù)防可以通過(guò)多種抗細(xì)菌抗真菌試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如間甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯(甲酯、丙酯、丁酯)、氯丁醇、苯酚、苯基汞鹽(醋酸鹽、硼酸鹽、硝酸鹽)、山梨酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，將優(yōu)選地包括滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，糖、氯化鈉)。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁和凝膠)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
無(wú)菌可注射溶液可以通過(guò)在具有上面所列舉的多種其它成分的適當(dāng)溶劑中按照要求摻入所需數(shù)量的活性化合物來(lái)制備，隨后過(guò)濾滅菌。一般地，分散體通過(guò)在無(wú)菌載體中摻入多種無(wú)菌活性成分來(lái)制備，所述無(wú)菌載體含有堿性分散介質(zhì)和所需的上面所列舉的其它成分。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)通過(guò)其先前已經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生含活性成分和任何其它預(yù)期成分的粉末。
一般地，PPF化合物可以被制劑化成穩(wěn)定的、安全的藥物組合物，用于給患者施用。預(yù)期在本發(fā)明的方法中使用的藥物制劑可以包括大約0.01到20％(w/v)，優(yōu)選地0.05到10％的PPF化合物。PPF化合物可以是醋酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或者谷氨酸鹽緩沖液，允許最終組合物的pH為大約3.0到大約7.0，含有碳水化合物或者多元醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，任選地，含有大約0.005到5.0％(w/v)的選自間甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯以及苯酚的防腐劑。如果制劑化的肽將包括在多用途的產(chǎn)物中，那么通常包括這樣的防腐劑。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑可以含有濃度在如下范圍的PPF化合物，例如，大約0.01％到大約98％w/w，或者大約1到大約98％w/w，或者優(yōu)選地大約80％到90％w/w，或者優(yōu)選地大約0.01％到大約50％w/w，更優(yōu)選地大約10％到大約25％w/w?？梢允褂米銐蛄康乃糜谧⑸洌员惬@得具有期望濃度的溶液。此處描述的藥物制劑可以凍干。一種例證性的制劑可以是10mM乙酸鈉緩沖溶液中含1mg/mL PPF化合物，該緩沖液的pH為4.2，含有9.3％蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑。
一般地，治療上或者預(yù)防上有效量的本發(fā)明的PPF多肽將通過(guò)接受者的年齡、體重和疾病或疾病或代謝紊亂的嚴(yán)重程度來(lái)確定。例如參見Remington’s Pharmaceutical Sciences 697-773。也參見Wang andHanson，Parenteral Formulations of Proteins and PeptidesStabilityand Stabilizers，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Supp.422S(1988)。典型地，可以使用大約0.001μg/kg體重/天到大約1000μg/kg體重/天的劑量，但正如熟練醫(yī)師將認(rèn)識(shí)到的，可以使用更多或者更少的劑量。定量給藥可以是每天一次、兩次、三次、四次或者更多次，或者頻率低一些，如一周一次，一月一次，或者一季度一次，這依賴于該制劑，并且可以與此處描述的其它組合物一起使用。應(yīng)該注意到，本發(fā)明不限于此處所列舉的劑量。
適當(dāng)?shù)膭┝靠梢酝ㄟ^(guò)使用已建立的用于確定代謝狀況或者紊亂的測(cè)定方法并結(jié)合相關(guān)的劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)一起來(lái)確定。最終劑量方案通過(guò)主治醫(yī)生來(lái)確定，要考慮改變藥物作用的因素，例如藥物的比活性，受損的嚴(yán)重程度和患者的反應(yīng)，患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴(yán)重程度、施用時(shí)間和其它臨床因素。隨著研究的進(jìn)展，關(guān)于適當(dāng)劑量水平和用于特定疾病和狀況的治療時(shí)間的進(jìn)一步信息將出現(xiàn)。
有效的劑量通常在大約0.5到30μg到大約5mg/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在大約10到30μg到大約2mg/天，更優(yōu)選地在大約5到100μg到大約1mg/天，最優(yōu)選地在大約5μg到大約500μg/天，單次施用，或以兩次、三次、四次或更多次的分次施用。因此，例證性的劑量可以來(lái)自一天內(nèi)所給予的藥物總量和一天內(nèi)所施用的劑數(shù)。例如，例證性劑量可以在大約0.125μg/劑(0.5μg，每天給予四次)到大約2mg/劑(2mg，每天給予一次)的范圍內(nèi)。其它劑量可以為大約0.01到大約100μg/kg/劑。將被施用的精確劑量可以由本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)確定，該劑量依賴于特定化合物的效能，以及依賴于個(gè)體的年齡、體重和身體狀況。施用應(yīng)該在期望抑制營(yíng)養(yǎng)物可利用性、食物攝取、體重、血糖或者血漿脂質(zhì)降低的任何時(shí)候開始，例如在第一次有癥狀時(shí)，或者在診斷出肥胖癥、糖尿病或者胰島素抗性綜合征后不久。施用可以通過(guò)任何途徑進(jìn)行，例如注射，優(yōu)選地是皮下或者肌內(nèi)、口服、經(jīng)鼻、經(jīng)皮等等。用于某些途徑的劑量，例如口服施用，因其生物利用度的降低，可以增加，例如大約5-100倍。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在藥物制劑將被腸胃外施用的情況下，組合物是制劑，以便送遞的PPF多肽的劑量為0.1μg/kg到100mg/kg體重/天，優(yōu)選地是1μg/kg到大約50mg/kg體重/天的劑量。例證性的每日量的下限為2、5、10、20、40、60或80，上限為80、100、150、200或250。腸胃外施用可以用初始劑量進(jìn)行，隨后連續(xù)地輸注以維持藥物產(chǎn)品的治療循環(huán)水平。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地最優(yōu)化有效劑量和施用，正如可通過(guò)良好的醫(yī)療實(shí)踐和個(gè)體患者的臨床狀況確定。
定量施用的頻率將依賴于試劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)和施用途徑。最優(yōu)藥物制劑將通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)施用途徑和所需劑量來(lái)確定。例如參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，supra，pages 1435-1712。這樣的制劑可以影響所施用試劑的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。依賴于施用途徑，可以根據(jù)體重、體表面積或者器官大小來(lái)計(jì)算合適的劑量。確定適當(dāng)?shù)闹委焺┝克枰倪M(jìn)一步的精算由本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員用常規(guī)方法確定，尤其是根據(jù)此處公開的劑量信息和測(cè)定方法，以及在動(dòng)物或者人臨床試驗(yàn)中所觀察到的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
應(yīng)該意識(shí)到，本發(fā)明的藥物組合物和治療方法在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有用。因此，將被處理的對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地是人類或者其它動(dòng)物。對(duì)于獸醫(yī)學(xué)的目的，對(duì)象包括，例如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，包括牛、綿羊、豬、馬和山羊，寵物如狗和貓，野生和/或動(dòng)物園動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉(cāng)鼠；以及家禽如雞、火雞、鴨和鵝。
此外，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包括本發(fā)明的PPF多肽，適于制備用于藥學(xué)應(yīng)用的本發(fā)明所述PPF多肽的成分，和所述PPF多肽和藥學(xué)應(yīng)用成分的使用說(shuō)明書。
為了有助于理解本發(fā)明，本發(fā)明包括了下面的實(shí)施例。與本發(fā)明相關(guān)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)然不應(yīng)該被解釋為特別地限制本發(fā)明，并且，將在本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員范圍內(nèi)的、現(xiàn)在已知或者以后要開發(fā)的本發(fā)明的這些變化，被認(rèn)為落入此處所描述的本發(fā)明以及后面權(quán)利要求所要求的范圍內(nèi)。
實(shí)施例參考下面的非限定性實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述，提供這些實(shí)施例用于更全面地描述本發(fā)明，但不應(yīng)該解釋為限制其范圍。這些實(shí)施例例證性說(shuō)明了本發(fā)明的PPF多肽的制備，以及本發(fā)明的這些PPF多肽的體外和/或體內(nèi)測(cè)試。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，在這些實(shí)施例中所描述的技術(shù)代表發(fā)明人所描述的技術(shù)，其在本發(fā)明的實(shí)踐中可以發(fā)揮很好的作用，同樣地，構(gòu)成用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選模式。然而，應(yīng)該意識(shí)到，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該按照本發(fā)明的公開內(nèi)容，意識(shí)到在所公開的特定方法中可以做出不背離本發(fā)明的精神和范圍的很多變化，仍然可以獲得相同或者類似的結(jié)果。
實(shí)施例1.PPF多肽的制備本發(fā)明的肽可以在Symphony肽合成儀(Protein Technologies，Inc)上組裝，其中使用Rink酰胺樹脂(Novabiochem)，其負(fù)載為0.43-0.49mmol/g，在0.050-0.100mmol。Fmoc氨基酸(5.0eq，0.250-.500mmol)殘基以0.10M的濃度溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中。所有其它試劑(HBTU，1-羥基苯并三唑水合物和N，N-二異丙基乙胺)制備為0.55M二甲基甲酰胺溶液。然后使用HBTU(2.0eq，0.100-0.200mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(1.8eq，0.090-0.18mmol)、N，N-二異丙基乙胺(2.4eq，0.120-0.240mmol)，使Fmoc保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到與樹脂結(jié)合的氨基酸上，結(jié)合2小時(shí)。在最后的氨基酸偶聯(lián)之后，使用二甲基甲酰胺中的20％(v/v)哌啶對(duì)肽去保護(hù)1小時(shí)。一旦肽序列是完全的，Symphony肽合成儀根據(jù)程序來(lái)切割樹脂。使用93％TFA、3％苯酚、3％水和1％三異丙基硅烷對(duì)進(jìn)行1小時(shí)三氟乙酸(TFA)對(duì)來(lái)自樹脂肽的切割。所切下的肽使用叔丁基甲醚沉淀，通過(guò)離心沉淀成團(tuán)，并且凍干。將成團(tuán)沉淀重新溶解在水中(10-15mL)，過(guò)濾并且通過(guò)反相HPLC，使用含有0.1％TFA的C18柱和乙腈/水梯度純化。所得到的肽通過(guò)反相HPLC純化到均質(zhì)，純度通過(guò)LCMS確認(rèn)。
用脂肪酸(例如辛酸和硬脂酸)對(duì)本發(fā)明的肽進(jìn)行N末端封端的一般方法如下rink酰胺樹脂上的肽(0.1mmol)懸浮在NMP(5mL)中。在獨(dú)立的小瓶中，將HBTU(0.3mmol)、HOBt(0.3mmol)溶解在DMF(5mL)中，隨后加入DIEA(0.6mmol)。該溶液被加入到樹脂中，將懸液振蕩2小時(shí)。過(guò)濾溶劑，用NMP(5mL×4)和CH2Cl2(20mL)徹底洗滌，干燥，進(jìn)行TFA切割1小時(shí)。切割和純化后，目標(biāo)肽的產(chǎn)率是約40mg。
PEG修飾可以在溶液中，在賴氨酸的游離ε-氨基或者已純化肽的末端氨基上，使用商品化的活化PEG酯進(jìn)行。所得到的PEG化衍生物通過(guò)反相HPLC被純化到均質(zhì)，純度通過(guò)LC/MS和MALDI-MS確認(rèn)。
本發(fā)明的PPF多肽可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常已知的結(jié)合試驗(yàn)在多種Y-受體結(jié)合試驗(yàn)中檢測(cè)。這樣的測(cè)定方法包括下面描述的那些方法。
NPY Y1受體結(jié)合測(cè)定法從SK-N-MC細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備膜，這些細(xì)胞可以內(nèi)源地表達(dá)神經(jīng)肽Y1受體。用60pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)，以及用未標(biāo)記的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在環(huán)境溫度下與膜共溫育60分鐘。然后使用Perkin Elmer平板收集儀將孔內(nèi)容物收集到96孔玻璃纖維平板上。將干燥的玻璃纖維平板與閃爍劑混合，在Perkin Elmer閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。
NPY Y2受體結(jié)合測(cè)定法從SK-N-BE細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備膜，這些細(xì)胞可以內(nèi)源地表達(dá)神經(jīng)肽Y2受體。用30pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Scienees)，以及用未標(biāo)記的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在環(huán)境溫度下與膜共溫育60分鐘。然后使用Perkin Elmer平板收集儀將孔內(nèi)容物收集到96孔玻璃纖維平板上。將干燥的玻璃纖維平板與閃爍劑混合，在Perkin Elmer閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。
NPY Y4受體結(jié)合測(cè)定法將CHO-K1細(xì)胞用編碼神經(jīng)肽Y4基因的cDNA短暫轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后，從細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備膜。用18pM[125I]-人胰腺多肽(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)，以及用未標(biāo)記的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在環(huán)境溫度下與膜共溫育60分鐘。然后使用Perkin Elmer平板收集儀將孔內(nèi)容物收集到96孔玻璃纖維平板上。將干燥的玻璃纖維平板與閃爍劑混合，在Perkin Elmer閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。
NPY Y5受體結(jié)合測(cè)定法將CHO-K1細(xì)胞用編碼神經(jīng)肽Y5基因的cDNA短暫轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后，從細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備膜。用44pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Seiences)，以及用未標(biāo)記的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在環(huán)境溫度下與膜共溫育60分鐘。然后使用Perkin Elmer平板收集儀將孔內(nèi)容物收集到96孔玻璃纖維平板上。將干燥的玻璃纖維平板與閃爍劑混合，在Perkin Elmer閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。
通過(guò)實(shí)施例的方式，表2示范性說(shuō)明了本發(fā)明的某些優(yōu)選的PPF多肽，以及這些PPF多肽在各種Y受體結(jié)合測(cè)定法中的活性，如上面所描述的Y受體結(jié)合測(cè)定法。








實(shí)施例2.PPF多肽在食物攝取測(cè)定試驗(yàn)中抑制食物攝取以0600的光照，12∶12小時(shí)光∶暗循環(huán)，將雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周齡)分組飼養(yǎng)。除非另外表明，隨意食用水和標(biāo)準(zhǔn)成粒的小鼠飼料。在實(shí)驗(yàn)前的一天，從大約1500小時(shí)開始，給動(dòng)物禁食。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的早晨，將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組。在典型的研究中，n＝4籠，每籠3只小鼠。
在t＝0分鐘時(shí)，給所有動(dòng)物腹腔注射賦性劑或者化合物，注射量在大約10nmol/kg到100nmol/kg的范圍內(nèi)，立即給予預(yù)先稱重量(10-15g)的標(biāo)準(zhǔn)食物。取出食物，在30、60和120分鐘稱重，以確定所消耗的食物的量(Morley，F(xiàn)lood等人，Am.J.Physiol.267R178-R184，1994)。從最初在t＝0時(shí)刻所提供的食物的重量中，減去例如30、60、120、180和/或240分鐘時(shí)間點(diǎn)后所保留的食物的重量，計(jì)算出食物攝取量。通過(guò)方差分析鑒別出有顯著的處理效果(p＜0.05)。在存在顯著差異的情況下，使用Dunnett檢驗(yàn)(Prism v.2.01，GraphPadSoftware Inc.，San Diego，California)將實(shí)驗(yàn)方法與對(duì)照方法比較。
圖1-4示范性說(shuō)明了本發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)選的PPF多肽在上面描述的食物攝取測(cè)定試驗(yàn)中減少累積食物攝取的能力。
實(shí)施例3.PPF多肽降低高脂肪喂飼的(飲食誘導(dǎo)的肥胖或者DIO)C57BL/6小鼠和高脂肪喂飼HSD大鼠的體重增加小鼠用高脂肪(HF，58％的飲食千卡為脂肪)或低脂肪(LF，11％的飲食千卡為脂肪)食物飼養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠(在研究開始時(shí)為4周齡)。在喂飼4周后，將滲透泵(Alzet#2002)植入每一小鼠，該滲透泵可以皮下送遞預(yù)定劑量的PPF多肽，持續(xù)送遞兩周。每周測(cè)量體重和食物攝取(Surwit等人，Metabolism-Clinical andExperimental，44645-51，1995)。實(shí)驗(yàn)化合物的效力被表示為每一處理組的至少14只小鼠的體重改變百分比(即從最初體重的改變百分比)的平均值+/-sd(p＜0.05ANOVA，Dunnett檢驗(yàn)，Prism v.2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，California)。
大鼠在處理前一夜，將消耗高脂肪食物(45％的千卡來(lái)自脂肪)的雄性Sprague-Dawley大鼠(平均體重＝415)分為兩個(gè)處理組，分組是基于相同的24小時(shí)食物攝取。在實(shí)驗(yàn)的晚上，在避光之前(1800h)，每只動(dòng)物接受一次賦形劑(10％DMSO)或化合物(1mg/kg)的IP注射，然后單獨(dú)放置到DietPro自動(dòng)喂飼籠中。每一籠子有一個(gè)食物儲(chǔ)藏箱，放置在連接到計(jì)算機(jī)的天平上，以及包括一個(gè)水瓶。在隨后的24小時(shí)記錄每小時(shí)的食物攝取(以克為單位)。動(dòng)物連續(xù)六個(gè)夜晚接受注射。每晚記錄體重。
圖5-6示范性說(shuō)明了本發(fā)明的幾個(gè)PPF多肽在上面描述的DIO小鼠測(cè)定試驗(yàn)中降低體重的能力。圖7示范性說(shuō)明了，在幾個(gè)夜晚，在高脂肪飲食的大鼠中，每日一次注射導(dǎo)致顯著的體重降低(P＜.05)。進(jìn)一步，圖8示范性說(shuō)明了，本發(fā)明的PPF多肽表現(xiàn)出比PYY(3-36)在食物攝取測(cè)定和DIO小鼠測(cè)定中的效能更高的效能。
實(shí)施例4.PPF多肽降低血壓使用遙測(cè)技術(shù)，將以12∶12小時(shí)光照∶黑暗循環(huán)，在22.8±0.8℃的溫度下飼養(yǎng)的雄性Harlan Sprague Dawley大鼠用于研究PPF多肽對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的影響。試驗(yàn)在光照循環(huán)下進(jìn)行。遙測(cè)技術(shù)允許實(shí)時(shí)讀取血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括動(dòng)脈血壓、心率和動(dòng)脈dP/dt，通過(guò)在有知覺的、未麻醉的、未受到抑制的大鼠中植入的無(wú)線電發(fā)射器讀取。在本實(shí)施例中，通過(guò)遠(yuǎn)程靜脈內(nèi)定量施用對(duì)大鼠注射賦形劑，10nmol/kg PYY，10nmol/kg PYY(3-36)或者10nmol/kg的幾種PPF多肽。遠(yuǎn)程靜脈內(nèi)定量施用通過(guò)埋入的血管接觸端口(Access Technologies(Skokie，IL))實(shí)現(xiàn)。該端口縫合于肩胛骨之間的緊挨皮膚下面的肌肉內(nèi)。導(dǎo)管位于頸靜脈中。在注射后收集最多60分鐘的數(shù)據(jù)。
正如圖9A-B所示，化合物1增加平均動(dòng)脈壓的效果類似于PYY(3-36)的效果。圖9C-D表明，盡管化合物3增加平均動(dòng)脈壓并且降低心率的效果與PYY(1-36)的效果類似，但那些效果被化合物2減弱。
實(shí)施例5.PYY和PYY激動(dòng)劑的抗分泌效果胃酸的分泌將雄性Harlan Sprague Dawley大鼠以12∶12小時(shí)光照∶黑暗循環(huán)，在22.8±0.8℃的溫度下飼養(yǎng)。試驗(yàn)在光照循環(huán)中進(jìn)行。這些動(dòng)物，喂飼大鼠食料(Teklad LM 485，Madison，WI)進(jìn)行飼養(yǎng)，在試驗(yàn)前大約20小時(shí)禁食。它們可以隨意進(jìn)水，直到試驗(yàn)開始。
通過(guò)外科手術(shù)給大鼠(11-16周齡，體重291-365g)配備上由DavidOsborne(Department of Biology，UCLA)定制生產(chǎn)的胃瘺管。稱量過(guò)夜禁食大鼠的體重，去掉它們的胃瘺管的蓋子，連接到有彈性的Tygon管子(3/8×1/16)上，該管子被連接到一條延伸到胃中的PE205管子上。通過(guò)狹窄的PE205管子注射鹽水，收集Tygon管子的流出物。為了確保瘺管和空胃適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)，用約5ml的室溫鹽水溶液將胃沖洗幾次，直到流動(dòng)容易，并且流出物清澈。通過(guò)注射5mL的鹽水(pH 7.0)，隨后注射3ml的空氣，并且收集流出物，以10分鐘為時(shí)間間隔測(cè)量胃酸分泌。使用pH計(jì)(Beckman model number PHI34 Fullerton，CA)，用0.01N氫氧化鈉將3ml每一胃抽出物滴定到7.0。每次滴定所需要的堿的量，校正為所收集的總體積，被用于計(jì)算每一樣品中酸的摩爾數(shù)。
在收集了基線樣品后，記錄所回收的體積，給動(dòng)物皮下注射125μg/kg五肽胃泌素(Sigma，lot#40K0616)，然后再次持續(xù)2小時(shí)的10分鐘胃取樣。在注射五肽胃泌素40分鐘后，當(dāng)?shù)湫偷赜^察到胃酸分泌的穩(wěn)定平臺(tái)時(shí)，給大鼠皮下注射(PYY[3-36])，每只動(dòng)物的劑量為1、3、10、100μg，或者鹽水(n分別為3、2、4、4、6)，(3.45、10.34、34.5、344.8μg/kg)。
正如圖10中所示，胃酸排出表示為五肽胃泌素刺激的分泌的百分比，計(jì)算為注射五肽胃泌素后，在時(shí)間點(diǎn)20、30和40分鐘的平均值。在注射40分鐘后對(duì)五肽胃泌素產(chǎn)生應(yīng)答，胃酸分泌從9.3±5.8μmol/10分鐘的基本速率增加到62.8±3.8μmol/10分鐘，增加了6.8倍(總平均P＜0.01)。在注射五肽胃泌素40分鐘后注射PYY(3-36)，其劑量依賴地并且顯著地抑制胃酸產(chǎn)生。用10μg和100μg PYY(3-36)的劑量，酸分泌被分別降低了74.7±7.2％和84.7±9.7％(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01；t-檢驗(yàn)，PYY(3-36)注射后20分鐘)(參見圖11-17中的t＝60分鐘)。PYY(3-36)抑制五肽胃泌素刺激的酸分泌的劑量反應(yīng)如圖11所示。PYY(3-36)的抗酸效果的ED50是11.31μg/kg±0.054log單位。
胃的排空為了確定PYY[3-36]對(duì)于胃排空的影響，使用最后區(qū)(APx)有真空抽吸損傷的有知覺的、未禁食的雄性Harlan Sprague Dawley大鼠，和假手術(shù)大鼠。試驗(yàn)在手術(shù)后至少2周進(jìn)行(體重426±8g)，3周后再次進(jìn)行試驗(yàn)(體重544±9g)。將大鼠隨機(jī)地分為處理組。所有大鼠在22.7℃飼養(yǎng)，以12∶12小時(shí)光照∶黑暗為循環(huán)(試驗(yàn)在光照循環(huán)中進(jìn)行)，并且隨意地喂飼并且飲水(diet LM-485 Teklad，Madison，Wisconsin，USA)。
在1ml 5μCi D-[3-3H]-水溶葡萄糖(lot #3165036 Dupont，Wilmington，DE，USA)灌胃前5分鐘，將溶解在鹽水中的PYY[3-36]以0.1ml皮下注射施用，劑量為0、1或者10μg。在給動(dòng)物給予口服液體食物后，皮下給予賦形劑或者不同劑量的PYY。
有15個(gè)處理組(1)對(duì)照鹽水n＝4(2)對(duì)照3μg/kg n＝3(3)對(duì)照30μg/kgn＝4(4)對(duì)照90μg/kgn＝5(5)對(duì)照300μg/kg n＝5(6)假鹽水 n＝5(7)假3μg/kg n＝2(8)假30μg/kg n＝4(9)假90μg/kg n＝3(10)假300μg/kgn＝5(11)Apx鹽水n＝5(12)APx 3μg/kgn＝3(13)APx 30μg/kg n＝3(14)APx 90μg/kg n＝3(15)APx 300μg/kg n＝5在灌胃后-15、0、5、15、30、60和90分鐘，從麻醉的大鼠尾收集血液用于測(cè)量，分離血漿以測(cè)量血漿葡萄糖來(lái)源的氚(CPM/10μl，在β-計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù))。血漿中氚的出現(xiàn)以前已經(jīng)顯示出反映了胃的排空。使用梯形法計(jì)算血漿中出現(xiàn)的總氚，作為高于氚灌胃之前的氚水平的增量(曲線下面的面積，計(jì)算30分鐘)。
在未手術(shù)大鼠中，PYY[3-36]劑量依賴性地抑制了標(biāo)記物的出現(xiàn)，(對(duì)于30μg/kg，90μg/kg，300μg/kg PYY[3-36]，分別為10.5±1.5，7.26±1.52和3.20±1.21cpm/μL分鐘；P＜0.0001ANOVA；圖12)。與鹽水注射的對(duì)照組相比，在假-AP大鼠中，10μg(n＝4)和30μg PYY[3-36]注射(n＝3)也劑量依賴地延遲了標(biāo)記物的出現(xiàn)(分別為11.89±3.23，9.88±2.45，18.94±3.23cpm/μL/min；P＜0.05)。與完全沒有手術(shù)的大鼠相比，假手術(shù)動(dòng)物中PYY的最大效力比較小，ED50也低于未手術(shù)動(dòng)物(從43.77下降到10.20μg/kg PYY[3-36]。在APx大鼠中，與假APx或未手術(shù)大鼠(9.38±3.25cpm/μL/min；P＜0.05，0.05)中的胃排空相比，其胃排空被減慢，但沒有因?yàn)槭┯肞YY[3-36]而有所改變?；貧w分析確認(rèn)了不存在劑量依賴性。
結(jié)果顯示PYY9[3-36]有效地調(diào)節(jié)了正常Sprague Dawley大鼠中的胃排空速率。在注射PYY(10，30和100μg/大鼠)后，觀察到依賴于劑量的胃排空抑制。100μg劑量的PYY產(chǎn)生了與支鏈淀粉(10μg)所引起的抑制類似數(shù)量級(jí)的抑制。與未手術(shù)和假手術(shù)大鼠(n.s.)相比，AP-損傷的動(dòng)物有延遲胃排空的傾向。PYY[3-36]施用在AP損傷的動(dòng)物中對(duì)胃排空沒有額外的影響。
膽囊的排空為了確定PYY[3-36]對(duì)膽囊排空的影響，將8周齡的雄性NIHSwiss小鼠，在22.8±0.8°的溫度下，以12∶12光∶黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，并且允許隨意地食用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物食物(Teklad LM 7012，Madison，WI)和水。在試驗(yàn)前3小時(shí)將大鼠的食物拿走。在t＝0時(shí)，PYY(3-36)、CCK-8或鹽水被皮下注射到有知覺的大鼠體內(nèi)。30分鐘后，通過(guò)頸脫位法給小鼠施以安樂(lè)死，施行中線剖腹手術(shù)，切除膽囊并且稱重。
處理組A組在t＝0皮下給予鹽水100μl，n＝14。
B組在t＝0皮下給予PYY(3-36)1μg/kg，n＝6。
C組在t＝0皮下給予PYY(3-36)10μg/kg，n＝10。
D組在t＝0皮下給予PYY(3-36)100μg/kg，n＝8。
E組在t＝0皮下給予CCK-81μg/kg，n＝3。
F組在t＝0皮下給予CCK-810μg/kg，n＝3。
G組在t＝0皮下給予PYY(3-36)10μg/kg+CCK-81μg/kg，n＝4。
H組在t＝0皮下給予PYY(3-36)10μg/kg+CCK-810μg/kg，n＝4。
結(jié)果如圖18和19中所示。PYY(3-36)劑量依賴性地抑制了基礎(chǔ)膽囊排空，ED50值為9.94μg/kg±0.24對(duì)數(shù)單位。相對(duì)于在注射鹽水的對(duì)照組中所觀察的膽囊重量(A組)，最大劑量(D組)使膽囊重量增加了168％(P＜0.005)。PYY(3-36)不影響CCK-8刺激的膽囊排空。這些數(shù)據(jù)表明PYY[3-36]通過(guò)不依賴于CCK的途徑抑制了膽囊排空。應(yīng)答外源CCK的膽囊排空不受PYY(3-36)的影響。類似的結(jié)果可以用PYY[1-36]在有知覺的狗中獲得；400ng/kg快速濃注+800pmol/kg/h輸注不抑制CCK-8刺激的膽囊收縮。
通過(guò)迷走神經(jīng)-膽堿能途徑調(diào)節(jié)PYY(3-36)對(duì)膽囊排空的影響是可能的。該思路得到如下發(fā)現(xiàn)的支持，即特定肽YY(PYY)結(jié)合位點(diǎn)最近已經(jīng)在大鼠的最后區(qū)、孤束核以及背運(yùn)動(dòng)核區(qū)域(總稱為背髓迷走復(fù)合體(DVC))中通過(guò)放射自顯影技術(shù)得到測(cè)定。這些脊髓腦干區(qū)域負(fù)責(zé)胃腸功能的迷走-迷走反射控制，包括運(yùn)動(dòng)和分泌。PYY(3-36)抑制通過(guò)迷走神經(jīng)-膽堿能機(jī)理調(diào)節(jié)的其它消化功能，如胃排空。
實(shí)施例6.PYY和PYY激動(dòng)劑的胃保護(hù)作用將雄性Harlan Sprague Dawley大鼠，在22.8±0.8°的溫度下，以12∶12光∶黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，允許隨意食用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物(TekladLM 485，Madison，WI)和水。在試驗(yàn)前大約20小時(shí)，對(duì)這些大鼠禁食，大鼠重200-220gm。
在t＝-30，皮下注射PYY(3-36)或鹽水。在t＝0，灌胃1ml無(wú)水乙醇(乙醇-200標(biāo)準(zhǔn)無(wú)水乙醇U.S.P.，punctilious)或鹽水。在t＝30，用5％異氟烷麻醉大鼠。采用中線剖腹切開術(shù)。露出胃，并且在幽門和下食管括約肌上連接。切除胃，沿著胃小彎打開，外翻露出粘膜。用鹽水輕輕地沖洗粘膜，由不知道處理的觀察者評(píng)價(jià)其損害(潰瘍、擴(kuò)張的血管、粘膜襯的脫落)。粘膜損害的得分在0(沒有損害)和5(充血和潰瘍覆蓋了100％的胃)之間。
處理組A組在t＝-30皮下給予鹽水100μl，在t＝0灌胃1ml H2O，n＝4。
B組在t＝-30皮下給予鹽水100μl，在t＝0灌胃1ml無(wú)水乙醇，n＝6。
C組在t＝-30給予PYY(3-36)1μg/kg，在t＝0灌胃1ml無(wú)水乙醇，n＝5。
E組在t＝-30給予PYY(3-36)100μg/kg，在t＝0灌胃1ml無(wú)水乙醇，n＝5。
F組在t＝-30給予PYY(3-36)300μg/kg，在t＝0灌胃1ml無(wú)水乙醇，n＝5。
在注射10、100和300μg/kg的PYY(3-36)后，PYY(3-36)劑量依賴性地降低損傷得分，分別降低了27.4±6.4，29.3±11.6和53.7±7.9％(n＝4，5，5，p＜0.05ANOVA)(圖20)。PYY[3-36]在大鼠中顯示了胃保護(hù)作用。內(nèi)源循環(huán)PYY[3-36]在控制胃酸分泌以及保護(hù)胃粘膜中起著生理作用。
下表給出了某些優(yōu)選的PPF多肽，但也可以預(yù)見到其它多肽。




















盡管已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例和實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但可以理解，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言可以做變化和修飾。因此，可以預(yù)期到所附權(quán)利要求覆蓋了所有等同的變化，這些變化在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種PPF多肽，其包括式(I)的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28Xaa29Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser，Thr或者不存在；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，Asp，或者不存在；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser，或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Asp，Thr，或者高絲氨酸；Xaa25是Arg，高精氨酸，Lys，高賴氨酸，Orn，或者Cit；Xaa26是His，Ala，Arg，高精氨酸，Lys，高賴氨酸，Orn，或者Cit；Xaa27是Tyr或者Phe；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa29是Asn或者Gln；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述PPF多肽不是天然PPF多肽，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(4-36)，Ala1NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或hPP(19-23)-pNPY。
2.如權(quán)利要求1的PPF多肽，進(jìn)一步的前提是所述PPF多肽不包括Phe27hPYY(3-36)，Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Gln29hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Lys25Phe27hPYY(3-36)，Lys25Ile28hPYY(3-36)，Lys25Val28hPYY(3-36)，Lys25Gln29hPYY(3-36)，Lys25Val30hPYY(3-36)，Lys25Ile31hPYY(3-36)，Lys25Leu31hPYY(3-36)，Lys25Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile28hPYY(3-36)，Phe27Val28hPYY(3-36)，Phe27Gln29hPYY(3-36)，Phe27Val30hPYY(3-36)，Phe27Ile31hPYY(3-36)，Phe27Leu31hPYY(3-36)，Phe27Phe36hPYY(3-36)，Gln29Val30hPYY(3-36)，Gln29Ile31hPYY(3-36)，Gln29Leu31hPYY(3-36)，Gln29Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，或者Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
3.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述PPF多肽進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)插入。
4.如權(quán)利要求3的PPF多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)插入包括一個(gè)或者多個(gè)氨基酸插入。
5.如權(quán)利要求3的PPF多肽，其中所述多肽包括選自SEQ ID NO54-SEQ ID NO87的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求3的PPF多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)插入包括一個(gè)或者多個(gè)選自修飾的氨基酸、非天然氨基酸和非氨基酸的插入。
7.如權(quán)利要求6的PPF多肽，其中所述多肽包括選自SEQ ID NOs131-132，150-156，160，180-186，207-210，219-220，252，265，275，281，286，287，289-293和313的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽被連接到一個(gè)或者多個(gè)水溶性聚合物上。
9.如權(quán)利要求8的PPF多肽，其中所述聚合物選自聚乙二醇和脂肪酸分子，其中所述聚乙二醇和脂肪酸分子連接到多肽的N末端或者C末端，或者多肽的序列內(nèi)的賴氨酸或絲氨酸殘基的側(cè)鏈上。
10.如權(quán)利要求9的PPF多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NOs187-197。
11.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括一個(gè)β-轉(zhuǎn)角的插入，所述β-轉(zhuǎn)角包括選自模擬物A、模擬物B、Ala-(2-氨基異丁酸)和Ala-Pro的二肽。
12.如權(quán)利要求11的PPF多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NOs211-247。
13.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式II的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，或hPP(1-17)-pNPY。
14.如權(quán)利要求13的PPF多肽，進(jìn)一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
15.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式III的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，NPY(2-36)，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或者h(yuǎn)PP(19-23)-pNPY。
16.如權(quán)利要求15的PPF多肽，進(jìn)一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
17.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式IV的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正纈氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高賴氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，Val，Ile，或者M(jìn)et；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，或者Val3hPYY(3-36)。
18.如權(quán)利要求17的PPF多肽，進(jìn)一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
19.如權(quán)利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式V的氨基酸序列Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Tyr Xaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31ThrArg Gln Arg Xaa36其中Xaa3是Ile，Ala，Pro，Ser，Thr，或者正纈氨酸；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Glu，Asp，d-Ala，高賴氨酸，或者高精氨酸；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羥脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正纈氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高絲氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正纈氨酸，或者Ile；Xaa31是Ala或者Val；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，或者Trp；前提是所述多肽不是天然PPF多肽。
20.一種PPF多肽，其包含選自SEQ ID NOs93，95-96，110，114-115，118，120，124-129，139-141，146-149，158，161-164，167-168，170-171，174-186，198-SEQ ID NO206，253-254，294，300-301和SEQ ID NOs314-317的氨基酸序列。
21.一種PPY多肽，其包括選自SEQ ID NOs7-29的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的胰多肽家族(“PPF”)多肽。本發(fā)明的PPF多肽一般地包括至少兩個(gè)PPF基序，與PYY(3－36)的全長(zhǎng)序列具有至少50％的序列同一性，并且通常將保留，至少部分地保留，PP、PYY或者NPY的生物活性。本發(fā)明的優(yōu)選PPF多肽是那些在此處描述的測(cè)定(優(yōu)選地是食物攝取、胃排空、胰分泌或者體重減輕測(cè)定)之一中具有效能的多肽，該效能大于相同測(cè)定試驗(yàn)中PP、NPY、PYY或PYY(3－36)的效能。一方面，本發(fā)明的PPF多肽包括新穎的PYY類似物多肽。另一方面，本發(fā)明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括一個(gè)連接到第二個(gè)PP家族多肽上的PP家族多肽的片段，其中兩個(gè)片段都包含PPF基序。也公開了使用本發(fā)明的PPF多肽的方法，和包括本發(fā)明的PPF多肽的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K14/575GK101065133SQ200580004687
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月11日
發(fā)明者O·E·萊維, C·M·喬德卡, S·S·高希, D·G·帕克斯, R·A·皮特納, L·J·德索扎, J·S·阿恩, K·S·普里克特 申請(qǐng)人:安米林藥品公司