專利名稱：二肽基肽酶-4抑制劑的制作方法
二肽基肽酶-4抑制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二肽基肽酶-4抑制劑及其制備方法。再者，本發(fā)明涉及含有該二肽基肽酶-4抑制劑的糖尿病的預(yù)防和/或改善劑。
背景技術(shù)：
二肽基肽酶_4(0丨？印衍(^1 P印tidase-4、以下記作“DPP-4”)是絲氨酸蛋白酶的1種，是識別從肽的N末端第2脯氨酸或丙氨酸而切斷的酶。已知DPP-4在哺乳動物組織中廣泛分布，特別是存在于腎臟、肝臟、腸道上皮、胎盤及血漿中。在哺乳類中的DPP-4的作用未完全明了，但被認(rèn)為在神經(jīng)肽的代謝、T細(xì)胞的活化、癌細(xì)胞之向內(nèi)皮細(xì)胞的附著或 HIV的向細(xì)胞內(nèi)的侵入等中發(fā)揮重要的作用。作為DPP-4的底物，已知與營養(yǎng)、代謝、免疫系統(tǒng)及痛覺等關(guān)聯(lián)的肽。在其中也是，作為使示葡萄糖依賴性的胰島素的分泌亢進(jìn)作用的胰高血糖素樣肽-1 (Glucagon-Like Peptide-I 以下記作“GLP-1 ”)或胃抑制多肽(Gastric Inhibitory Polyp印tide或葡萄糖依賴性促胰島素肽)失活的酶，DPP-4受到關(guān)注(非專利文獻(xiàn)1)。作為GLP-I的生理作用，除了從胰腺的β細(xì)胞的葡萄糖依賴性的胰島素的分泌作用之外，有胰高血糖素的分泌抑制作用、胰腺β細(xì)胞的保護(hù)及增殖作用、胃排泄的抑制、在肝臟的糖原合成酶促進(jìn)作用等。再者，在中樞中，作用于下丘腦的飽中樞而引起攝食量的減少(非專利文獻(xiàn)2)。也已知通過抑制DPP-4活性等來抑制GLP-I的分解，則葡萄糖濃度依賴性地促進(jìn)胰島素分泌的等GLP-I有的生理活性增強。從這些的事實期待，有DPP-4抑制作用的化合物對在1型糖尿病及2型糖尿病等中確認(rèn)的糖耐受不良、餐后高血糖、空腹時高血糖或伴隨其的肥胖-糖尿病性并發(fā)癥等示效果。另外，由于促進(jìn)胰島素分泌，促進(jìn)向肌肉的糖的攝入， 也期待輔助向運動時的肌肉的能供給的作用。DPP-4也相關(guān)于被稱為神經(jīng)肽Y、內(nèi)嗎啡肽1、內(nèi)嗎啡肽2、物質(zhì)P的神經(jīng)肽的代謝。 從而，抑制DPP-4的化合物通過抑制這些的生理活性肽的分解，也可期待作為精神分裂癥、 抑郁癥、不安、癲癇，應(yīng)激性疾病的治療藥或鎮(zhèn)痛藥。再者DPP-4已知與各種的細(xì)胞因子類或趨化因子類的代謝，或作為免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞的T細(xì)胞的活化、癌細(xì)胞的向內(nèi)皮的附著、血液細(xì)胞的增殖等相關(guān)，所以，經(jīng)這些的作用，抑制DPP-4的化合物被認(rèn)為在糖尿病之外，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、哮喘或食物過敏等的過敏疾病、癌、癌轉(zhuǎn)移、HIV感染、貧血、 血小板減少癥等的預(yù)防和/或改善有用。作為DPP-4抑制劑，多數(shù)報告通過化學(xué)合成得到的化合物(專利文獻(xiàn)1，2，3，4)。 這些之內(nèi)，幾種已經(jīng)作為糖尿病治療藥而實用化。另一方面，作為天然物來源的DPP-4抑制齊U，已知明膠來源的肽(專利文獻(xiàn)幻、乳酪蛋白來源的肽(專利文獻(xiàn)6)、水解型單寧(專利文獻(xiàn)7)、紅辣椒等的植物提取物(專利文獻(xiàn)8)等。另外，為了預(yù)防和/或治療經(jīng)DPP-4的癥狀，報告可使用將蛋白質(zhì)通過公知的方法水解，而可實用使得到的物(專利文獻(xiàn)9)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 特表2005-500321號公報專利文獻(xiàn)2 特表2004-535455號公報專利文獻(xiàn)3 特表2004-536115號公報專利文獻(xiàn)4 特開2000-327689號公報專利文獻(xiàn)5 :W02008/066070號公報專利文獻(xiàn)6 特開2007-394 號公報專利文獻(xiàn)7 特開2008-28(^91號公報專利文獻(xiàn)8 特開2007-277163號公報專利文獻(xiàn)9 特表2008-500304號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 日藥理志125，379 384(2005)非專利文獻(xiàn)2 :Expert Opin. Investig. Drugs 1091-1102(2004)

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題本發(fā)明旨在提供以有食經(jīng)驗的天然物作為原料，不僅是DPP-4抑制活性，在味、吸收性的方面也適宜于經(jīng)口攝取用途的，DPP-4抑制劑及含有該DPP-4抑制劑的預(yù)防和/或改善糖尿病的組合物(食品、功能性食品、藥品、經(jīng)腸營養(yǎng)劑、飼料等)。解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明人為了解決上述課題，經(jīng)銳意檢查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將特定的豆類中的蛋白質(zhì)的肽鍵用微生物或微生物來源的蛋白質(zhì)分解酶水解而得到的產(chǎn)物有DPP-4抑制作用，另外在味的方面也優(yōu)良，從而完成本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及DPP-4抑制劑，其特征在于，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到。上述微生物而言，優(yōu)選選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1種以上，蛋白質(zhì)分解酶而言，是以選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1種以上的微生物作為來源的酶是優(yōu)選的實施方式。另外，本發(fā)明涉及DPP-4抑制劑，其特征在于，將大豆用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到。再者，本發(fā)明涉及DPP-4抑制劑的制備方法，其特征在于，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，通過將有食經(jīng)驗的特定的豆類用相同地在食品中一般使用著的微生物或微生物來源的酶處理，可提供有優(yōu)良的DPP-4抑制活性的DPP-4抑制劑，或含有其作為有效成分的食品、功能性食品、藥品、飼料等。本發(fā)明的DPP-4抑制劑，從上述的方面來看， 不僅在安全性上優(yōu)良，在味覺或吸收性的方面也特別適宜于經(jīng)口攝取用途。本發(fā)明的DPP-4抑制劑作為用于預(yù)防和/或改善糖尿病的組合物的有效成分有用。實施方式
接下來詳細(xì)地說明本發(fā)明。
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本發(fā)明的DPP-4抑制劑是將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到的。即本發(fā)明也涉及DPP-4抑制劑的制備方法，其特征在于，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理。在本發(fā)明中，認(rèn)為上述豆類中的蛋白質(zhì)的肽鍵經(jīng)水解而片段化(低分子化)的產(chǎn)物作為DPP-4抑制劑的有效成分而相關(guān)。從而，本發(fā)明中也包括以小豆或菜豆來源的蛋白質(zhì)的水解物作為有效成分的DPP-4抑制劑。在本發(fā)明中，在小豆或菜豆的處理中使用的微生物不特別限定，但優(yōu)選產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解酶的微生物，出安全性的觀點來看，優(yōu)選食品制備中使用的微生物。作為那樣的微生物，具體而言，可舉曲霉、乳酸菌、納豆菌等。此中特別優(yōu)選曲霉。另外，在本發(fā)明中，在小豆或菜豆的處理中使用的蛋白質(zhì)分解酶而言，只要是可水解肽鍵的微生物來源的蛋白質(zhì)分解酶，就不特別限定，但優(yōu)選以曲霉、乳酸菌或納豆菌作為來源的蛋白質(zhì)分解酶，更優(yōu)選以曲霉作為來源的蛋白質(zhì)分解酶。再者，在本發(fā)明中，將大豆用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到的產(chǎn)物也可作為DPP-4抑制劑使用。在本發(fā)明中使用的，或者作為使用的酶的來源的曲霉與在國內(nèi)外的食品的制備相關(guān)聯(lián)，只要是安全的就不特別限定，例如，可使用在醬油、醬、酒等的生產(chǎn)中使用的。那樣的曲霉而言，除了例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)等的曲霉屬之外，還可舉紅曲霉等。在其中也是，出蛋白酶活性高的方面，優(yōu)選使用醬油用曲霉，更優(yōu)選米曲霉(Aspergillus oryzae)或醬油曲霉(Aspergillus sojae)等，特別優(yōu)選米曲霉(Aspergillus oryzae)。另外，利用使如上述一樣的曲霉在豆、米、麥、麩等上附著生長的，所謂的曲、種曲也可。在本發(fā)明中使用的，或者成為使用的酶的來源的乳酸菌而言，只要是通過代謝生成乳酸的細(xì)菌類，就不特別限定，具體而言，可舉乳桿菌(Lactobacillus)屬、雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬、腸球菌(Enterococcus)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、片球菌 (Pediococcus)屬、明串珠菌(Leuconostoc)屬等。另外，在本發(fā)明中使用的，或者成為使用的酶的來源的納豆菌而言，可舉枯草芽孢桿菌納豆變種(Bacillus subtilis var. natto)。在一般而言，蛋白質(zhì)分解酶有水解肽的肽鍵的肽酶或水解蛋白質(zhì)的肽鍵的蛋白酶等。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)分解酶是純化的單一的肽酶或單一的蛋白酶也可，是含多個肽酶或蛋白酶等的組合物也可。另外，是以不損害肽酶或蛋白酶的活性的程度含其他酶的組合物也可。使用的蛋白質(zhì)分解酶而言，如后述，利用市售品也可，利用將產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解酶的微生物破碎，或部分純化而得到的菌體處理物或部分純化酶也可。再者，產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解酶的重組菌的菌體處理物或以該重組菌作為來源的酶也可。重組菌的制備可使用通常的基因工程學(xué)方法。為了使蛋白質(zhì)經(jīng)分解而容易從腸道吸收，優(yōu)選將蛋白質(zhì)分解成更低分子的肽，從其樣的觀點，本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)分解酶優(yōu)選含肽酶。另外，已知蛋白質(zhì)的脯氨酸殘基周邊是蛋白酶、肽酶一般難以作用。X-脯氨酰二肽基氨基肽酶是將氨基末端的X-脯氨酸(X是任意的氨基酸殘基)用二肽單位特異性地游離的酶，有此酶活性的蛋白質(zhì)分解酶被認(rèn)為，容易將蛋白質(zhì)更低分子化。從這樣的觀點開看，本發(fā)明中使用的微生物或蛋白質(zhì)分解酶更優(yōu)選有X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性。 再有，米曲霉(Aspergillus oryzae)已被報告產(chǎn)生X-脯氨酰二肽基氨基肽酶(H.Tachi， Phytochemistry，31(11)，3707-3709 (1992))。在本發(fā)明中使用市售品的蛋白質(zhì)分解酶時，對其種類不特別限定，但作為食品添加物而可適宜地使用市售的?？膳e例如，々7彡廿^ A G、蛋白酶A“7 7 7 T、蛋白酶A“7 ι 乂，，SD、蛋白酶M "T 7，，G、蛋白酶M "T 7 "SD(以上、天野酶株式會社制)、義^千一A LP、^彡f 一A FP、^彡f 一A LPL (以上、新日本化學(xué)工業(yè)株式會社制)、"V午一七NP-2 ( Y夕A卜藥品工業(yè)株式會社制)、才〗J工 > 夕一七ONS (工^ f匕· ^ 7 ^株式會社制)等。再有，作為上述的蛋白質(zhì)分解酶，變更形狀的也可在本發(fā)明中使用。形狀可以是顆粒狀，也可為粉末狀或液狀。只要可水解蛋白質(zhì)，就可在本發(fā)明中使用。在上述的蛋白質(zhì)分解酶之中，從X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性的強度的方面，也更適宜地使用々7 S廿4 A G。成本發(fā)明的DPP-4抑制劑的原料的小豆是小豆屬小豆(Vigna angularis)、大豆是大豆屬大豆(Glycine max)、菜豆是菜豆屬菜豆(Phaseolus vulgaris)，也包括在菜豆， 花豆、大手亡、鶉豆、大福豆等的品種。另外，關(guān)于大豆，從無將基因重組大豆(GM0大豆)的蛋白質(zhì)用微生物或微生物來源的蛋白酶水解之時的，對于安全性或過敏原性的充分的數(shù)據(jù)的事實來看，優(yōu)選使用非基因重組(nonGMO)大豆。另外，nonGMO大豆可從DPP-4抑制活性或味等的方面也相比GMO大豆更適宜地使用。上述的本發(fā)明中使用的豆類以豆本身作為原料也可，以如納豆、醬油、豆?jié){、餡或其類似品等一樣以豆類作為原料而制備的組合物，或如豆腐渣或脫脂豆等一樣從豆類制造其他食品之后的殘渣等作為原料利用也可。上述豆類可作為直接用于制備本發(fā)明的DPP-4抑制劑的原料而使用，但進(jìn)行干燥、破碎、粉碎、加熱、加壓、脫脂、酸處理、堿處理、榨汁、提取等的預(yù)處理也可。另外這些預(yù)處理是將2種以上組合實施也可。再者，從上述豆類材料分離蛋白質(zhì)或富含蛋白質(zhì)的成分之后，作為用于制備本發(fā)明的DPP-4抑制劑的原料也可。在本發(fā)明中，將上述豆類用微生物處理的方法不特別限定?？膳e例如，將豆類材料根據(jù)必要經(jīng)上述預(yù)處理之后，在其表面生長微生物，或使微生物生長之后，通過添加水而再反應(yīng)來將豆類中的蛋白質(zhì)的肽鍵水解的方法。再者，也可舉在將豆類材料或者它們的處理物懸浮和/或溶解于水等的液體的狀態(tài)下使微生物生長的方法，或使微生物在液體的豆類加工物中生長的方法等。另外，在本發(fā)明中，將上述豆類用蛋白質(zhì)分解酶處理的方法也不特別限定?？膳e將豆類材料根據(jù)必要經(jīng)上述預(yù)處理之后，通過在其表面播撒蛋白質(zhì)分解酶，或在將豆類材料或者它們的處理物懸浮和/或溶解于水等的液體的狀態(tài)下使與蛋白質(zhì)分解酶作用，從而將豆類中的蛋白質(zhì)的肽鍵水解的方法之外，還有向液體的豆類加工物添加蛋白質(zhì)分解酶的方法等。在本發(fā)明中，將通過上述方法得到的，微生物、或者，蛋白質(zhì)分解酶的處理物直接作為DPP-4抑制劑利用也可，但在不失DPP-4抑制活性的范圍內(nèi)進(jìn)行除臭、脫色等也可。另外，為了濃縮DPP-4抑制活性成分，進(jìn)行提取、沉淀、過濾、超濾、柱層析等的方法、或者由這些的方法的組合的分級分離也可。
DPP-4活性可通過，例如，向人DPP-4酶，作為底物加甘氨酰_L_脯氨酸4_甲基香豆酰-7-酰胺而溫育，將生成的7-氨基-4-甲基香豆素的量用熒光光度計定量來測定。在本發(fā)明中，在上述測定中，比較作為DPP-4抑制活性的評價的對象的待測樣品存在時(樣品)和不存在時(溶劑對照)的DPP-4活性，對于溶劑對照的DPP-4活性，將顯著降低DPP-4 活性的樣品評價為有“DPP-4抑制活性”。本發(fā)明的DPP-4抑制劑而言，優(yōu)選將溶劑對照的 DPP-4活性作為100%之時，樣品的DPP-4活性成70%以下的，更優(yōu)選成60%以下的，特別優(yōu)選成50%以下的。 另外，本發(fā)明的DPP-4抑制劑，不僅有DPP-4抑制活性，在優(yōu)選的實施方式中，有具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的情況。α-葡萄糖苷酶活性可通過，例如向酵母來源α-葡萄糖苷酶，作為底物加蔗糖而溫育，將生成的葡萄糖用市售的葡萄糖定量試劑盒定量來測定。 在本發(fā)明中，在上述測定中，比較作為α-葡萄糖苷酶抑制活性的評價的對象的待測樣品存在時(樣品)和不存在時(溶劑對照)的α-葡萄糖苷酶活性，對于溶劑對照的α-葡萄糖苷酶活性，將顯著降低α -葡萄糖苷酶活性的樣品評價為有“ α -葡萄糖苷酶抑制活性”。 本發(fā)明的DPP-4抑制劑而言，優(yōu)選將溶劑對照的α-葡萄糖苷酶活性作為100%之時，共具樣品的α-葡萄糖苷酶活性成90%以下的α-葡萄糖苷酶抑制活性的，更優(yōu)選共具成80% 以下的α-葡萄糖苷酶抑制活性的。一般而言，已知水解蛋白質(zhì)而得到肽的制法易出苦味或臭味。但是，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到的本發(fā)明的DPP-4抑制劑、或者， 將大豆用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到的本發(fā)明的DPP-4抑制劑苦味或臭味少，特別是，在使用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶時，可制備呈味性優(yōu)良的DPP-4抑制劑。從而，本發(fā)明的DPP-4抑制劑特別優(yōu)選可在優(yōu)選呈味性優(yōu)良的經(jīng)口攝取用的組合物中利用。作為其中說道的經(jīng)口攝取用組合物是說人或家畜、寵物等經(jīng)口攝取的組合物，具體而言是說食品、藥品、飼料等。本發(fā)明的DPP-4抑制劑，如上述一樣作為經(jīng)口攝取用組合物使用也可，作為如經(jīng)腸營養(yǎng)劑等一樣直接施用到消化管內(nèi)而由消化管吸收的組合物使用也可。另外，直接作為飲食用、醫(yī)藥用、飼料用等利用也可，但作為含有其的組合物而在飲食用、醫(yī)藥用、飼料用等的用途中使用也可。本發(fā)明的DPP-4抑制劑在如上述一樣的用途中使用時，不限定其形態(tài)， 例如，作為飲食用，除了一般食品之外，可作為功能性食品(保健功能食品(特定保健用食品、營養(yǎng)功能食品)、健康食品、營養(yǎng)輔助食品、運動輔助物等)等的輔助物利用?；蛘?，作為醫(yī)藥用，除了醫(yī)療用藥品之外，可作為OTC等可容易入手的藥品或準(zhǔn)藥品、化妝品等而利用。將本發(fā)明的DPP-4抑制劑作為一般食品或功能性食品攝取時，直接攝取也可，另夕卜，作為與公知的載體或助劑等的添加劑混合的組合物，成型為膠囊劑、錠劑、顆粒劑等易服用的形態(tài)而攝取也可。另外，以營養(yǎng)強化的目的，添加維生素Α、C、D、E等的各種維生素類而聯(lián)用也可。再者，與其他功能性食品等作為合劑也可。作為合劑的其他功能性食品而言，不特別限定，但可舉血糖降低作用、脂質(zhì)降低作用、抗肥胖作用等的代謝調(diào)節(jié)作用，或血壓降低作用、骨質(zhì)疏松預(yù)防和/或改善作用等的已知的功能性食品。再者，混合到食物材料中，可在口香糖、巧克力、糖果、果凍、餅干、咸餅干等的點心類；冰淇淋、冰點心等的冷點心類；茶、清涼飲料、營養(yǎng)飲料、美容飲料等的飲料；烏冬面，中華面、意大利面、方便面等的面類；魚板、竹輪、魚肉山芋餅等的糜制品；調(diào)味汁、蛋黃醬、沙司等的調(diào)味料；人造奶油、黃油、色拉油等的油脂類；面包、火腿、湯、甑煮食品、冷凍食品等的一般食品中使用。將本發(fā)明的DPP-4抑制劑作為醫(yī)藥用而使用時，其劑形不特別限定，可舉例如，膠囊劑、錠劑、顆粒劑、注射劑、栓劑、貼附劑等。在制劑化中，可適宜添加藥劑學(xué)容許的其他制劑原料、例如，賦形劑、崩解劑、潤滑劑、結(jié)合劑、氧化防止劑、著色劑、凝集防止劑、吸收促進(jìn)劑、溶解輔助劑、穩(wěn)定化劑等來制備。再者，將本發(fā)明的DPP-4抑制劑作為醫(yī)藥用使用時，與其他抗糖尿病藥、抗肥胖藥、抗骨質(zhì)疏松藥等的藥品作為合劑也可。作為其他抗糖尿病藥或抗肥胖藥不特別限定，但可舉例如，磺酰基尿素系藥、雙胍系藥、α -葡萄糖苷酶抑制藥、胰島素制劑、胰島素分泌促進(jìn)藥、胰島素增感藥、PPAR激動藥(PPARa激動藥、PPAR γ激動藥、PPARa+ γ激動藥)、β3 腎上腺素受體激動藥、醛糖還原酶抑制藥、DPP-4抑制藥、AMP激酶活化藥、1型11 β -羥基類固醇脫氫酶(ΙΙβ-HSDl)抑制藥、脂肪酶抑制藥、食欲抑制藥等等?？构琴|(zhì)疏松藥而言， 可舉活性型維生素D3制劑、雌激素制劑、選擇的雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽制劑、維生素 Κ2制劑、鈣制劑等。α-葡萄糖苷酶是在腸內(nèi)將麥芽糖或蔗糖等的二糖類分解為單糖類的酶。通過抑制a -葡萄糖苷酶，可抑制多糖類及二糖類的吸收，顯著地抑制餐后的過血糖，從而知對于糖尿病的預(yù)防或改善有效。但是，如從機制明了，無法確認(rèn)α-葡萄糖苷酶抑制劑對由葡萄糖攝取的血糖值升高的效果。另外，α-葡萄糖苷酶抑制劑如果不在就餐直前攝取，則得不到其效果等，也有服用方法的限制。本發(fā)明的DPP-4抑制劑不僅對由葡萄糖攝取的血糖值升高有效果，還有不限服用時期的優(yōu)點。再者，本發(fā)明的DPP-4抑制劑，如上所述，更優(yōu)選共具有DPP-4抑制活性和a -葡萄糖苷酶抑制活性的兩方，從而可期待更強的血糖值降低效^ ο綜上所述，含有本發(fā)明的DPP-4抑制劑的組合物可作為用于糖尿病的預(yù)防和/或改善的組合物而利用。另外，本發(fā)明的DPP-4抑制劑也可作為血糖升高抑制劑、血糖降低藥、胰島素分泌促進(jìn)劑、活性型GLP-I量增多劑、胰高血糖素分泌抑制劑、胰β細(xì)胞再生促進(jìn)劑和/或向肌肉的糖的攝取促進(jìn)劑使用。另外，本發(fā)明也是將上述DPP-4抑制劑施用于施用對象的，糖尿病的預(yù)防和/或改善方法。另外本發(fā)明也是將上述DPP-4抑制劑施用于施用對象的，血糖值的升高抑制方法。 糖尿病的預(yù)防也包括糖尿病的發(fā)生風(fēng)險的輕減。另外，上述的情況的施用對象而言，優(yōu)選糖尿病患者、糖尿病高風(fēng)險者(雖然在正常域，但血糖值升高的，被指從遺傳的要因或生活習(xí)慣成糖尿病的風(fēng)險高的人)，但也包括健康者。
實施例以下，舉實施例再具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些的實施例限定。DPP-4抑制活性的測定法在本發(fā)明中，使用市售的測定試劑盒(BI0M0L社制DPP_4Drug Discovery kit)，根據(jù)試劑盒附帶的說明書來測定DPP-4活性，通過比較其值來評價DPP-4抑制活性。接下來， 簡單地示測定方法。
向測定試劑盒上附屬的白色的96Half-Area板中，向空白的孔中放入50 μ L、向?qū)φ盏目字蟹湃?5 μ L、向樣品的孔中放入25 μ L的緩沖液(50mM Tris, pH7. 5)。接下來，向樣品孔添加10 μ L樣品之后，向?qū)φ蘸蜆悠返目字刑砑?5yL酶溶液(人DPP-4酶)，用板混合器充分混合。接下來，向全部的孔加50 μ L成DPP-4的底物的甘氨酰-L-脯氨酸4-甲基香豆酰-7-酰胺(孔中的總液量ΙΟΟμ 、于37°C溫育，進(jìn)行酶反應(yīng)。溫育在可溫度調(diào)節(jié)的熒光強度測定裝置(P0WERSCANHT大日本制藥制)之中進(jìn)行，溫育開始后立即和12分鐘后，以激發(fā)波長380nm、測定波長460nm進(jìn)行測定，測定酶反應(yīng)的結(jié)果生成的7-氨基-4-甲基香豆素。再有，樣品的DPP-4活性是將對照中的DPP-4活性的值作為100%，如以下一樣算
出οDPP-4 活性(% ) = {(A-B) / (C-D)} X 100式中A表示溫育開始12分鐘后的樣品孔的熒光強度、B表示溫育開始后立即的樣品孔的熒光強度、C表示溫育開始12分鐘后的對照孔的熒光強度、D表示溫育開始后立即的對照孔的熒光強度。此時呈現(xiàn)，DPP-4活性的值越低，抑制活性越強。實施例1豆類的曲霉處理物的制備將市售的大豆、小豆、大手亡、大福豆、紫花豆、四棱豆各自Ikg在蒸煮后粗碾碎， 根據(jù)需要炒熬割碎處理之外調(diào)節(jié)到水分量達(dá)到約50%之后，裝備濾器而放入可供給無菌空氣的容器中，于121°C高壓蒸氣滅菌30分鐘。接下來，將使用曲霉(米曲霉(Aspergillus oryzae)KBN616 ；株式會社e才7々制)而得到的麩曲3g在潔凈臺內(nèi)使不混入曲霉以外的微生物地接種到滅菌的原料中，向容器內(nèi)供給著無菌空氣地于31°C僅用曲霉進(jìn)行發(fā)酵48 小時。其后，將在潔凈臺內(nèi)得到的各自的發(fā)酵物75g放入滅菌的玻璃容器中，加滅菌蒸留水150mL而用硅栓封口，不添加食鹽地，在不存在曲霉以外的微生物的條件下于30°C進(jìn)行3天處理而得到曲霉處理液。其后，將各自的曲霉處理液于90°C加熱30分鐘之后，過濾而得到澄明的液。將其使用分子量篩截3000的離心式超濾裝置(Millipore制7 ^ ^ ^ > YM-3)以14000g離心分級分離100分鐘，將得到的濾液冷凍干燥，得到各自的豆類的曲霉處理物。將得到的豆類的曲霉處理物溶解到水中至達(dá)到lOmg/mL的濃度而作為樣品(作為DPP-4活性測定時的濃度lmg/mL)，將各樣品的DPP-4抑制活性用上述的方法評價。結(jié)果示于表1。表1
權(quán)利要求
1.DPP-4抑制劑，其特征在于，其為將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到。
2.權(quán)利要求1所述的DPP-4抑制劑，其中所述微生物是選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1 種以上。
3.權(quán)利要求1所述的DPP-4抑制劑，其中所述蛋白質(zhì)分解酶是以選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1種以上的微生物作為來源的酶。
4.DPP-4抑制劑，其特征在于，其為將大豆用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到。
5.權(quán)利要求2 4任一項所述的DPP-4抑制劑，其中所述曲霉是米曲霉(Aspergillus oryzae)或醬油曲霉(Aspergillus sojae)。
6.權(quán)利要求1、3或4所述的DPP-4抑制劑，其中所述蛋白質(zhì)分解酶包括肽酶。
7.權(quán)利要求1、3或4所述的DPP-4抑制劑，其中所述蛋白質(zhì)分解酶有X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性。
8.糖尿病的預(yù)防和/或改善用組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1 7任一項所述的 DPP-4抑制劑。
9.DPP-4抑制劑的制備方法，其特征在于，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理。
10.權(quán)利要求9所述的DPP-4抑制劑的制備方法，其中所述微生物是選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1種以上。
11.權(quán)利要求9所述的DPP-4抑制劑的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)分解酶是以選自曲霉、乳酸菌及納豆菌的1種以上的微生物作為來源的酶。
12.DPP-4抑制劑的制備方法，其特征在于，將大豆用曲霉或曲霉來源的蛋白質(zhì)分解酶處理。
13.權(quán)利要求10 12任一項所述的DPP-4抑制劑的制備方法，其中所述曲霉是米曲霉 (Aspergillus oryzae)或醬油曲霉(Aspergillus sojae)。
14.權(quán)利要求9、11或12所述的DPP-4抑制劑的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)分解酶包括肽酶。
15.權(quán)利要求9、11或12所述的DPP-4抑制劑的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)分解酶有X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性。
全文摘要
本發(fā)明以提供將食品作為原料得到的，在味、吸收性的方面也適宜于經(jīng)口攝取用途的，DPP-4抑制劑及含有該DPP-4抑制劑的預(yù)防和/或改善糖尿病的組合物作為課題。本發(fā)明提供DPP-4抑制劑，其特征在于，將小豆或菜豆用微生物或者微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶處理而得到。在其中也是通過將小豆用曲或曲霉來源的蛋白質(zhì)水解酶水解而將小豆中的蛋白質(zhì)片段化而得到適宜的DPP-4抑制劑。
文檔編號A61K38/55GK102470166SQ201080034399
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者北川雅康, 太田徹, 富永雄仁, 岸田秀之, 橫田真一, 田中穗積, 館博 申請人:株式會社鐘化