專利名稱：組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
虎杖苷(polydatin)和白藜蘆醇(resVeratrol)均為植物體內(nèi)天然產(chǎn)生的二苯乙烯類多酚物質(zhì)，是具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和確切療效的單體化合物，對(duì)人體具有強(qiáng)心擴(kuò)血管、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，更為重要的是其特異性地針對(duì)癌細(xì)胞具有殺傷力而不影響正常細(xì)胞，被譽(yù)為“二十一世紀(jì)最有前途的抗癌藥物之一”，因此廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療及保健業(yè)，國內(nèi)外市場需求量很大。
虎杖苷和白藜蘆醇在自然界的很多植物中都存在，例如葡萄、花生、藜蘆、虎杖、歐洲云杉等，其中以在虎杖中的含量最為豐富，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他植物。目前制藥工業(yè)主要依靠從大量采挖的野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇，據(jù)統(tǒng)計(jì)提取10噸白藜蘆醇需要消耗5000噸虎杖原料。虎杖苷和白藜蘆醇在植物體內(nèi)的含量不僅普遍較低，而且還明顯受到產(chǎn)地、采收季節(jié)以及生長環(huán)境等因素的影向，例如云南地區(qū)的虎杖根莖中虎杖苷的含量為3.24％，而廣東一帶僅為0.64％；同一產(chǎn)地的虎杖八月份采收時(shí)其根莖中含有白藜蘆醇0.30％，到十月份采收時(shí)就降為0.04g％，所以單純依靠從植物原料中提取的方法，不僅質(zhì)量難以控制，而且生產(chǎn)周期長、成本高、產(chǎn)品得率低，更為嚴(yán)重的是長期掠奪式地采挖還會(huì)加快野生資源的滅絕速度，不符合我國經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。如何在不破壞自然資源的條件下，生產(chǎn)出質(zhì)量可控、純度較高的白藜蘆醇及其苷類，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。
生物合成(biosynthesis)，即通過對(duì)植物高產(chǎn)細(xì)胞、組織或器官的篩選與優(yōu)化培養(yǎng)，將植物體作為一個(gè)“藥物加工廠”，在特定的生物反應(yīng)器內(nèi)達(dá)到目標(biāo)成分的高效產(chǎn)出，對(duì)于解決中草藥資源的可持續(xù)利用及天然藥物的生產(chǎn)問題具有重要意義。目前，利用生物合成途徑生產(chǎn)虎杖苷或白藜蘆醇的研究主要集中在細(xì)胞培養(yǎng)物方面，例如專利00113914.2公開了利用葡萄細(xì)胞株生產(chǎn)白藜蘆醇的技術(shù)方案。但是利用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行次生代謝物的大規(guī)模生產(chǎn)存在許多不足，例如細(xì)胞普遍生長緩慢且依賴激素維持、含量低下、遺傳穩(wěn)定性差和放大培養(yǎng)時(shí)對(duì)剪切力敏感等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用組培技術(shù)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacter ium rhizogene)生根質(zhì)粒上的一段T-DNA對(duì)虎杖外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)培養(yǎng)所產(chǎn)生的毛狀根來生產(chǎn)虎杖苷的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于它包括如下步驟A、野生虎杖組培選取發(fā)育良好的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，消毒處理后經(jīng)分化培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)，生根培養(yǎng)形成發(fā)育完整的幼苗，切取無菌組培苗的莖段、葉片、葉柄及幼芽等外植體作為感染材料備用；B、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)取出冰箱保存的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ATCC11325室溫平衡20～30min，然后在超凈工作臺(tái)上吸取500～800μl菌液于已滅菌的100～150ml新鮮YEB培養(yǎng)液中，于23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振蕩培養(yǎng)20～24h即可；C、虎杖毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)劃傷受體材料表面以形成傷口，放入步驟B的農(nóng)桿菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接觸，取出感染材料用無菌吸水紙輕輕蘸干多余菌液，24～27℃、黑暗條件下置于MS0中進(jìn)行共培養(yǎng)。7～15天后在感染材料的傷口部位可見毛狀根的萌生；D、虎杖毛狀根優(yōu)化培養(yǎng)經(jīng)分子鑒定后采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，附加3％蔗糖作為碳源，在pH值為6.0～6.5，溫度22～27℃，搖床轉(zhuǎn)速120～140r·min-1，黑暗或弱光條件下6～30天獲得大量增殖的毛狀根株系；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取從培養(yǎng)液中取出毛狀根、烘干、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇結(jié)合30～40min超聲波處理進(jìn)行提取，之后于3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即可得到純度較高的虎杖苷產(chǎn)品。
所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，步驟A中對(duì)野生材料的消毒方法是采用流水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，無菌水漂洗三次后再置于0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，無菌水充分漂洗后即可接種；誘導(dǎo)叢生芽分化的培養(yǎng)基是指MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壯苗生長的培養(yǎng)基是指MS+0.1mg/LCPPU+1.0mg/L NAA，生根培養(yǎng)基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培養(yǎng)條件均為白天27±1℃，夜晚20±1℃濕度60～70％，光強(qiáng)28μmol/m2.s，光照時(shí)間13～17h/d。
所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，提高步驟G所述的虎杖毛狀根誘導(dǎo)率的方法包括a、發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌雙感染；b超聲波振蕩輔助感染；c，微波輻射輔助感染；d、選取成熟葉的葉片部分作為感染材料；e、感染葉片不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)且共培養(yǎng)時(shí)葉片上表皮向上放置；或f、黑暗、室溫環(huán)境下誘導(dǎo)根的發(fā)生。
所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，步驟D所述的分子鑒定是指切取從感染材料上產(chǎn)生的毛狀根根段，分離成單根后轉(zhuǎn)接至MS0固體培養(yǎng)基中生長，10～15天繼代培養(yǎng)一次；從大量的單克隆毛狀根系中篩選生長迅速、外形粗壯、分枝較多的毛狀根進(jìn)行PCR分子鑒定，證實(shí)具有轉(zhuǎn)發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA性質(zhì)的毛狀根進(jìn)入下一步操作。
所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，步驟D所述的培養(yǎng)周期6～24天內(nèi)采取每7天更換培養(yǎng)液一次。
所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，將步驟D得到虎杖毛狀根進(jìn)行固體種質(zhì)保存以用于工業(yè)化生產(chǎn)。
所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，將生長迅速、含量較高且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良虎杖毛狀根單克隆系，保存于添加有1％活性碳并提高蔗糖含量至5％的MS固體培養(yǎng)基中。
所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，將步驟D得到的虎杖毛狀根在優(yōu)化條件下擴(kuò)大培養(yǎng)以便定期收獲毛狀根，繼代培養(yǎng)時(shí)接種量控制在0.5～1.0g鮮重毛狀根100～150ml培養(yǎng)液。
所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，可同時(shí)制備白藜蘆醇提取物。
本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步效果表現(xiàn)在(1)與從野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的現(xiàn)今生產(chǎn)方式相比，利用毛狀根來生產(chǎn)以根入藥為主的藥用植物的某些有效成分，具有生產(chǎn)周期短、質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，而且天然藥物的生產(chǎn)是在可控和可重復(fù)條件下進(jìn)行，不會(huì)受到病蟲害和自然環(huán)境等因素的影響。
(2)與化學(xué)合成的方法相比，利用毛狀根培養(yǎng)物生物合成途徑除了可提供虎杖苷和白藜蘆醇外，還可直接生產(chǎn)出前體及其他具有藥理活性結(jié)構(gòu)而化學(xué)手段很難合成的化合物，此外產(chǎn)物可無限、連續(xù)、均勻的生產(chǎn)，分離、提取操作簡單，節(jié)約人力物力。
(3)與利用其他組織培養(yǎng)物(如自然根、愈傷組織、懸浮細(xì)胞等)生產(chǎn)方式相比，毛狀根中由于導(dǎo)入了發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA，具有不依賴激素自主快速生長的特性，而其他培養(yǎng)物必須添加昂貴或?qū)θ梭w有毒害的外源激素來維持其生長。在本發(fā)明具體實(shí)施例中篩選獲得的優(yōu)質(zhì)虎杖毛狀根株系，在30d培養(yǎng)期內(nèi)干重增長率可達(dá)到8.29，是相同條件下懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的192.8倍，是自然根培養(yǎng)物的8.4倍。此外，毛狀根遺傳性能穩(wěn)定，繼代操作簡單，生長不需要光照，成本低廉，更適于工廠化生產(chǎn)。
(4)本發(fā)明利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌雙菌共感染的方式，不僅可以明顯提前出根，而且有效提高了毛狀根的誘導(dǎo)率及誘根密度，毛狀根平均誘導(dǎo)率可達(dá)到97.1％，誘根密度達(dá)到15.8，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同屬其他植物。此外，與以往文獻(xiàn)報(bào)道不同的是，本項(xiàng)技術(shù)中感受材料不需預(yù)培養(yǎng)，劃傷后直接浸泡于活化好的菌液中，在葉片生根及毛狀根繼代培養(yǎng)過程中均不需要繁雜的除菌工作，節(jié)省了人力物力，也使得毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)操作更為簡便。


圖1感染7d后從葉片上開始出現(xiàn)毛狀根圖2感染20d后形成大量生長迅速的毛狀根系圖3虎杖毛狀根的液體擴(kuò)大培養(yǎng)圖4虎杖毛狀根中rolb基因引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜圖中從左向右依次為①空白(無模板DNA)；②Ri質(zhì)粒；③感染葉片；④未感染葉片；⑤Marker；⑥毛狀根；⑦自然根。
圖5虎杖毛狀根中tms基因引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜圖中從左向右依次為①M(fèi)arker；②毛狀根；③自然根；④空白(無模板DNA)。
圖6虎杖苷對(duì)照品的HPLC色譜7白藜蘆醇對(duì)照品的HPLC色譜8虎杖毛狀根樣品的HPLC色譜中虎杖苷對(duì)照品0.101mg·mL-1白藜蘆醇對(duì)照品0.0300mg·mL-11、虎杖苷 2、白藜蘆醇具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、選取生長健壯、發(fā)育良好，無病蟲害及霉菌侵染的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，常規(guī)消毒處理后置于誘導(dǎo)叢生芽分化的培養(yǎng)基中MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA。培養(yǎng)條件為白天溫度27±1℃，夜晚溫度20±1℃；濕度60-65％，光強(qiáng)28μmol/m2.s，光照時(shí)間14h/d。15d后將叢生苗分離成單株，置于壯苗生長培養(yǎng)基中MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/LNAA，培養(yǎng)條件同上。1周后移植單株組培苗于生根培養(yǎng)基中MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭，培養(yǎng)條件同上。以此不定芽器官增殖途徑可持續(xù)進(jìn)行快繁，每株芽的繁殖系數(shù)為5～7，2周內(nèi)即可獲得發(fā)育良好的完整植株。
2、切取虎杖無菌組培苗的葉片外植體作為感染材料備用。
3、野生型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ATCC11325通常于添加有20％甘油的YEB液體培養(yǎng)基中-20℃避光保存。從冰箱中取出發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ATCC11325平衡30min，然后在超凈工作臺(tái)上吸取500μl菌液于已滅菌的100ml新鮮YEB培養(yǎng)液中，25℃、140r·min-1、黑暗振蕩培養(yǎng)22h即可使用。
4、用無菌解剖刀小心劃傷葉片表面以形成傷口，放入活化好的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10min，輕輕搖動(dòng)使之充分接觸。取出感染材料，用無菌吸水紙輕輕蘸干多余菌液，使葉片上表皮向下放置于MS0培養(yǎng)基中，25℃、黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。感染一周左右葉片表面劃傷處開始出現(xiàn)密集叢生的毛狀根(圖1)，向下扎入培養(yǎng)基中迅速生長。持續(xù)共培養(yǎng)20～30d即可形成大量豐富的毛狀根系(圖2)。其間未出現(xiàn)農(nóng)桿菌生長情況，因此省去除菌環(huán)節(jié)。
5、毛狀根的分子鑒定毛狀根轉(zhuǎn)基因性質(zhì)的鑒定采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)，設(shè)計(jì)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中TL-DNA或TR-DNA上與生根有關(guān)的基因引物，提取毛狀根基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳進(jìn)行分析鑒定，確定得到的特異性基因片段。rolb基因是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒TL-DNA(T-DNA左臂)上與生根密切相關(guān)的一個(gè)基因，而tms基因則位于TR-DNA(T-DNA右臂)上，參與編碼生長素的合成，如果所誘導(dǎo)的毛狀根具有轉(zhuǎn)發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA性質(zhì)，則通過設(shè)計(jì)TL-DNA或TR-DNA上特異的基因引物，與提取的毛狀根基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體操作參照王關(guān)林等編《植物基因工程原理及技術(shù)》(1998年科學(xué)出版社)。
從圖4、圖5顯示的結(jié)果可見，利用rolb及tms的PCR引物，能從感染后的虎杖葉片及毛狀根總DNA中分別擴(kuò)增到期望的422bp和910bp左右的特異性DNA片段，而從未轉(zhuǎn)化的自然根及未感染的葉片總DNA中擴(kuò)增不到任何片段。這說明，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325Ri質(zhì)粒的TL-DNA和TR-DNA部分已在虎杖毛狀根基因組中得到整合與表達(dá)。
6、對(duì)篩選的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，不添加其他植物生長調(diào)節(jié)劑(如 NAA、CPPU、TDZ或乙烯利)，調(diào)節(jié)pH值為6.0～6.5，并附加3％蔗糖作為碳源。溫度22～27℃，搖床轉(zhuǎn)速120～140 r·min-1，黑暗或弱光下進(jìn)行培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)時(shí)接種量控制在0.5～1.0g(鮮重)毛狀根100～150ml培養(yǎng)液較適宜。在毛狀根生長最快的指數(shù)期(6～24天)采取補(bǔ)液培養(yǎng)的方式，能夠最大程度地收獲培養(yǎng)物。毛狀根在液體培養(yǎng)基中能夠自主快速增殖如圖3，培養(yǎng)過程中日增長量平均為0.214～0.275g干重/天，30天的生長量(鮮重)為接種量的7～9倍，干重增長率可達(dá)到8.29，是相同條件下懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的192.8倍，是自然根培養(yǎng)物的8.4倍。
7、從培養(yǎng)液中取出毛狀根，低溫(45℃)干燥至恒重后，用研缽研成細(xì)粉，過60目篩，用50％(V∶V，以下同)乙醇結(jié)合30～40min超聲波處理進(jìn)行提取，之后3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即可得到純度較高的虎杖苷和白藜蘆醇。
8、利用高效液相色譜法(HPLC)檢測毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇含量，與標(biāo)準(zhǔn)品圖6、圖7比對(duì)發(fā)現(xiàn)，虎杖毛狀根中含有虎杖苷和白藜蘆醇成分如圖8所示。用本發(fā)明提供的毛狀根系與培養(yǎng)方法，毛狀根日增長量平均為0.214～0.275g干重/天，虎杖苷含量可達(dá)培養(yǎng)物干重的0.18～0.22％，白藜蘆醇含量可達(dá)培養(yǎng)物干重的0.05～0.0g％。
9、將優(yōu)良毛狀根株系轉(zhuǎn)接于添加有適量活性碳，如1-2％，并提高蔗糖含量如5-10％的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體種質(zhì)保存，用于工業(yè)化生產(chǎn)在優(yōu)化條件下擴(kuò)大培養(yǎng)以便定期收獲毛狀根。
實(shí)施例2
在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的莖段作為感染材料。步驟(3)中，同時(shí)加入根癌農(nóng)桿菌C58菌液500μl于100ml YEB培養(yǎng)液中，和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325在25℃、140r·min-1、黑暗共培養(yǎng)22h后使用。步驟(4)中，莖段外植體在雙菌活化液中浸泡10min，黑暗條件下置于MS0中共培養(yǎng)。步驟(5)中，對(duì)莖段誘導(dǎo)獲得的毛狀根分離培養(yǎng)后進(jìn)行PCR分子鑒定；步驟(6)中，對(duì)莖段誘導(dǎo)獲得的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從莖段誘導(dǎo)獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品。步驟(8)中，利用HPLC法對(duì)莖段誘導(dǎo)獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測。步驟(9)中，對(duì)莖段誘導(dǎo)獲得的毛狀根篩選后直接進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，收獲得到的大量毛狀根培養(yǎng)物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例3在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的幼芽作為感染材料。步驟(3)中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325在26℃、150r·min-1、黑暗共培養(yǎng)24h后使用。步驟(4)中，幼芽外植體浸泡于100ml活化菌液中，在超聲波振蕩器中處理5～10sec，取出吸干多余菌液后，黑暗條件下置于MS0中共培養(yǎng)。步驟(5)中，對(duì)幼芽誘導(dǎo)獲得的毛狀根分離培養(yǎng)后進(jìn)行PCR分子鑒定；步驟(6)中，對(duì)幼芽誘導(dǎo)獲得的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從幼芽誘導(dǎo)獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品。步驟(8)中，利用HPLC法對(duì)幼芽誘導(dǎo)獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測。步驟(9)中，對(duì)幼芽誘導(dǎo)獲得的毛狀根篩選后直接進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，收獲得到的大量毛狀根培養(yǎng)物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例4在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的成熟葉片(葉長≥1.5cm)作為感染材料。步驟(3)中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325在27℃、140r·min-1、黑暗共培養(yǎng)20h后使用。步驟(4)中，葉片外植體浸泡于100ml活化菌液中，在微波爐中輻射處理5～10sec，取出吸干多余菌液后，黑暗條件下置于MS0中共培養(yǎng)。步驟(5)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根分離培養(yǎng)后進(jìn)行PCR分子鑒定；步驟(6)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品。步驟(8)中，利用HPLC法對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測。步驟(9)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根篩選后直接進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，收獲得到的大量毛狀根培養(yǎng)物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例5在步驟(2)中切取虎杖無菌苗葉片的葉柄部分作為感染材料。步驟(3)中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325在24℃、130r·min-1、黑暗共培養(yǎng)23h后使用。步驟(4)中，葉柄外植體浸泡于100ml活化菌液中8min，取出吸干多余菌液后，黑暗條件下置于MS0中共培養(yǎng)。步驟(5)中，對(duì)葉柄誘導(dǎo)獲得的毛狀根分離培養(yǎng)后進(jìn)行PCR分子鑒定；步驟(6)中，對(duì)葉柄誘導(dǎo)獲得的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉柄誘導(dǎo)獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品。步驟(8)中，利用HPLC法對(duì)葉柄誘導(dǎo)獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測。步驟(9)中，對(duì)葉柄誘導(dǎo)獲得的毛狀根篩選后直接進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，采用1/2MS0夜體培養(yǎng)基，在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，收獲得到的大量毛狀根培養(yǎng)物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例6在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的成熟葉片(葉長≥1.5cm)作為感染材料。步驟(3)中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325在23℃、130r·min-1、黑暗共培養(yǎng)23h后使用。步驟(4)中，葉片外植體浸泡于100ml活化菌液中15min，取出吸干多余菌液后，使葉片上表皮向上放置于MS0培養(yǎng)基中，弱光條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。步驟(5)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根分離培養(yǎng)后進(jìn)行PCR分子鑒定；步驟(6)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品。步驟(8)中，利用HPLC法對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測。步驟(9)中，對(duì)葉片誘導(dǎo)獲得的毛狀根篩選后直接進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，收獲得到的大量毛狀根培養(yǎng)物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產(chǎn)品，其他同實(shí)施例1。
本發(fā)明列舉的實(shí)施例旨在更進(jìn)一步地闡明這種組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制，用本發(fā)明實(shí)施例得到的產(chǎn)品和經(jīng)由本發(fā)明權(quán)利要求書所述均可得到組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷及白藜蘆醇產(chǎn)品。需要說明的是白藜蘆醇及其苷在植物體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，因此對(duì)其含量需要有全面的評(píng)價(jià)。
實(shí)施例中涉及的縮寫術(shù)語、培養(yǎng)基及統(tǒng)計(jì)方法說明1、菌種發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325和根癌農(nóng)桿菌C58購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心。
2、農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基YEB(yeast e×tract bacto)培養(yǎng)基，是基因工程領(lǐng)域常用的培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基，其配方可在基因工程的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)中獲得。
3、植物培養(yǎng)基MS(Murashige & Skoog，1962)培養(yǎng)基，是植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域常用的基本培養(yǎng)基，在組織培養(yǎng)方面的教科書或?qū)嶒?yàn)指導(dǎo)手冊(cè)中均可獲得其配方。MS0指未添加任何生長調(diào)節(jié)劑的MS基本培養(yǎng)基；1/2MS0指大量元素成分減半的MS0培養(yǎng)基。
4、標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇(resveratrol，純度99％)購自Sigma公司；虎杖苷(polydatin，純度98％)購自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司。
6、干重增長率＝(收獲干重-接種干重)/接種干重；毛狀根誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生毛狀根外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100％；誘根密度＝毛狀根產(chǎn)生的條數(shù)/生根外植體數(shù)。有效成分含量(％)＝有效成分質(zhì)量(g)/100g培養(yǎng)物干重。
權(quán)利要求
1.組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于它包括如下步驟A、野生虎杖組培選取發(fā)育良好的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，消毒處理后經(jīng)分化培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)，生根培養(yǎng)形成發(fā)育完整的幼苗，切取無菌組培苗的莖段、葉片、葉柄及幼芽等外植體作為感染材料備用；B、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)取出冰箱保存的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ATCC11325平衡20～30min，然后在超凈工作臺(tái)上吸取500～800μl菌液于已滅菌的100～150ml新鮮YEB培養(yǎng)液中，于23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振蕩培養(yǎng)20～24h即可；C、虎杖毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)劃傷受體材料表面以形成傷口，放入步驟B的農(nóng)桿菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接觸，取出感染材料用無菌吸水紙輕輕蘸干多余菌液，24～27℃、黑暗條件下置于MS0中進(jìn)行共培養(yǎng)7～15天后在感染材料的傷口部位可見毛狀根的萌生；D、虎杖毛狀根優(yōu)化培養(yǎng)經(jīng)分子鑒定后采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，附加3％蔗糖作為碳源，在pH值為6.0～6.5，溫度22～27℃，搖床轉(zhuǎn)速120～140r·min-1，在黑暗或弱光條件下6～30天獲得大量增值的毛狀根株；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取從培養(yǎng)液中取出毛狀根、烘干、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇結(jié)合30～40min超聲波處理進(jìn)行提取，之后于3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即可得到純度較高的虎杖苷產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于步驟A中對(duì)野生材料的消毒方法是采用流水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，無菌水漂洗三次后再置于0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，無菌水充分漂洗后即可接種；誘導(dǎo)叢生芽分化的培養(yǎng)基是指MS+0.05mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壯苗生長的培養(yǎng)基是指MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/L NAA，生根培養(yǎng)基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培養(yǎng)條件均為白天27±1℃，夜晚20±1℃；濕度60～70％，光強(qiáng)28μmol/m2.s，光照時(shí)間13～17h/d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于提高步驟C所述的虎杖毛狀根誘導(dǎo)率的方法包括a、發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌雙感染；b超聲波振蕩輔助感染；c，微波輻射輔助感染；d、選取成熟葉的葉片部分作為感染材料；e、感染葉片不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)且共培養(yǎng)時(shí)葉片上表皮向上放置；或f、黑暗、室溫環(huán)境下誘導(dǎo)根的發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于步驟D所述的分子鑒定是指切取從感染材料上產(chǎn)生的毛狀根根段，分離成單根后轉(zhuǎn)接至MS0固體培養(yǎng)基中生長，10～15天繼代培養(yǎng)一次；從大量的單克隆毛狀根系中篩選生長迅速、外形粗壯、分枝較多的毛狀根進(jìn)行PCR分子鑒定，證實(shí)具有轉(zhuǎn)發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA性質(zhì)的毛狀根進(jìn)入下一步操作。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于步驟D所述的培養(yǎng)周期6～24天內(nèi)采取每7天更換培養(yǎng)液一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于將步驟D得到虎杖毛狀根進(jìn)行固體種質(zhì)保存以用于工業(yè)化生產(chǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于將生長迅速、含量較高且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良虎杖毛狀根單克隆系，保存于添加有1％活性碳并增加5％蔗糖含量的MS固體培養(yǎng)基中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于將步驟D得到虎杖毛狀根在優(yōu)化條件下擴(kuò)大培養(yǎng)以便定期收獲毛狀根，繼代培養(yǎng)時(shí)接種量控制在0.5～1.0g鮮重毛狀根100～150ml培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述組培誘導(dǎo)虎杖毛狀根制備虎杖苷的方法，其特征在于上述方法可同時(shí)制備白藜蘆醇提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用組培技術(shù)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogene)生根質(zhì)粒上的一段T－DNA對(duì)虎杖外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)培養(yǎng)所產(chǎn)生的毛狀根來生產(chǎn)虎杖苷的方法。它包括如下步驟A、野生虎杖組培；B、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)；C、虎杖毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)；D、虎杖毛狀根優(yōu)化培養(yǎng)；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取。本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步效果表現(xiàn)在與從野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的現(xiàn)今生產(chǎn)方式相比，利用毛狀根來生產(chǎn)以根入藥為主的藥用植物的某些有效成分，具有生產(chǎn)周期短、質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，而且天然藥物的生產(chǎn)是在可控和可重復(fù)條件下進(jìn)行，不會(huì)受到病蟲害和自然環(huán)境等因素的影響。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1759665SQ200510012809
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者于樹宏, 范慶書, 查建蓬, 張嫡群 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)